Флюидная кассета для тестирования
Изобретения относятся к интегрированному устройству идентификации нуклеиновых кислот. Предлагается кассета для обнаружения нуклеиновой кислоты, при этом кассета содержит по меньшей мере одну реакционную камеру; при этом, когда указанная кассета ориентирована вертикально, верхняя часть указанной реакционной камеры содержит впускное отверстие и выступ, проходящий вниз в указанную реакционную камеру для минимизирования или предотвращения капиллярного потока жидкости через верхнюю часть указанной реакционной камеры, при этом первая сторона указанного выступа проходит, по существу, вертикально рядом с указанным впускным отверстием, и причем вторая сторона указанного выступа проходит вверх по направлению к указанной верхней части указанной реакционной камеры под углом менее чем 60 градусов от вертикали. 9 з.п. ф-лы, 48 ил.
ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
Настоящая заявка заявляет приоритет и преимущество на основании подачи предварительной заявки на патент США № 62/488453, озаглавленной «Fluidic Test Cassette», поданной 21 апреля 2017 года, описание и формула которой включены в настоящий документ посредством ссылки.
ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Область техники изобретения (Область техники)
Варианты осуществления настоящего изобретения относятся к интегрированному устройству и связанным с ним способам обнаружения и идентификации нуклеиновых кислот. Устройство может быть полностью одноразовым или может содержать одноразовую часть и повторно используемую часть.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Следует обратить внимание на то обстоятельство, что последующее обсуждение может относиться к ряду публикаций и ссылок. Обсуждение таких публикаций в данном документе дается для более полного представления научных принципов и не должно рассматриваться как признание того, что такие публикации являются предшествующим уровнем техники для целей определения патентоспособности.
В связи с тем, что влияние на здравоохранение и информированность об инфекционных и возникающих новых болезнях, представляющих биоугрозу веществах, генетических болезнях и резервуарах болезнетворных микроорганизмов в окружающей среде возросло, необходимость в более информативных, чувствительных и специфических быстрых анализах в местах использования увеличила спрос на средства на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР). Молекулярные тестирования на основе нуклеиновых кислот с использованием таких способов, как амплификация на основе ПЦР, являются чрезвычайно чувствительными, специфичными и информативными. К сожалению, доступные в настоящее время тесты на нуклеиновые кислоты являются неприменимыми или имеют ограниченную практичность для использования в полевых условиях, поскольку они требуют сложного и дорогостоящего оборудования, специализированных лабораторных материалов и/или многочисленных манипуляций, зависящих от вмешательства пользователя. В связи с этим, большинство образцов для молекулярного тестирования отправляются в централизованные лаборатории, что приводит к длительным срокам обработки для получения необходимой информации.
Чтобы удовлетворить потребность в быстром молекулярном тестировании в месте использования, предыдущие усилия были сосредоточены на разработке изделий с использованием одноразового картриджа и относительно дорогого сопутствующего инструмента.
Использование внешних инструментов для обеспечения движения жидкости, контроля температуры амплификации и обнаружения упрощает многие инженерные задачи, изначально присущие интеграции нескольких процессов, которые необходимы для молекулярного тестирования. К сожалению, зависимость от сложного инструментария создает огромные экономические барьеры для небольших клиник, местных и государственных органов власти и правоохранительных органов. Кроме того, зависимость от небольшого количества инструментов для проведения тестов может привести к ненужным задержкам в периоды повышенной потребности, как это происходит во время предполагаемого выделения веществ при применении биологического оружия или при возникновении эпидемии. Действительно, модель инструмента и одноразового картриджа с реагентами представляет собой потенциально существенное узкое место в тех случаях, когда при внезапной вспышке заболевания требуется увеличение объема и увеличение скорости обработки материала. Кроме того, зависимость от инструмента усложняет конкретно обусловленное распределение устройств для тестирования в местах развертывания, где логистические ограничения не позволяют транспортировать громоздкое связанное оборудование или отсутствуют требования к инфраструктуре (например, надежные источники питания).
Гравитация была описана как средство движения жидкости в существующих микрофлюидных устройствах.
Тем не менее, стандартное устройство не обеспечивает возможность программируемого или электронного управления таким движением жидкости, или возможность смешивания более двух жидкостей. Кроме того, в некоторых устройствах используется падение давления, создаваемое убывающей инертной или предварительно заправленной жидкостью, для создания небольшого вакуума и подачи реагентов в камеры обработки при вертикальной ориентации, что увеличивает сложность хранения и транспортировки для обеспечения стабильности предварительно заправленных жидкостей. Для существующих устройств, в которых демонстрируется перемещение жидкости посредством множества отдельных этапов, требуются хрупкие уплотнения или клапаны между камерами, что усложняет процесс и изготовление. В таких устройствах не используются отдельные, удаленно расположенные вентиляционные отверстия для каждой камеры.
Традиционные микрофлюидные устройства используют меньшие реакционные объемы, чем те, которые используются в стандартных лабораторных процедурах. ПЦР или другие реакции амплификации нуклеиновых кислот, такие как петлевая амплификация (LAMP), амплификация, основанная на последовательности нуклеиновых кислот (NASBA) и другие изотермические и термоциклические способы, как правило проводятся в исследовательских лабораториях и лабораториях для проведения анализов с использованием реакционных объемов от 5 до 100 микролитров. Эти реакционные объемы соответствуют объемам тестируемых образцов, достаточным для обеспечения обнаружения в малых количествах целевых параметров анализа в разбавленных образцах. Микрофлюидные системы, которые уменьшают реакционные объемы по сравнению с теми, которые используются в традиционных лабораторных молекулярных тестированиях, также обязательно уменьшают объем образца, который может быть добавлен в реакцию. Результатом меньшего реакционного объема является уменьшение способности вместить достаточный объем образца для того, чтобы обеспечить присутствие обнаруживаемых количеств определяемого параметра в разбавленных образцах или там, где количество определяемого параметра анализа является недостаточным.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Данное изобретение представляет собой кассету для обнаружения определяемой нуклеиновой кислоты, при этом данная кассета содержит множество камер, множество вентиляционных карманов, соединенных с камерами, и термолабильный материал для герметизации одного или более вентиляционных карманов, причем по меньшей мере один из вентиляционных карманов содержит выступ. Выступ предпочтительно содержит выемку или неровность и предпочтительно в достаточной степени предотвращает прикрепление расплавленного термолабильного материала к термостойкому материалу, расположенному рядом с термолабильным материалом, для предотвращения повторной герметизации вентиляционного кармана после разрыва термолабильного материала.
Данное изобретение также представляет собой кассету для обнаружения определяемой нуклеиновой кислоты, при этом данная кассета содержит множество камер, множество вентиляционных карманов, соединенных с камерами, термолабильный материал для герметизации одного или более из вентиляционных карманов, термостойкий материал и прокладку, расположенную между термолабильным материалом и термостойким материалом, причем прокладка содержит отверстие, охватывающее множество вентиляционных карманов. Прокладка предпочтительно является достаточно толстой, чтобы обеспечить достаточный объем воздуха для уравновешивания давлений и обеспечения свободного перемещения воздуха между открытыми вентиляционными карманами. Кассета предпочтительно содержит гибкую плату, при этом гибкая плата содержит структурированные металлические электрические компоненты, расположенные на термостойком материале. Прокладка предпочтительно содержит второе отверстие или имеет ограниченный размер, в результате чего гибкая плата будет находиться в прямом контакте с жидкостью по меньшей мере в одной из камер. Электрические компоненты предпочтительно содержат резистивные нагревательные элементы или токопроводящие дорожки. Резистивные нагревательные элементы предпочтительно совмещены с вентиляционными карманами и камерами. Кассета предпочтительно содержит один или более датчиков температуры окружающей среды для регулировки температуры нагрева, времени нагрева и/или скорости нагрева одной или более камер.
Настоящее изобретение также представляет собой кассету для обнаружения определяемой нуклеиновой кислоты, при этом кассета содержит вертикально ориентированную камеру обнаружения, тест–полоску для анализа (методом латеральной диффузии), расположенную в камере обнаружения, ориентированную таким образом, что тест–зона для приема образца тест–полоски для анализа находится на нижнем конце тест–полоски для анализа, а пространство в камере обнаружения ниже тест–полоски для анализа (методом латеральной диффузии) для приема жидкости, содержащей амплифицированные определяемые нуклеиновые кислоты, при этом пространство имеет достаточную вместимость для размещения всего объема жидкости на высоте, что позволяет жидкости течь вверх по тест–полоске для анализа посредством капиллярного эффекта без поступления избыточного количества или обхода иным способом областей тест–полоски для анализа. Пространство предпочтительно содержит детектирующие частицы, такие как красящие полистирольные микросферы, латекс, коллоидное золото, коллоидная целлюлоза, нанозолото или полупроводниковые нанокристаллы. Детектирующие частицы предпочтительно содержат олигонуклеотиды, комплементарные последовательности амплифицированных определяемых нуклеиновых кислот или лигандов, такие как биотин, стрептавидин, гаптен или антитело, способные связываться с амплифицированными определяемыми нуклеиновыми кислотами. Детектирующие частицы предпочтительно были высушены, лиофилизированы или присутствовали по меньшей мере на части внутренней поверхности в виде высушенной смеси детектирующих частиц в носителе, таком как полисахарид, детергент или белок, для облегчения ресуспендирования детектирующих частиц. Капиллярный пул жидкости предпочтительно образуется в пространстве, обеспечивая улучшенное смешивание и диспергирование детектирующих частиц для того, чтобы облегчить смешивание детектирующих частиц с амплифицированной определяемой нуклеиновой кислотой. Кассета при необходимости выполняет анализ, имеющий объем менее чем около 200 мкл и предпочтительно менее чем около 60 мкл.
Данное изобретение также представляет собой кассету для обнаружения определяемой нуклеиновой кислоты, при этом указанная кассета содержит одно или более углублений для содержания по меньшей мере одного лиофилизированного или высушенного реагента, причем по меньшей мере одно из углублений содержит одну или более конструкций для направления жидкостей для облегчения регидратации по меньшей мере одного высушенного или лиофилизированного реагента, при этом углубления расположены в одной или более камерах обнаружения, или в одном или более каналах, соединенных с камерами обнаружения. Конструкции предпочтительно содержат гребни, канавки, выемки или их комбинации.
Настоящее изобретение также представляет собой кассету для обнаружения определяемой нуклеиновой кислоты, при этом кассета содержит по меньшей мере одну камеру, содержащую элемент для предотвращения перетекания жидкости, вертикально попадающей в верхнюю часть камеры, непосредственно в выходное отверстие камеры. Элемент предпочтительно отклоняет жидкость в сторону камеры, которая является противоположной выпускному отверстию. Полученный в результате путь потока жидкости предпочтительно содержит горизонтальный компонент, таким образом, достаточно увеличивая эффективную длину пути потока и достаточно уменьшая скорость потока жидкости для того, чтобы ограничить количество жидкости, которая выходит из выпускного отверстия.
Эта конструктивная особенность предпочтительно создает завихрение жидкости внутри камеры, тем самым увеличивая смешивание реагентов внутри жидкости. Элемент предпочтительно имеет треугольную или трапециевидную форму. Выпускное отверстие при необходимости может быть конусообразным. Канал расположен по ходу движения среды после выпускного отверстия и при необходимости содержит витки для увеличения эффективной длины канала. Элемент предпочтительно расположен вблизи или на дне камеры или около середины камеры.
Данное изобретение также представляет способ управления вертикальным потоком жидкости через камеру в кассете для обнаружения определяемой нуклеиновой кислоты, при этом способ включает отклонение потока жидкости, попадающего в верхнюю часть камеры, тем самым предотвращая перетекание жидкости непосредственно в выходное отверстие камеры. Способ предпочтительно включает уменьшение скорости потока жидкости, благодаря чему уменьшается расстояние, которое жидкость проходит по каналу, соединенному с выпускным отверстием до того, как жидкость остановится. Способ предпочтительно включает разделение потока жидкости внутри камеры на первый поток жидкости, который контактирует со стенкой камеры и направлен вверх, и второй поток жидкости, который входит в выходное отверстие. Первый поток жидкости предпочтительно завихряется в камере, тем самым увеличивая смешивание реагентов внутри жидкости. Второй поток жидкости предпочтительно образует серповидную форму и проходит через канал, соединенный с выпускным отверстием, при этом серповидная форма увеличивает давление в закрытом воздушном пространстве в канале по ходу движения жидкости, пока давление не остановит поток жидкости в канале. Выпускное отверстие при необходимости может быть конусообразным, что увеличивает объем сжимаемого воздуха на входе в выпускное отверстие. Способ при необходимости включает обеспечение витков в канале, соединенном с выходом, тем самым увеличивая эффективную длину пути канала и уменьшая скорость потока жидкости в канале.
Данное изобретение также представляет кассету для обнаружения нуклеиновой кислоты, при этом кассета содержит по меньшей мере одну реакционную камеру, в которой, когда кассета ориентирована вертикально, верхняя часть реакционной камеры содержит впускное отверстие и выступ, проходящий вниз внутрь реакционной камеры для того, чтобы минимизировать или предотвратить поток капиллярной жидкости через указанную верхнюю часть реакционной камеры. Выступ предпочтительно имеет, как правило, треугольную форму. Первая сторона выступа предпочтительно проходит по существу вертикально рядом с впускным отверстием. Вторая сторона выступа предпочтительно проходит вверх к верхней части реакционной камеры под углом менее чем около 60 градусов от вертикали, более предпочтительно менее чем около 45 градусов от вертикали, еще более предпочтительно менее чем около 30 градусов от вертикали и, при необходимости, вертикально. Кассета предпочтительно содержит углубление для содержания по меньшей мере одного лиофилизированного или высушенного реагента, при этом углубление расположено в канале, соединенном с впускным отверстием в реакционную камеру. Выступ предпочтительно уменьшает или предотвращает удаление вновь ресуспендированного реагента из объема реакционного раствора. Углубление предпочтительно содержит одну или более конструкций для направления жидкостей с целью облегчения регидратации по меньшей мере одного высушенного или лиофилизированного реагента. Конструкции предпочтительно содержат гребни, канавки, выемки или их комбинации. В качестве альтернативы или в дополнение, реакционная камера содержит углубление для содержания по меньшей мере одного лиофилизированного или высушенного реагента.
Цели, преимущества и новые отличительные признаки, а также дополнительный объем применимости данного изобретения будут частично изложены в последующем подробном описании, взятом вместе с прилагаемыми графическими материалами, и частично станут очевидными для специалистов в данной области техники после изучения нижеизложенного или могут быть изучены при практическом применении изобретения. Цели и преимущества изобретения могут быть реализованы и достигнуты с помощью средств и комбинаций, конкретно указанных в прилагаемой формуле изобретения.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
Прилагаемые графические материалы, которые включены в описание и составляют его часть, иллюстрируют варианты осуществления данного изобретения и вместе с описанием служат для объяснения принципов изобретения. Графические материалы предназначены только для иллюстрации определенных вариантов осуществления изобретения и не должны рассматриваться как ограничивающие изобретение. На графических материалах:
На Фиг. 1А представлен чертеж, иллюстрирующий вариант осуществления изобретения кассеты для тестирования в соответствии с настоящим изобретением.
На Фиг. 1B представлен вид с пространственным разделением деталей одного варианта осуществления изобретения кассеты для тестирования, показывающий скользящее уплотнение, отверстие для образца, чашку для образца и внутреннюю область расширительной камеры.
На Фиг. 2A представлена флюидная сеть в одном варианте осуществления изобретения кассеты для тестирования согласно данному изобретению.
На Фиг. 2B–2C проиллюстрированы схематические представления до и после открытия вентиляционного отверстия, соответственно, того, как термоинициируемый вентиляционный клапан может использоваться для вентиляции в расширительной камере для осуществления управления потоком жидкости в условиях герметически закрытой кассеты для тестирования.
На Фиг. 2D представлен чертеж одного варианта осуществления изобретения одноразовой кассеты для тестирования, иллюстрирующий размещение печатной платы в сборе (PCA), содержащей резистивные нагревательные элементы и датчики температуры.
На Фиг. 2E представлена фотография пластиковой кассеты для тестирования, отлитой под давлением, которая содержит элементы, описанные на Фиг. 2A.
На Фиг. 3A представлен принцип работы варианта осуществления изобретения расширительной камеры.
На Фиг. 3B представлено поперечное сечение поршневой расширительной камеры до расширения газа в кассете для тестирования.
На Фиг. 3C представлено поперечное сечение поршневой расширительной камеры после расширения газа внутри кассеты для тестирования.
На Фиг. 4А представлена иллюстрация подхода к формированию расширительной камеры, в которой расширяемый резервуар используется для обеспечения расширяющегося внутреннего объема.
На Фиг. 4B представлено поперечное сечение расширительной камеры на основе резервуара до расширения газа внутри кассеты для тестирования.
На Фиг. 4C представлено поперечное сечение расширительной камеры на основе резервуара после расширения газа внутри кассеты для тестирования.
На Фиг. 5А представлена иллюстрация подхода к формированию расширительной камеры, в которой расширяемый сильфон используется для обеспечения расширяющегося внутреннего объема.
На Фиг. 5B представлено поперечное сечение сильфонной расширительной камеры до расширения газа внутри кассеты для тестирования.
На Фиг. 5С представлено поперечное сечение сильфонной расширительной камеры после расширения газа внутри кассеты для тестирования.
На Фиг. 6А проиллюстрировано использование полупроницаемого барьера, мембраны или материала, который позволяет газу свободно проходить, в то время как частицы, такие как бактерии, вирусы или большие молекулы, такие как ДНК или РНК, удерживаются внутри устройства.
На Фиг. 6B представлено поперечное сечение полупроницаемого барьера, используемого вместо расширительной камеры для уравновешивания внутренних давлений с давлениями окружающей среды или для снижения внутреннего давления.
На Фиг. 7 представлен вид с пространственным разделением деталей конструкции кассеты для тестирования, в которой расширительная камера образована распоркой между слоем пленки из биаксиально ориентированного полистирола (BOPS).
На Фиг. 8А представлен чертеж варианта осуществления изобретения гибкой платы, содержащей резистивные нагревательные элементы для двух жидкостных камер, камеры с тест–полоской для анализа и три вентиляционных отверстия, и электрические контактные площадки.
На Фиг. 8В представлен вариант осуществления изобретения гибкой платы, содержащей резистивные нагревательные элементы для двух жидкостных камер, камеры с тест–полоской для анализа и три вентиляционных отверстия, и электрические контактные площадки для питания резистивных нагревательных элементов.
На Фиг. 8С проиллюстрирован вид с пространственным разделением деталей варианта осуществления изобретения кассеты для тестирования. На Фиг. 8D представлен вид собранной кассеты для тестирования, изображенной на Фиг. 8С.
На Фиг. 9 изображены полоски (с технологией латеральной диффузии) от устройств с капиллярным пулом и без него на тест–зоне для приема образца тест–полоски. При наличии капиллярного пула наблюдается более равномерное распределение детектирующих частиц и более равномерный сигнал по тест–полоске.
На Фиг. 10 представлена схема, иллюстрирующая иерархический подход к разделению образцов.
На Фиг. 11 представлена иллюстрация многоканальной флюидной сети для мультиплексирования и разделения образца, показывающая путь потока жидкости для каждого теста. Дополнительные пути жидкости или каналы могут быть включены в сеть для дополнительного увеличения числа параллельных тестов, которые могут выполняться одновременно в одной одноразовой кассете для тестирования.
На Фиг. 12 проиллюстрировано представление флюидной сети в одном варианте осуществления изобретения кассеты для тестирования согласно изобретению, в которой образец разделяется после введения в чашку для образца через отверстие для образца, чтобы обеспечить возможность проведения параллельных независимых тестов для одного и того же входного образца. Раздваивающийся путь жидкости из чашки для образца позволяет разделить раствор образца и направить в два отдельных флюидных канала или пути кассеты для тестирования для того, чтобы обеспечить возможность одновременного проведения тестов параллельно на разделенном образце.
На Фиг. 13А представлен чертеж собранной подсистемы подготовки образца, показывающий расположение внутренних компонентов.
На Фиг. 13B представлен вид с пространственным разделением деталей подсистемы подготовки образца, показывающий компоненты устройства для очистки нуклеиновых кислот, сконфигурированного для встраивания в кассету для тестирования.
На Фиг. 14 представлено поперечное сечение подсистемы подготовки образца, иллюстрирующее перемещения компонентов, происходящие в процессе обработки образца.
На Фиг. 15 представлен вид с пространственным разделением деталей, показывающий подсистему подготовки образца с компонентами герметичного уплотнения, отлитой под давлением флюидной подсистемой, соответствующей подложкой кассеты и печатной платой в сборе (PCA).
На Фиг. 16 представлена фотография варианта осуществления изобретения кассеты для тестирования с интегрированной подсистемой подготовки образца.
На Фиг. 17А представлен вид с пространственным разделением деталей, показывающий подсистему подготовки образца с компонентами герметичного уплотнения и конструкцией отлитой под давлением флюидной подсистемы.
На Фиг. 17B представлен чертеж варианта осуществления изобретения кассеты для тестирования с показанной интегрированной подсистемой подготовки образца, сопряженной с печатной платой в сборе (PCA).
На Фиг. 17С представлен чертеж в частичном разрезе варианта осуществления изобретения кассеты для тестирования, изображающий пути жидкости, сопряженную электронику и компоненты для подготовки образца.
На Фиг. 18А представлен чертеж, иллюстрирующий вариант осуществления изобретения стыковочного узла в соответствии с настоящим изобретением, показанного с крышкой в открытом положении и вставленной кассетой для тестирования.
На Фиг. 18В представлен чертеж стыковочного узла, показанного с крышкой в закрытом положении.
На Фиг. 19 представлена фотография одного варианта осуществления стыковочного узла, показанного с крышкой в открытом положении и вставленной кассетой для тестирования. ЖК–дисплей показывает обнаружение введения тест–кассеты для гриппа A/В.
На Фиг. 20 проиллюстрирован вариант осуществления изобретения механизма герметизации кассеты в соответствии с настоящим изобретением. На Фиг. 21А представлен чертеж расположения датчика герметичности кассеты внутри стыковочного узла с вставленной кассетой с уплотнением в открытом положении.
На Фиг. 21В представлен чертеж с частичным разрезом расположения датчика герметичности кассеты внутри стыковочного узла с вставленной кассетой с уплотнением в открытом положении.
На Фиг. 21С представлен чертеж расположения датчика герметичности кассеты внутри стыковочного узла с вставленной кассетой с уплотнением в закрытом положении.
На Фиг. 21D представлен чертеж с частичным разрезом расположения датчика герметичности кассеты внутри стыковочного узла с вставленной кассетой с уплотнением в закрытом положении.
На Фиг. 22 представлен чертеж варианта осуществления изобретения механизма герметизации кассеты, в котором используется приводной механизм для обеспечения закрытия уплотнения с использованием вращающегося клапана.
На Фиг. 23А представлен чертеж, иллюстрирующий вариант осуществления изобретения кассеты для тестирования, в котором крышка представляет собой откидную крышку, содержащую кольцевое уплотнение и объем свободного воздуха, который служит в качестве расширительной камеры. На этом чертеже крышка находится в открытом положении.
На Фиг. 23В представлен чертеж, иллюстрирующий крышку в закрытом положении, где уплотнительное кольцо образует герметичное уплотнение с ободом отверстия для образца.
На Фиг. 24А представлен вид с пространственным разделением деталей платы нагревателя и компонентов держателя кассеты для тестирования стыковочного узла, образующих принимающий подузел кассеты для тестирования.
На Фиг. 24В представлен чертеж, иллюстрирующий вариант осуществления изобретения принимающего подузла кассеты для тестирования стыковочного узла.
На Фиг. 25 представлен вид скользящей части держателя кассеты для тестирования и системы крепления платы нагревателя в сцепленных и расцепленных положениях.
На Фиг. 26 представлен чертеж, иллюстрирующий размещение инфракрасных датчиков температуры в одном варианте осуществления изобретения стыковочного узла для контроля температуры первой и второй нагретых жидкостных камер.
