Ген, кодирующий открытую рамку считывания м-сегмента ккгл, и рекомбинантная конструкция, обеспечивающая экспрессию структурных гликопротеинов вируса крым-конго геморрагической лихорадки

Изобретение относится к биотехнологии. Описан ген, кодирующий структурные гликопротеины вируса Крым-Конго геморрагической лихорадки. А также описана рекомбинантная плазмида, обеспечивающая экспрессию указанного гена за счет цитомегаловирусного (CMV) промотора, а также его интеграцию в геном клеток млекопитающих. Изобретение может быть использовано в биотехнологии, молекулярной биологии, генетической инженерии и медицине. Техническим результатом заявленного изобретения является создание рекомбинантной плазмиды, обеспечивающей интеграцию и экспрессию структурных гликопротеинов вируса Крым-Конго геморрагической лихорадки. Указанный технический результат достигается путем создания гена, кодирующего открытую рамку считывания М-сегмента вируса ККГЛ, который представлен последовательностью SEQ ID NO: 1 длиной 5052 п.н. Создана плазмида pSB3delta-GPC, которая имеет размер 11495 п.н. и содержит в соответствии с физической и генетической картой, представленной на фиг. 4, целевой ген, кодирующий открытую рамку считывания М-сегмента вируса ККГЛ, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2 длиной 1683 а.к.о. 2 н.п. ф-лы, 7 ил., 4 табл.

 

Изобретение относится к гену, кодирующему структурные гликопротеины вируса Крым-Конго геморрагической лихорадки и рекомбинантной плазмиде, обеспечивающей экспрессию указанного гена за счет цитомегаловирусного (CMV) промотора, а также их интеграцию в геном клеток млекопитающих за счет инвертированных повторов, фланкирующих последовательность гена интереса, промоторных элементов и селективного маркера, и может быть использовано в биотехнологии, молекулярной биологии, генетической инженерии и медицине, в частности для получения вакцины.

Геморрагическая лихорадка Крым-Конго - это особо опасное природно-очаговое трансмиссивное заболевание, вызываемое вирусом Крымско-Конго геморрагической лихорадки (ККГЛ), одно из широко распространенных в мире арбовирусных инфекций, также является рекуррентной инфекцией, эндемичной для юга Европейской части России. Вирус ККГЛ относится к семейству Nairoviridae, порядку Bunyavirales. Геном вируса ККГЛ состоит из трех сегментов: малого (S), среднего (М) и большого (L), представленных одноцепочечной РНК отрицательной полярности [1].

Переносчиками вируса являются иксодовые клещи рода Hyalomma, а хозяевами и резервуаром в природе дикие млекопитающие. Ареал распространения вируса ККГЛ, практически совпадает с ареалом распространения клещей рода Hualomma и охватывает Африку и южную часть Евразии. Для более чем 30 стран была выявлена заболеваемость ККГЛ или же показано наличие вируса ККГЛ в клещах [10].

На данный момент не существует одобренной вакцины, однако имеется множество вакцинных препаратов, которые включают в себя субъединичные антигены, генетически модифицированные растения, вирусные векторы и ДНК-вакцины, экспрессирующие антигены ККГЛ, вирусоподобные частицы (VLP), препараты матричной РНК (мРНК) и инактивированные вирусные частицы [7].

Известно решение по патенту (WO 2020123989, МПК А61К 39/12, опубл. 18.06.2020 г.) [11], где был предложен вариант репликонных вирусных частиц, содержащих все вирусные белки, S- и L-сегменты генома, но не содержащих полноразмерного М-сегмента. Получение вирусных частиц на культуре клеток достигалось путем трансфекции плазмидами pCAGGS, содержащие все три рамки считывания, и минигеномными плазмидами рТ7, содержащие полноразмерные S- и L-сегменты. Для увеличения титра, авторы дополнительно размножали репликонные вирусные частицы, на клеточной культуре Huh7, трансфицированной также pCAGGS-GPC-Oman.

Наиболее близким аналогом (прототипом) является решение по патенту (US 9109199, МПК А61К 39/12, опубл. 18.08.2015 г.) [12], где описан способ получения репликонных частиц буньявирусов, включая вирус лихорадки долины Рифт и ККГЛ, путем транс-комплементации структурных гликопротеинов Gc и Gn как в присутствии, так и в отсутствие кодирующих областей NSm. Транс-комплементация достигалась путем транзиентной экспрессии полноценных вирусных гликопротеинов в клеточной культуре ВНК-21 плазмидой pCAGGS, кодирующей открытую рамку считывания М-сегмента вируса ККГЛ или же путем использования вирусного вектора, кодирующего открытую рамку считывания М-сегмента вируса ККГЛ. В патенте раскрывается подход дизайна репликонных частиц буньявирусов с целью изучения иммунного ответа, разработки средств диагностики буньявирусных инфекций, а также изучения свойств вирусов за пределами помещений класса BSL-4.

Недостатками вышеперечисленных решений является использование дополнительных плазмид или вирусного вектора, которые бы обеспечивали продукцию вирусных гликопротеинов, что может повлечь снижение титра репликонных частиц, а также потерю способности клеточной линии к экспрессии гликопротеинов. Дополнительно, при исключении из вирусной частицы М-сегмента, происходит снижение Т-клеточного ответа, поскольку не обеспечивается внутриклеточный синтез основного структурного антигена. Кроме того, это решение не является технологичным для серийного производства вакцинных препаратов, поскольку при пассировании суспензионных клеточных культур необходима их постоянная трансфекция экспрессионной плазмидой, кодирующей вирусные гликопротеины.

Таким образом, в уровне техники существует потребность в разработке новых подходов, обеспечивающих более стабильную экспрессию вирусных генов и их использовании для разработки кандидатных вакцинных препаратов.

