Антисмысловое для scn9a обезболивающее средство

Группа изобретений относится к области биотехнологии, в частности к производным пептидной нуклеиновой кислоты, нацеленным на 3'–участок сплайсинга экзона 4 в пре–мРНК SCN9A человека, и может быть использовано в медицине. Производные пептидной нуклеиновой кислоты активно индуцируют варианты сплайсинга мРНК SCN9A, лишенные экзона 4 SCN9A, в клетках млекопитающих, вследствие чего их можно использовать для безопасного лечения различных видов болей или состояний, вовлекающих активность натрий-ионных каналов Na_v1.7-типа. 10 н. и 6 з.п. ф-лы, 24 ил., 2 табл., 22 пр.

 

Настоящее изобретение относится к производным пептидной нуклеиновой кислоты, комплементарно нацеленным на пре-мРНК SCN9A человека, для лечения боли и нарушений, опосредованных потенциалзависимым натриевым каналом подтипа Na_v1.7, и по нему испрашивается приоритет Предварительной заявки США No. 62/449738, поданной 24 января 2017 г., полное содержание которого приведено в настоящем документе в качестве ссылки.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ ДЛЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Потенциалзависимые натриевые каналы (VGSC) представляют собой трансмембранные белки, состоящие из субъединиц α и β. VGSC функционирует в качестве шлюза для пересечения ионами натрия клеточной мембраны. Активность натриевого канала обеспечивает α-субъединица. Подтип VGSC определяют с в соответствии с подтипом α-субъединицы. К настоящему времени, существует по меньшей мере 10 подтипов VGSC, т.е. Na_v1.1, Na_v1.2, …, Na_v1.9 и Na_x.

Каждый подтип VGSC имеет отличную α-субъединицу, и предназначен, чтобы проявлять характерные физиологические роли в зависимости от ткани для экспрессии. Например, подтип Na_v1.2 экспрессируется в центральных нейронах и, по–видимому, связан с эпилепсией [Human Mol. Genet. vol 24(5), 1459-1468 (2015)]. Подтип Na_v1.5 обильно экспрессируется в кардиомиоцитах. Ингибирование Na_v1.5 может вызывать синдром удлинения интервала QT и неожиданную смерть [Handbook Exp. Pharmacol. vol 221, 137-168 (2014)]. Подтип Na_v1.7 обильно экспрессируется в ганглиях задних корешков. Повышающая регуляция активности Na_v1.7 вызывает эритромелалгию [J. Med. Genet. vol 41, 171-174 (2004)]. В то же время, люди с генетическим отсутствием активности Na_v1.7 (т.е., с каналопатиями из-за SCN9A) не чувствуют тяжелых болей, несмотря на то, что обнаружено, что у этих индивидуумов нормальные другие сенсорные функции [Nature vol 444, 894-898 (2006)].

Тетродотоксин (TTX) представляет собой нейротоксин, обнаруженный у иглобрюха. TTX является необычайно токсичным, и его внутрибрюшинная LD₅₀ составляет 10 мкг/кг у мышей [Toxins vol 6, 693-755 (2014)]. Пероральное употребление TTX может вызывать парестезию губ и языка, повышенное слюноотделение, потоотделение, головную боль, тремор, паралич, цианоз, судороги, нарушение координации, диарею, боль в области живота, гипотензию, респираторный дистресс, сердечные аритмии, кому и т.д. Известно, что TTX индуцирует такие неблагоприятные эффекты посредством неспецифического связывания с активными участками подтипов VGSC. Таким образом неспецифическое ингибирование подтипов VGSC может приводить к серьезным неблагоприятным событиям.

Лидокаин представляет собой неспецифический ингибитор VGSC, и является общеупотребительным в качестве местного анестетика. При внутривенном введении, лидокаин может индуцировать нежелательные побочные эффекты, такие как мышечная судорога, рвота, нерегулярное сердцебиение, сонливость, и т.д. Такие побочные эффекты считают обусловленными неспецифическим ингибированием подтипов VGSC. Однако, ингибирование Na_v1.5 с использованием лидокаина может быть полезным для лечения желудочковой тахикардии. Тем не менее, системное введение лидокаина считают нежелательным для лечения хронической боли из-за неблагоприятных событий, возникающих в результате неспецифического ингибирования подтипов натриевых каналов.