На Фиг. 27А представлен чертеж, иллюстрирующий размещение оптического датчика в варианте осуществления изобретения стыковочного узла для считывания штрих–кода, расположенного в нижней части кассеты для тестирования.
На Фиг. 27В представлена деталь, изображенная на Фиг. 27A.
На Фиг. 28A и 28B представлены вид с пространственным разделением деталей и вид сборе, соответственно, конфигурации с двойной нагревательной платой, в которой кассета для тестирования расположена между двумя сборками нагревательной платы.
На Фиг. 29A и 29B представлены графические материалы варианта осуществления изобретения стыковочного узла (проиллюстрированного как трехмерная сплошная модель, и как прозрачный, соответственно), в котором поворотная дверца используется для приема кассеты для тестирования. Закрытие поворотной дверцы приводит к контакту задней части кассеты для тестирования с платой нагревателя, установленной внутри стыковочного узла.
На Фиг. 30A и 30B представлены виды спереди и сбоку в частичном разрезе, соответственно, внутренних компонентов стыковочного узла, содержащего серводвигатели для приведения в действие подготовки образца и оптическую систему для сбора результатов тестов.
На Фиг. 31A и 31B представлены фотографии с видом спереди и сбоку оптической подсистемы для варианта осуществления изобретения стыковочного узла, который содержит тестовый ридер.
На Фиг. 32А и 32В представлены фотографии варианта осуществления изобретения стыковочного узла с поворотной дверцей для приема кассеты для тестирования в открытом и закрытом положениях, соответственно.
На Фиг. 33 проиллюстрирован повторно используемый узел для стыковочного узла в соответствии с настоящим изобретением. На Фиг. 34 показаны результаты тестов, полученные в Примере 1, описанном в данном документе.
На Фиг. 35 показаны результаты тестов, полученные в Примере 2, описанном в данном документе.
На Фиг. 36 показаны результаты тестов, полученные в Примере 3, описанном в данном документе.
На Фиг. 37А представлен вид в перспективе кассеты, содержащей три камеры. На Фиг. 37B представлен вид с пространственным разделением деталей кассеты, проиллюстрированной на Фиг. 37A.
На Фиг. 38 представлен вид кассеты, (изображенной как прозрачная) проиллюстрированной на Фиг. 37А, показывающий флюидные конструктивные особенности.
На Фиг. 39 проиллюстрирован вариант осуществления изобретения камеры, в соответствии с настоящим изобретением, содержащей треугольный выступающий конструктивный элемент для потока и конусное выпускное отверстие.
На Фиг. 40 проиллюстрирован вариант осуществления изобретения камеры, в соответствии с настоящим изобретением, содержащей треугольный выступающий конструктивный элемент для потока и параллельное выпускное отверстие.
На Фиг. 41 проиллюстрирован вариант осуществления изобретения камеры, в соответствии с настоящим изобретением, содержащей трапециевидный выступающий конструктивный элемент для потока и параллельное выпускное отверстие.
На Фиг. 42 проиллюстрирован вариант осуществления изобретения камеры, в соответствии с настоящим изобретением, содержащей расположенные друг над другом треугольные конструктивные элементы для потока и параллельное выпускное отверстие.
На Фиг. 43 проиллюстрирован вариант осуществления изобретения камеры в соответствии с настоящим изобретением, содержащей выступающий конструктивный элемент для потока примерно в середине камеры.
На Фиг. 44 проиллюстрировано углубление для реагента, содержащее внутренние конструктивные элементы для направления потока жидкости.
На Фиг. 45 проиллюстрирован вариант осуществления изобретения вентиляционного кармана в соответствии с настоящим изобретением, содержащего деталь с выемкой.
На Фиг. 46А представлен чертеж варианта осуществления изобретения флюидного слоя кассеты в соответствии с настоящим изобретением, содержащего углубления для лиофилизированного реагента, расположенные в путях потока жидкости. На Фиг. 46В проиллюстрирован увеличенный вид углубления и реакционной камеры, показывающий вертикальный выступ, проходящий в камеру.
На Фиг. 47А представлен чертеж варианта осуществления изобретения флюидного слоя кассеты в соответствии с настоящим изобретением, содержащего углубления для лиофилизированного реагента, расположенные в одной или более реакционных камерах. На Фиг. 47В проиллюстрирован увеличенный вид углубления в реакционной камере, показывающий вертикальный выступ, проходящий в камеру.
На Фиг. 48 проиллюстрирована реакционная камера без вертикального выступа.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Вариант осуществления данного изобретения представляет собой герметичную одноразовую платформу для обнаружения определяемой нуклеиновой кислоты, при этом одноразовая платформа предпочтительно содержит камеру для образца, предназначенную для приема образца, содержащего определяемую нуклеиновую кислоту, камеру амплификации, соединенную через первый канал с камерой для образца и соединенную через второй канал с первым вентиляционным карманом, камеру для мечения, соединенную через третий канал с камерой амплификации и соединенную через четвертый канал со вторым вентиляционным карманом, подсистему обнаружения, соединенную с камерой для мечения через пятый канал и соединенную через шестой канал с третьим вентиляционным карманом, множество резистивных нагревательных элементов и одно или более устройств для измерения температуры, при этом каждый вентиляционный карман герметично отделен от сообщения с воздушной камерой термолабильным материалом в подходящей форме, такой как мембрана, пленка или пластиковый лист, расположенный вблизи одного или более резистивных нагревательных элементов. Одноразовая платформа при необходимости содержит уплотнение для герметизации платформы до начала анализа обнаружения. Одноразовая платформа предпочтительно содержит углубления вдоль каналов между камерами для размещения в них высушенных или лиофилизированных реагентов внутри одноразовой платформы. Эти углубления могут при необходимости содержать конструкции на одной или более поверхностях, обращенных к реагенту (реагентам), для содействия направлению жидкостей, предпочтительно с использованием капиллярности или поверхностного натяжения, к закрытым высушенным реагентам для облегчения регидратации высушенных реагентов. Такие элементы могут содержать гребни, такие как гребень 7001 на Фиг. 44, канавки, выемки или другие конструкции для направления жидкостей во внутреннее пространство углубления, когда жидкость проходит через углубление, или иным образом способствуют потоку жидкости во внутреннее пространство углубления во время потока жидкости. В альтернативном варианте углубление может быть расположено непосредственно в одной (или более) камерах.
Одноразовая платформа при необходимости дополнительно содержит ячейку для подготовки образца, содержащую выход в прямом жидкостном соединении с входом камеры для образца. Размеры по существу плоской поверхности камеры амплификации предпочтительно примерно совпадают с размерами по существу плоской поверхности резистивного нагревательного элемента, находящегося в тепловом контакте с камерой амплификации. Камера амплификации необязательно содержит раствор для амплификации, а углубление в канале от камеры для образца до камеры амплификации необязательно содержит лиофилизированную смесь реагентов для амплификации , и предпочтительно имеется углубление в канале от камеры амплификации до камеры для мечения, содержащей высушенные или лиофилизированные детектирующие частицы. Камеру амплификации и камеру для мечения предпочтительно нагревают с помощью резистивных нагревательных элементов. Подсистема обнаружения предпочтительно содержит полоску (с технологией латеральной диффузии), которая содержит детектирующие частицы. Камеры, каналы и вентиляционные карманы предпочтительно расположены на жидкостном сборном слое, а электронные элементы устройства предпочтительно расположены на отдельном слое, содержащем печатную плату, при этом отдельный слой связан с жидкостным сборным слоем или размещен в контакте с жидкостным сборным слоем посредством стыковочного узла. Подсистема обнаружения предпочтительно расположена на жидкостном сборном слое или, при необходимости, на втором жидкостном сборном слое. Объем по меньшей мере одной из камер предпочтительно составляет от около 1 микролитра до около 150 микролитров. Одноразовая платформа предпочтительно дополнительно содержит разъем для стыковки одноразовой платформы со стыковочным узлом, который предпочтительно поддерживает одноразовую платформу в вертикальном или наклонном положении и, при необходимости, обеспечивает электрические контакты, компоненты и/или источник питания.
Вариант осуществления данного изобретения представляет собой способ обнаружения одной или более определяемых нуклеиновых кислот, при этом способ предпочтительно включает внесение образца, содержащего определяемую нуклеиновую кислоту, в камеру для образца одноразовой платформы; ориентацию одноразовой платформы вертикально или под наклоном; открывание первого вентиляционного кармана, соединенного с камерой амплификации с закрытым объемом воздуха, тем самым позволяя образцу течь внутрь камеры амплификации, реагируя на образец с предварительно лиофилизированной смесью реагентов для амплификации, расположенной в углублении канала между камерой для образца и камерой амплификации, амплифицируя определяемую нуклеиновую кислоту в камере амплификации, открывание второго вентиляционного кармана, соединенного с камерой для мечения, с закрытым объемом воздуха, тем самым позволяя амплифицированной определяемой нуклеиновой кислоте поступать внутрь камеры для мечения, метя амплифицированную определяемую нуклеиновую кислоту с использованием детектирующих частиц в углублении в канале между камерой амплификации и камерой для мечения, открывание третьего вентиляционного кармана, соединенного с подсистемой обнаружения, с закрытым объемом воздуха, тем самым позволяя меченой определяемой нуклеиновой кислоте попадать внутрь подсистемы обнаружения, и обнаружение амплифицированной определяемой нуклеиновой кислоты. Этап амплификации предпочтительно включает амплификацию определяемой нуклеиновой кислоты с использованием резистивного нагревательного элемента, расположенного внутри одноразовой платформы вблизи камеры амплификации. Способ предпочтительно дополнительно включает пассивное охлаждение камеры амплификации. Способ предпочтительно дополнительно включает нагрев камеры для мечения во время этапа мечения с использованием резистивного нагревательного элемента, расположенного внутри одноразовой платформы в непосредственной близости от камеры для мечения. Способ предпочтительно дополнительно включает управление работой одноразовой платформы с использованием стыковочного узла, который не является внешним инструментом.
Варианты осуществления данного изобретения включают одноразовую платформу, которая объединяет внешние независимые от инструмента средства для проведения всех необходимых этапов молекулярного анализа нуклеиновой кислоты и дополняет существующие на данный момент экспресс–иммуноанализы с использованием технологии латеральной диффузии с помощью нового поколения тестов на нуклеиновую кислоту, предлагающих более информативные и чувствительные анализы. Варианты осуществления данного изобретения облегчают более широкое использование экспресс–тестирования нуклеиновых кислот в небольших клиниках и в суровых или отдаленных условиях, где инфекционные заболевания, представляющие биоугрозу вещества, сельское хозяйство и экологические тесты окажут наибольшее влияние. Определенные варианты осуществления данного изобретения являются полностью автономными и одноразовыми, что обеспечивает «максимальную мощность» во времена повышенного спроса, позволяя проводить параллельные тесты без ограничений, которые связаны с использованием внешнего инструмента. Кроме того, в тех областях применения, где предпочтительным является недорогой одноразовый картридж в сочетании с недорогим стыковочным узлом с питанием от батареи или адаптера переменного тока, вариант осуществления изобретения, в котором используется простой стыковочный узел, дополнительно снижает затраты на тестирование посредством размещения повторно используемых компонентов в повторно используемом, но недорогом основании. Технология платформы, описанная в данном документе, предоставляет чувствительность одного уровня с лабораторными способами, основанными на амплификации нуклеиновых кислот, минимальное вмешательство пользователя и требования к обучению, специфичность последовательности, обусловленную как амплификацией, так и обнаружением, емкость мультиплексного теста, стабильные реагенты, совместимость с недорогим крупномасштабным производством, работу от батареи или солнечной батареи, что позволяет использовать ее в суровых условиях, и технологию гибкой платформы, обеспечивающую возможность включения дополнительных или альтернативных биомаркеров без изменения конструкции устройства.
Варианты осуществления данного изобретения предоставляют системы и способы для недорогого обнаружения и идентификации нуклеиновых кислот в местах использования, подходящие для проведения анализов в местоположениях, удаленных от лабораторной среды, где обычно проводятся тесты. Преимущественно объемы реакций амплификации нуклеиновых кислот могут находиться в том же диапазоне объемов, который обычно используется в традиционных лабораторных тестах (например, 5–150 мкл). Реакция, проводимая в вариантах осуществления данного изобретения, таким образом, напрямую сопоставима с принятыми лабораторными анализами и обеспечивает возможность предоставления таких же объемов образцов, которые, как правило, используются в традиционных молекулярных тестированиях. Кроме того, амплификация нуклеиновых кислот предпочтительно происходит в герметически закрытой кассете для тестирования, которая предпочтительно постоянным образом герметично закрывается до начала амплификации. Удержание амплифицированных нуклеиновых кислот в герметичной системе предотвращает загрязнение среды тестирования и окружающих областей продуктами амплификации и, по этой причине, снижает вероятность того, что последующие теста приведут к ложным положительным результатам. Интеграция системы герметизации в кассету для тестирования позволяет использовать соответствующую систему зубчатого зацепления для герметизации в стыковочном узле, чтобы обеспечить формирование герметичности во время начала анализа. В варианте осуществления изобретения используется реечно–шестереночный механизм для того, чтобы сдвинуть встроенный в кассету для тестирования механизм герметизации на место, чтобы обеспечить закрытие уплотнения перед амплификацией. Датчик, размещенный в стыковочном узле, опрашивает кассету для тестирования, чтобы подтвердить, что герметичность была создана до начала тестовой реакции.
Варианты осуществления данного изобретения могут быть изготовлены с использованием процессов литья под давлением и ультразвуковой сварки, и недорогих одноразовых компонентов для достижения высокопроизводительного производства. В некоторых вариантах осуществления в флюидном компоненте предусмотрено одно или более углублений, в каждом из которых размещается высушенная таблетка реагента. Углубления позволяют использовать лиофилизированные или иным образом высушенные материалы в флюидном компоненте во время окончательной сборки, когда ультразвуковая сварка может использоваться без разрушения таблетки какой–либо энергией, вводимой в систему во время сварки.
Варианты осуществления данного изобретения могут использоваться для обнаружения присутствия последовательности определяемой нуклеиновой кислоты или последовательностей в образце. Определяемые последовательности могут представлять собой ДНК, такие как, например хромосомная ДНК или внехромосомная ДНК (например, митохондриальная ДНК, хлоропластная ДНК, плазмидная ДНК и т. д.) или РНК (например, рибосомная РНК, информационная РНК, малые РНК или вирусная РНК). Аналогичным образом, варианты осуществления изобретения могут быть использованы для идентификации полиморфизмов нуклеиновых кислот, включая полиморфизмы отдельных нуклеотидов, делеции, вставки, инверсии и дупликации последовательностей. Кроме того, варианты осуществления изобретения могут быть использованы для обнаружения событий регуляции генов, таких как повышение и понижение гена на уровне транскрипции. Таким образом, варианты осуществления изобретения могут использоваться для таких направлений практического применения, как: 1) обнаружение и идентификация патогенных нуклеиновых кислот в сельскохозяйственных, клинических, пищевых, экологических и ветеринарных образцах; 2) выявление генетических биомаркеров заболевания; и 3) диагностика наличия заболевания или метаболического состояния путем обнаружения соответствующих биомаркеров заболевания или метаболического состояния, таких как события регуляции гена (повышение или понижение информационной РНК или индукция малых РНК или молекул другой нуклеиновой кислоты, генерируемых или подавляемых во время заболевания или метаболического состояния), которые возникают в ответ на присутствие болезнетворного микроорганизма, токсина, другого возбудителя болезни, экологического стимула или метаболического состояния.
Варианты осуществления данного изобретения включают средства подготовки, амплификации и детекции образца определяемой нуклеиновой кислоты при добавлении образца нуклеиновой кислоты, включающие все аспекты контроля жидкости, регулирования температуры и смешивания реагентов. В некоторых вариантах осуществления изобретения устройство обеспечивает средства для проведения анализа нуклеиновых кислот с использованием портативного источника питания, такого как батарея, и является полностью одноразовым. В других вариантах осуществления изобретения одноразовый картридж для анализа нуклеиновых кислот работает в сочетании с простым электронным компонентом многократного использования, который может выполнять все функции лабораторного оборудования, такого как внешний инструмент, который, как правило, является необходимым для тестирования нуклеиновых кислот, без необходимости использования таких лабораторных инструментов или внешнего инструмента.
Варианты осуществления данного изобретения представляют устройство для амплификации и обнаружения нуклеиновой кислоты, содержащее, но не ограничиваясь этим, корпус, монтажную плату и флюидный или микрофлюидный компонент. В некоторых вариантах осуществления монтажная плата может содержать множество компонентов для поверхностного монтажа,
таких как резисторы, термисторы, светодиоды (LED), фотодиоды и микроконтроллеры. В определенных вариантах осуществления монтажная плата может содержать гибкую монтажную плату, содержащую термостойкую основу, такую как полиимид. В некоторых вариантах осуществления изобретения гибкие платы могут содержать медь или другие проводящие покрытия или слои, нанесенные на термостойкую основу или связанные с ней. Эти покрытия могут быть вытравлены или иным образом сформированы так, чтобы они содержали резистивные нагревательные элементы, используемые для контроля температуры биохимической реакции и/или проводящие дорожки для размещения таких нагревателей и/или компонентов поверхностного монтажа, таких как резисторы, термисторы, светодиоды (LED), фотодиоды и микроконтроллеры. Флюидный или микрофлюидный компонент представляет собой часть устройства, которая принимает, удерживает и перемещает образцы на водной основе и может быть изготовлена из различных пластиков и с использованием различных технологий изготовления, включая ультразвуковую сварку, склеивание, сплавление или ламинирование, лазерную резку, гидроабразивную резку и/или литье под давлением. Флюидные компоненты и компоненты монтажной платы фиксируются вместе либо с возможностью разъемного соединения, либо неразъемно, и их тепловая связь может быть усилена теплопроводящими материалами или соединениями. Корпус предпочтительно служит частично в качестве поверхностной и защитной оболочки, скрывающей хрупкие компоненты микрофлюидных слоев и монтажной платы, и может также служить для облегчения ввода образца, высвобождения буфера, элюирования нуклеиновой кислоты, образования герметичности и инициирования процессов, необходимых для функциональности устройства. Например, корпус может содержать входное отверстие для образца, механическую систему для создания герметизации, или зубчатое зацепление для герметизации, кнопку или аналогичный механический конструктивный элемент, позволяющий активацию пользователем, высвобождение буфера, инициирование потока образца, элюирование нуклеиновой кислоты и термическое или другое формирование физического интерфейса между электронными компонентами и флюидными компонентами.
В некоторых вариантах осуществления изобретения флюидный или микрофлюидный компонент содержит ряд камер в контролируемом жидкостном сообщении, при этом камеры при необходимости регулируются по температуре, тем самым подвергая содержащуюся в них жидкость воздействию программируемых температурных режимов. В некоторых вариантах осуществления изобретения флюидный или микрофлюидный компонент содержит пять камер, предпочтительно включая расширительную камеру, камеру для ввода образца, камеру обратной транскрипции, камеру амплификации и камеру обнаружения. Камера для ввода образца предпочтительно содержит канал к расширительной камере, входное отверстие для образца, куда может быть добавлен образец, содержащий нуклеиновую кислоту, первое углубление, в котором высушенные материалы могут быть помещены во время изготовления для смешивания с входным образцом, выходной канал, ведущий ко второму углублению, в котором высушенные материалы могут быть помещены во время изготовления, и канал, ведущий оттуда к камере обратной транскрипции. В других вариантах осуществления изобретения функции двух или более камер объединены в одной камере, что позволяет использовать меньшее количество камер.
Первое и второе углубления могут также содержать лиофилизированные реагенты, которые могут содержать, например, подходящие буферы, соли, дезоксирибонуклеотиды, рибонуклеотиды, олигонуклеотидные праймеры и ферменты, такие как ДНК–полимераза и обратная транскриптаза. Такие лиофилизированные реагенты являются предпочтительно солюбилизированными непосредственно после поступления образца нуклеиновой кислоты в углубление. В некоторых вариантах осуществления первое углубление содержит соли, химические вещества и буферы, используемые для лизиса биологических веществ и/или стабилизации нуклеиновых кислот, присутствующих во входном образце. В некоторых вариантах осуществления изобретения вводимый образец нагревают в камере для ввода образца для того, чтобы выполнить лизис клеток или вирусов, присутствующих в образце. В некоторых вариантах осуществления изобретения второе углубление содержит лиофилизированные реагенты и ферменты, такие как обратная транскриптаза, используемые для синтеза комплементарной ДНК из РНК. В варианте осуществления изобретения второе углубление достаточно изолировано от камеры для ввода образца, чтобы материалы во втором углублении могли поддерживать более низкую температуру, чем температура камеры для ввода образца во время нагревания. В некоторых вариантах осуществления изобретения камера обратной транскрипции содержит канал, содержащий третье углубление, содержащее лиофилизированные реагенты для амплификации нуклеиновых кислот. Камера для ввода образца, камера обратной транскрипции, камера амплификации и камера обнаружения предпочтительно расположены в регистрирующем устройстве и в достаточной близости от нагревательных элементов на монтажной плате нагревателя, чтобы обеспечить теплопроводность при установке на плату нагревателя либо непосредственно, либо через вставку флюидного или микрофлюидного компонента, или кассеты в стыковочный узел. Аналогичным образом, электронные компоненты, присутствующие на монтажной плате нагревателя, предпочтительно размещены в физическом контакте или вблизи вентиляционных карманов в флюидном
компоненте для того, чтобы обеспечить электронное управление посредством открытия вентиляционного отверстия. Планировка размещения монтажной платы нагревателя предназначена для обеспечения совмещения с элементами флюидного или микрофлюидного компонента, в результате чего резистивные нагревательные элементы монтажной платы нагревателя для лизиса, обратной транскрипции, амплификации, гибридизации и/или управления потоком жидкости расположены для создания теплового взаимодействия с элементами
флюидного компонента, с которыми они взаимодействуют.
В некоторых вариантах осуществления изобретения флюидный или микрофлюидный компонент предпочтительно содержит пять камер, включая камеру для ввода образца, камеру лизиса, камеру обратной транскрипции, камеру амплификации и камеру обнаружения, а также углубления для высушенных или лиофилизированных реагентов, расположенные вдоль каналов между каждой камерой. В этом варианте осуществления обратная транскрипция РНК в комплементарную ДНК (кДНК) и амплификация кДНК происходят в отдельных камерах. В данном варианте осуществления изобретения первое углубление, расположенное вдоль канала, ведущего от чашки для ввода образца к камере лизиса, содержит соли, химические вещества (например, дитиотреитол) и буферы (например, для стабилизации, повышения или снижения рН), используемые для лизиса биологических веществ и/или стабилизации нуклеиновых кислот, присутствующих во входном образце. В некоторых вариантах осуществления изобретения входной образец нагревается в камере термического лизиса, сначала вытекая из чашки для ввода образца через первое углубление, в котором образец при необходимости смешивается с веществами, которые содержатся в первом углублении. В других вариантах осуществления изобретения лизис осуществляется посредством химической обработки, являющейся результатом смешивания образца с химикатами в первом углублении и инкубации образца в присутствии этих химикатов в камере лизиса.
После фактического завершения обработки в камере лизиса раствор образца выпускается с использованием электронного управления нагревателем, который немеханически разрывает отверстие, позволяя раствору образца протекать через канал через второе углубление в камеру обратной транскрипции.
Указанное второе углубление может при необходимости содержать лиофилизированные реагенты, которые могут включать подходящие буферы, соль, дезоксирибонуклеотиды, рибонуклеотиды, олигонуклеотидные праймеры и ферменты, такие как ДНК–полимераза и/или обратная транскриптаза, необходимые для осуществления обратной транскрипции РНК в образце в кДНК. После практического завершения реакции обратной транскрипции открывается второе отверстие для выпуска раствора образца для протекания через канал и третье углубление, которое содержит реагенты, необходимые для амплификации нуклеиновой кислоты, такие как лиофилизированные реагенты, которые могут включать подходящие буферы, соль, дезоксирибонуклеотиды, рибонуклеотиды, олигонуклеотидные праймеры и ферменты, такие как ДНК–полимераза, в амплификационную камеру.