Раскрытие изобретения

Техническим результатом заявленного изобретения является создание рекомбинантной плазмиды, обеспечивающей интеграцию и стабильную экспрессию структурных гликопротеинов вируса Крым-Конго геморрагической лихорадки и не имеющих недостатков выше приведенных аналогов и прототипа.

Указанный технический результат достигается путем создания гена, кодирующего открытую рамку считывания М-сегмента вируса ККГЛ, который представлен последовательностью SEQ ID NO: 1 длиной 5052 п.н.

Указанный технический результат также достигается созданием рекомбинантной плазмиды pSB3delta-GPC, которая имеет размер 11495 п.н. и содержит в соответствии с физической и генетической картой, представленной на фиг. 4, целевой ген, кодирующий белок-предшественник (открытую рамку считывания М-сегмента вируса ККГЛ), имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2 длиной 1683 а.к.о., и состоит из следующих элементов:

• ген β-лактамазы (координаты с 10442 по 11303 п.н.) под контролем промотора (координаты с 11304 по 11409 п.н.), в качестве генетического маркера, определяющего устойчивость к ампициллину клеток бактерии E. coli;

• точка начала репликации ori плазмидного вектора pUC (координаты с 9683 по 10272 п.н.)

• 5'-ITR и 3'-ITR инвертированные повторы, имеющие координаты с 17 по 241 п.н. и с 9215 по 9439 п.н. соответственно, обеспечивают интеграцию участка плазмиды, заключенного между ними, в геном клеток млекопитающих при помощи транспозазы Sleeping Beauty (SB);

• промотор и энхансер цитомегаловируса человека (CMV) - обеспечивает экспрессию гена по п. 1 в клетках млекопитающих (координаты с 855 по 1438 п.н.);

• himeric intron - химерный интрон, обеспечивающий эффективную транскрипцию, стабильность и транспорт транскрипта из ядра клетки (координаты с 1574 по 1706 п.н.);

• Т7 promoter - нуклеотидная последовательность промотора бактериофага Т7, необходимая для in vitro транскрипции (координаты с 1751 по 1769 п.н.);

• Glycoprotein precursor - открытая рамка считывания гена, кодирующего структурные гликопротеины вируса ККГЛ (координаты с 1783 по 6834 п.н.);

• IRES2 - внутренний сайт посадки рибосом вируса энцефаломиелита, обеспечивающий экспрессию гена устойчивости к пуромицину (координаты с 6879 по 7465 п.н.);

• PuroR - ген устойчивости к пуромицину, кодирующий N-ацетил трансферазу (координаты с 7466 по 8068 п.н.);

• bGH poly(A) signal - сигнал полиаденелирования (координаты с 8099 по 8323 п.н.).

Существенными отличиями от прототипа, обеспечивающими достижение технического результата, являются:

1. Промоторный IE-элемент цитомегаловируса (CMV) человека необходим для получения стабильно экспрессирующих линий клеток;

2. Полученная рекомбинантная плазмида является интеграционным вектором, который содержат в своем составе ITRs, фланкирующие последовательность гена интереса, промоторных элементов и селективного маркера. Данные последовательности ITRs узнаются транспозазой Sleeping Beauty (SB), с помощью которой происходит интеграция в геном клетки;

3. Ген устойчивости к антибиотику пуромицину позволяет проводить селекцию стабильно экспрессирующих клеточных трансформантов;

4. Вирусные гены структурных гликопротеинов были получены из эпидемиологически значимого штамма вируса ККГЛ.

Сущность заявленного изобретения поясняется чертежами. На фиг. 1 обозначена схема амплификации открытой рамки считывания М-сегмента вируса ККГЛ. На фиг. 2 представлена электрофореграмма в 1.5% агарозном геле фрагментов открытых рамок считывания М- и L-сегментов вируса ККГЛ, амплифицированных на матрице кДНК. На фиг. 3 изображена электрофореграмма в 1.5% агарозном геле продуктов overlap extension ПЦР, полученных путем объединения ампликонов, где М - ДНК-маркер 1 Kb М12 (СибЭнзим, Россия), GPC - открытая рамка считывания М-сегмента, RdRp - открытая рамка считывания L-сегмента. На фиг. 4 изображена схема конструкции рекомбинантной плазмиды pSB3delta-GPC. На фиг. 5 представлена электрофореграмма в 1% агарозном геле фрагментов ДНК после гидролиза плазмид pSB3delta-GPC и pSB3delta-RdRp эндонуклеазами рестрикции XhoI и MluI, где М - ДНК-маркер 1 Kb M12 (СибЭнзим, Россия), GPC - ДНК pSB3delta-GPC, гидролизованная ферментами XhoI - MluI, RdRp - ДНК pSB3delta-RdRp, гидролизованная ферментами XhoI - MluI. На фиг. 6 показаны популяции клеточных линий HEK293-А через двое (А), через пять (Б) суток и через семь (В) суток после трансфекции плазмидами pSB100X и pSB3delta-GPC. На фиг. 7 показано электрофоретическое разделение продуктов амплификации внутреннего участка М-сегмента вируса ККГЛ, где М - маркер длин ДНК 1 kb M12 (СибЭнзим, Россия); 1-5 - ампликоны, полученные с использованием раствора выделенных РНК/ДНК с концентрацией ДНК от 50 нг до 0,005 нг; 6-10 - ампликоны, полученные с использованием образца после обратной транскрипции с концентрацией ДНК от 50 нг до 0,005 нг; К- - образец отрицательного контроля, содержащий ПНР-смесь без ДНК-матрицы.