После практического завершения амплификации нуклеиновой кислоты в камере амплификации открывается третье отверстие для выпуска раствора образца в канал, ведущий к камере обнаружения. Указанный канал может при необходимости, но предпочтительно, содержать четвертое углубление, содержащее высушенные или лиофилизированные реагенты для обнаружения, такие как химические вещества и/или конъюгаты детектирующих частиц, используемые для обнаружения нуклеиновых кислот в камере обнаружения. Камера обнаружения предпочтительно содержит капиллярный пул, реагенты для обнаружения амплифицированной нуклеиновой кислоты и тест–полоску для анализа (с технологией латеральной диффузии). Капиллярный пул предпочтительно обеспечивает пространство достаточной емкости для размещения всего объема жидкости в камере обнаружения на высоте, которая позволяет жидкости течь вверх по тест–полоске для анализа посредством капиллярного эффекта без поступления избыточного количества или обхода иным способом областей тест–полоски для анализа, предназначенных для того, чтобы получить жидкость для соответствующего капиллярного движения вверх по тест–полоске для анализа. В некоторых вариантах осуществления изобретения реагенты для обнаружения представляют собой лиофилизированные реагенты. В некоторых вариантах осуществления изобретения реагенты для обнаружения содержат окрашенные полистирольные микросферы, коллоидное золото, полупроводниковые нанокристаллы или наночастицы целлюлозы. Раствор образца смешивается с реагентами для обнаружения в камере обнаружения и течет посредством капиллярного эффекта вверх по тест–полоске для анализа. Микронагреватели, установленные в камере обнаружения, могут при необходимости использоваться для регулирования температуры раствора, когда он перемещается вверх по тест–полоске для анализа.
В некоторых вариантах осуществления изобретения реакция амплификации представляет собой асимметричную реакцию амплификации, в которой один праймер из каждой пары праймеров в реакции присутствует в концентрации, отличной от другого праймера из данной пары. Асимметричные реакции могут быть использованы для генерации одноцепочечной нуклеиновой кислоты для облегчения обнаружения путем гибридизации.
Асимметричные реакции также могут быть использованы для генерации ампликонов в реакции линейной амплификации, позволяющей выполнить количественный или полуколичественный анализ определяемых уровней в образце.
Другие варианты осуществления изобретения включают устройство для обратной транскрипции, амплификации и обнаружения нуклеиновой кислоты, которое интегрировано с устройством для подготовки образца. Варианты осуществления изобретения, включающие устройство для подготовки образца, представляют средства для жидкостного сообщения между выходными отверстиями или клапанами подсистемы подготовки образца и входным отверстием или отверстиями флюидных или микрофлюидных компонентов устройства.
Другие варианты осуществления изобретения включают в себя средства для разделения входного образца на два или более путей для жидкости в флюидном или микрофлюидном компоненте. Средства для разделения входного образца содержат разветвленный канал для подачи входной жидкости в измерительную камеру с объемом, предназначенным для разделения жидкости по нескольким путям подачи жидкости. Каждая измерительная камера содержит проводящий канал к вентиляционному карману и проводящий канал к следующей камере на пути жидкости, например, к камере лизиса или камере обратной транскрипции или камере амплификации.
Если не указано иное, все термины, обозначения и другая научная терминология, используемые в данном документе, предназначены для того, чтобы иметь значения, обычно понятные специалистам в области техники, к которой относится данное изобретение. Способы и процедуры, описанные или на которые в настоящем документе делается ссылка, как правило, являются хорошо понятными и обычно используются специалистами в данной области техники с использованием широкопринятых методологий, таких как, например, широко используемые методологии молекулярного клонирования, описанные в Sambrook и др, Molecular Cloning: A Laboratory Manual третий. выпуск (2001 г.) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. Cold Spring Harbor, N.Y. и Current Protocols in Molecular Biology (Ausbel и др, eds., John Wiley & Sons, Inc. 2001 г. В зависимости от конкретного случая процедуры, включающие использование имеющихся в продаже наборов и реагентов в целом проводятся в соответствии с протоколами и/или параметрами, определенными производителем, если не указано иное.
Используемые в описании и формуле изобретения термины «определяемая нуклеиновая кислота» или «матричная нуклеиновая кислота» означает одноцепочечный или двухцепочечный фрагмент или последовательность ДНК или РНК, предназначенные для обнаружения.
Используемые на всем протяжении в описании и формуле изобретения термины «микрочастица» или «детектирующая частица» означают любое соединение, используемое для мечения продукта нуклеиновой кислоты, образующегося во время реакции амплификации, включая флуоресцентные красители, специфичные для дуплексной нуклеиновой кислоты, флуоресцентно модифицированные олигонуклеотиды и конъюгированные с олигонуклеотидами квантовые точки или твердофазные элементы, такие как полистирол, латекс, целлюлоза или парамагнитные частицы, или микросферы.
Используемый на всем протяжении в описании и формуле изобретения термин «камера» означает отделение для жидкости, в котором жидкость находится в течение некоторого периода времени. Например, камера может представлять собой камеру для образца, камеру амплификации, камеру для мечения или камеру обнаружения.
Используемый на всем протяжении в описании и формуле изобретения термин «кассета» определяется как одноразовая или расходуемая кассета, корпус, компонент или картридж, используемые при проведении исследования или другого химического или биохимического анализа. Кассета может быть одноразовой или многоразовой.
Используемый на всем протяжении в описании и формуле изобретения термин «карман» означает отделение, которое служит в качестве вентиляционного механизма. Карман предпочтительно расположен рядом с резистором или другим механизмом, или наложен на него, чтобы открывать карман. Например, в отличие от флюидных камер, которые описаны выше, карман, созданный в флюидном компоненте кассеты, может иметь одну открытую поверхность, которая совмещается с резистором на печатной плате в сборе (PCA). Эта открытая поверхность предпочтительно покрыта тонкой мембраной, пленкой или другим материалом для создания герметичной полости, которая легко разрушается при подаче питания на нижележащий резистор.
Используемый на всем протяжении в описании и формуле изобретения термин «канал» означает узкий проход внутри флюидного узла, который, как правило, соединяет две или более камеры и/или карманы, или их комбинации, включая, например, впускной, выпускной или вентиляционный канал. В части, касающейся входного или выходного канала, образец жидкости мигрирует через канал. В части, касающейся вентиляционного канала, канал предпочтительно остается свободным от жидкости и соединяет флюидную камеру с вентиляционным карманом.
Используемый на всем протяжении в описании и формуле изобретения термин «внешний инструмент» означает многоразовый инструмент, который имеет одну или более из следующих характеристик: выполняет механическое воздействие на одноразовый анализ или кассету, кроме герметизации кассеты, включая, но не ограничиваясь этим, прокалывание пакетов с буфером и/или перекачивание, или активное обеспечение иным образом перемещающего усилия для жидкостей, содержит движущиеся части для управления клапанами и другими компонентами для управления потоком жидкости в кассете или одноразовом анализе, регулирует поток жидкости, кроме выборочного нагрева анализа, или требует периодической калибровки.
Используемый на всем протяжении в описании и формуле изобретения термин «стыковочный узел» означает многоразовое устройство, которое управляет анализами, но не имеет каких–либо характеристик, перечисленных выше для внешних инструментов.
Варианты осуществления данного изобретения представляют устройства для недорогого тестирования нуклеиновых кислот в месте использования, подходящие для проведения анализов в местах, удаленных от лабораторной среды, где обычно проводится тестирование. Некоторые устройства содержат флюидные и электронные компоненты или слои, при необходимости заключенные в защитный корпус. В вариантах осуществления данного изобретения флюидный компонент включает пластик и содержит ряд камер и карманов, соединенных узкими каналами, в которых камеры ориентированы вертикально друг относительно друга во время работы. Флюидный компонент накладывается или иным образом помещается в физический контакт с электронными компонентами, предпочтительно управляемыми через микроконтроллер, такими как печатная плата, содержащая серийно выпускаемые устройства поверхностного монтажа (SMD), и/или гибкая плата, содержащая протравленный проводящий материал для формирования резистивных нагревательных элементов и, при необходимости, содержащие устройства поверхностного монтажа (SMD). В некоторых вариантах осуществления изобретения устройства вся сборка является одноразовой. В других вариантах осуществления изобретения флюидные и физически связанные электронные слои являются одноразовыми, в то время как небольшой недорогой управляющий блок является многоразовым. В другом варианте осуществления изобретения флюидный компонент является одноразовым, а небольшой управляющий стыковочный узел или стыковочный узел является многоразовым. Для всех вариантов осуществления изобретения данное изобретение может быть интегрировано с устройством для подготовки образца нуклеиновой кислоты, таким как устройство, описанное в международной публикации № WO 2009/137059 А1, озаглавленное «Highly Simplified Lateral Flow–Based Nucleic Acid Sample Preparation and Passive Fluid Flow Control» (включено в данное описание посредством ссылки) и/или использует способы, описанные в нем.
Варианты осуществления данного изобретения включают интегрированное устройство для тестирования нуклеиновых кислот, которое может быть недорого изготовлено с использованием установленных производственных процессов. Изобретение обеспечивает данные молекулярных тестов, сохраняя при этом простоту с точки зрения конечного пользователя широко распространенных ручных иммуноанализов, преодолевая проблемы регулирования температуры жидкости внутри устройства, транспортировки малых объемов образцов последовательными шагами, добавления реагентов, смешивания реагентов, обнаружения нуклеиновых кислот. В некоторых вариантах осуществления изобретения подсистемы для сбора, интерпретации, отчетов и/или передачи результатов анализа включены в изобретение. Варианты осуществления данного изобретения уникально адаптированы для использования готовых электронных элементов, которые могут быть сконструированы стандартными способами сборки, и для них не требуется движущихся частей, или требуется минимальное их количество. Более того, конструкция флюидного слоя позволяет использовать легкодоступные пластики и технологии производства. В результате получается недорогое, одноразовое и надежное устройство, способное к выделению, амплификации и обнаружению нуклеиновых кислот без необходимости в специальной лабораторной инфраструктуре.
В существующих устройствах для тестирования нуклеиновых кислот, как правило, используются сложные нагревательные элементы, такие как осажденные пленочные нагреватели и устройства Пельтье, которые значительно увеличивают стоимость и/или требуют специальных способов изготовления. В вариантах осуществления изобретения нагрев реакционного раствора предпочтительно достигается за счет использования простых резистивных устройств для поверхностного монтажа, которые можно купить за малую сумму денег или меньше, и которые собраны и испытаны в соответствии с общепринятыми производственными стандартами. Посредством наложения флюидных камер на эти резистивные элементы и связанные с ними сенсорные элементы температуру жидкости реакционных растворов можно удобно регулировать. Широкое использование SMD–резисторов и гибких плат в электронной промышленности гарантирует, что данное изобретение поддается хорошо зарекомендовавшим себя способам контроля качества. В других вариантах осуществления изобретения резистивный нагрев осуществляется с использованием нагревательных элементов, сформированных по шаблону в проводящем слое основы гибкой платы. Многие способы амплификации нуклеиновых кислот, такие как ПЦР, требуют не только быстрого нагревания реакционного раствора, но также и быстрого охлаждения. Реакционные камеры в настоящем изобретении предпочтительно нагревают на одной стороне, а температуру окружающей среды на противоположной поверхности используют для снижения температуры жидкости. В дополнение к этому, вертикальная ориентация вариантов осуществления изобретения устройства обеспечивает более быстрое охлаждение посредством пассивной конвекции, чем если бы устройство было ориентировано горизонтально, таким образом, сокращая период теплового цикла без использования дорогостоящих устройств, таких как устройства Пельтье. В некоторых вариантах осуществления изобретения для облегчения охлаждения используется вентилятор.
Контроль жидкости – это еще одна проблема, связанная с дешевыми конструкциями устройств для тестирования нуклеиновых кислот. Устройства, известные в данной области техники, как правило, используют электромеханические, электрокинетические или пьезоэлектрические насосные механизмы для манипулирования жидкостями во время работы устройства. Эти насосные элементы увеличивают сложность и стоимость устройства. Аналогичным образом, клапаны, использующие сложные микромеханические конструкции или движущиеся детали, могут увеличить стоимость изготовления и снизить надежность из–за таких осложнений, как поломка движущейся детали или биологическое загрязнение. В отличие от ранее описанных устройств для тестирования нуклеиновых кислот, варианты осуществления данного изобретения используют гидростатическое давление под управлением микроконтроллера вместе с капиллярным эффектом и поверхностным натяжением для манипулирования объемами жидкости. Вертикальная ориентация некоторых вариантов осуществления данного изобретения позволяет реакционному раствору каскадно переходить из камеры в камеру под управлением микроконтроллера, чтобы приспособить необходимые манипуляции анализа. Жидкость может удерживаться в отдельных реакционных камерах посредством баланса размеров каналов, гидростатического давления и поверхностного натяжения, при котором поверхностное натяжение и гидростатическое давление препятствуют продвижению жидкости при вытеснении газа. Образец продвигается в нижнюю камеру предпочтительно только после активации простого вентиляционного механизма под управлением микроконтроллера. После открытия отверстие позволяет жидкости перемещаться из первой камеры во вторую камеру посредством обеспечения пути для вытесненного воздуха, выходящего из второй камеры в связи с тем, что входит жидкость. Каждая камера (или каждый канал между камерами) внутри флюидного компонента предпочтительно соединяется с герметичным вентиляционным карманом через узкий вентиляционный канал. Вентиляционный карман предпочтительно герметизируют на одной поверхности с использованием тонкой термолабильной пластиковой мембраны или листа, которые легко разрываются при нагреве небольшого резистора для поверхностного монтажа, который расположен рядом с мембраной или листом, ниже их, или прилегает к ним. Как только отверстие нижней камеры открывается, продвижение жидкости продолжается даже при низком гидростатическом давлении.
Как более конкретно описано ниже, флюидный или микрофлюидный вентиляционный механизм, используемый в некоторых вариантах осуществления данного изобретения, предпочтительно использует нагревательный элемент в тепловом и (при необходимости) физическом контакте с термолабильным уплотнением, чтобы обеспечить электронное управление движением жидкости посредством вентиляции камеры более низкой высоты, чтобы позволить жидкости из камеры более высокой высоты перетекать в нижнюю камеру. В одном варианте осуществления изобретения резистор монтируется на печатной плате с использованием широко используемых и хорошо зарекомендовавших себя способов изготовления электроники, и помещается в физический контакт с уплотнением канала, содержащим термолабильный материал. Под напряжением резистор для поверхностного монтажа генерирует достаточно тепла для того, чтобы разорвать уплотнение, что приводит к вентиляции камеры, чтобы обеспечить уравновешивание давления в области или камере, где жидкость перемещается начиная от области или камеры, где жидкость находится перед вентиляцией. Уравновешивание давления между камерами позволяет перемещать жидкость из камеры более высокого уровня в камеру более низкого уровня. Прямое уплотнение
Между камерами верхнего и нижнего уровня предпочтительно не используется. Канал и вентиляционное уплотнение могут быть расположены удаленно от флюидных камер, тем самым облегчая расположение флюидного устройства в конфигурациях, эффективных для изготовления. Уплотнительный материал может содержать любой материал, который может герметизировать вентиляционный канал и разрываться при нагревании, как описано, например, тонкий пластиковый лист. Этот подход к управлению движением жидкости в устройстве выгоден из–за низких материальных затрат, пригодности для производства с использованием устоявшихся технологий изготовления, в то же время обеспечивая способность для перемещения жидкости через ряд камер под управлением электронных схем управления, таких как микропроцессоры или микроконтроллеры. Использование отверстий, термолабильного материала для герметизации отверстий (а не для герметизации флюидных камер или самих флюидных микроканалов) и электронных средств разрушения указанного уплотнения теплом обеспечивает средства управления потоком жидкости через устройство для обеспечения возможности перемещения жидкости в заранее определенное время или после завершения определенных событий (например, достижения температуры, изменения температуры или серии изменений температуры, или завершения времени, или времени инкубации, или других событий). В некоторых вариантах осуществления изобретения в канал между камерами может быть введен блокирующий элемент в тех случаях, когда газофазная вода должна быть изолирована от камеры, соединенной указанным каналом. Блокирующий элемент может представлять собой растворимый материал, который растворяется при контакте с жидкой водой после открытия вентиляционного отверстия или легко расплавляемый материал, такой как парафин, который может быть удален путем подведения тепла к месту закупорки.
Кроме того, вентиляционный подход имеет ряд преимуществ по сравнению с герметизацией самих флюидных камер. Вентиляционные карманы могут быть расположены в любом месте на флюидной схеме размещения и просто сообщаться с камерой, регуляцию которой они осуществляют через вентиляционный канал. С точки зрения производства, вентиляционные карманы могут быть локализованы так, что только одна герметизирующая мембрана для всех вентиляционных карманов (которые могут содержать коллектор вентиляционных карманов) прикрепляется к флюидному компоненту, предпочтительно с помощью хорошо известных способов, таких как клеевые соединения, ламинирование при нагревании, ультразвуковая сварка, лазерная сварка и т. д. В противоположность этому прямая герметизация флюидной камеры требует размещения герметизирующего материала в разных местах, соответствующих местоположению каждой камеры, что является более трудным для изготовления. Это представляет более сложный сценарий в процессе производства по сравнению с коллектором с одним вентиляционным карманом, герметизированным одной мембраной. Кроме того, если камеры являются герметично закрытыми, расплавленный герметизирующий материал может оставаться в каналах между камерами, перекрывая поток. Вязкость герметизирующего материала может требовать большего давления в столбе жидкости, чем это достигается в миниатюрном гравитационном устройстве.
В вариантах осуществления данного изобретения смешивание реагентов требует не большей сложности, чем в других системах. Реагенты, необходимые для амплификации нуклеиновых кислот, такие как буферы, соли, дезоксирибонуклеотиды, олигонуклеотидные праймеры и ферменты, предпочтительно стабильно включаются с использованием лиофилизированных таблеток или лепешек. Эти лиофилизированные реагенты, герметично закрытые в флюидной камере, углублении в флюидной камере или углублении в канале, могут быть легко солюбилизированы при контакте с водным раствором. В случае, когда требуется дополнительное смешивание, вертикальная ориентация вариантов осуществления данного изобретения предлагает возможности для новых способов смешивания растворов. Используя нагреватели, расположенные под флюидными камерами, газ может быть нагрет, доставляя пузырьки к реакционному раствору в камеру выше, когда раствор содержит термочувствительные компоненты. В качестве альтернативы, нагреватели могут быть использованы для непосредственного нагрева раствора до точки кипения, если раствор не содержит термочувствительных компонентов. Возникновение пузырьков воздуха является часто нежелательным в ранее описанных флюидных и микрофлюидных устройствах, поскольку они могут накапливаться в флюидных камерах и каналах, и вытеснять реакционные растворы или препятствовать движению жидкости внутри устройства. Вертикальная конструкция вариантов осуществления изобретения, представленных в данном документе, позволяет пузырькам подниматься к поверхности жидкости, что приводит только к минимальному и кратковременному вытеснению жидкости, эффективно уменьшая любые неблагоприятные воздействия пузырьков на флюидную или микрофлюидную систему. Смешивание при кипячении также является удобным с использованием этой вертикальной конструкции, поскольку вытесненная во время процесса жидкость просто возвращается в исходную флюидную камеру под действием силы тяжести после выключения нагревательных элементов.
В вариантах осуществления изобретения колориметрическая тест–полоска для анализа используется для обнаружения амплифицированных нуклеиновых кислот. Анализы по технологии латеральной диффузии широко используются в тестах иммуноанализа в связи с их простотой использования, надежностью и низкой стоимостью. Известный уровень техники содержит описания использования тест–полосок (с технологией латеральной диффузии) для обнаружения нуклеиновых кислот с использованием пористых материалов в качестве тест–зоны для приема образца, которая находится в зоне мечения или около нее, также состоящей из пористого материала и размещенной на одном конце или рядом с ним устройства латерального проточного анализа. В этих предшествующих изобретениях маркирующие фрагменты находятся в зоне мечения. Использование пористых материалов в качестве зоны для приема образца и зоны мечения приводит к удержанию некоторого количества раствора образца, а также к обнаружению частиц в пористых материалах. Несмотря на то, что зоны мечения, содержащие пористые материалы, имеющие обратимо иммобилизованные фрагменты, необходимые для обнаружения, могут быть использованы в вариантах осуществления данного изобретения, в вариантах осуществления данного изобретения предпочтительно используются детектирующие частицы или фрагменты, удерживаемые в области устройства, отличной от зоны приема образца полоски с технологией латеральной диффузии и содержащей непористые материалы с низкими характеристиками удержания жидкости. Этот подход позволяет пометить образцы, содержащие определяемую нуклеиновую кислоту, до введения в пористые компоненты тест–зоны для приема образца компонента с технологией латеральной диффузии устройства, и тем самым исключается задержка и/или потеря материала образца и детектирующих частиц в пористой зоне мечения. Этот способ дополнительно позволяет использовать различные обработки образца в присутствии детектирующих фрагментов, такие как обработка высокими температурами, для достижения денатурации двухцепочечной мишени или вторичных структур в одноцепочечной мишени, не заботясь о воздействии температуры на пористые материалы зоны приема или мечения образцов или материалы тест–полоски для анализа (по технологии латеральной диффузии). Кроме того, использование зоны мечения, не контактирующей в латеральной диффузии с зоной приема образца, но при условии контроля флюидных компонентов, таких как вентиляционные отверстия, позволяет мишени и метке оставаться в контакте в течение периодов времени, контролируемых системами управления потоком жидкости. Таким образом, варианты осуществления данного изобретения могут отличаться от традиционных тест–полосок с технологией латеральной диффузии, при этом образец и время взаимодействия с детектирующей частицей, а также условия, определяются капиллярно–транспортными свойствами материалов. Благодаря включению детектирующих частиц в камеру с регулируемой температурой возможно денатурация дуплексной нуклеиновой кислоты, что обеспечивает эффективное обнаружение на основе гибридизации. В альтернативных вариантах осуществления изобретения используется флуоресценция для обнаружения амплификации нуклеиновой кислоты с использованием комбинации светодиодов, фотодиодов и оптических фильтров. Эти оптические системы обнаружения могут использоваться для обнаружения и количественного определения нуклеиновых кислот в режиме реального времени во время амплификации и определения конечной точки после амплификации.
Варианты осуществления изобретения включают недорогую систему, предназначенную для мест использования, в которой образец нуклеиновой кислоты может быть выборочно амплифицирован и обнаружен. Дополнительные варианты осуществления включают в себя интеграцию с устройством для подготовки образца нуклеиновой кислоты, таким как устройство, описанное в международной публикации № WO 2009/137059 А1, озаглавленной «Highly Simplified Lateral Flow–Based Nucleic Acid Sample Preparation and Passive Fluid Flow Control». Вариант осуществления изобретения устройства предпочтительно включает как пластиковый флюидный компонент, так и печатную плату в сборе (PCA) и/или гибкую плату, и, при необходимости, заключен в корпус, который защищает активные компоненты. Регулирование температуры, смешивание жидкости и реагента предпочтительно координируется микроконтроллером. Реакционная кассета предпочтительно ориентирована и расположена вертикально, в результате чего гравитация, гидростатическое давление, капиллярный эффект и поверхностное натяжение в сочетании с отверстиями, открываемыми микроконтроллером, регулируют движение жидкости внутри устройства.