Осуществление изобретения. Первым этапом создания целевой плазмиды стал выбор способа экспрессии целевого гена в клеточных культурах. Для этого была выбрана система транспозонов Sleeping Beauty, которая позволяет высокоэффективно осуществляет встройку в геном фрагментов ДНК различной длины, ограниченных опознаваемыми особыми последовательностями - так называемыми инвертированными концевыми повторами (англ. ITR, inverted terminal repeats). Кассета, предназначенная для встройки в геном и ограниченная ITR, доставляется в клетку в составе плазмидного вектора. При одновременной доставке вектора и осуществляющейся в клетке экспрессии транспозазы, кассета вырезается из вектора и встраивается в произвольное место в геноме клетки-хозяина. Таким образом, высокоэффективно осуществляется стабильная трансфекция клеточных культур [8]. Использование клеточных линий, стабильно экспрессирующих вирусные белки, может стать преимуществом при разработке кандидатных ДНК-вакцин и VLP против вируса ККГЛ и других вирусов порядка Bunyavirales.

В качестве целевого гена были выбраны участки, кодирующие структурные гликопротеины (открытая рамка считывания М-сегмента) вируса ККГЛ. Такой выбор обусловлен тем, что в вирусные гликопротеины (Gc и Gn, VP38) содержат множество иммуногенных эпитопов и используются в большинстве подходов для индукции как гуморального, так и клеточного ответов [2, 9]. Было показано, что кандидатные вакцинные препараты, содержавшие в своем составе данные участки защищали мышей при контрольном заражении [3-5].

Таким образом, данное изобретение может быть использовано для транс-комплементации М-сегмента при создании репликонных частиц буньявирусов.

Пример 1. Получение кДНК копий М-сегмента вируса ККГЛ

Подбор праймеров (Таблица 1) осуществляли с помощью ПО SnapGene v.3.2.1 и Oligo7, используя в качестве референса последовательности М-сегмента вируса ККГЛ изолят Ast199 (последовательности GenBank: KX056051, KX056050). Синтез олигонуклеотидных праймеров был проведен биотехнологической компанией «Евроген» (г. Москва). Сайты рестрикции в олигонуклеотидах обозначены подчеркиванием и полужирным шрифтом.

1.1. Выделение вирусной РНК и постановка реакции обратной транскрипции

Выделение тотальной РНК проводили из вируссодержащего материала (инфицированный монослой культуры клеток Vero в лизирующем буфере AVL). Для выделения использовали коммерческий набор QIAamp Viral RNA Mini Kit (Qiagen, Германия) в соответствии рекомендациями производителя. Элюат хранили при минус 20°С; в следующем этапе работы использовали его для постановки обратной транскрипции.

Для получения первой цепи ДНК на матрице вирусной геномной РНК использовали набор RNAscribe RT (Biolabmix, Россия). Для проведения реакции пробирку с смесью необходимых компонентов помещали в амплификатор Thermal Cycler С1000 (BioRad, США) и использовали рекомендуемый производителем температурно-временной профиль.

1.2. Амплификация методом ПЦР кДНК фрагментов, кодирующих гликопротеины вируса ККГЛ

Методом ПЦР с использованием специфических праймеров (Таблица 1) были амплифицированы участки, согласно Фиг. 1. Для амплификации использовали высокоточную полимеразу Phusion High-Fidelity (NEB, США), постановку реакции осуществляли согласно рекомендациям производителя. Реакцию для каждого фрагмента проводили в двух повторах с использованием амплификатора Thermal Cycler С1000 с заданным температурно-временным профилем (Таблица 2)

1.3. Выделение ДНК из агарозного геля. После проведения ПНР, очистку продуктов амплификации ДНК проводили методом электрофореза в 1.5% агарозном геле в трис-ацетатном буфере (ТАЕ×1), окрашивали раствором бромистого этидия в течение 10 мин и проявляли с использованием УФ-трансиллюминатора «UV Transilluminator 2000» (BioRad, США). После визуализации под УФ-излучением фрагменты ДНК необходимой длины, разделенные в агарозном геле (фиг. 2) вырезали и выделяли из геля при помощи набора QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, Германия) в соответствии с рекомендациями производителя.

1.4. Объединение фрагментов при помощи overtap-extension ПЦР

Концентрацию выделенных ДНК фрагментов измеряли при помощи NanoDrop One (Thermo Scientific, США). После чего, фрагменты смешивали в эквимолярных количествах и осуществляли первый этап (overlap) синтеза кДНК копий, кодирующих ORF М-сегмента с помощью полимеразы Phusion High-Fidelity (NEB, США), используя температурно-временной профиль, представленный в Таблице 3. Второй этап (extension) осуществляли при помощи концевых праймеров, содержащих сайты рестрикции Smal и Mlul (Таблица 1) с заданным температурно-временным профилем (Таблица 4).

Очистку продуктов амплификации ДНК при помощи электрофореза в агарозном геле осуществляли способом, описанным ранее. После визуализации под УФ-излучением фрагменты ДНК необходимой длины, разделенные в агарозном геле (фиг. 3), вырезали и выделяли из геля аналогичным образом.

Пример 2 Получение интеграционной конструкции pSB3detta-GPC, несущей открытую рамку считывания М-сегмента вируса ККГЛ

2.1. Клонирование ПЦР продуктов, несущих открытую рамку считывания М-сегмента вируса ККГЛ в плазмиду pSB3delta

Для клонирования генов структурных гликопротеинов в вектор pSB3delta осуществляли ферментативный гидролиз плазмидного вектора и ПЦР продуктов с помощью эндонуклеаз рестрикции SmaI и MluI (NEB, США) с прилагаемыми к ним буферами. Реакционную смесь готовили в соответствии с активностью фермента и концентрацией ДНК. Условия реакции и длительность проведения ферментативного гидролиза ДНК подбирали в соответствии с инструкциями производителя.