В вариантах осуществления данного изобретения приготовленная или неочищенная жидкость образца входит в отверстие для образца и заполняет или частично заполняет чашку для образца. Образец может удерживаться в течение различных периодов времени в чашке для образца, где высушенные или лиофилизированные реагенты могут смешиваться с образцом. Такие реагенты, как положительные контрольные реагенты, контрольные матрицы или химические реагенты, используемые для выполнения теста, могут быть введены в раствор образца путем включения в сухой, жидкой или лиофилизированной форме в чашку для образца. Другие виды обработки, такие как инкубация с контролируемой температурой или тепловой лизис бактериальных или вирусных аналитов, могут при необходимости выполняться в чашке для образцов, например, с помощью нижележащего микронагревателя и системы датчиков температуры, соединенных с электроникой для регулирования температуры. Флюидная сеть содержит отверстие для образца, через которое образец вводится в кассету либо вручную пользователем, либо через автоматизированную систему, например подсистему, интегрированную в стыковочный узел, или подсистему обработки образца; чашку для образца, в которой образец удерживается для облегчения накопления во время введения образца и для добавления реагентов, компонентов для выполнения обработок, требуемых перед дальнейшим перемещением образца в нижележащие участки флюидной сети (например, термической обработки для выполнения лизиса бактериальной клетки или вируса); рециркуляционный вентиляционный канал для уравновешивания давлений воздуха, газа или раствора флюидных каналов и/или камер с давлением расширительной камеры кассеты; углубление для гранул, в котором гранула реагента (например, гранула или таблетка материала, реагент, химикаты, биологические вещества, белки, ферменты или другие вещества или смеси этих веществ) в высушенном/обезвоженном или лиофилизированном, или полусухом состоянии могут быть гидратированы при помощи раствора образца или буферного раствора, введенного в кассету перед добавлением образца, для регидратации содержащихся гранул или таблеток, и, в связи с этим, смешивания материалов с раствором образца; набор из одного или более отверстий, которые могут быть открыты для управления движением жидкости внутри кассеты; первую камеру, в которой образец может подвергаться воздействию режима температур; необязательный барьер внутри флюидного канала, соединяющего первую камеру со второй камерой, для предотвращения преждевременного проникновения жидкостей и/или газов во вторую камеру или для временного управления движением раствора или газов во вторую камеру; вторую камеру, в которой раствор образца может быть подвергнут дополнительным воздействиям температурных режимов при необходимости после добавления реагентов из необязательного углубления с гранулами реагента, при необходимости расположенного между первой и второй камерами; углубление для тест–полоски, образующее камеру, в которой установлена тест–полоска для обнаружения аналита или репортерной молекулы, или другого вещества, указывающего на присутствие аналита. В некоторых вариантах осуществления изобретения кассета вставлена в стыковочный узел, который выполняет функции герметизации кассеты, элюирования, обнаружения и передачи данных. Предпочтительно вмешательство пользователя не требуется после того, как кассета вставлена в стыковочный узел, образец загружен и крышка закрыта.
Ссылаясь на репрезентативные графические материалы кассеты 2500 на Фиг. 1–2, образец нуклеиновой кислоты добавляется в чашку 10 для образца в флюидном компоненте 5 через отверстие 20 для образца. Скользящее уплотнение 91 перемещается в закрытое положение путем закрытия крышки стыковочного узла во время начала анализа. Крышка 25 удерживает ползунок 91 на месте для герметизации расширительной камеры 52. Образец нуклеиновой кислоты может быть получен в режиме онлайн (то есть, из интегрированной подсистемы подготовки нуклеиновой кислоты), в результате отдельного процесса подготовки нуклеиновой кислоты (например, с использованием одного из многих коммерчески доступных способов (например, спин–колонок для очистки фрагментов нуклеиновой кислоты от примесей) с последующим добавлением очищенной нуклеиновой кислоты в устройство с помощью пипетки, или в виде необработанного образца, содержащего нуклеиновую кислоту. В чашке для образца или, предпочтительно, в углублении 13 внутри или рядом с чашкой для образца, находится смесь реагентов 16, которая может быть в жидкой или сухой форме, содержащая компоненты, используемые для облегчения лизиса клеток и вирусов и/или стабилизации выделенных нуклеиновых кислот. Например, дитиотреитол и/или рН–буферные реагенты могут быть использованы для стабилизации нуклеиновых кислот и ингибирования рибонуклеаз. Аналогичным образом, могут быть использованы реагенты для осуществления лизиса, опосредованного кислотой или основанием. В некоторых вариантах осуществления изобретения смесь реагентов лиофилизируется с образованием лиофилизированных реагентов. В некоторых вариантах осуществления изобретения присутствует в смеси реагентов положительный контроль, такой как вирус, бактерия или нуклеиновая кислота. Введение образца в чашку для образца заставляет реагенты и образцы смешиваться так, что реагенты воздействуют на образец. Необязательный этап смешивания пузырьков для дополнительного смешивания образца с реагентами или ресуспендирования реагентов может быть выполнен при необходимости. Затем жидкость при необходимости нагревают в чашке 10 для образца, чтобы лизировать клетки и вирусные частицы. Затем жидкость предпочтительно направляется через канал 40 в первую камеру 30, которая находится под чашкой для образца, когда устройство находится в вертикальной ориентации. Углубление 15 для реагента предпочтительно расположено вдоль впускного канала таким образом, что жидкость проходит через углубление для смешивания с высушенными или лиофилизированными реагентами, содержащимися в нем, перед поступлением в первую камеру 30.
В вариантах осуществления изобретения, в которых первая камера представляет собой камеру обратной транскрипции, предпочтительно в углублении 15 для реагента присутствуют все компоненты, необходимые для реакции обратной транскрипции, такие как буферные реагенты, дезоксирибонуклеозидтрифосфаты, олигонуклеотидные праймеры и/или ферменты (например, обратная транскриптаза) в высушенной или лиофилизированной форме. Камера обратной транскрипции предпочтительно находится в контакте с нагревательными элементами, чтобы обеспечить средства для регулирования температуры, необходимые для поддержки обратной транскрипции РНК в кДНК. Канал 35 соединяет камеру 30 с углублением 37 для реагента. После синтеза кДНК в камере 30 отверстие 50 открывается, чтобы позволить реакции обратной транскрипции протекать через канал 35 в углубление 37 для реагента. Высушенные или лиофилизированные реагенты из углубления 37 для реагента смешиваются с жидкостью, поскольку она проходит через углубление во вторую камеру 90 через впускное отверстие 39, в результате чего реагенты воздействуют на образец во второй камере, которая предпочтительно является камерой амплификации. Предпочтительно в углублении 37 для реагента находятся все компоненты, необходимые для реакции амплификации, такие как буферные вещества, соли, дезоксирибонуклеозидтрифосфаты, рибонуклеозидтрифосфаты, олигонуклеотидные праймеры и/или ферменты. В некоторых вариантах осуществления изобретения смесь реагентов лиофилизируется с образованием лиофилизированных реагентов. Чтобы облегчить мультиплексные тесты, в которых генерируется множество ампликонов, мультиплексированная амплификация может быть выполнена путем осаждения множества наборов праймеров в камере (камерах) амплификации или, предпочтительно, внутри углублений для реагентов перед указанной камерой (камерами) амплификации. Кроме того, монтажная плата и флюидные конструкции, в которых в устройство встроено множество камер амплификации и обнаружения, поддерживают множественные параллельные реакции амплификации, которые могут представлять собой одноплексные или мультиплексные реакции. Этот подход уменьшает или устраняет осложнения, известные специалистам в данной области техники, которые возникают в результате мультиплексной амплификации с использованием нескольких пар праймеров в одной реакции. Кроме того, использование реакционных камер с множественной амплификацией обеспечивает возможность одновременной амплификации в различных температурных режимах, чтобы удовлетворить требования для оптимальной амплификации, такие как разные температуры плавления или отжига, требуемые для разных последовательностей мишеней и/или праймеров.
После амплификации нуклеиновой кислоты вентиляционный карман 150 открывается, чтобы позволить продукту реакции амплификации протекать через канал 135 в камеру 230. Тест–полоска для анализа 235, расположенная в камере 230, позволяет обнаруживать определяемые нуклеиновые кислоты, помеченные детектирующими частицами, расположенными в области тест–полоски для анализа. 235 или, возможно, в капиллярном пуле 93.
Перемещение жидкости из чашки 10 для образца в первую камеру 30 происходит потому, что камера 30 открывается в расширительную камеру 52 через отверстие 51. Движение жидкости из первой камеры во вторую камеру устройства предпочтительно осуществляется через отверстие прохода, соединенное со второй камерой. Когда жидкость входит в первую камеру 30, вентиляционный карман 50, соединенный с камерой ниже по потоку, герметизируется, и, таким образом, жидкость не будет проходить через канал 35, соединяющий две камеры. Далее со ссылкой на Фиг. 2А, перемещение жидкости из камеры 30 в камеру 90 может быть достигнуто за счет того, что воздух внутри камеры 90 может сообщаться с воздухом в расширительной камере 52 путем разрыва уплотнения, перекрывающего вентиляционный карман 50. Разрыв уплотнения в вентиляционном кармане 50 обеспечивает сообщение воздуха в камере 90 через вентиляционный канал 60 с воздухом в расширительной камере 52, которая соединена через отверстие 51 с вентиляционным карманом 54. Уплотнение в вентиляционном кармане 54 предпочтительно является открытым или было предварительно разорвано, как показано на Фиг. 2B. Как проиллюстрировано на Фиг. 2С, разрыв уплотнения вентиляционного кармана 50 обеспечивает возможность вентиляционному карману 50 (и, следовательно, камере 90) сообщаться с вентиляционным карманом 54 (и, следовательно, с расширительной камерой 52). Этот способ движения жидкости предпочтительно воплощен в герметически закрытом пространстве, чтобы содержать биологически опасные образцы и амплифицированные нуклеиновые кислоты в кассете для тестирования. Чтобы обеспечить герметичное закрытие кассеты, селективно теплостойкие и термолабильные материалы наслаивают так, как схематически показано в поперечном разрезе на Фиг. 2B–2C. Далее со ссылкой на Фиг. 2B–2C, источник 70 тепла, который предпочтительно содержит резистор, на монтажной плате или печатной плате в сборе (PCA) 75 размещен в регистрирующем устройстве с вентиляционными карманами 50, 54 и в непосредственной близости от термолабильного материала 80 уплотнения вентиляционного кармана. Уплотнение вентиляционного кармана может содержать термолабильный материал, такой как полиолефин или полистирол. Термостойкий материал (такой как полиимид) 72 предпочтительно расположен между источником 70 тепла и термолабильным материалом 80 уплотнения вентиляционного кармана для образования герметичного барьера. В некоторых вариантах осуществления изобретения герметичное пространство 55 между вентиляционными карманами, или окружающее их, увеличено за счет включения дополнительной прокладки или распорки 56, содержащей адгезивный слой, который связывает термостойкий материал 72 с термолабильным материалом 80 и/или флюидным компонентом 5 и поддерживает герметичное уплотнение кассеты для тестирования в области отверстий после того, как одно или более отверстий являются открытыми, при этом предпочтительно также обеспечивается воздушный зазор для сообщения воздуха между открытыми отверстиями и/или необязательной расширительной камерой. В этом варианте осуществления изобретения тепло передается от источника 70 тепла через термостойкий материал 72 и герметичное пространство 55 к материалу 80 термолабильного уплотнения вентиляционного кармана, разрывая его и открывая вентиляционный карман 50. Микроконтроллер предпочтительно отвечает за передачу электрического тока к источнику тепла 70. Вентиляционный карман 50 предпочтительно открывается в замкнутое пространство, в результате чего газ внутри кассеты для тестирования может оставаться герметично закрытым относительно окружающей среды за пределами кассеты для тестирования. Закрытое пространство может содержать воздух внутри кассеты для тестирования, необязательно включая свободную воздушную камеру для обеспечения расширения газа, такую как расширительная камера. Как проиллюстрировано на Фиг. 2C, открытие вентиляционного кармана 50 приводит к сообщению газов в вентилируемой флюидной камере с газом расширительной камеры, поскольку вентиляционный карман 54 ранее был был разорван источником 71 тепла, и вентиляционный карман 54 находится в газовом сообщении с расширительной камерой. Полученное в результате пониженное давление в вентилируемой флюидной камере обеспечивает возможность жидкости самотеком поступать в вентилируемую камеру из камеры, расположенной над ней. Другие варианты осуществления изобретения вентиляционного кармана могут включать уплотнения, кроме термочувствительной мембраны, и могут использовать другие способы разрушения уплотнений, такие как прокол, разрыв или растворение. Фотография такой кассеты показана на Фиг. 2E.
Поверхность, противоположная открытой поверхности вентиляционного кармана, может при необходимости содержать выемку, выступ, неровность или другую подобную структуру, такую как выемка 7004 на Фиг. 45, для облегчения образования отверстия во время разрыва материала уплотнения отверстия. Такая конструкция также предпочтительно предотвращает повторное закрывание отверстия после разрыва уплотнения. Это может происходить в вариантах осуществления изобретения, содержащих монтажную плату с компонентами для поверхностного монтажа. В таких вариантах осуществления изобретения резисторы для поверхностного монтажа могут растягивать полиимидную пленку, проталкивая ее в отверстие в прокладке и вплотную к термолабильному материалу.
После того как уплотнение разрывается, расплавленный материал уплотнения может образовывать вторичное уплотнение с этим полиимидом, тем самым закрывая отверстие. В вариантах осуществления изобретения с гибкой платой, содержащей металлические дорожки, образующие нагревательные элементы, нагреватель может вызывать локальную деформацию полиимидной гибкой платы, часто образуя выступ (часто содержащий материал нагревателя), проходящий в отверстие в прокладке, насколько возможно перекрывая отверстие благодаря расплавленному материалу уплотнения. Выемка 7004 может способствовать в предотвращении такие случаи.
Герметичное пространство 55 при необходимости обеспечивает канал для других отверстий, вентиляционных карманов или камер (таких как расширительная камера 52). После вентиляционного отверстия флюидный компонент 5 остается изолированным от внешней среды 59. Расширительная камера 52 предпочтительно обеспечивает расширение газа во время нагревания путем буферизации объема воздуха/водяного пара либо путем обеспечения достаточно большого объема, в результате чего расширение газа из–за изменений температуры не оказывает практического влияния на давление в системе, или путем обеспечения расширения газа за счет смещения поршня (Фиг. 3), гибкого резервуара (Фиг. 4 сильфона (Фиг. 5) или гидрофобного барьера, который пропускает газ, но не макромолекулы через барьер (Фиг. 6). На Фиг. 3 в расширительной камере используется поршень, который перемещается при увеличении давления внутри герметичной флюидной системы. Расширительная камера служит для уменьшения или устранения накопления давления в герметичной системе. Смещение поршня происходит в ответ на повышенное давление в герметично закрытой кассете для тестирования, что снижает внутреннее давление внутри кассеты для тестирования в результате таких процессов, как расширение газа при нагревании. На Фиг. 4 отклонение резервуара происходит в ответ на повышенное давление внутри герметически закрытой кассеты для тестирования. Смещение резервуара снижает внутреннее давление внутри кассеты для тестирования, возникшее в результате таких процессов, как расширение газа при нагревании. На Фиг. 5 в ответ на повышенное давление внутри герметически закрытой кассеты для тестирования происходит растяжение сильфона. Растяжение сильфона снижает внутреннее давление внутри кассеты для тестирования, возникшее в результате таких процессов, как расширение газа при нагревании.
Расширительные камеры могут быть включены в качестве объема свободного воздуха, такого как включенный объем, показанный в расширительной камере 52 в верхней части кассеты для тестирования, проиллюстрированной на Фиг. 1. Как проиллюстрировано на Фиг. 7, чтобы облегчить изготовление кассеты минимальной толщины, расширительной камеры также могут быть встроены в воздушный зазор 440, образованный подходящим образом сконструированной прокладкой 420, когда она герметично закрыта для нагревания лабильного материала 410 и термостойкого материала 430 для формирования подложки флюидного компонента 400. Минимизация физических размеров кассеты для тестирования является предпочтительным для того, чтобы снизить транспортные расходы, уменьшить тепловую массу и обеспечить эстетически приятный и удобный дизайн. В дополнение к образованию объема воздуха для расширения газа прокладка 420 создает пространство между термостойким материалом 430 и термолабильным материалом 410, чтобы способствовать свободному движению воздуха через открытые отверстия, в то же время поддерживая герметичность системы для предотвращения воздействия на окружающую среду. Прокладка 420 предпочтительно является достаточно толстой, чтобы обеспечить достаточный воздушный зазор для уравновешивания давлений между открытыми отверстиями, но также является достаточно тонкой, чтобы не оказывать, практически, влияния на границу раздела между нагревателями и соответствующими вентиляционными карманами или герметизацию кассеты термостойким материалом. В вариантах осуществления данного изобретения, которые содержат гибкую плату, гибкая плата может содержать термостойкий материал, такой как полиимид, и в этом случае отдельный лист термостойкого материала 430 не требуется, например, как показано на Фиг. 8С. Использование расширительной камеры для снижения или уравновешивания давления внутри герметичной кассеты для тестирования гарантирует, что неравновесные давления не приводят к неблагоприятным или преждевременным перемещениям раствора внутри кассеты для тестирования, и что накопление давления не оказывает негативного влияния на требуемое движение жидкости, такое как движение между камерами или через каналы. Такой контроль давления, то есть установление назначенных распределений давления по всему устройству, позволяет системе работать как задумано независимо от атмосферного давления. Следовательно, расширительная камера позволяет использовать контролируемые перемещения жидкости, которые зависят от стабильного давления внутри системы, а также позволяет использовать герметически закрытую кассету для тестирования, что позволяет избежать недостатков выпуска из кассеты для тестирования в атмосферу, например, потенциального выброса ампликона в атмосферу. Кроме того, способ обеспечения потока жидкости путем снижения давления ниже по потоку жидкости, например, путем открытия отверстия в расширительной камере, устраняет необходимость в насосах, таких как те, которые создают положительное давление выше по потоку жидкости, или другие устройства с движущимися частями. Подобные преимущества возможны благодаря дренированию области ниже по потоку жидкости в относительно больший резервуар (такой как расширительная камера), по существу, под тем же давлением, что и в области ниже по потоку, что позволяет протекание жидкости под действием силы тяжести (при условии, что устройство находится в соответствующей ориентации). Размер расширительной камеры является предпочтительно достаточно большим для размещения паров реакции, образующихся во время анализа, без увеличения давления в системе до точки, где она преодолевает капиллярное или гравитационное усилие, необходимое для протекания жидкости.
В вариантах осуществления изобретения, где вторая камера представляет собой камеру амплификации, камера предпочтительно находится в контакте с нагревательными элементами для того, чтобы обеспечить средства для регулирования температуры, необходимой для поддержки амплификации нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления изобретения камера амплификации может содержать олигонуклеотиды по меньшей мере на части внутренней поверхности. На границе раздела между стенкой 95 камеры 30 и одним или более нагревательными элементами 100, как проиллюстрировано на Фиг. 2D, может быть преимущественным размещение теплопроводящего материала, такого как теплопроводная паста или теплопроводное соединение. Микроконтроллер предпочтительно модулирует ток на резистивном нагревательном элементе (элементах), предпочтительно с помощью металлоксидных полевых полупроводниковых транзисторов (MOSFET), на основе данных, собранных от датчика 110 температуры на печатной плате в сборе (PCA) 75, с использованием простого включения/выключения или пропорционально–интегрально–производного (PID) способа регулирования температуры или других алгоритмических способов регулирования температуры, известных специалистам в данной области.
Размещение нагревательных элементов, а в некоторых вариантах и соответствующего температурного датчика (датчиков), на одноразовом компоненте позволяет изготавливать высоковоспроизводимую тепловую связь между подсистемой регулирования температуры и камерами амплификации и обнаружения, с которыми они взаимодействуют. Этот подход обеспечивает высоконадежные средства соединения жидкостной подсистемы с электронной подсистемой терморегуляции путем формирования теплопроводного интерфейса в процессе производства. Полученный в результате превосходный тепловой контакт между компонентами электронного регулирования температуры и флюидной подсистемой приводит к быстрому уравновешиванию температуры и, следовательно, к быстрому анализу. Использование гибкой платы для обеспечения одноразовых резистивных нагревательных элементов, которые приплавлены к задней части подложки флюидного компонента либо непосредственно, либо с промежуточной прокладкой, обеспечивает недорогие средства для достижения превосходного теплового контакта, быстрого циклического изменения температуры и воспроизводимого производства. Резистивные нагревательные элементы для обратной транскрипции, амплификации и регулирования потока жидкости могут быть сформированы непосредственно в гибкой плате путем травления проводящего слоя гибкой платы, чтобы сформировать геометрические формы, демонстрирующие требуемое сопротивление. Такой подход устраняет необходимость в дополнительных электронных компонентах и упрощает производство при одновременном снижении затрат.
В варианте осуществления данного изобретения гибкая плата 799 для резистивного нагрева и вентиляционного отверстия показана на Фиг. 8. Использование гибкого нагревателя в качестве компонента одноразовой кассеты обеспечивает возможность конфигурирования подложки кассеты для того, чтобы позволить жидкости в нагретых флюидных камерах вступать в прямой контакт с материалом, составляющим плату гибкого нагревателя. К примеру, как проиллюстрировано на Фиг. 8С, окна 806 из термолабильного материала 807 (который предпочтительно содержит двухосноориентированный полистирол (BOPS)), который образует заднюю часть кассеты, могут быть расположены над флюидными камерами для того, чтобы обеспечить прямой контакт жидкости с гибкой платой 799. Прямой контакт между слоем гибкой платы и жидкостью для регулирования температуры с помощью нагревателей в гибкой плате обеспечивает систему с низкой тепловой массой, выполненную с возможностью быстрых изменений температуры. Чтобы обеспечить сбор данных о температуре для использования при регулировании температуры, датчик температуры может быть при необходимости встроен в гибкую плату, и/или могут быть использованы бесконтактные средства контроля температуры, такие как инфракрасный датчик. Резистивные нагревательные элементы, такие как нагревательный элемент 800, в гибкой плате могут быть использованы для разрыва отверстия, когда они расположены в регистрирующем устройстве с вентиляционным карманом. Электрические контактные площадки 812 подают ток на нагревательные элементы 800. Аналогичным образом, гибкая плата или платы могут содержать резистивные нагревательные элементы 802 и 803 для нагрева флюидных камер и необязательный резистивный нагревательный элемент 804 для регулирования температуры тест–полоски для анализа.
В этом варианте осуществления изобретения гибкая плата 799 также предпочтительно служит в качестве термостойкого уплотнения для поддержания герметичности кассеты, аналогично термостойкому материалу 72, описанному выше. При необходимости, дополнительный термостойкий слой (например, содержащий полиимид) может быть размещен между гибкой платой 799 и задним корпусом или панелью 805. Является предпочтительным, чтобы вокруг отверстий у резисторов 800 между термически лабильным материалом 807 и гибкой платой 799 размещалась проставка или прокладка 808 для того, чтобы обеспечить свободное движение воздуха через открытые отверстия при сохранении герметичности кассеты. Задний корпус или панель 805 предпочтительно содержат тонкий пластик и предпочтительно размещены над открытой поверхностью гибкой платы для того, чтобы защитить ее во время эксплуатации. Задний корпус или панель 805 могут содержать окна над нагревательными элементами на гибкой плате 799 для облегчения охлаждения и контроля температуры. Электрический контакт в составе управляющей электроники стыковочного узла (описанного ниже) может быть при необходимости представлен набором электрических контактных площадок 810, предпочтительно, содержащим краевой соединитель или контакты соединителя, такие как подпружиненные контакты.