Обработанные ферментами ПЦР продукты и вектор pSB3 delta разделяли с помощью электрофореза в 1.5% агарозном геле с последующим выделением с помощью набора QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, Германия) в соответствии с рекомендациями производителя.

Реакцию лигирования проводили 30 минут при 22°С, используя смесь каждого из ПЦР продуктов, векторной плазмиды pSB3delta в эквимолярных количествах и ДНК-лигазы фага Т4 (ThermoFisher, США) в прилагаемом к коммерческому набору реакционном буфере. Полученная ДНК-конструкция pSB3delta-GPC (фиг. 4) использовали для трансформации культуры компетентных клеток Е. coli штамм NEB Stable (NEB, США). Трансформанты были отобраны с помощью стандартной процедуры ПЦР-скрининга на внутренний участок каждой из вставок.

2.2. Получение плазмидной конструкции pSB3delta-GPC и подтверждение ее структуры при помощи рестрикционного анализа. С помощью бактериологической петли колонию с чашки Петри переносили в пробирку, содержащую 3,5 мл жидкой питательной среды SOB с селективным антибиотиком ампициллином (100 мкг/мл). Далее пробирки помещали в шейкер-инкубатор на 16-18 часов при 170 об/мин, 30°С. Полученную бактериальную суспензию использовали для выделения плазмидной ДНК при помощи набора QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen, Германия) в соответствии с рекомендациями производителя.

Для подтверждения структуры полученной плазмидной конструкции был проведен гидролиз плазмидной конструкции pSB3delta-GPC с помощью эндонуклеаз рестрикции XhoI и MluI. Согласно теоретически рассчитанной последовательности при гидролизе плазмиды pSB3delta-GPC вышеуказанными ферментами должны появится фрагменты длиной 5471 п.н., 3195 п.н., 1440 п.н. и 1389 п.н.

На фиг. 5 представлена электрофореграмма фрагментов ДНК после гидролиза плазмиды pSB3delta-GPC эндонуклеазами рестрикции XhoI и MluI в 1% агарозном геле, где:

М - ДНК-маркер 1 Kb M12 (СибЭнзим, Россия)

GPC - ДНК pSB3delta-GPC, гидролизованная ферментами XhoI - MluI

RdRp - ДНК pSB3delta-RdRp, гидролизованная ферментами XhoI - MluI

Из данных, представленных на фиг. 5 видно, что подвижность фрагментов гидролизата плазмид pSB3delta-GPC и pSB3delta-RdRp в 1% агарозном геле относительно маркеров молекулярной массы соответствует подвижности теоретически рассчитанных фрагментов.

2.3. Подтверждение структуры плазмид секвенированием по Сэнгеру

Для подтверждения корректной нуклеотидной последовательности полученных образцов использовали метод секвенирования по Сэнгеру. Для постановки реакции использовали набор BrilliantDye Terminator (v3.1) Cycle Sequencing kit (Nimagen, Нидерланды), очищали образцы через Sephadex G-50 Superfine (Cytiva, Швеция) колоночным методом согласно рекомендациям производителя, после чего передавали для проведения капиллярного гель-электрофореза на автоматическом секвенаторе 3500xl Applied Biosystems (США). Полученные хроматограммы анализировали с использованием программного обеспечения SnapGene 3.2.1.

Пример 3. Липофекции клеточной линии HEK293-А плазмидами pSB100X/pSB3delta-GPC и подтверждение экспрессии гена. Для создания линий клеток, стабильно экспрессирующих ген полипротеина GPC, была выбрана перевиваемая клеточная линия HEK293-А. Для липофекции использовали набор Lipofectamine 3000 (Thermo Fisher Scientific, США). Количество взятой для трансфекции плазмидной ДНК в сумме составляло 3 мкг для одной лунки, с соотношением 1 часть плазмиды pSB 100Х к 9 частям плазмиды pSB3delta-GPC. Смесь для липофекции готовили согласно рекомендациям производителя. Перед проведением трансфекции делали рассев клеток на культуральном 6-луночном планшете по 2 мл клеточной суспензии с концентрацией 100 тыс. клеток/мл на лунку в питательной ростовой среде DMEM/F-12 с 7%-содержанием фетальной бычьей сыворотки. Планшет инкубировали до получения монослоя клеток с конфлюентностью в 70-90%.

В культуральном 6-луночном планшете, содержащем монослой клеточной линии, делали замену питательной среды DMEM/F-12 на среду с пониженным содержанием сыворотки OptiMEM (2 мл на лунку), после чего вносили по 250 мкл полученной смеси ДНК-липидного комплекса в 3 лунки, распределяя смесь по всей поверхности. В качестве контроля оставляли 3 лунки с монослоем клеток без добавления ДНК-липидного комплекса. После инкубации в течение двух суток при 37°С в CO₂-инкубаторе заменяли кондиционированную питательную среду с пониженным содержанием сыворотки OptiMEM на среду DMEM/F-12 с добавлением селективного антибиотика пуромицина с концентрацией 5 мкг/мл. В одну из трех лунок с монослоем клеток, которые не подвергались трансфекции, вносили питательную среду без добавления антибиотика для наблюдения состояния клеточной популяции. Далее проводили инкубацию при 37°С в CO₂-инкубаторе со сменой питательной среды каждые 2-3 дня до получения монослоя трансфицированных клеток с конфлюентностью 70-90% (фиг. 6).

Для подтверждения экспрессии гена, кодирующего структурные гликопротеины вируса ККГЛ проводили выделение РНК и ДНК из суспензии клеток трансгенной линии HEK293-А с помощью набор реагентов «РИБО-преп» (Helicon, Россия). Часть раствора очищенных РНК/ДНК гидролизовали ДНКазой I (NEB, США), свободной от РНКаз, и использовали для получения кДНК методом обратной транскрипции с олигонуклеотидными праймерами F-CCHFV_inner и R-CCHFV_inner (Таблица 1), соответствующими внутреннему участку М-сегмента (размер 1541 п.н.). Количество ДНК в растворе выделенных РНК/ДНК и образце после обратной транскрипции измеряли на спектрофотометре NanoDrop One (Thermo ScientiHc, США) и проводили ПЦР с 6 точками 10-кратного разбавления 50 нг ДНК, содержащейся в растворе очищенных РНК/ДНК и в образце с кДНК. По результатам электрофоретического разделения в агарозном геле продуктов амплификации фрагмента можно сделать вывод, что используемые для выделения РНК и ДНК клетки трансгенной линии HEK293-А содержали в геноме последовательность гена структурных гликопротеинов вируса ККГЛ. Присутствие РНК в количестве, достаточном для успешной постановки обратной транскрипции со специфическими олигонуклеотидными праймерами, предполагает стабильную экспрессию данного гена в полученной линии клеток (фиг. 7), что подтверждает заявляемый технический результат.

Источники патентной и научно-технической информации

1. Fields, Bernard N; Knipe, David M; Howley P.M. Fields virology 6th ed. (2013) //Book. 2013. C. 2664.

2. Goedhals D., Paweska J.Т., Burt F.J. Long-lived CD8+ T cell responses following Crimean-Congo haemorrhagic fever virus infection // PLoS Neglected Tropical Diseases. 2017. №12(11). C. e0006149.

3. Hinkula J. [и др.]. Immunization with DNA Plasmids Coding for Crimean-Congo Hemorrhagic Fever Virus Capsid and Envelope Proteins and/or Virus-Like Particles Induces Protection and Survival in Challenged Mice // Journal of Virology. 2017. №10(91).

4. Rodriguez S.E. [и др.]. Vesicular Stomatitis Virus-Based Vaccine Protects Mice against Crimean-Congo Hemorrhagic Fever // Scientific Reports. 2019. №1 (9). C. 1-13.

5. Spengler J. R. [и др.]. Heterologous protection against Crimean-Congo hemorrhagic fever in mice after a single dose of replicon particle vaccine // Antiviral Research. 2019. (170). C. 104573.

6. Sun Y. [и др.]. Bunyavirales ribonucleoproteins: the viral replication and transcription machinery // Critical Reviews in Microbiology. 2018. №5 (44). C. 522-540.

7. Tipih Т., Burt F.J. Crimean-congo hemorrhagic fever virus: Advances in vaccine development // BioResearch Open Access. 2020. №1 (9). C. 137-150.

8. Tschorn N., Berg K., Stitz J. Transposon vector-mediated stable gene transfer for the accelerated establishment of recombinant mammalian cell pools allowing for high-yield production of biologies // Biotechnology Letters. 2020. №7 (42). C. 1103-1112.

9. Zhang J. [и др.]. Fine mapping epitope on glycoprotein Gc from Crimean-Congo hemorrhagic fever virus // Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases. 2019. (67). C. 24-31.

10. Куличенко A.H. [и др.]. Крымская геморрагическая лихорадка в Евразии в XXI веке: эпидемиологические аспекты // Эпидемиол. и инф. бол. Акт. вопр. 2012. (3). С. 42-53.

11. WO 2020123989, МПК А61К 39/12, опубл. 18.06.2020 г. (аналог).

12. US 9109199, МПК А61К 39/12, опубл. 18.08.2015 г. (прототип).

ПРИЛОЖЕНИЕ

--->

Перечень последовательностей

<110> Федеральное бюджетное учреждение науки «Государственный научный

центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по

надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

(ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора)

<120> Ген, кодирующий открытую рамку считывания М-сегмента ККГЛ,

и рекомбинантная конструкция, обеспечивающая экспрессию структурных

гликопротеинов вируса Крым-Конго геморрагической лихорадки

<160> 2

<210> SEQ ID NO:1

<211> 5052 п.н.

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Нуклеотидная последовательность искусственного гена, кодирующего

структурные гликопротеины вируса ККГЛ.