Варианты осуществления изобретения камер кассеты для тестирования предпочтительно содержат материалы, способные выдерживать многократное нагревание и охлаждение до температур в диапазоне от около 30 °С до около 110 °C. Является еще более предпочтительным, чтобы камеры содержали материалы, способные выдерживать многократное нагревание и охлаждение до температур в диапазоне от около 30 °С до около 110 °С со скоростью изменения температуры порядка от около 10 °С до около 50 °С в секунду. Камеры предпочтительно способны удерживать растворы в них при температурах, подходящих для опосредованного теплом лизиса и биохимических реакций, таких как протоколы обратной транскрипции, термоциклирования или изотермической амплификации, предпочтительно управляемые программированием микроконтроллера. В некоторых направлениях практического применения амплификации нуклеиновой кислоты является предпочтительным провести начальную инкубацию при повышенной температуре, например, при температуре от около 37 °С до около 110 °С в течение периода от 1 секунды до 5 минут для того, чтобы денатурировать определяемую нуклеиновую кислоту. и/или активировать полимеразу с горячим стартом. Впоследствии реакционный раствор выдерживают при температуре амплификации в камере амплификации для изотермической амплификации или для амплификации на основе термоциклирования, при этом изменяют температуру по меньшей мере между двумя температурами, включая, но не ограничиваясь этим, температуру, которая приводит к денатурации двухцепочечной нуклеиновой кислоты и температуру, подходящую для отжига праймера путем гибридизации с мишенью и удлинения праймера посредством полимеризации нуклеиновой кислоты, катализируемой полимеразой. Продолжительность инкубации при каждой требуемой температуре в режиме термоциклирования может варьироваться в зависимости от состава последовательности определяемой нуклеиновой кислоты и состава реакционной смеси, но предпочтительно составляет от около 0,1 секунды до около 20 секунд. Повторные нагрев и охлаждение обычно проводят в течение от около 20 до около 50 циклов. В вариантах осуществления изобретения, включающих способы изотермической амплификации, температуру реакционного раствора поддерживают на постоянном уровне (в некоторых случаях после начальной инкубации при повышенной температуре) в течение от около 3 минут до около 90 минут в зависимости от используемых технических способов амплификации. После того как реакция амплификации завершается, раствор реакции амплификации транспортируют, открывая отверстие, которое сообщается с камерой ниже камеры, используемой для амплификации, в нижнюю камеру для выполнения дальнейших манипуляций с амплифицированными нуклеиновыми кислотами. В некоторых вариантах осуществления изобретения манипуляции включают денатурацию амплифицированных нуклеиновых кислот и гибридизацию для обнаружения олигонуклеотидов, конъюгированных с детектирующими частицами. В некоторых вариантах осуществления изобретения амплифицированные нуклеиновые кислоты гибридизуются для обнаружения олигонуклеотидов, конъюгированных с детектирующими частицами и с целью захвата маркeрных субстратов, иммобилизованных на тест–полоске для анализа.
В некоторых вариантах осуществления изобретения дополнительные биохимические реакции могут проводиться в камере амплификации до, во время или после реакции амплификации. Такие процессы могут включать, но не ограничиваются этим, обратную транскрипцию, в которой РНК транскрибируется в кДНК, мультиплексирование, при котором множество пар праймеров одновременно амплифицируют множество определяемых нуклеиновых кислот, и амплификацию в реальном времени, когда продукты амплификации обнаруживаются в процессе реакции амплификации. В последнем случае камера амплификации может не содержать клапан или выпускной канал, и камера амплификации предпочтительно должна содержать оптическое окно или иным образом быть сконфигурированной для обеспечения возможности исследования концентрации ампликона во время процесса реакции амплификации. В одном варианте осуществления изобретения амплификации в реальном времени либо флуоресцентно меченные олигонуклеотиды, комплементарные определяемой нуклеиновой кислоте, либо флуоресцентные красители, специфичные для двухцепочечной ДНК, контролируются на интенсивность флуоресценции с использованием источника света возбуждения, такого как светодиоды или диодный лазер (лазеры), и детектора, такого как фотодиод, и соответствующих оптических компонентов, включая, но не ограничиваясь этим, оптические фильтры.
Обнаружение:
Варианты осуществления изобретения камеры 230 обнаружения предпочтительно предусматривают специфическое мечение амплифицированных определяемых нуклеиновых кислот, генерируемых в камере амплификации. Как проиллюстрировано на Фиг. 2А, камера обнаружение 230 предпочтительно содержит капиллярный пул или пространство 93, и тест–полоску для анализа 235. Детектирующие частицы , содержащие красящие полистирольные микросферы, латекс, коллоидное золото, коллоидную целлюлозу, нанозолото, или полупроводниковые нанокристаллы предпочтительно присутствует в капиллярном пуле 93. Вышеуказанные детектирующие частицы могут содержать олигонуклеотиды, комплементарные определяемому аналиту, или могут содержать лиганды, способные связываться с амплифицированной определяемой нуклеиновой кислотой, такие как биотин, стрептавидин, гаптен или антитело, направленное против метки, такой как гаптен, присутствующий в определяемых амплифицированных нуклеиновых кислотах. Камера 230 обнаружения может содержать детектирующие частицы, которые высушены, лиофилизированы или присутствуют по меньшей мере на части внутренней поверхности в виде высушенной смеси детектирующих частиц в носителе, таком как полисахарид, детергент, белок или другое соединение, известное специалистам в данной области, для облегчения ресуспендирования детектирующих частиц. В некоторых вариантах осуществления изобретения тест–полоска для анализа (по технологии латеральной диффузии) может содержать детектирующие частицы. В других вариантах осуществления изобретения канал 135 с углублением для реагента, ведущий к камере обнаружения, может содержать детектирующие частицы. Камера обнаружения может быть выполнена с возможностью нагреваться и/или охлаждаться.
Подходящие детектирующие частицы включают, но не ограничиваются ими, флуоресцентные красители, специфичные для двухцепочечной нуклеиновой кислоты, флуоресцентно модифицированные олигонуклеотиды или конъюгированные с олигонуклеотидом окрашенные микрочастицы, или коллоидное золото, или коллоидную целлюлозу. Обнаружение ампликона включает «обнаружение олигонуклеотида или другого «маркeрного субстрата обнаружения», который является комплементарным, или способным иным образом специфически связываться с ампликоном, подлежащим обнаружению. Конъюгирование детектируемого олигонуклеотида с микрочастицей может происходить с использованием частиц, покрытых стрептавидином и биотинилированных олигонуклеотидов, или с помощью карбодиимидных химических методов, в которых карбоксилированные частицы активируются в присутствии карбодиимида и специфически взаимодействуют взаимодействуют с первичными аминами, присутствующими в детектируемом олигонуклеотиде. Конъюгирование детектируемого олигонуклеотида с детектируемым фрагментом может происходить внутри или на 5'–конце, или 3'–конце. Обнаруживаемые олигонуклеотиды могут быть присоединены непосредственно к микрочастице или, более предпочтительно, через спейсерный фрагмент, такой как этиленгликоль или полинуклеотиды. В некоторых вариантах осуществления изобретения детектирующие частицы могут связываться с несколькими видами амплифицированных нуклеиновых кислот, возникающих в результате таких процессов, как мультиплексная амплификация. В этих вариантах осуществления изобретения конкретное обнаружение каждого вида амплифицированной нуклеиновой кислоты может быть реализовано путем обнаружения на тест–полоске для анализа с использованием способа, специфичного для каждого вида, подлежащего обнаружению. В таком варианте осуществления изобретения метка, введенная в определяемые нуклеиновые кислоты во время амплификации, может быть использована для мечения всех присутствующих амплифицированных видов, в то время как последующая гибридизация меченых нуклеиновых кислот с видоспецифическими маркeрными субстратами захвата, иммобилизованными на тест–полоске для анализа, используется для определения того, какие специфические виды амплифицированной ДНК присутствуют.
В случае продукта амплификации двухцепочечной ДНК нагревание реакционного раствора после введения в камеру обнаружения может облегчать обнаружение. Плавление двухцепочечной ДНК или денатурирование вторичной конструкции одноцепочечной ДНК, а затем охлаждение в присутствии детектируемого олигонуклеотида приводит к специфичной для последовательности маркировке амплифицированной определяемой нуклеиновой кислоты.
Нагревательный элемент, расположенный под камерой обнаружения, может быть использован для нагрева объема жидкости в течение от около 1 до около 120 секунд, чтобы инициировать плавление двухцепочечной ДНК или денатурацию вторичной структуры одноцепочечной ДНК. В связи с тем, что раствору дают остыть до комнатной температуры, амплифицированная определяемая нуклеиновая кислота может специфически гибридизоваться с детектирующими микрочастицами. Реакционный объем затем предпочтительно направляют в область камеры обнаружения ниже камеры для мечения путем открытия отверстия камеры обнаружения.
Для эффективного мечения солюбилизированные детектирующие частицы предпочтительно хорошо смешивают с реакционным раствором. В вариантах осуществления изобретения детектирующие частицы могут быть локализованы в капиллярном пуле 93 на выпускном отверстии канала 135, чтобы облегчить смешивание с раствором, когда он входит в камеру 230.
Детектирующие частицы в капиллярном пуле 93 могут необязательно представлять собой лиофилизированные детектирующие частицы. Капиллярный пул обеспечивает улучшенное смешивание и диспергирование частиц, чтобы облегчить смешивание детектирующих частиц с нуклеиновыми кислотами, с которыми связываются детектирующие частицы. Капиллярный пул также увеличивает равномерность миграции частиц на тест–полоске для анализа, как проиллюстрировано на Фиг. 9. Капиллярный пул является особенно преимущественным для анализов с малым объемом, таких как анализы с объемом менее 200 мкл или, более конкретно, менее чем около 100 мкл, или даже более конкретно, менее чем около 60 мкл или даже более конкретно, около 40 мкл по объему.
Варианты осуществления изобретения камеры обнаружения в соответствии с данным изобретением обеспечивают специфическое обнаружение амплифицированных определяемых нуклеиновых кислот. В некоторых вариантах осуществления изобретения обнаружение осуществляется путем капиллярного затекания раствора, содержащего меченый ампликон, через абсорбирующую полоску, состоящую из пористого материала (такого как целлюлоза, нитроцеллюлоза, полиэфирсульфон, поливинилиденфторид, нейлон, заряженный модифицированный нейлон или политетрафторэтилен) с упорядоченной структурой в виде линий, точек, микрочипов или других визуально различимых элементов, содержащих связывающую часть, способную специфически связываться с меченым ампликоном, прямо или косвенным образом. В некоторых вариантах осуществления изобретения компонент абсорбирующей полоски устройства содержит до трех пористых подложек в физическом контакте: прокладку с сурфактантом, содержащую амфипатические реагенты для усиления впитывания, зону обнаружения, содержащую пористый материал (такой как целлюлоза, нитроцеллюлоза, полиэфирсульфон, поливинилидинфторид, нейлон, заряженный модифицированный нейлон или политетрафторэтилен), с которым иммобилизован по меньшей мере один связывающий фрагмент, способный селективно связывать меченый ампликон, и/или абсорбирующую прокладку для обеспечения дополнительной абсорбирующей способности.
Несмотря на то, что детектирующие частицы могут быть при необходимости включены в пористые материалы с технологией латеральной диффузии в камере обнаружения, в отличие от ранее описанных устройств обнаружения (с технологией латеральной диффузии), детектирующие частицы предпочтительно вместо этого удерживаются выше по потоку в капиллярном пуле, где существенно улучшенное образование связывающих комплексов между ампликоном и детектирующими частицами может выполняться до введения или одновременно с введением полученных в результате меченых нуклеиновых кислот в пористые компоненты устройства.
«Захватывающий олигонуклеотид» или «маркeрный субстрат захвата» является предпочтительно иммобилизованным на элементе тест–полоски для анализа устройства любым из множества средств, известных специалистам в данной области, таким как, например, УФ–облучение. Маркeрный субстрат захвата предназначен для захвата меченой нуклеиновой кислоты в связи с тем что раствор, содержащий меченую нуклеиновую кислоту, проходит через зону захвата, что приводит к увеличению концентрации метки в месте иммобилизации маркeрного субстрата захвата, таким образом создавая детектируемый сигнал, указывающий на присутствие ампликона (ампликонов) меченой определяемой нуклеиновой кислоты. Одна тест–полоска для анализа может быть структурирована с одним или более маркeрными субстратами захвата для обеспечения мультиплексного обнаружения множества ампликонов, определения последовательности ампликона, количественного определения ампликона путем расширения линейности детектирующего сигнала и контроля качества анализа (положительного и отрицательного контроля).
Флюидный компонент
Варианты осуществления изобретения флюидного компонента предпочтительно содержат пластик, такой как акрил, поликарбонат, полиэтилентерефталат гликоль (PETG), полистирол, сложный полиэфир, полипропилен и/или другие подобные материалы. Эти материалы являются легко доступными и могут быть изготовлены стандартными способами. Флюидные компоненты содержат как камеры, так и каналы. Флюидные камеры содержат стенки, две поверхности и соединяются с одним или более каналами, такими как впускной, выпускной, углубление или отверстие. Каналы могут соединять две флюидные камеры или флюидную камеру и углубление и содержать стенки и две поверхности. Конструкция флюидной камеры предпочтительно максимизирует отношение площади поверхности к объему, чтобы облегчить нагрев и охлаждение. Внутренний объем камеры предпочтительно составляет от около 1 микролитра до около 200 микролитров.
Площадь поверхности камеры, соприкасающейся с раствором, предпочтительно соответствует площади, с которой стыкуются нагревательные элементы, чтобы обеспечить равномерную температуру жидкости во время нагревания. Форма флюидных камер может быть выбрана для сопряжения с нагревательными элементами и для обеспечения подходящих геометрий для входа и выхода раствора. В некоторых вариантах осуществления изобретения объем камеры может быть больше, чем объем жидкости, чтобы обеспечить пространство для пузырьков, которые появляются в ходе работы устройства. Флюидные камеры могут иметь увеличенные удлиненные части, ведущие к вентиляционным каналам, чтобы гарантировать, что жидкость не будет проникать в канал под действием капилляров или иным образом блокировать вентиляционный механизм.
В некоторых вариантах осуществления изобретения может быть предпочтительным уменьшить или исключить попадание воды в жидкой или газообразной фазе в камеру до времени высвобождения раствора. Повышенные температуры, используемые в технологических процессах в соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения, генерируют пары (например, газофазную воду), которые могут привести к преждевременному проникновению влаги внутрь канала, камеры или углубления. Уменьшение проникновения жидкой фазы или газовой фазы может быть предпочтительным для сохранения, например, высушенного состояния высушенных реагентов или лиофилизированных реагентов, присутствующих в камере или углублении. В некоторых вариантах каналы могут быть временно или полностью заблокированы материалом, который может быть удален посредством внешних факторов, таких как тепло, влага и/или давление. Материалы, подходящие для временной блокировки каналов, включают, но не ограничиваются ими, латекс, целлюлозу, полистирол, горячий клей, парафин, воски и масла.
В некоторых вариантах осуществления изобретения кассета для тестирования содержит предпочтительно отлитый под давлением флюидный компонент, содержащий чашку для образца, камеры, каналы, вентиляционные карманы и направители энергии. Флюидный компонент кассеты для тестирования, отлитый под давлением, предпочтительно содержит пластик, подходящий для ультразвукового приваривания к пластиковой подложке аналогичного состава. В одном варианте осуществления изобретения флюидный компонент кассеты для тестирования содержит один отлитый под давлением элемент, который ультразвуковым способом приварен к материалу подложки. Направители энергии представляют собой необязательные конструктивные особенности флюидного компонента, которые направляют ультразвуковую энергию только в те области термолабильного слоя, которые предназначены для соединения с флюидным компонентом. Отлитый под давлением флюидный компонент может быть при необходимости размещен в корпусе. На Фиг. 7 проиллюстрирована кассета, содержащая предпочтительно отлитый под давлением флюидный компонент 400 (предпочтительно содержащий полимер, такой как ударопрочный полистирол (HIPS), полиэтилен, полипропилен или NAS 30, стирол–акриловый сополимер), термолабильный материал 410 (содержащий, например, двухосноориентированный полистирол (BOPS), который имеет относительно низкую температуру плавления около 239 °С и температуру стеклования около 100 °С, которая является достаточной , чтобы выдерживать повышенные температуры при денатурации, или поликарбонат, который имеет температуру плавления 265 °С и температуру стеклования 150 °C), клеевой разделитель 420 (содержащий, например, силиконовый клей для переноса, который предпочтительно не включает носитель, акриловый клей с полиэфирным носителем или любой клей, который может противостоять повышенным температурам устройства), и термостойкий слой 430. Термолабильный материал 410 разрывается при помощи тепла, которое предпочтительно передается через вышележащий теплостойкий слой 430 (содержащий, например, полиимид или другой полимер, имеющий высокую термостойкость). Расплавление термолабильного материала над вентиляционными конструктивными элементами кассеты открывает отверстие и вентиляционный канал в расширительную камеру, обеспечивая тем самым выравнивание давления внутри кассеты. Вышележащий термостойкий слой 430 предпочтительно остается неповрежденным, что позволяет кассете сохранять герметичное уплотнение после открытия отверстия.
В некоторых вариантах осуществления изобретения клеевой разделитель содержит свободную область 440, которая может служить в качестве расширительной камеры, чтобы сдерживать расширение газов во время нагревания для того, чтобы снизить внутреннее давление герметичной кассеты. Термолабильный слой 410 является связанным с флюидным компонентом 400 при помощи способа или процесса связывания, такого как ультразвуковая сварка или использование адгезива. Полученная часть затем связывается с разделителем и термостойким слоем. В некоторых вариантах осуществления изобретения термостойкий слой сконструирован таким образом, что он не присутствует над нагретыми камерами. В других вариантах осуществления изобретения термостойкий слой присутствует над нагретыми камерами. В еще других вариантах осуществления изобретения клеевой разделитель и термостойкие слои присутствуют только над областью, которая находится в конструктивных особенностях вентиляционного кармана флюидного компонента. В этом варианте осуществления изобретения термостойкий слой может быть при необходимости размещен непосредственно над термолабильным материалом в областях, расположенных в нагреваемых камерах.
В некоторых вариантах осуществления изобретения толщина флюидных камер и стенок канала находится в диапазоне от около 0,025 мм до около 1 мм и предпочтительно в диапазоне от около 0,1 мм до около 0,5 мм. Эта толщина предпочтительно отвечает требованиям как конструктивной целостности флюидного компонента, так и поддержания герметичности закрытой камеры при высоких температурах и соответствующих давлениях. Толщина стенок канала, в частности стенок вентиляционных каналов, является предпочтительно меньше толщины камер и находится в диапазоне от около 0,025 мм до около 0,25 мм. Ширина входного и выходного отверстий каналов предпочтительно выбирается для усиления капиллярности. Малый вентиляционный канал придает улучшенную жесткость флюидному компоненту, не оказывая вредного влияния на вентиляцию. Пластиковые формообразующие поверхности флюидного компонента являются предпочтительно более тонкими, чем те, которые формуют стенки для того, чтобы максимизировать теплопередачу. Дополнительные терморазрывы прорезают некоторые компоненты флюидного компонента и окружают камеры амплификации и обнаружения, способствуя тепловой изоляции камер с регулируемой температурой.
В некоторых вариантах осуществления изобретения перед тем, как флюидный компонент 400 будет связан с термолабильным материалом подложки 410, могут быть включены дополнительные компоненты кассеты для тестирования, такие как лиофилизированные реагенты 16, узел 230 тест–полоски для анализа и детектирующие частицы. В некоторых вариантах осуществления изобретения компоненты могут быть ламинированы путем приложения давления для обеспечения хорошей адгезии. В некоторых вариантах осуществления изобретения компоненты могут быть скреплены комбинацией способов, таких как чувствительные к давлению адгезивы и ультразвуковая сварка. Следует избегать использования адгезивов, которые, как известно или выявлено отрицательно влияют на эффективность реакций амплификации нуклеиновой кислоты. В изобретении были успешно использованы адгезивы на основе акрила или кремния. Одной предпочтительной адгезивной пленкой является S17876, которая поставляется компанией Advanced Adhesives Research. Другие адгезивы могут быть использованы, если установлено, что они химически совместимы с используемыми буферами, пластиками и химическими реагентами, обеспечивая при этом надежную герметизацию при возникающих температурах во время работы устройства.
Как проиллюстрировано на Фиг. 2 и 7, вентиляционные карманы предпочтительно отличаются от других камер по своей конструкции. После создания флюидного компонента, как описано выше, вентиляционные карманы имеют открытую поверхность на стороне флюидного компонента, которая будет прилегать к печатной плате в сборе (PCA) 75 либо непосредственно, либо в некоторых вариантах осуществления изобретения опосредованно через промежуточный воздушный зазор 420 или вентиляционный карман 54 и термостойкий материал 430. Чтобы сформировать вентиляционный карман, для герметизации камеры присоединяется дополнительный пластиковый компонент, предпочтительно содержащий тонкую термолабильную мембрану 410, смежную с резистором 70 отверстия печатной плате в сборе (PCA). Пленка 410 содержит материал, подходящий для ультразвуковой сварки с отлитым под давлением флюидным компонентом, такой как полистирол, хотя могут использоваться и другие подобные материалы. Эта пленка хорошо подходит как для герметизации вентиляционного кармана, так и для обеспечения легкой перфорации и, таким образом, для выпуска воздуха в камеру более низкого давления, когда ток проходит через резистор отверстия, вызывая быстрое повышение температуры.
Предпочтительно пленка является достаточно стабильной при нагревании, в результате чего материал может выдерживать температуры, используемые в других операциях с кассетой для тестирования, таких как тепловой лизис, обратная транскрипция и амплификация нуклеиновой кислоты. Использование материала со стабильностью в температурных диапазонах, используемых для денатурации, мечения, обратной транскрипции, амплификации нуклеиновой кислоты и обнаружения, но с температурой плавления, легко достижимой резистором 70, позволяет использовать один материал для подложки отлитого под давлением флюидного компонента 400, служащий как поверхностью камер, так и поверхностью вентиляционного кармана. В некоторых вариантах осуществления изобретения дополнительная температурная стабильность в областях камер с регулируемой температурой может быть реализована с помощью вышележащей пленки из термостойкого материала, такого как полиимид. В других вариантах осуществления изобретения окно в термолабильной пленке находится в камерах с регулируемой температурой для того, чтобы обеспечить прямой контакт между жидкостями в камере и основой гибкой платы, приплавленной к задней стороне кассеты для тестирования.
Дополнительные компоненты флюидного компонента
Как описано выше, несколько дополнительных компонентов являются предпочтительно включенными в флюидный компонент в соответствии с данным изобретением перед окончательным соединением. Реагенты, включая буферы, соли, дезоксирибонуклеозидтрифосфат, рибонуклеозидтрифосфат, олигонуклеотидные праймеры и ферменты, такие как ДНК–полимераза и обратная транскриптаза, могут быть лиофилизированы или высушены сублимацией в таблетки, сферы или лепешки перед сборкой устройства.
Лиофилизация реагента является хорошо известной в данной области и включает дегидратацию аликвот замороженного реагента путем сублимации в вакууме. Путем добавления конкретных композиций лиопротекторов, таких как сахара (ди– и полисахариды) и полиспирты, к реагентам перед замораживанием может быть сохранена активность ферментов и повышена скорость регидратации. Лиофилизированные таблетки, сферы или лепешки с реагентами изготавливаются стандартными способами и, будучи сформированными, являются достаточно долговечными, и могут быть легко помещены внутрь конкретных камер флюидного компонента перед ламинированием конечной поверхности. Является более предпочтительным, чтобы углубления были включены в флюидную сеть, чтобы обеспечить возможность размещения таблеток, сфер или лепешек с лиофилизированными реагентами в флюидном компоненте перед связыванием флюидного компонента с материалом подложки. Путем выбора геометрии флюидной сети и порядка расположения углубления, образец может реагировать с требуемым лиофилизированным реагентом в желаемое время для оптимизации производительности. Например, путем помещения лиофилизированных (или высушенных) сфер с реагентами для обратной транскрипции (RT) и амплификации в два отдельных углубления в путях потока реакционной камеры обратной транскрипции (RT) и камеры амплификации обеспечивается оптимальная реакция обратной транскрипции без влияния ферментов амплификации. В дополнение к этому, чтобы минимизировать влияние ферментов обратной транскрипции (RT) на последующую реакцию амплификации, ферменты обратной транскрипции (RT) после реакции обратной транскрипции (RT), представленные в реакции обратной транскрипции (RT), могут быть инактивированы нагреванием перед введением в реагенты для амплификации, чтобы минимизировать их влияние на амплификацию.
При необходимости, другие соли, поверхностно–активные вещества и другие усиливающие химические вещества могут быть добавлены в различные углубления для того, чтобы модулировать эффективность анализа. Кроме того, эти углубления облегчают смешивание лиофилизированных реагентов с жидкостями, когда они проходят через углубление, а также служат для изоляции лиофилизированных материалов от ультразвуковой энергии во время ультразвуковой сварки, и для изоляции лиофилизированных реагентов от экстремальных температур во время этапов нагревания теста перед их солюбилизацией. В дополнение к этому углубления обеспечивают, чтобы лиофилизированные таблетки не сжимались и не измельчались во время производства, что позволяет им оставаться пористыми для того, чтобы минимизировать время регидратации.