<400> 1

ATGCATACAC TCTTGGTGTG CTTCATTCTT TACCTACAGC TGTCGGGTTT AGGAGGAGCT 60

CATGGACAGT CAAACGCAAC TGAACACAAT GGAACAAACA CCACCACAGT ACCCGGCACA 120

AGTCAAAGCC CCAAGCCACC CGCGAGCACC ACTCTACCAC ACACACCAGA ATCCTCCACC 180

GTCAAACTCA CCACACCAAC AAGCGAAACA GAAGGCTCAG GGGAAACGAC CCCACCCCCA 240

AACACCACCC AGGGCCTGCC CCTACCAGGG ACCACACCAG AACGCTCCGC AACAACCGCC 300

ACAAGCACGT CAAGCACAGA CAACATGAAT TCCACCACAC AGGTGACCGA TAACACCCCC 360

ACATCAACAG TCAGCATAAG TCCATCCAGC AGCTCCAGCA TGCCATCCAC ATCACAAGGC 420

ATACACCATC CCGTAAGGAG TCTATTGTCA GTCTCGAGCC CTAAGACAGC AACAACACCG 480

ACACCAATGA GCCCTGGAGA GATGAGCCCG GAAACCAGCA GTCAGCACTC AGCCATGAGC 540

AGAGCGCCAA CCCTCCACAC AGCAACCCAG GTCTCCACTG AGAACACCGA CCGCAGCACA 600

CCTAGACAAT CTGAGTCCTC AGTACAGCCG GCAACCCAAA GCCCAATAAC TTCCCCAGCG 660

CAAACAATCC TTCTGATGAG TGCTGCTCCT AAAGCTATTC AGGACATGCA TCCCAGCCCA 720

ACAAACAGGT CCAAGAGGAA CCTTGAGGTG GAAATAATTT TAACTCTGTC TCAAGGTCTA 780

AAGAAATATT ACGGTAAAAT ACTGAAGCTT CTGCACCTTA CCTTGGAAGA GGATACTGAA 840

GGCCTGTTAG AATGGTGTAA GAGAAACCTT GGGTCAAATT GTGATGATGA CTTCTTTCAA 900

AAGAGAATAG AAGAATTCTT CATAACTGGT GAGGGCTACT TCAATGAAGT CCTACAATTT 960

AAAACACTAA GCACACTAAG CCCCACGGAG CCGTCTCATG TCAGGCTACC AACAGCGGAG 1020

CCCTTCAAAT CTTACTTCGC TAAGGGCTTC CTTTCAATAG ATTCGGGTTA CTTCTCTGCC 1080

AAATGTTATC CAAGATCATC CACTTCAGGG CTTCAGCTGA TCAATGTCAC CCAACACCCA 1140

GCTAGGATAG CAGAAACACC TGGACCCAAA ACAACGAGTC TGAAAACCAT CAACTGTATC 1200

AACCTAAGAG CATCAGTCTT CAAAGAACAC AGAGAAGTTG AGATCAATGT GCTTCTTCCT 1260

CAGATTGCAG TCAACCTCTC AAACTGCCAT GTTGTGATCA ACTCACATGT CTGTGATTAC 1320

TCTTTAGACA CTGACGGGCC AGTGAGGCTT CCTCGCATTC ACCATGAAGG TACTTTCATA 1380

CCAGGAACTT ATAAAATAGT GATAGACAGG AAAAATAAGC TAAATGACCG ATGCTCGCTA 1440

GTCACTAACT GTGTGATAAA GGGAAGAGAG GTTCGTAAGG GCCAATCAGT GCTGAGGCAG 1500

TACAAAACAG AAATTAAGAT AGGCAAGACA TCAACAGGCT CTAGGAAACT ACTGTCCGAA 1560

GAGCCAGGTG ACGACTGCAT ATCAAGAACT CAGCTATTGA AGACAGAAAC AGCAGAGATC 1620

CATGACGACA ACTATGGTGG TCCAGGTGAC AAAATCACTA TCTGCAATGG TTCAACCATT 1680

GTAGATCAGA GACTGGGCAG TGAACTAGGG TGTTATACCA TCAACAGGGT GAAGTCATTC 1740

AAGCTATGCG AAAACAGTGC CACAGGGAAA ACCTGTGAGA TAGACAGCAC TCCGGTCAAG 1800

TGCAGGCAAG GTTTTTGTTT GAAAATCACC CAAGAGGGAA GGGGCCACGT AAAATTATCC 1860

AGGGGCTCAG AGGTTGTTTT GGATGCTTGC GACTCGAGCT GTGAAATAAT GATACCTAAA 1920

GGCACTGGAG ATATCCTAGT AGACTGTTCA GGTGGACAGC AACATTTCTT AAAAGACAAC 1980

TTGATTGACC TAGGGTGCCC TCATATCCCG CTATTGGGTA AAATGGCCAT TTACATTTGC 2040

AGAATGTCAA ATCATCCCAG GACAACCATG GCTTTCCTCT TCTGGTTCAG TTTTGGCTAT 2100

GTGATCACCT GTATATTTTG CAAGGCTCTT TTTTATTCAT TGATAATTAT TGGGACACTA 2160

GGGAAAAAAA TCAAGCAATA TAGGGAGCTA AAACCTCAAA CTTGCACCAT ATGTGAGACA 2220

GCTCCTGTCA ATGCAATAGA TGCTGAAATG CATGACCTCA ACTGTAGTTA CAATATATGC 2280

CCTTATTGTG CATCAAGACT GACCTCTGAT GGGCTGGCTA GGCATGTGAC ACAATGCCCT 2340

AAGCGAAAGG AGAAAGTTGA GGAGACTGAA CTGTATTTGA ACCTGGAAAG AATTCCTTGG 2400

ATAGTCAGAA AGCTATTGCA AGTGTCAGAG TCCACTGGTG TGGCATTGAA ACGAAGCAGT 2460

TGGCTGATTG TGCTGCTTGT GTTACTCACA GTCTCATTGT CACCGGTCCA ATCAGCACCT 2520

GTTGGTCATG GTAAGACAAT CGAAACATAT CAGACCAGAG AGGGATTCAC AAGTATCTGT 2580