В некоторых вариантах осуществления изобретения детектирующие микрочастицы являются еще одним дополнительным компонентом флюидного компонента. В некоторых вариантах осуществления изобретения эти микрочастицы могут быть лиофилизированы, как описано для реагентов реакции выше. В других вариантах осуществления изобретения микрочастицы в жидком буфере могут быть непосредственно нанесены на внутреннюю поверхность флюидной камеры и высушены перед окончательной сборкой кассеты для тестирования. Жидкий буфер, содержащий микрочастицы, предпочтительно также содержит сахара или полиспирты, которые способствуют регидратации. Включение микрочастиц в водный буфер непосредственно в флюидный компонент перед сушкой может упростить и снизить конечную стоимость производства, а полное смешивание лиофилизированных частиц с реакционным раствором и денатурация двухцепочечных нуклеиновых кислот или двухцепочечных областей нуклеиновой кислоты в одноцепочечную нуклеиновую кислоту может быть облегчено путем нагревания или применения пузырчатого режима кипения. В некоторых вариантах осуществления изобретения лиофилизированные детектирующие частицы помещают в углубления в флюидной сети. В других вариантах осуществления изобретения лиофилизированные или высушенные детектирующие частицы помещают в пространство 93 непосредственно под тест–полоской для анализа. В других вариантах осуществления изобретения детектирующие частицы являются высушенными или лиофилизированными в гигроскопичной подложке в капиллярной связи с тест–полоской для анализа или являются высушенными или лиофилизированными непосредственно на тест–полоске для анализа. Капиллярная связь может представлять собой прямой физический контакт указанной гигроскопичной подложки с тест–полоской для анализа или непрямой, когда капиллярная связь проходит на промежуточном расстоянии, состоящем из области канала или камеры, через которую достигается капиллярный транспорт для того, чтобы транспортировать жидкость от содержащей большое количество детектирующих частиц гигроскопичной подложки к тест–полоске для анализа.
В некоторых вариантах осуществления изобретения данного изобретения узел тест–полоски для анализа (по технологии латеральной диффузии) является также встроенным в флюидный компонент. Тест–полоска для анализа предпочтительно содержит мембранный узел, состоящий по меньшей мере из одного пористого компонента и, при необходимости, может содержать абсорбирующую прокладку, детектирующую мембрану, прокладку с сурфактантом и опорную пленку. Детектирующая мембрана предпочтительно изготовлена из нитроцеллюлозы, целлюлозы, полиэфирсульфона, поливинилидинфторида, нейлона, заряженного модифицированного нейлона или политетрафторэтилена и может иметь основу из пластиковой пленки. Как описано выше, маркерный субстрат захвата может быть нанесен и необратимо иммобилизован на детектирующей мембране в виде линий, пятен, микрочипов или любого порядка расположения, который может быть визуализирован невооруженным глазом человека или автоматической системой обнаружения, такой как система визуализации. Осажденные олигонуклеотиды могут быть иммобилизованы на постоянной основе путем УФ–облучения детектирующей мембраны после нанесения маркерного субстрата захвата.
Прокладка с сурфактантом может содержать пористый субстрат, предпочтительно с минимальными свойствами связывания нуклеиновой кислоты и удержания жидкости, что обеспечивает беспрепятственную миграцию продукта нуклеиновой кислоты и детектирующих микрочастиц. Прокладка с сурфактантом может содержать такие материалы, как стекловолокно, целлюлоза или сложный полиэфир. В вариантах осуществления изобретения составы, содержащие по меньшей мере один амфипатический реагент, являются высушенными на прокладке с сурфактантом для того, чтобы обеспечить равномерную миграцию образца через детектирующую мембрану. Абсорбирующая прокладка может содержать любой абсорбирующий материал и способствует обеспечению впитывания образца через узел детектирующей мембраны. Используя клейкую опорную пленку, такую как двухсторонняя клейкая пленка, в качестве основы, компонент детектирующей мембраны собирают, сначала устанавливая детектирующую мембрану, а затем при необходимости абсорбирующую прокладку и/или прокладку с сурфактантом в физическом контакте с детектирующей мембраной с перекрытием от около 1 мм до около 2 мм. В некоторых вариантах осуществления изобретения детектирующая мембрана может иметь косвенную капиллярную связь с прокладкой с сурфактантом, где существует физическое разделение между прокладкой с сурфактантом и детектирующей прокладкой с промежуточным пространством, состоящим из капиллярного пространства, в котором жидкости могут проходить через пространство с использованием капиллярного эффекта. В некоторых вариантах осуществления изобретения прокладка с сурфактантом или область прокладки с сурфактантом может содержать детектирующие частицы, высушенные детектирующие частицы или лиофилизированные детектирующие частицы.
Кассета с тремя камерами
В некоторых вариантах осуществления изобретения могут быть включены дополнительные реакционные камеры и/или дополнительные углубления для высушенных или лиофилизированных реагентов. В некоторых вариантах осуществления изобретения такая конструкция облегчает тесты, в которых является предпочтительным обеспечить начальную отдельную реакцию лизиса до обратной транскрипции и амплификации. Как проиллюстрировано на Фиг. 37А, 37В и 38, кассета 5000 содержит крышку 5020, герметизирующую расширительную камеру 5021, гибкую нагревательную плату 5022, предпочтительно расположенную в тесном контакте с флюидным компонентом 5023, и заднюю крышку 5024, которая скрывает плату от пользователя. Образец, содержащий нуклеиновые кислоты, вводится в чашку для образца 5002 через отверстие для образца 5001.
Образец свободно протекает в углубление 5003, где он растворяет первый лиофилизированный сферический элемент 5004, предпочтительно содержащий реагенты для лизиса, перед тем как течь вниз по каналу 5005 в первую реакционную камеру 5006. Этот свободный поток облегчается за счет использования вентиляционного канала 5007, который соединяется с верхней частью чашки для образца. 5002. Вентиляционный канал 5007 может дополнительно соединяться с расширительной камерой 5021 через отверстие 5008. В герметичном воздушном пространстве ниже первой реакционной камеры 5006 создается незначительно избыточное давление в связи с потоком жидкости и приводит к тому, что поток останавливается чуть ниже первой реакционной камеры 5006. Первую реакционную камеру 5006 затем предпочтительно нагревают до определенной температуры для способствования надлежащей реакции с реагентами для лизиса, лизирования биологических частиц и/или клеток в образце, выделения любых присутствующих в нем нуклеиновых кислот.
Открытие выпускного клапана 5009, соединенного с верхней частью второй реакционной камеры 5011, затем облегчает поток образца во второе углубление, где растворяется второй лиофилизированный сферический элемент 5010, предпочтительно содержащий реагенты для обратной транскрипции. Затем жидкость поступает во вторую реакционную камеру 5011, где ее поток останавливается в результате повышенного давления воздуха в замкнутом объеме воздуха ниже потока. Затем вторую реакционную камеру 5011 предпочтительно затем нагревают до соответствующей температуры для того, чтобы облегчить процесс обратной транскрипции.
Открытие следующего выпускного клапана 5009, соединенного с верхней частью третьей реакционной камеры 5013, инициирует поток образца из второй реакционной камеры 5011 через третье углубление, где растворяется лиофилизированный сферический элемент 5012, предпочтительно содержащий лиофилизированные реагенты для амплификации ПЦР. Затем образец поступает в третью реакционную камеру 5013, где подвергается термическому циклированию для амплификации определяемых аналитов, присутствующих в образце.
Впоследствии открытие выпускного клапана 5009, соединенного с дальним концом полоски 5014 (с технологией латеральной диффузии), позволяет образцу, который теперь содержит амплифицированные аналиты, протекать к полоске 5014 (с технологией латеральной диффузии) для обнаружения аналитов, как описано ранее.
Элементы управления потоком
Конструкция флюидного компонента может при необходимости содержать элементы управления потоком внутри реакционных камер или на выходах из них. Эти элементы отклоняют поток, поступающий в камеру, к стороне камеры, противоположной выпускному отверстию, до того, как поток входит в выпускное отверстие. В результате этого поток поступает в выходной канал с меньшей скоростью, уменьшая расстояние, по которому жидкость стекает по каналу до ее остановки. Кроме того, горизонтальная составляющая пути потока добавляет длину к каналу без добавления вертикального расстояния между камерами, увеличивая эффективную длину пути потока, поэтому это является достаточным для того, чтобы остановить поток в требуемом местоположении на основе уменьшенной скорости потока. Это обеспечивает более короткое вертикальное расстояние между камерами кассеты, поскольку требуется меньше вертикального канала. Кроме того, перенаправление потока через реакционную камеру создает закручивающее действие в потоке внутри камеры, улучшая смешивание реагентов с жидкостью образца. Элемент управления потоком может иметь любую форму.
В варианте осуществления изобретения, проиллюстрированном на Фиг. 39, жидкость поступает в реакционную камеру 4003 из впускного канала 4002 и протекает к нижней части реакционной камеры, где она перенаправляется к стороне реакционной камеры 4003, противоположной отверстию во впускной канал 4002, посредством треугольного элемента 4001 управления потоком. В связи с тем, что поток продолжается до противоположного угла 4004, поток разделяется, при этом некоторая часть поступает в выходное отверстие 4005, в то время как остальная часть соприкасается со стенкой и направляется вверх, создавая эффект завихрения, который улучшает смешивание. Поток в выпускном отверстии предпочтительно образует серповидную форму и проходит через выпускной канал 4006 по направлению к следующей реакционной камере или углублению для лиофилизированных сферических элементов. В связи с тем, что выпускной канал 4006 является герметично закрытым ниже реакционной камеры 4003, жидкость перемещается вдоль выходного канала 4006 с увеличением давления воздуха в канале ниже потока до достижения равновесия с напором давления, в связи с этим останавливая поток. В этом варианте осуществления изобретения выпускное отверстие 4005 сужается от реакционной камеры 4003 к выпускному каналу 4006 , чтобы эффективно образовать серповидную форму потока, который впоследствии может увеличить давление в закрытом воздушном пространстве ниже по потоку. Это большее отверстие в выпускном канале предпочтительно обеспечивает увеличенный объем сжимаемого воздуха, в результате чего серповидная форма потока может быть надежно сформирована в более широком отверстии.
В варианте осуществления изобретения, проиллюстрированном на Фиг. 40, жидкость поступает в реакционную камеру 4103 из впускного канала 4102 и протекает к нижней части реакционной камеры, где она перенаправляется к стороне реакционной камеры 4103, противоположной отверстию во впускной канал 4102, посредством треугольного элемента управления потоком 4101. В связи с тем, что поток продолжается до противоположного угла 4104, поток разделяется, при этом некоторая часть поступает в выходное отверстие 4105, в то время как остальная часть соприкасается со стенкой и направляется вверх, создавая эффект завихрения, который улучшает смешивание. Поток в выпускном отверстии предпочтительно образует серповидную форму и проходит через выпускной канал 4106 по направлению к следующей реакционной камере или углублению для лиофилизированных сферических элементов. В связи с тем, что выпускной канал 4106 является герметично закрытым ниже реакционной камеры 4103, жидкость перемещается вдоль выходного канала 4106 с увеличением давления воздуха в канале ниже потока до достижения равновесия с напором давления, в связи с этим останавливая поток. В этом варианте осуществления изобретения выпускное отверстие 4105 и выпускной канал 4106 имеют одинаковую ширину. В этом варианте осуществления изобретения образование серповидной формы потока в реакционной камере может быть несколько более надежным в результате более узкого канала. Серповидная форма потока впоследствии увеличивает давление в закрытом воздушном пространстве ниже по потоку.
В варианте осуществления изобретения, проиллюстрированном на Фиг. 41, жидкость поступает в реакционную камеру 4103 из впускного канала 4202 и протекает к нижней части реакционной камеры, где она перенаправляется к стороне реакционной камеры 4203, противоположной отверстию во впускной канал 4202, посредством треугольного элемента управления потоком 4201. В связи с тем, что поток продолжается до противоположного угла 4204, поток разделяется, при этом некоторая часть поступает в выходное отверстие 4205, в то время как остальная часть соприкасается со стенкой и направляется вверх, создавая эффект завихрения, который улучшает смешивание. В этом варианте осуществления изобретения выпускное отверстие 4205 ориентировано по существу вертикально. Поток в выпускном отверстии предпочтительно образует серповидную форму и проходит через выпускной канал 4206 по направлению к следующей реакционной камере или углублению для лиофилизированных сферических элементов. В связи с тем, что выпускной канал 4206 является герметично закрытым ниже реакционной камеры 4203, жидкость перемещается вдоль выходного канала 4206 с увеличением давления воздуха в канале ниже потока до достижения равновесия с напором давления, в связи с этим останавливая поток. В этом варианте осуществления изобретения выпускное отверстие 4205 и выпускной канал 4206 имеют одинаковую ширину. В этом варианте осуществления изобретения образование серповидной формы потока в реакционной камере может быть несколько более надежным в результате более узкого канала. Серповидная форма потока впоследствии увеличивает давление в закрытом воздушном пространстве ниже по потоку.
В варианте осуществления изобретения, проиллюстрированном на Фиг. 42, жидкость поступает в реакционную камеру 4305 из впускного канала 4304 и протекает к нижней части реакционной камеры, где она перенаправляется к стороне реакционной камеры 4305, противоположной отверстию во впускной канал 4304, посредством треугольного элемента управления потоком 4303. В связи с тем, что поток продолжается до противоположного угла 4306, поток разделяется, при этом некоторая часть поступает в выходное отверстие 4307, в то время как остальная часть соприкасается со стенкой и направляется вверх, создавая эффект завихрения, который улучшает смешивание. Поток в выпускном отверстии предпочтительно образует серповидную форму и проходит через выпускной канал 4306 по направлению к следующей реакционной камере или углублению для лиофилизированных сферических элементов. В этом варианте осуществления изобретения выпускной канал 4306 проходит через расположенные друг над другом элементы 4303, 4302 и 4301 управления потоком, которые обеспечивают извилистый путь для потока жидкости, обеспечивая увеличенную длину выпускного канала в небольшом вертикальном пространстве.
В варианте осуществления изобретения, проиллюстрированном на Фиг. 43, жидкость поступает в реакционную камеру 4403 из впускного канала 4402 и перенаправляется к стороне реакционной камеры 4403, противоположной отверстию во впускной канал 4402, посредством элемента управления потоком 4401, расположенного над нижней частью реакционной камеры, предпочтительно вдоль около половины длины реакционной камеры 4403. В отличии от предыдущих вариантов осуществления изобретения, элемент управления потоком 4401 не образует выпускного отверстия реакционной камеры 4403. Элемент управления потоком 4401 отклоняет поток от выпускного канала 4405 в противоположном углу 4404, тем самым снижая скорость потока до выхода из камеры. Подобно предыдущим вариантам осуществления изобретения перенаправление жидкости способствует турбулентности и смешиванию реагентов.
Для облегчения эффективного смешивания реакционного раствора с лиофилизированными реагентами варианты осуществления изобретения части кассеты для тестирования, содержащей путь потока жидкости, могут содержать специальные углубления 4600 для реагента, встроенные в путь потока жидкости между камерами, как проиллюстрировано на Фиг. 46A и 46В. В альтернативных вариантах осуществления изобретения углубления 4700 для реагента расположены внутри самой реакционной камеры, как проиллюстрировано на Фиг. 47A и 47В. Лиофилизированные таблетки с реагентом предпочтительно располагаются в углублениях для реагента во время изготовления. В части, касающейся углубления для реагента, расположенного внутри флюидной камеры, присутствие реакционного раствора в флюидной камере приводит к ресуспендированию лиофилизированного реагента или реагентов, помещенных в углубление во время изготовления. Размещение лиофилизированного реагента (реагентов) внутри углубления флюидной камеры может быть предпочтительнее размещения реагента (реагентов) в углублении для реагента в флюидном канале, когда для ресуспендирования реагента требуется более длительное время ресуспендирования, чем при переходном прохождении жидкости через углубление, локализованное в канале, во время потока раствора из одной камеры в другую камеру. Благодаря хранению лиофилизированного реагента внутри флюидной камеры продолжительность пребывания реакционного раствора с реагентом увеличивается, увеличивая воздействие лиофилизированного материала на жидкость и обеспечивая более полное ресуспендирование лиофилизированных реагентов и более полное смешивание реагентов. с реакционным раствором. В дополнение к этому, лиофилизированные реагенты, расположенные в углублениях на пути потока, могут быть подвержены просачиванию (или капиллярной утечке) из камеры выше до завершения реакции. Это может придать реагентам густую консистенцию, вызывая проблемы с потоком жидкости, когда основная часть раствора транспортируется через углубление из верхней камеры.
Эту проблему предпочтительно избегать, когда углубление расположено в самой нижней камере.
В направлениях практического применения, когда предпочтительным является разместить углубление для реагента внутри флюидного канала, так как показано в стандартном варианте осуществления изобретения, показанном на Фиг. 48, улучшения для ресуспендирования реагента и смешивания реагента с реакционным раствором могут быть реализованы путем включения выступа в флюидную камеру, такого как выступ 4605, показанный на Фиг. 46В или выступ 4705, показанный на Фиг. 47В. Резкий вертикальный подъем со стороны выступа внутри камеры препятствует потоку капиллярной жидкости через верх или крышку флюидной камеры, уменьшая или предотвращая улавливание вновь ресуспендированного реагента из объема реакционного раствора.
Мультиплексирование анализов
В некоторых вариантах осуществления изобретения множественные независимые анализы могут выполняться параллельно, используя флюидную конструкцию, которая позволяет разделять входной образец жидкости на два или более параллельных пути жидкости через устройство. На Фиг. 10 проиллюстрировано схематическое представление разделения объема жидкости, например, 80 мкл, двумя последовательными этапами на первые два отдельных объема по 40 мкл, а затем на четыре объема по 20 мкл. Проиллюстрированная схема является целесообразной для обеспечения проведения отдельных независимых манипуляций, таких как биохимические реакции, на разделенных объемах. Такие конфигурации используются для увеличения количества аналитов, которые могут быть обнаружены в одном устройстве, путем облегчения мультиплексного обнаружения множества мишеней, таких как последовательности нуклеиновых кислот, в мультиплексных реакциях обратной транскрипции и/или амплификации нуклеиновой кислоты. Аналогичным образом, использование множества тест–полосок для анализа в конце независимых путей жидкости может обеспечить повышенную надежность тест–полосок для анализа множества мишеней или различения последовательностей или мутаций в аналитах нуклеиновой кислоты. Кроме того, предоставление дополнительных тест–полосок для анализа для независимого опроса продуктов реакции множественной амплификации может повысить специфичность путем уменьшения вероятности побочной перекрестной реактивности, такой как перекрестная гибридизация, во время этапа обнаружения теста. На Фиг. 11 проиллюстрирована кассета для тестирования, содержащая два пути жидкости в одной кассете для тестирования. Каждый путь жидкости может независимо регулироваться в зависимости от времени, типа реакции и т. д. Как проиллюстрировано на Фиг. 12, образец, введенный в чашку 1000 для образца, разделяется на приблизительно равные объемы и протекает в камеры 1001 и 1002 разделения объема, поток в которые регулируется выпускными клапанами 1003 и 1004.
Разделительные камеры 1001 и 1002 регулируют объем образца в каждом испытательном канале путем пассивного уравновешивания количества образца в каждой камере. После разделения объема раствору позволяют течь через углубления 1007 и 1008 для реагентов путем открывания отверстий 1005 и 1006. Реагенты, такие как лиофилизированные реагенты, располагаются в углублениях 1007, 1008 и смешиваются с образцом, когда он протекает через углубления и в первую группу камер с предпочтительно регулируемой температурой 1009 и 1010. Реакции, такие как тепловой лизис, обратная транскрипция и/или амплификация нуклеиновой кислоты, проводят в каждой из первых групп нагретых камер, чему способствуют реагенты, предусмотренные в углублениях для реагентов 1007, 1008. Такие реагенты могут включать, но не ограничиваются ими, лиофилизированное вещество положительного контроля (например, нуклеиновую кислоту, вирус, бактериальные клетки и т. д.), лиофилизированную обратную транскриптазу и ассоциированные вспомогательные реагенты, такие как нуклеотиды, буферы, дитиотреитол (DTT), соли и т. д., необходимые для обратной транскрипции РНК в ДНК и/или амплификации ДНК с использованием лиофилизированной ДНК–полимеразы или термостабильной лиофилизированной ДНК–полимеразы и необходимых вспомогательных реагентов, таких как нуклеотиды, буферы и соли.
После завершения биохимических реакций, таких как обратная транскрипция, амплификация нуклеиновой кислоты или одновременная обратная транскрипция и амплификация нуклеиновой кислоты (например, полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией (RT–PCR) «в одной пробирке» или одноэтапная RT–PCR, или одноэтапная RT–Oscar) в первой группе камер, уплотнения для вентиляционных карманов 1011 и 1012 разрываются, чтобы позволить жидкости протекать из первой группы камер через вторую группу углублений для реагента 1013 и 1014 и во вторую группу предпочтительно камер с регулируемой температурой 1015 и 1016. Реагенты, такие как лиофилизированные реагенты, могут быть расположены в углублениях 1013 и 1014 таким образом, чтобы они смешивались с раствором образца, когда жидкость течет из камер 1009 и 1010 в камеры 1015 и 1016. Реагенты, такие как лиофилизированные реагенты для амплификации нуклеиновой кислоты, или высушенные или лиофилизированные детектирующие частицы, такие как конъюгированные с маркерным субстратом окрашенные полистирольные микросферы или конъюгированное с маркерным субстратом коллоидное золото, могут быть при необходимости помещены в углубления для реагента 1013 и/или 1014. После завершения реакций или других манипуляций, таких как связывание или гибридизация с конъюгированными с маркeрным субстратом детектирующими частицами в нагретых камерах, раствору обеспечивают возможность протекать в камеры 1017 и 1018 с тест–полоской для анализа, открывая выпускные клапаны 1019 и 1020. В некоторых вариантах осуществления изобретения третья группа углублений для реагентов может быть размещена в путях жидкости из камер 1015 и 1016, в результате чего дополнительные реагенты, такие как реагенты для обнаружения, содержащие детектирующие частицы, соли и/или поверхностно–активные вещества и другие вещества, используемые для облегчения гибридизации или других способов обнаружения, могут смешиваться с раствором, протекающим в камеры 1017 и 1018 с полосками. Камеры 1017 и 1018 с тест–полосками для анализа могут нагреваться и предпочтительно содержать тест–полоски для анализа, такие как полоски (с технологией латеральной диффузии), для обнаружения аналитов, таких как амплифицированные нуклеиновые кислоты. Тест–полоски для анализа могут содержать серию абсорбирующих материалов, легированных или структурированных высушенными или лиофилизированными реагентами для обнаружения, такими как детектирующие частицы (например, конъюгаты с окрашенной микросферой и/или конъюгаты с коллоидным золотом), маркерные субстраты захвата для захвата аналитов, такие как гибридизационные захватные, олигонуклеотиды для захвата аналитов нуклеиновой кислоты путем последовательно–специфической гибридизации, лиганды, такие как биотин или стрептавидин, для захвата соответственно модифицированных аналитов, и абсорбирующие материалы для обеспечения абсорбирующей способности, достаточной для обеспечения полной миграции объема раствора образца через тест–полоску для анализа с помощью таких средств, как капиллярный эффект или впитывание.