CTCTTTATGT TAGGAAGCAT CCTATTCATA GTTTCTTGCC TGGTAAAGGG GCTGGTTGAC 2640

AGTGTCAGTG ACAGCTTCTT CCCCGGCCTG TCTGTCTGTA AGACATGCTC TATTGGCAGT 2700

ATAAATGGCT TTGAAATTGA ATCGCATAAA TGCTACTGTA GTTTATTTTG CTGCCCCTAC 2760

TGTAGGCACT GCTCTGCTGA CAGAGAAATT CACCAGTTGC ACTTGAGTAT CTGCAAAAAA 2820

AGAAAAACGG GGAGCAATGT CATGCTGGCT GTCTGCAAGC GCATGTGCTT TAAGGCAACC 2880

ATAGAAGCAA GCAGAAGAGC CCTGCTCATC CGAAGCATTA TCAATACCAC TTTTGTAATG 2940

TGCATTCTAA CATTAGCAAT CTGTGTTGTT AGCACCTCTG CAGTAGAGAT GGAAGACCTT 3000

CCAGCAGGCA CTTGGGAGAG AGAGGAAGAC CTAACAAATT TCTGCCATCA GGAATGCCAG 3060

GTGACCGAGA CGGAATGCCT CTGTCCATAC GAAGCTCTTG TGCTCAGGAA ACCCCTTTTC 3120

TTAGACAGTA TAGTTAAAGG TATGAAAAAT TTGCTAAACT CAACAAGCTT AGAAACAAGC 3180

TTATCAATTG AGGCACCATG GGGAGCAATA AATGTCCAGT CAACCTTTAA ACCAACAGTA 3240

TCGACTGCAA ACATAGCACT CAGTTGGAGC TCAGTAGAGC ACAGAGGCAA CAAGATCTTG 3300

GTCACAGGCA GGTCTGAATC AATTATGAAA CTAAAGGAAA GGACAGGAGT CAGCTGGGAT 3360

CTAGGCGTAG AAGATGCCTC TGAATCCAAA TTACTTACCG TCTCTATCAT GGATTTGTCA 3420

CAAATGTATT CCCCTGTTTT TGAGTACTTA TCAGGAGATA GACAGGTTGA AGAATGGCCC 3480

AAGGCAACCT GCACAGGTGA TTGCCCAGAA AGGTGTGGCT GCACATCATC AACCTGCTTG 3540

CATAAAGAAT GGCCTCATTC AAGAAACTGG AGATGTAATC CCACTTGGTG CTGGGGAGTA 3600

GGAACCGGCT GCACATGCTG CGGAGTGGAT GTAAAAGACC TTTTTACAGA CCACATGTTT 3660

ATCAAATGGA AGGTTGAATA TATAAAAACC GAAGCCATAG TATGTGTTGA GCTCACCAGC 3720

CAAGAAAGAC AGTGCAGTCT GATTGAGGCA GGTACTAGAT TCAACTTGGG TCCTGTGACT 3780

ATCACCCTGT CTGAGCCAAG AAACATTCAG CAGAAGCTTC CCCCTGAGAT CATTACGCTG 3840

CATCCCAAAA TTGAAGAAGG CTTCTTTGAC TTGATGCATG TGCAAAAAGT GTTATCTGCA 3900

AGTACAGTGT GTAAACTGCA GAGTTGCACA CATGGTATAC CAGGAGACCT ACAAATTTAC 3960

CACATTGGCA ACTTGTTGAA AGGGGATAGA GTAAACGGCC ATCTAATTCA CAAAATTGAA 4020

CCACATTTTA ACACCTCTTG GATGTCCTGG GATGGTTGTG ACCTAGACTA CTATTGCAAC 4080

ATGGGGGATT GGCCTTCTTG CACATACACA GGAGTGACCC AACATAATCA TGCTGCATTT 4140

GTAAACTTGC TTAACATTGA AACTGATTAC ACGAAAACCT TCCACTTCCA CTCTAAAAGA 4200

GTCACAGCAC ATGGAGACAC ACCACAATTA GACTTAAAAG CAAGGCCGAC CTACGGTGCA 4260

GGTGAGATCA CTGTGCTGGT TGAGGTTGCT GACATGGAGT TGCATACCAA AAAAGTTGAG 4320

ATATCAGGCT TGAAATTTGC AAGTCTGACT TGTACGGGTT GCTATGCTTG TAGCTCTGGC 4380

ATCTCCTGTA AAGTCAGAAT TCATGTAGAT GAACCAGATG AGCTCACAGT GCATGTAAAG 4440

AGCAGTGATC CAGATGTGGT TGCAGCTAGC ACAAGCCTTA TGGCAAGGAA GCTTGAATTT 4500

GGGACAGATA GCACATTCAA GGCATTTTCA GCTATGCCCA AAACCTCTTT ATGCTTTTAC 4560

ATTGTGGAGA GGGAATACTG CAAGAGCTGC AGTGAAGATG ATACAAAAAA ATGTGTTGAC 4620

ACAAAACTTG AGCAGCCACA GAGCATACTA ATTGAGCACA AAGGGACGAT AATTGGAAAG 4680

CAGAATGATA CTTGCACAGC CAAGGCAAGT TGTTGGCTAG AGTCAGTAAA GAGTTTTTTT 4740

TATGGATTGA AGAATATGCT TGGCAGTGTT TTTGGTAGTT TTTTCGTAGG CATTTTGTTA 4800

TTCCTTGCCC CTTTCGTCTT GTTGGTGCTT TTCTTTATGT TTGGATGGAA AATCTTGTTT 4860

TGCTTTAAAT GTTGCAGGAG GACCAGAGGC TTGTTTAAGT ATAGACACCT CAAAGATGAC 4920

GAGGAAACAG GCTACAGAAG GATTATTGAA AGACTGAACA GCAAAAAAGG AAAAAACAGA 4980

CTGCTTGATG GTGAGAGGTT GGCTGATAGG AAAATTGCTG AGCTGTTCTC TACAAAAACA 5040

CACATTGGCT AA 5052

<210> SEQ ID NO:2

<211> 1683 а.к.о.

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Аминокислотная последовательность структурных гликопротеинов

вируса ККГЛ

<400> 2

MHTLLVCFIL YLQLSGLGGA HGQSNATEHN GTNTTTVPGT SQSPKPPAST TLPHTPESST 60

VKLTTPTSET EGSGETTPPP NTTQGLPLPG TTPERSATTA TSTSSTDNMN STTQVTDNTP 120

TSTVSISPSS SSSMPSTSQG IHHPVRSLLS VSSPKTATTP TPMSPGEMSP ETSSQHSAMS 180

RAPTLHTATQ VSTENTDRST PRQSESSVQP ATQSPITSPA QTILLMSAAP KAIQDMHPSP 240

TNRSKRNLEV EIILTLSQGL KKYYGKILKL LHLTLEEDTE GLLEWCKRNL GSNCDDDFFQ 300

KRIEEFFITG EGYFNEVLQF KTLSTLSPTE PSHVRLPTAE PFKSYFAKGF LSIDSGYFSA 360

KCYPRSSTSG LQLINVTQHP ARIAETPGPK TTSLKTINCI NLRASVFKEH REVEINVLLP 420

QIAVNLSNCH VVINSHVCDY SLDTDGPVRL PRIHHEGTFI PGTYKIVIDR KNKLNDRCSL 480

VTNCVIKGRE VRKGQSVLRQ YKTEIKIGKT STGSRKLLSE EPGDDCISRT QLLKTETAEI 540

HDDNYGGPGD KITICNGSTI VDQRLGSELG CYTINRVKSF KLCENSATGK TCEIDSTPVK 600

CRQGFCLKIT QEGRGHVKLS RGSEVVLDAC DSSCEIMIPK GTGDILVDCS GGQQHFLKDN 660

LIDLGCPHIP LLGKMAIYIC RMSNHPRTTM AFLFWFSFGY VITCIFCKAL FYSLIIIGTL 720

GKKIKQYREL KPQTCTICET APVNAIDAEM HDLNCSYNIC PYCASRLTSD GLARHVTQCP 780

KRKEKVEETE LYLNLERIPW IVRKLLQVSE STGVALKRSS WLIVLLVLLT VSLSPVQSAP 840

VGHGKTIETY QTREGFTSIC LFMLGSILFI VSCLVKGLVD SVSDSFFPGL SVCKTCSIGS 900

INGFEIESHK CYCSLFCCPY CRHCSADREI HQLHLSICKK RKTGSNVMLA VCKRMCFKAT 960

IEASRRALLI RSIINTTFVM CILTLAICVV STSAVEMEDL PAGTWEREED LTNFCHQECQ 1020

VTETECLCPY EALVLRKPLF LDSIVKGMKN LLNSTSLETS LSIEAPWGAI NVQSTFKPTV 1080

STANIALSWS SVEHRGNKIL VTGRSESIMK LKERTGVSWD LGVEDASESK LLTVSIMDLS 1140

QMYSPVFEYL SGDRQVEEWP KATCTGDCPE RCGCTSSTCL HKEWPHSRNW RCNPTWCWGV 1200

GTGCTCCGVD VKDLFTDHMF IKWKVEYIKT EAIVCVELTS QERQCSLIEA GTRFNLGPVT 1260

ITLSEPRNIQ QKLPPEIITL HPKIEEGFFD LMHVQKVLSA STVCKLQSCT HGIPGDLQIY 1320

HIGNLLKGDR VNGHLIHKIE PHFNTSWMSW DGCDLDYYCN MGDWPSCTYT GVTQHNHAAF 1380

VNLLNIETDY TKTFHFHSKR VTAHGDTPQL DLKARPTYGA GEITVLVEVA DMELHTKKVE 1440

ISGLKFASLT CTGCYACSSG ISCKVRIHVD EPDELTVHVK SSDPDVVAAS TSLMARKLEF 1500

GTDSTFKAFS AMPKTSLCFY IVEREYCKSC SEDDTKKCVD TKLEQPQSIL IEHKGTIIGK 1560

QNDTCTAKAS CWLESVKSFF YGLKNMLGSV FGSFFVGILL FLAPFVLLVL FFMFGWKILF 1620

CFKCCRRTRG LFKYRHLKDD EETGYRRIIE RLNSKKGKNR LLDGERLADR KIAELFSTKT 1680

HIG* 1683

<---

1. Ген, кодирующий структурные гликопротеины вируса ККГЛ, имеющий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1 длиной 5052 п.н.

2. Рекомбинантная плазмида pSB3delta-GPC, предназначенная для интеграции и экспрессии гена структурных гликопротеинов вируса ККГЛ в клетках млекопитающих, имеет размер 11495 п.н. и содержит в соответствии с физической и генетической картой, представленной на Фиг. 4, целевой ген по п. 1, кодирующий белок-предшественник, представляющий собой открытую рамку считывания М-сегмента вируса ККГЛ, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2 длиной 1683 а.к.о., и состоит из следующих элементов:

• ген β-лактамазы (координаты с 10442 по 11303 п.н.) под контролем промотора (координаты с 11304 по 11409 п.н.), в качестве генетического маркера, определяющего устойчивость к ампициллину клеток бактерии Е. coli;

• точка начала репликации ori плазмидного вектора pUC (координаты с 9683 по 10272 п.н.);

• 5'-ITR и 3'-ITR инвертированные повторы, имеющие координаты с 17 по 241 п.н. и с 9215 по 9439 п.н. соответственно, обеспечивают интеграцию участка плазмиды, заключенного между ними, в геном клеток млекопитающих при помощи транспозазы Sleeping Beauty (SB);

• промотор и энхансер CMV - обеспечивает экспрессию гена по п. 1 в клетках млекопитающих (координаты с 855 по 1438 п.н.);

• chimeric intron - химерный интрон, обеспечивающий эффективную транскрипцию, стабильность и транспорт транскрипта из ядра клетки (координаты с 1574 по 1706 п.н.);

• Т7 promoter - нуклеотидная последовательность промотора бактериофага Т7, необходимая для in vitro транскрипции (координаты с 1751 по 1769 п.н.);

• Glycoprotein precursor - открытая рамка считывания гена, кодирующего структурные гликопротеины вируса ККГЛ по п. 1 (координаты с 1783 по 6834 п.н.);

• IRES2 - внутренний сайт посадки рибосом вируса энцефаломиелита, обеспечивающий экспрессию гена устойчивости к пуромицину (координаты с 6879 по 7465 п.н.);

• PuroR - ген устойчивости к пуромицину, кодирующий N-ацетил трансферазу (координаты с 7466 по 8068 п.н.);

• bGH poly (A) signal - сигнал полиаденелирования (координаты с 8099 по 8323 п.н.).