Подготовка образца
В некоторых вариантах осуществления изобретения может быть предпочтительным установка системы подготовки образца внутрь кассеты. Система подготовки образца, такая как система очистки нуклеиновой кислоты, может содержать инкапсулированные растворы для осуществления подготовки образцов и выделения очищенных молекул, таких как очищенная ДНК, РНК или белки, в кассету для тестирования. На Фиг. 13 изображена подсистема 1300 подготовки образца нуклеиновой кислоты, предназначенная для интеграции с кассетой для тестирования. Подсистема подготовки образца содержит основной корпус 1302 и крышку 1301 корпуса для размещения компонентов подсистемы. Компонент 1303 отделения раствора содержит резервуар 1312 неочищенного образца, который является предпочтительно открытым на верхней поверхности, но герметично закрывается нижним уплотнением 1305. Компонент 1303 отделения раствора также предпочтительно содержит резервуар 1314, содержащий первый промывочный буфер, и резервуар 1315, содержащий второй промывочный буфер, оба из которых предпочтительно герметизируются с помощью верхнего уплотнения 1304 и нижнего уплотнения 1305. Матрица 1306, связывающая нуклеиновую кислоту, помещается в путь капиллярного потока раствора, обеспечиваемый абсорбирующими материалами 1307 и 1308.
Стекловолокно или силикагель, проявляющие свойства связывания нуклеиновой кислоты и свойства впитывания, являются примерами материалов, подходящих для использования в качестве связующей матрицы 1306. Широкий спектр абсорбирующих материалов может включать абсорбирующие материалы 1307 и 1308, включая полиэфир, стекловолокно, нитроцеллюлозу, полисульфон, целлюлозу, хлопок или их комбинации, а также другие впитывающие материалы, при условии, что они обеспечивают адекватную капиллярность и минимальное связывание с молекулами, которые должны быть очищены подсистемой. Любой легко разрывающийся или ломкий материал, способный герметизировать компонент 1303 отделения раствора и быть химически совместимым с инкапсулированными растворами, подходит для использования в качестве материала уплотнения 1304 и 1305. Материал уплотнения 1305 вступает в контакт с образцом или лизатом образца и должен дополнительно быть химически совместимым с образцом или раствором лизата образца. Примерами подходящего материала уплотнения являются термосвариваемая металлическая пленка и пластиковая пленка. Материал уплотнения 1305 разрывается во время использования путем смещения компонента 1303 отделения раствора, в результате чего уплотнение 1305 пробивается конструкциями 1311, присутствующими в корпусе 1302. Необработанный образец или неочищенный образец, смешанный с буфером для лизиса, таким как буфер, содержащий хаотропный агент, вводится во время использования в резервуар для образца 1312 через отверстие для образца 1309 в крышке 1301. В некоторых вариантах осуществления изобретения буфер для лизиса при необходимости может быть герметизирован в резервуаре 1312 путем растягивания уплотнения 1304, чтобы закрыть верхнее отверстие резервуара 1312. В таких вариантах осуществления изобретения может быть предпочтительным включение язычка или другого средства для частичного удаления этой области уплотнения 1304, покрывающей резервуар 1312, чтобы обеспечить возможность добавления неочищенного образца в резервуар 1312, в результате чего неочищенный образец может соединяться или смешиваться с содержащимся в нем буфером для лизиса.
Раствор образца или лизат, содержащий материал образца, вводят в отверстие 1309 для добавления образца и удерживают в резервуаре 1312 для образца буферного резервуара 1303 до начала процесса подготовки образца.
На момент начала подготовки образца, компонент 1303 отделения раствора выталкивается на конструкции 1311 для прокалывания уплотнения, что приводит к одновременному высвобождению раствора или лизата образца в резервуаре 1312 и первого и второго промывочных буферов в резервуарах 1314 и 1315 соответственно. Механическое перемещение компонента 1303 может быть выполнено вручную или с помощью привода или приводов, присутствующих в инструменте многократного использования, в который помещается одноразовая кассета для тестирования во время использования. Доступ к приводу или механизму ручного перемещения к резервуару 1303 предпочтительно обеспечивается через отверстие 1310 для доступа крышки 1301 корпуса. Образец или раствор лизата, а также первый и второй промывочные буферы перемещаются через материалы 1307, 1306 и 1308 посредством капиллярного эффекта. Физическое расположение резервуаров и геометрическая конфигурация абсорбирующего материала 1307 обеспечивают последовательный поток неочищенного лизата, первого промывочного буфера и второго промывочного буфера через связующую матрицу 1306. Дополнительная абсорбирующая способность для обеспечения непрерывного капиллярного транспорта всех объемов раствора через систему обеспечивается абсорбирующей прокладкой 1313, помещенной в контакт с впитывающий элементом 1308. По завершении транспортировки раствора через абсорбирующие материалы отработанные растворы попадают в абсорбирующую прокладку 1313. После окончания капиллярной транспортировки всех растворов через систему очищенные нуклеиновые кислоты связываются со связывающей матрицей 1306, из которой нуклеиновые кислоты могут быть извлечены в чашку 1402 для образца встроенной кассеты для тестирования, как проиллюстрировано на Фиг. 15.
Перемещение компонентов подсистемы подготовки образца, происходящие в процессе подготовки образца, проиллюстрировано на Фиг. 14, которая иллюстрирует вариант осуществления изобретения подсистемы подготовки образца в поперечном сечении до и после обработки образца. Элюции предшествует перемещение связующей матрицы 1306 из пути капиллярного потока и через компонент 1316 уплотнения под действием привода в соответствующем многоразовом инструменте для тестирования. Компонент 1316 уплотнения образует уплотнение с частью канала 1318 буфера для элюции, чтобы обеспечить возможность введения буфера для элюции через связующую матрицу 1306 и в чашку 1402 для образца без потери раствора на пути капиллярного потока подсистемы подготовки образца. Канал 1318, присоединенный к компоненту инжектора буфера для элюции, или к его части, состоит из резервуара 1317 буфера для элюции и поршня 1319. Поршень 1319 может дополнительно содержать уплотнительные кольца для облегчения герметизации буфера для элюции внутри резервуара 1317. Во время элюции очищенной нуклеиновой кислоты привод перемещает компонент 1317 резервуара для элюции, в результате чего присоединенный канал 1318 образует уплотнение с компонентом 1316 уплотнения и смещает связующую матрицу 1306 в камеру 1321. Механический доступ к резервуару 1317 для элюции с углублением обеспечивается через отверстие 1320 доступа исполнительного механизма. После перемещения связующей матрицы 1306 из основного пути потока капиллярного раствора подсистемы подготовки образца связующая матрица 1306 находится в камере 1321 для элюции. Элюция очищенной нуклеиновой кислоты в чашку 1402 для образца осуществляется путем нагнетания буфера для элюции из резервуара 1317 буфера для элюции с помощью исполнительного механизма, действующего через отверстие 1322 исполнительного механизма для перемещения поршня 1319 через резервуар 1317 в подобном шприцу действии. Буфер для элюции протекает по каналу 1318 через связующую матрицу 1306, что приводит к инъекции буфера для элюции, содержащего элюированные очищенные нуклеиновые кислоты, в чашку 1402 для образца.
Как проиллюстрировано на Фиг. 15, подсистема 1300 подготовки образца предпочтительно связана с флюидным компонентом 1403 кассеты 1500 с помощью широко используемых способов изготовления, таких как ультразвуковая сварка, для формирования интегрированной одноразовой кассеты для тестирования с подходом «от образца к результату». В некоторых вариантах осуществления изобретения является предпочтительным герметичное закрытие флюидной среды кассеты для тестирования после введения элюата, содержащего очищенную нуклеиновую кислоту, чтобы уменьшить вероятность выхода амплифицированной нуклеиновой кислоты из кассеты. Скользящее уплотнение 1404 может быть при необходимости, но предпочтительно размещено между подсистемой подготовки образца и флюидным корпусом 1403 кассеты для тестирования для герметизации кассеты на входе в чашку 1402 для образца. Скользящее уплотнение 1404 перемещается в герметичное положение под действием исполнительного механизма для образования герметичного уплотнения, содержащего уплотнительное кольцо 1405. Подложка 1406 кассеты соединяется с флюидным корпусом после введения высушенных реагентов и тест–полосок. Как описано выше для подложки других вариантов осуществления изобретения кассет для тестирования, подложка 1406 содержит материалы для функциональности отверстия, обеспечения герметичного уплотнения, теплового интерфейса, расширительной камеры (камер) и может дополнительно содержать печатную плату или слой гибкой платы, несущий жидкость и электронные компоненты для регулирования температуры. Электронные компоненты могут быть дополнительно размещены в многоразовом стыковочном узле. Печатная плата в сборе (PCA) 1501, содержащая электронные компоненты, предпочтительно изготовлена из материалов с низкой теплоаккумулирующей способностью и электронных компонентов для поверхностного монтажа.
Массивы резисторов для поверхностного монтажа и проксимально расположенных датчиков температуры обеспечивают одно из средств регулирования температуры в камере в кассете для тестирования. Резисторы для поверхностного монтажа и массивы датчиков температуры печатной плате в сборе (PCA) 1501 располагают так, чтобы они были установленными в кассете для тестирования, когда кассета для тестирования загружается в стыковочный узел. Интегрированная кассета «от образца к результату» показана на Фиг. 16. На Фиг. 17 проиллюстрирована интегрированная кассета с нижележащим слоем электроники с использованием традиционных компонентов печатной платы и поверхностного монтажа. В некоторых вариантах осуществления изобретения гибкая плата может быть присоединена к задней части кассеты для тестирования.
Электроника
В некоторых вариантах осуществления изобретения является предпочтительным размещать электронные компоненты в повторно используемом компоненте таким образом, чтобы нагреватели, датчики и другая электроника соединялись с одноразовой кассетой для тестирования с помощью средства, способного установить благоприятный тепловой интерфейс и точную установку электроники с вышележащими элементами одноразовой кассеты для тестирования, с которыми они должны взаимодействовать. В других вариантах осуществления изобретения является предпочтительным использовать комбинацию многоразовых и одноразовых компонентов для регулирования температуры. Например, мониторинг температуры в автономном режиме может быть выполнен с помощью инфракрасных датчиков, размещенных в многоразовом стыковочном узле, в то время как резистивные нагреватели для контроля температуры и контроля жидкости размещены в гибкой плате, встроенной в одноразовую кассету для тестирования.
В некоторых вариантах осуществления изобретения печатная плата (PCB) содержит стандартный фольгированный медью ламинированный материал FR4 толщиной 0,062 дюйма, хотя могут использоваться другие стандартные материалы и толщины платы. Электронные компоненты, такие как резисторы, термисторы, светодиоды и микроконтроллер, предпочтительно содержат готовые устройства поверхностного монтажа (SMD) и размещаются в соответствии с методологией промышленного стандарта.
В альтернативных вариантах осуществления изобретения печатная плата в сборе (PCA) может быть интегрирована со стенкой кассеты и содержать гибкую пластиковую плату. Могут быть использованы материалы гибкой платы, такие как ПЭТ и полиимид, как проиллюстрировано на Фиг. 8. Использование гибкой пластиковой платы является хорошо известным в данной области. В другом варианте осуществления изобретения нагревательные элементы и датчики температуры могут быть трафаретно напечатаны на пластиковом флюидном компоненте с помощью технологии, разработанной такими компаниями, как Soligie, Inc.
В некоторых вариантах осуществления изобретения толщина печатной платы (PCB), а также количество и размещение меди в областях, окружающих резистивные нагреватели, специально приведены в соответствие для термического управления реакционным раствором в флюидном компоненте. Это может быть достигнуто путем использования уже упомянутых стандартных технологий производства.
В некоторых вариантах осуществления изобретения резистор представляет собой толстопленочный модуль 2512, хотя могут быть использованы и другие резисторы. Нагревательные камеры в флюидном компоненте предпочтительно имеют размеры, аналогичные размерам резистора, чтобы обеспечить равномерный нагрев по всей камере. Одного резистора такого размера достаточно для нагревания около 15 мкл раствора при условии, что толщина флюидного компонента составляет 0,5 мм. На Фиг. 2D показаны два резистора 100, образующих нагреватель, достаточный для нагрева около 30 мкл раствора, при условии, что толщина флюидного компонента составляет 0,5 мм. В этом случае резисторы предпочтительно имеют сопротивление 40 Ом каждый и расположены в параллельной конфигурации.
В некоторых вариантах осуществления изобретения датчик 110 температуры предпочтительно содержит термистор, такой как NTC–устройство 0402, или датчик температуры, такой как Atmel AT30TS750, каждый из которых имеет высоту, аналогичную высоте модуля резистора 2512. Термистор предпочтительно расположен по одной линии или на одной прямой либо рядом с резистивными нагревателями, либо находится между ними, в случае установки одного резистора или двух резисторов соответственно. При тесном совмещении этих электронных элементов между ними возникает только очень тонкий воздушный зазор.
Кроме того, нанесение термопасты перед сборкой флюидного слоя с электронным слоем обеспечивает хороший тепловой контакт между флюидным компонентом, резистором и термистором.
В некоторых вариантах осуществления изобретения резисторы 70, 71 у отверстий содержат толстопленочный модуль 0805, хотя могут быть использованы и другие резисторы. Вместо резистора также может быть использован нагревательный элемент из нихромовой проволоки малого калибра, такой как нихромовая проволока 40–го калибра.
В некоторых вариантах осуществления изобретения микроконтроллер представляет собой Microchip Technologies PIC16F1789. Микроконтроллер предпочтительно соответствует сложности флюидной системы. Например, при мультиплексировании количество отдельных отверстий и нагревателей соизмеримо с количеством микроконтроллеров I/O линий. Размер памяти может быть выбран в соответствии с размером программы.
В некоторых вариантах осуществления изобретения N–канальные полевые МОП–транзисторы в корпусе SOT–23, работающие в режиме ВКЛ–ВЫКЛ, используются для модуляции текущей нагрузки на вентиляционные и нагревательные резисторы.
Сигналы модуляции отправляются через микроконтроллер. В альтернативных вариантах осуществления изобретения схема широтно–импульсной модуляции и/или другие алгоритмы управления могут использоваться для более усовершенствованного теплового управления жидкостями. Это обычно выполняется микроконтроллером и может потребовать дополнительных аппаратных и/или программных функций, известных специалистам в данной области техники.
В зависимости от применения некоторые варианты осуществления изобретения содержат устройство, в котором небольшой управляющий стыковочный узел или стыковочный узел управляет меньшим одноразовым узлом, содержащим флюидные системы, которые вступают в контакт с биологическими материалами, которые обозначают как кассета для тестирования. В одном таком варианте осуществления изобретения стыковочный узел содержит электронные компоненты. Удаление электрических компонентов из одноразовой кассеты для тестирования снижает затраты и, в некоторых случаях, воздействие на окружающую среду. В другом варианте осуществления изобретения некоторые электронные компоненты включены как в стыковочный узел, так и в кассету для тестирования. В этом конкретном варианте осуществления изобретения кассета для тестирования предпочтительно содержит недорогую печатную плату в сборе (PCA) или, предпочтительно, гибкую плату для обеспечения некоторых электрических функций, таких как регулирование температуры, регулирование потока жидкости и измерение температуры, которые питаются, контролируются и/или запрашиваются стыковочным узлом через соответствующий интерфейс. Как описано выше, электронные функции такого устройства предпочтительно разбиты на два отдельных подузла. Одноразовая кассета 2500 предпочтительно содержит заднюю поверхность, предназначенную для сопряжения с резистивными нагревательными и измерительными элементами стыковочного узла. Материалы, содержащиеся в задней поверхности кассеты для тестирования, предпочтительно выбираются так, чтобы обеспечить подходящую теплопроводность и стабильность при одновременном обеспечении возможности управления потоком жидкости через разрыв отверстия. В некоторых вариантах осуществления изобретения задняя поверхность кассеты для тестирования или ее часть содержит гибкую плату, изготовленную на основе, такой как полиимид. Гибкие платы могут быть использованы для создания недорогих резистивных нагревательных элементов с низкой теплоаккумулирующей способностью. Основы гибкой платы предпочтительно могут быть помещены в прямой контакт с растворами, присутствующими в флюидной сети кассеты для тестирования, чтобы обеспечить высокоэффективный и быстрый нагрев и охлаждение. Соединительный элемент 810, который проиллюстрирован на Фиг. 8, предпочтительно подает ток на резистивные нагреватели вместе с линией питания и сигнала на дополнительный термистор (термисторы).
Если используется гибкая плата 799, один или более ИК–датчиков, расположенных в стыковочном узле, могут контролировать температуру нагретых камер (например, камер амплификации или обнаружения), считывая сигнал через окно в подложке 805 или непосредственно с задней части гибкой платы 799. При необходимости, термисторы на печатной плате в сборе (PCA) или гибкой плате 799 могут использоваться для контроля температуры. При необходимости представление взвешенного среднего значения выходных сигналов ИК–датчиков и термисторов улучшает корреляцию между показаниями и температурой жидкости в кассете. В дополнение к этому датчики также могут определять температуру окружающей среды, позволяя системе вводить поправку на нее, чтобы обеспечить быстрое уравновешивание образца жидкости до требуемых температур.
Как проиллюстрировано на Фиг. 33, стыковочный узел предпочтительно содержит подузел многоразового компонента 3980, содержащий микроконтроллер, полевой МОП–транзистор (MOSFET), переключатели, источник питания или разъем питания и/или аккумулятор, необязательный вентилятор 903 охлаждения, необязательный пользовательский интерфейс, инфракрасные датчики температуры 901, 902 и соединительный элемент 900 совместимый с соединительным элементом 810 кассеты 2500. Когда подузлы сопрягаются через соединительные элементы 810 и 900, стыковочный узел предпочтительно поддерживает одноразовую кассету 2500 в по существу вертикальной или почти вертикальной ориентации. Хотя по существу вертикальная ориентация является предпочтительной в некоторых вариантах осуществления изобретения, описанных в данном документе, аналогичные результаты могут быть получены, если устройство эксплуатируется с наклоном, особенно если некоторые пути являются покрытыми для уменьшения угла смачивания используемых растворов.
Другой вариант осуществления изобретения устройства может быть использован для того, чтобы минимизировать эксплуатационные расходы путем снижения стоимости расходуемой части системы за счет исключения всех электронных схем, расположенных на одноразовой части. Микроконтроллер, нагреватели, датчики, источник питания и все другие схемы расположены на нескольких печатных платах в сборе (PCA) и электрически связаны друг с другом с помощью ленточных кабелей промышленного стандарта с большим количеством проводников. Также может быть добавлен дисплей, чтобы помочь пользователю в работе устройства. Также может быть использован дополнительный порт последовательного ввода–вывода данных, чтобы обеспечить возможность пользователю загружать изменения в параметры теста и отслеживать ход любого тестирования. Одна версия этого варианта осуществления изобретения содержит пять различных печатных плат в сборе (PCA). Главная печатная плата в сборе (PCA) содержит плату управления, порт последовательного ввода–вывода данных, источник питания и разъемы для подключения к другим платам в системе. Печатная плата в сборе (PCA) нагревателя содержит нагревательные резисторные элементы, датчики температуры и нагревательные элементы для прожига отверстий. Для того чтобы облегчить тепловое взаимодействие между этой платой нагревателя и одноразовой флюидной кассетой, эта плата установлена на подпружиненном держателе, который перемещается к задней стороне флюидной кассеты посредством закрывающего действия крышки до контакта с флюидной кассетой. Тонкая теплопроводящая нагревательная прокладка прикреплена сверху резисторов нагревателя камеры и датчика температуры, улучшая теплообмен между платой нагревателя и флюидной кассетой. Прочный прожигающий отверстие нагревательный элемент может быть реализован с использованием нихромовой проволоки, обмотанной вокруг небольшого керамического держателя. Печатная плата в сборе (PCA) с ИК–датчиком установлена на небольшом расстоянии от противоположной стороны кассеты и используется для отслеживания температуры нагревания камеры. Это обеспечивает возможность регулировать температуру в замкнутом контуре процесса нагревания и охлаждения и приспосабливать колебания температуры окружающей среды. На плате с ИК–датчиком также установлены множество отражающих оптронов, которые позволяют определять наличие кассеты и могут быть использованы для идентификации типа кассеты, обозначенной конфигурируемым отражающим рисунком, расположенным на кассете. Плата дисплея печатной платы в сборе (PCA) может быть расположена примерно за ИК–платой, чтобы пользователь мог видеть дисплей спереди устройства. И, наконец, плата затвора печатной платы в сборе (PCA) расположена напротив верхнего края кассеты и содержит переключатель и отражающий оптрон, который используется для определения того, использовалась ли уже кассета, и когда крышка закрывается, удерживается кассета в месте для тестирования.
Охлаждение системы может быть дополнительно увеличено с помощью вентилятора, такого как вентилятор типа «маффин», который включается микроконтроллером только во время фазы охлаждения тестирования. Система отверстий предпочтительно используется для направления наружного воздуха от охладителя к нагревательным камерам и выталкивания его с боков устройства.
Для обеспечения полного молекулярного теста «от образца к результату» любой из вышеупомянутых вариантов осуществления изобретения может быть подключен к системе 1300 подготовки образца, которая обеспечивает нуклеиновые кислоты в виде выходного продукта для камеры 1402 для образца. Это было продемонстрировано с использованием технологии подготовки образца, описанной в международной публикации № WO 2009/137059 А1, озаглавленной «Highly Simplified Lateral Flow–Based Nucleic Acid Sample Preparation and Passive Fluid Flow Control». Вариант осуществления изобретения полученного интегрированного устройства проиллюстрирован на Фиг. 15 и Фиг. 16.
Стыковочный узел
Многоразовый стыковочный узел содержит необходимые электронные компоненты для обеспечения функциональности кассеты для тестирования. Различные варианты стыковочного узла были изобретены для взаимодействия с соответствующими вариантами конструкции кассеты для тестирования. В одном варианте осуществления изобретения стыковочный узел, который проиллюстрирован на Фиг. 18 и Фиг. 19 содержит все электронные компоненты, необходимые для проведения теста, устраняя необходимость в электронных компонентах в кассете для тестирования. Как проиллюстрировано на Фиг. 18, перед добавлением образца кассета 2500 вставляется в стыковочный узел 2501. Стыковочный узел 2501 содержит дисплей, такой как ЖК–дисплей 2502, для передачи пользователю информации, такой как протоколы тестов и статус тестов. После вставки кассеты в стыковочный узел 2501 образец вводится в отверстие 20 для образца кассеты 2500, и крышка 2503 стыковочного узла закрывается, чтобы начать тестирование. Стыковочный узел со вставленной кассетой для тестирования показан на Фиг. 19, стыковочный узел 2501 с крышкой в закрытом положении проиллюстрирован на Фиг. 18B.
В некоторых вариантах осуществления изобретения стыковочного узла в шарнир крышки встроен механизм 2503, который перемещает скользящее уплотнение 91 кассеты для тестирования в закрытое положение. Герметичная кассета для тестирования способствует обеспечению того, что амплифицированные нуклеиновые кислоты остаются в кассете для тестирования. Как проиллюстрировано на Фиг. 20, может быть использован либо ручной или же автоматизированный способ для перемещения клапана через отверстие для образца для герметизации кассеты. В некоторых вариантах осуществления изобретения ползунок герметизирует отверстие для образца путем зацепления уплотнительного кольца.
Крышка расширительной камеры удерживает ползунок клапана на месте над уплотнительным кольцом отверстия для образца. Уплотнение перемещается в положение с помощью серводвигателя или с помощью ручного действия, такого как закрытие крышки многоразового стыковочного узла, которая, в свою очередь, приводит в действие механизм для закрытия уплотнения кассеты. В показанном варианте осуществления изобретения реечно–шестереночный механизм 2504 использует привод 3979 скользящего уплотнения для перемещения скользящего уплотнения 91 в закрытое положение. Реечно–шестереночный механизм 2504 может приводиться в движение или перемещаться посредством закрывания крышки 2503 стыковочного узла посредством механического соединения с шарниром крышки. При необходимости, датчик, такой как оптический датчик 2505, может быть расположен для опроса положения скользящего уплотнения 91, чтобы гарантировать правильное размещение уплотнения до начала анализа, как проиллюстрировано на Фиг. 21. Оптический датчик определяет состояние (т. е. положение) уплотнения отверстия для образца кассеты. Оптический датчик позволяет запрограммировать стыковочный узел для обнаружения случайного введения ранее использованной кассеты для тестирования и обнаружения успешного закрытия уплотнения кассеты для тестирования. Сообщение об ошибке, указывающее на неисправность уплотнения, может отображаться на дисплее 2502, и программа тестирования прерывается, если датчик 2505 не может обнаружить закрытие уплотнения. В других вариантах осуществления изобретения кассеты для тестирования и стыковочного узла герметизирующий механизм может содержать другое средство механической герметизации камеры, такое как вращающийся клапан, как проиллюстрировано на Фиг. 22. В еще одном варианте осуществления изобретения уплотнение кассеты для тестирования может быть размещено в откидной крышке кассеты, размещенной таким образом, что вставка в стыковочный узел является невозможной без предварительного закрытия крышки кассеты и, таким образом, установки уплотнения. В этом варианте осуществления изобретения образец добавляется в кассету для тестирования до введения в стыковочный узел. Кассета для тестирования, содержащая откидную крышку с уплотнением, показана на Фиг. 23. В целом, после того, как кассета вставлена в стыковочный узел и образец загружен в кассету, является предпочтительным, чтобы закрывающаяся крышка стыковочного узла автоматически как запечатывала кассету, так и запускала анализ, предпочтительно без использования сервоприводов или других механических устройств.
В некоторых вариантах осуществления изобретения стыковочного узла набор компонентов предпочтительно облегчает правильную установку кассеты для тестирования, в то же время гарантируя, что электронные компоненты, которые должны взаимодействовать с кассетой для тестирования, не будут физически мешать установке кассеты, но при этом образуют надежный тепловой интерфейс во время тестирования. Эти компоненты образуют механизм для удержания печатной платы в сборе (PCA) 75 за пределами пути вставки кассеты до закрытия крышки 2503. Как проиллюстрировано на Фиг. 24, внутри стыковочного узла плата нагревателя установлена на держателе 2506 печатной платы в сборе (PCA), который предпочтительно служит в качестве каркаса с низкой теплоаккумулирующей способностью, в то время как кассета для тестирования загружается в держатель 2507 кассеты с низкой теплоаккумулирующей способностью, при этом направляющие 2509 направляют кассету в стыковочный узел и удерживают ее в правильном положении, например, параллельно поверхности платы нагревателя для взаимодействия с печатной плате в сборе (PCA) 75, установленной на держателе печатной плате в сборе (PCA) 2506. В открытом положении крышки, выступающие части 2508 на держателе 2507 кассеты создают помехи держателю печатной плате в сборе (PCA) 2506 для поддержания открытым пути вдоль направляющих 2509 для вставки кассеты. Предпочтительно наклонная поверхность охватывает расстояние между поверхностью выступающих частей 2508 и нижней отметкой компонента 2507 для облегчения плавного перемещения выступающих частей 2508 в выемках 2511 на держателе 2506 печатной платы в сборе (PCA) во время закрытия крышки 2503. При закрытии крышки стыковочного узла выступающие части 2508 входят в зацепление с выемками 2511, тем самым перемещая крепление платы нагревателя ближе к задней поверхности кассеты для тестирования 2500. Закрытие крышки 2503 оказывает направленное вниз усилие на держатель 2507 кассеты, тем самым перемещая держатель 2507 кассеты в положение, в котором выступающие части 2508 останавливаются в выемках 2511 приводя к перемещению держателя 2506 печатной платы в сборе (PCA) таким образом, что печатная плата в сборе (PCA) 75 прижимается к задней части кассеты 2500. Предпочтительно, чтобы держатель 2506 печатной платы в сборе (PCA) находился под постоянным усилием, таким как усилие пружины, чтобы обеспечить воспроизводимое давление на заднюю часть кассеты посредством печатной платы в сборе (PCA) 75 после закрытия крышки. Размещение печатной плате в сборе (PCA) 75 в задней части кассеты 2500 образует тепловой интерфейс, который проводит тепло от резистивных нагревательных элементов на печатной плате в сборе (PCA) к камерам с регулируемой температурой и отверстиям кассеты для тестирования. Предпочтительно компоненты 2506 и 2507 сконструированы так, чтобы иметь минимальную теплоаккумулирующую способность для системы и обеспечивать доступ к поверхностям кассеты для тестирования для охлаждающих устройств, таких как вентиляторы, и контроля температуры с помощью датчиков, таких как инфракрасные датчики. Таким образом, после закрытия крышки плата нагревателя предпочтительно плотно прижимается к задней части кассеты для тестирования, образуя тепловой интерфейс, который позволяет микронагревателям на плате нагревателя нагревать растворы в флюидных камерах кассеты для тестирования и плавить термолабильные вентиляционные пленки кассеты для тестирования, предпочтительно в соответствии с микроконтроллером или микропроцессорным управлением. На Фиг. 25 проиллюстрирован механизм сопряжения между кассетой и печатной плате в сборе (PCA) в поперечном сечении как в расцепленном положении (крышка открыта), так и в сцепленном положении (крышка закрыта).
В некоторых вариантах осуществления изобретения стыковочный узел содержит дополнительные датчики для таких применений, как измерение температуры, обнаружение наличия или удаления кассеты для тестирования и обнаружение конкретных кассет для тестирования для обеспечения возможности автоматического выбора параметров тестирования. Как проиллюстрировано на Фиг. 26, инфракрасные датчики 2600 определяют температуру кассеты для тестирования в областях, расположенных над камерами с регулируемой температурой, таких как камеры 30 и 90. Датчики позволяют собирать данные о температуре в дополнение или вместо данных о температуре, собираемых локализованными датчиками температуры печатной платы в сборе (PCA) 75, таким как, например, датчик 110. Оптические датчики могут быть при необходимости, но предпочтительно, использованы для обнаружения конкретных кассет для тестирования, чтобы идентифицировать кассеты для конкретных заболеваний или состояний и обеспечить автоматический выбор температурных профилей, подходящих для конкретного теста. Как проиллюстрировано на Фиг. 27A и 27В, оптический датчик или массив оптических датчиков, такой как массив 2601 оптических датчиков, может использоваться в сочетании со штрих–кодом штрих–кодоподобными элементами 2602 на кассете для тестирования для определения типа кассеты для тестирования и для подтверждения полной установки и правильного размещения кассеты для тестирования. Массив 2602 датчиков совместно с датчиком 2505 может использоваться для обнаружения вставки ранее использованной кассеты для тестирования путем обнаружения закрытого уплотнения перед закрытием крышки. Стыковочный узел может содержать датчики для определения типа кассеты для тестирования, вставленной в стыковочный узел, и/или для подтверждения правильного введения, расположения и совмещения кассеты внутри стыковочного узла. Обнаружение кассеты для тестирования гриппа A/В проиллюстрировано в стыковочном узле и системе кассеты для тестирования, показанных на Фиг. 19. Стыковочный узел может также предпочтительно считывать штрих–код или другой символ на каждой кассете и изменять свое программирование в соответствии с сохраненными программами для различных анализов.
В некоторых вариантах осуществления изобретения является предпочтительным нагревать обе стороны кассеты для тестирования. Конфигурация печатной платы в сборе (PCA) с двумя нагревателями, в которой кассета для тестирования вставлена между двумя печатными платами в сборе (PCA) нагревателей, изображена на Фиг. 28А и 28В.
В другом варианте осуществления изобретения стыковочный узел содержит сервоприводы, оптическую подсистему для автоматического считывания результатов, подсистему беспроводной передачи данных, пользовательский интерфейс с сенсорным экраном, источник питания в виде аккумуляторной батареи и приемник кассеты для тестирования, который принимает кассету для тестирования, содержащую встроенную подсистему для подготовки образца. Как проиллюстрировано на Фиг. 29A, 29В и 30, стыковочный узел 2700 принимает кассету для тестирования 1500 и помещает кассету для тестирования в термический контакт с печатной платой в сборе (PCA) 1501, чтобы обеспечить регулирование температуры и регулирование потока жидкости кассеты для тестирования. Кассета для тестирования 1500 вставляется в слот 3605 приемника кассеты поворотной дверцы стыковочного узла 2702. После добавления неочищенного образца или лизата в кассету для тестирования закрытие дверцы стыковочного узла помещает заднюю часть кассеты для тестирования в регистрирующее устройство в соприкосновении с печатной платой в сборе (PCA) 1501 и в совмещении с сервоприводами. Сервопривод 3602 расположен с возможностью доступа к компоненту 1303 отделения раствора через отверстие 1310 привода кассеты 1500 и обеспечивает механическое усилие, необходимое для разрыва уплотнительного материала 1305.
Разрыв механического уплотнения 1305 высвобождает неочищенный лизат и промывочные буферы для прохождения через капиллярные материалы для подготовки образца подсистемы подготовки образца, как описано выше. После завершения капиллярной транспортировки жидкости сервопривод 3601, который расположен с возможностью доступа к резервуару 1317 для элюции через отверстие 1320 привода кассеты 1500, обеспечивает механическое усилие для перемещения компонента 1317 таким образом, что присоединенный канал 1318 образует уплотнение с уплотнением 1316 и вытесняет связующую матрицу 1306 в отделение 1321 для элюции. Сервопривод 3604, расположенный с возможностью доступа к поршню 1319 для элюции через отверстие 1322 привода кассеты 1500, затем создает механическое усилие для поршня 1319, чтобы вытолкнуть буфер для элюции из резервуара 1317 для элюции через связующую матрицу 1306, что приводит к элюции нуклеиновых кислот в чашку 1402 для образца кассеты 1500. Сервопривод 3603 герметизирует кассету после элюции, как описано выше. Управление приводом предпочтительно обеспечивается микроконтроллером или микропроцессором на управляющей электроникой печатной плате в сборе (PCA) 3606 в соответствии с инструкциями по программно–аппаратному обеспечению или программному обеспечению. Аналогичным образом, управление температурой и потоком жидкости в кассете для тестирования осуществляется в соответствии с инструкциями, содержащимися в программно–аппаратном или программном обеспечении, хранящихся в памяти микроконтроллера или микропроцессора. Оптическая подсистема 3607, содержащая светодиодный источник 3608 света и CMOS–датчик 3609, показанные на Фиг. 31, оцифровывает данные сигнала тест–полоски для анализа.
Собранные изображения тест–полоски для анализа сохраняются в памяти в стыковочном модуле, где интерпретация результатов может быть выполнена с помощью встроенного процессора и передана на ЖК–дисплей 2701. Кольцо светодиодов обеспечивает равномерное освещение во время сбора изображений с помощью цифровой камеры на основе CMOS. Изображения, собранные с помощью устройства размером с почтовую марку, могут предоставить данные с высоким разрешением (5 мегапикселей, 10 бит), пригодные для колориметрического анализа сигнала (по технологии латеральной диффузии). Предпочтительно низкопрофильная конструкция (–1 см) в сочетании с оптикой на коротком рабочем расстоянии позволяет интегрировать систему в тонкий корпус устройства.
При необходимости оцифрованные результаты могут быть переданы для автономного анализа, хранения и/или визуализации через систему беспроводной связи, встроенную в стыковочный узел, использующий либо стандартные сети Wi–Fi, либо сотовые сети связи. Фотографии этого варианта осуществления стыковочного узла показаны на Фиг. 32A и 32B.
Примеры
Пример 1. Способ мультиплексной амплификации и обнаружения очищенной вирусной РНК (грипп A/B) и вируса внутреннего положительного контроля
Кассету для тестирования для гриппа A и B помещали в стыковочный узел. 40 мкл раствора образца добавляли в отверстие для образца. Растворы образца содержали либо очищенную РНК вируса гриппа A/Puerto Rico в концентрации, эквивалентной 5000 ТЦД50/мл, очищенную РНК вируса гриппа B/Brisbane в концентрации, эквивалентной 500 ТЦД50/мл, либо воду молекулярного качества (без контрольного образца матрицы).
При входе в отверстие для образца объем образца 40 мкл смешивается с лиофилизированным сферическим элементом по мере его поступления в первую камеру кассеты для тестирования. Лиофилизированный сферический элемент состоял из вирусных частиц фага MS2 в качестве положительного внутреннего контроля и ОТТ. В первой камере кассеты образец нагревали до 90°C в течение 1 минуты, чтобы способствовать вирусному лизису, затем охлаждали до 50°C до открытия отверстия, соединенного со второй камерой. Открытие отверстия, соединенного со второй камерой, позволяет образцу течь во вторую камеру, обеспечивая возможность перемещения воздуха во второй камере в расширительную камеру. По мере того, как образец перемещался во вторую камеру, он смешивался с олигонуклеотидными праймерами амплификации к вирусу гриппа A, гриппа B и фагу MS2, а также с реагентам и ферментами для обратной транскрипции и амплификации нуклеиновых кислот, присутствующими в виде лиофилизированной таблетки в углублении пути жидкости между первой и второй камерами.
Камеру амплификации нагревали до 47 °С в течение 6 минут, в течение которых матрица РНК была обратно транскрибирована в кДНК. После завершения обратной транскрипции во второй камере проводили 40 циклов термоциклической амплификации. После завершения термоциклирования отверстие, соединенное с третьей камерой, открывали, чтобы позволить реакционному раствору протекать в третью камеру. Третья камера содержала тест–полоску и лиофилизированный сферический элемент, содержащий три окрашенных в синий цвет полистирольных микросферных конъюгата, используемых в качестве детектирующих частиц. Конъюгаты состояли из 300 нм полистирольных микросфер, ковалентно связанных с олигонуклеотидными маркерными субстратами, комплементарными амплифицированным последовательностям вируса гриппа A, или вируса гриппа B или фага MS2. Раствор растворял лиофилизированные детектирующие частицы по мере его поступления в третью камеру. Три линии захвата были иммобилизованы на мембране с технологией латеральной диффузии, снизу устройства они были следующими: отрицательный контрольный олигонуклеотид, некомплементарный каким–либо анализируемым мишеням; маркерный субстрат захвата, комплементарный продукту амплификации гриппа B; маркерный субстрат захвата, комплементарный продукту амплификации гриппа A; и олигонуклеотид, комплементарный продукту амплификации фага MS2.
Полоску (с технологией латеральной диффузии) обрабатывали в течение шести минут до визуальной интерпретации результатов.
После обработки полоски (с технологией латеральной диффузии) положительные образцы гриппа A показали образование синих тестовых линий в положениях гриппа A и фага MS2, положительные образцы гриппа B показали образование синих тестовых линий в положениях гриппа B и фага MS2, отрицательные образцы показали образование синих тестовых линий только в положении фага MS2, как проиллюстрировано на Фиг. 34.
Пример 2. Способ мультиплексной амплификации и обнаружения вирусного лизата в буфере и вируса внутреннего положительного контроля
Кассету для тестирования для гриппа A и B помещали в стыковочный узел. 40 мкл раствора образца добавляли в отверстие для образца. Растворы образца содержали либо вирус гриппа A/Puerto Rico в концентрации, эквивалентной 5000 ТЦД50/мл, вирус гриппа B/Brisbane в концентрации, эквивалентной 500 ТЦД50/мл, либо воду молекулярного качества (без контрольного образца матрицы). При входе в отверстие для образца объем образца 40 мкл смешивается с лиофилизированным сферическим элементом по мере его поступления в первую камеру кассеты для тестирования. Лиофилизированный сферический элемент состоял из вирусных частиц фага MS2 в качестве положительного внутреннего контроля и ОТТ. В первой камере кассеты образец нагревали до 90°C в течение 1 минуты, чтобы способствовать вирусному лизису, затем охлаждали до 50°C до открытия отверстия, соединенного со второй камерой. Открытие отверстия, соединенного со второй камерой, позволяет образцу течь во вторую камеру, обеспечивая возможность перемещения воздуха во второй камере в расширительную камеру. По мере того, как образец перемещался во вторую камеру, он смешивался с олигонуклеотидными праймерами амплификации к вирусу гриппа A, гриппа B и фагу MS2, а также с реагентам и ферментами для обратной транскрипции и амплификации нуклеиновых кислот, присутствующими в виде лиофилизированной таблетки в углублении пути жидкости между первой и второй камерами.
Камеру амплификации нагревали до 47 °С в течение 6 минут, в течение которых матрица РНК была обратно транскрибирована в кДНК. После завершения обратной транскрипции во второй камере проводили 40 циклов термоциклической амплификации. После завершения термоциклирования отверстие, соединенное с третьей камерой, открывали, чтобы позволить реакционному раствору протекать в третью камеру. Третья камера содержала тест–полоску и лиофилизированный сферический элемент, содержащий три окрашенных в синий цвет полистирольных микросферных конъюгата, используемых в качестве детектирующих частиц. Конъюгаты состояли из 300 нм полистирольных микросфер, ковалентно связанных с олигонуклеотидными маркерными субстратами, комплементарными амплифицированным последовательностям вируса гриппа A, или вируса гриппа B или фага MS2. Раствор растворял лиофилизированные детектирующие частицы по мере его поступления в третью камеру. Три линии захвата были иммобилизованы на мембране с технологией латеральной диффузии, снизу устройства они были следующими: Отрицательный контрольный олигонуклеотид, некомплементарный каким–либо анализируемым мишеням; маркерный субстрат захвата, комплементарный продукту амплификации гриппа B; маркерный субстрат захвата, комплементарный продукту амплификации гриппа A; и олигонуклеотид, комплементарный продукту амплификации фага MS2. Полоску (с технологией латеральной диффузии) обрабатывали в течение шести минут до визуальной интерпретации результатов.
После обработки полоски (с технологией латеральной диффузии) положительные образцы гриппа A показали образование синих тестовых линий в положениях гриппа A и фага MS2, положительные образцы гриппа B показали образование синих тестовых линий в положениях гриппа B и фага MS2, отрицательные образцы показали образование синих тестовых линий только в положении фага MS2, как проиллюстрировано на Фиг. 35.
Пример 3. Способ мультиплексной амплификации и обнаружения вируса гриппа (очищенного), добавленного в отрицательные клинические назальные образцы, и вируса внутреннего положительного контроля
Образцы назального мазка, взятые у людей, помещали в 3 мл 0,025% раствора Triton X–100, 10 ммоль/л Tris, pH 8,3 и проверяли на наличие гриппа A и гриппа B с использованием одобренного FDA теста ОТ–ПЦР (RT–PCR) в реальном времени. Образцы были подтверждены как отрицательные на грипп A и грипп B перед использованием в этом исследовании. К подтвержденному отрицательному на грипп назальному образцу был добавлен вирус гриппа A/Puerto Rico в концентрации, эквивалентной 5000 ТЦД50/мл, или он использовался без добавления вируса в качестве отрицательного контроля. 40 мкл полученных в результате добавления образцов или образцов отрицательных контролей добавляли в отверстие для образца кассеты для тестирования для гриппа A и B. При входе в отверстие для образца объем образца 40 мкл смешивается с лиофилизированным сферическим элементом по мере его поступления в первую камеру кассеты для тестирования.
Лиофилизированный сферический элемент состоял из вирусных частиц фага MS2 в качестве положительного внутреннего контроля и ОТТ. В первой камере кассеты образец нагревали до 90°C в течение 1 минуты, чтобы способствовать вирусному лизису, затем охлаждали до 50°C до открытия отверстия, соединенного со второй камерой. Открытие отверстия, соединенного со второй камерой, позволяет образцу течь во вторую камеру, обеспечивая возможность перемещения воздуха во второй камере в расширительную камеру. По мере того, как образец перемещался во вторую камеру, он смешивался с олигонуклеотидными праймерами амплификации к вирусу гриппа A, гриппа B и фагу MS2, а также с реагентам и ферментами для обратной транскрипции и амплификации нуклеиновых кислот, присутствующими в виде лиофилизированной таблетки в углублении пути жидкости между первой и второй камерами.
Камеру амплификации нагревали до 47 °С в течение 6 минут, в течение которых матрица РНК была обратно транскрибирована в кДНК. После завершения обратной транскрипции во второй камере проводили 40 циклов термоциклической амплификации. После завершения термоциклирования отверстие, соединенное с третьей камерой, открывали, чтобы позволить реакционному раствору протекать в третью камеру. Третья камера содержала тест–полоску и лиофилизированный сферический элемент, содержащий три окрашенных в синий цвет полистирольных микросферных конъюгата, используемых в качестве детектирующих частиц. Конъюгаты состояли из 300 нм полистирольных микросфер, ковалентно связанных с олигонуклеотидными маркерными субстратами, комплементарными амплифицированным последовательностям вируса гриппа A, или вируса гриппа B или фага MS2. Раствор растворял лиофилизированные детектирующие частицы по мере его поступления в третью камеру. Три линии захвата были иммобилизованы на мембране с технологией латеральной диффузии, снизу устройства они были следующими: отрицательный контрольный олигонуклеотид, некомплементарный каким–либо анализируемым мишеням; маркерный субстрат захвата, комплементарный продукту амплификации гриппа B; маркерный субстрат захвата, комплементарный продукту амплификации гриппа A; и олигонуклеотид, комплементарный продукту амплификации фага MS2. Полоску (с технологией латеральной диффузии) обрабатывали в течение шести минут до визуальной интерпретации результатов.
После обработки полоски (с технологией латеральной диффузии) положительные образцы гриппа A показали образование синих тестовых линий в положениях гриппа A и фага MS2, образцы отрицательного контроля показали образование синих тестовых линий только в положении фага MS2, как проиллюстрировано на Фиг. 36.
Следует отметить, что в описании и формуле изобретения термины «около» или «приблизительно» означают отклонение в пределах двадцати процентов (20%) от приведенного числового количества. В данном контексте формы единственного числа включают и множественное число, если контекст явно не предписывает иное. Таким образом, например, ссылка на «функциональную группу» относится к одной или более функциональным группам, а ссылка на «способ» включает ссылку на эквивалентные этапы и способы, которые будут понятны и приняты во внимание специалистами в данной области техники, и так далее.
Хотя изобретение было подробно описано с конкретной ссылкой на раскрытые варианты осуществления изобретения, другие варианты осуществления изобретения могут достигать тех же результатов. Вариации и модификации данного изобретения будут очевидны для специалистов в данной области техники, и предполагается, что оно охватывает все такие модификации и эквиваленты. Полные описания всех патентов и публикаций, упомянутых выше, включены в данное описание посредством ссылки.
1. Кассета для обнаружения нуклеиновой кислоты, при этом кассета содержит по меньшей мере одну реакционную камеру;
при этом, когда указанная кассета ориентирована вертикально, верхняя часть указанной реакционной камеры содержит впускное отверстие и выступ, проходящий вниз в указанную реакционную камеру для минимизирования или предотвращения капиллярного потока жидкости через верхнюю часть указанной реакционной камеры,
отличающаяся тем, что первая сторона указанного выступа проходит, по существу, вертикально рядом с указанным впускным отверстием, и причем вторая сторона указанного выступа проходит вверх по направлению к указанной верхней части указанной реакционной камеры под углом менее чем 60 градусов от вертикали.
2. Кассета по п. 1, отличающаяся тем, что указанный выступ имеет треугольную форму.
3. Кассета по п. 1 или 2, отличающаяся тем, что указанный угол составляет менее чем 45 градусов от вертикали.
4. Кассета по п. 3, отличающаяся тем, что указанный угол составляет менее чем 30 градусов от вертикали.
5. Кассета по п. 4, отличающаяся тем, что указанная вторая сторона указанного выступа проходит вертикально по направлению к указанной верхней части указанной реакционной камеры.
6. Кассета по п. 1, содержащая углубление для содержания по меньшей мере одного лиофилизированного или высушенного реагента, при этом указанное углубление расположено в канале, соединенном с указанным впускным отверстием указанной реакционной камеры.
7. Кассета по п. 6, отличающаяся тем, что указанный выступ уменьшает или предотвращает секвестрацию вновь ресуспендированного реагента из основного объема реакционного раствора.
8. Кассета по п. 6, отличающаяся тем, что указанное углубление содержит одну или более конструкций для направления жидкостей с целью облегчения регидратации по меньшей мере одного высушенного или лиофилизированного реагента.
9. Кассета по п. 8, отличающаяся тем, что указанные конструкции содержат гребни, канавки, выемки или их комбинации.
10. Кассета по п. 1, отличающаяся тем, что указанная реакционная камера содержит углубление для содержания по меньшей мере одного лиофилизированного или высушенного реагента.