Каналопатия из-за SCN9A: Ген SCN9A (натриевый канал подтипа 9A) кодирует α-субъединицу подтипа VGSC Na_v1.7. Существует необычайно малое количество индивидуумов, которые не чувствуют тяжелой боли, но являются нормальными по другим сенсорным функциям. Обнаружено, что такие индивидуумы имеют ген SCN9A, мутированный для кодирования нефункционального подтипа Na_v1.7 [Nature vol 444, 894-898 (2006)]. Это называют каналопатией из-за SCN9A. Поведенческие фенотипы каналопатии из-за SCN9A у человека довольно сильно воспроизводятся у мышей с нокаутом SCN9A [PLoS One 9(9): e105895 (2014)]. Таким образом, избирательное ингибирование подтипа Na_v1.7 можно использовать для безопасного лечения хронической боли у пациентов-людей.

Избирательные низкомолекулярные ингибиторы Na_v1.7: Отражая физиологическую функцию VGSC, активные участки подтипов VGSC являются сходными по своей 3D структуре. Посредством прямого нацеливания на активный участок низкомолекулярных ингибиторов, избирательное ингибирование подтипа Na_v1.7 может быть весьма проблематичным. Лидокаин и тетродотоксин являются хорошими примерами таких неизбирательных ингибиторов подтипов VGSC (ср. фигуру 1A).

Ингибиторы Na_v1.7 с умеренной избирательностью по сравнению с Na_v1.5 (приблизительно в 8 раз) идентифицированы посредством мероприятий высокопроизводительного скрининга библиотеки из 200000 соединения для идентификации избирательных ингибиторов Na_v1.8 [J. Gen. Physiol. vol 131(5), 399-405 (2008)]. Обнаружено, что производное 1-бензазепин-2-она избирательно ингибирует Na_v1.7 по сравнению с Na_v1.5 с умеренной Na_v1.7 избирательно (приблизительно в 8 раз) по электрофизиологическому анализу (ср. фигуру 1B).

До настоящего времени, описан ряд избирательных низкомолекулярных ингибиторов Na_v1.7, и несколько оценивали у пациентов-людей (ср. фигуру 1C). Например, фунапид (XEN-402/TV-45070) оценивали для небольшого количества пациентов эритромелалгией [Pain vol 153, 80-85 (2012)]. Несмотря на то, что для фунапида показана анальгетическая активность, для фунапида показаны связанные с лечением и ограничивающие дозу неблагоприятные события, включая головокружение и сонливость, у относительно большой части зарегистрированных пациентов. Неблагоприятные события в ЦНС позволяют предполагать, что избирательность фунапида Na_v1.7 не может быть достаточно высокой для безопасного лечения хронической боли

Раксатригин (CNV1014802/GSK-1014802) ингибирует Na_v1.7, так же как другие подтипы VGSC. Однако заявлено, что раксатригин ингибирует функциональную активность натриевого канала посредством избирательной стабилизации неактивного состояния натриевого канала. Несмотря на то, что раксатригин ингибирует подтипы натриевого канала в ЦНС, он являлся хорошо переносимым в терапевтической дозе [The Pharmaceutical J. 11 Mar. 2016. Na_v1.7: a new channel для pain treatment]. Для раксатригина показана хорошая анальгетическая активность у пациентов с невралгией тройничного нерва, хотя пациентов регистрировали для клинической оценки на основании строгих кардиологических критериев из-за потенциальной кардиотоксичности в результате относительно слабой избирательности для Na_v1.7.

PF-05089771 представляет собой избирательный ингибитор Na_v1.7 с IC₅₀ 11 нМ. Заявлено, что PF-05089771 стабилизирует неактивную форму Na_v1.7 [Biophysical J. vol 108(2) Suppl., 1573a-1574a (2015)]. Терапевтический потенциал PF-05089771 оценивали у пациентов с эритромелалгией или зубной болью после удаления зуба мудрости. Фармакокинетический анализ PF-05089771 позволяет предполагать, что низкая концентрация лекарственного средства в ткани-мишени, ответственной за невропатическую боль, может являться возможным объяснением его слабой анальгетической активности у пациентов-людей [Clin. Pharmacokinet. vol 55(7), 875-87 (2016)]. Хотя заявлено, что PF-05089771 имеет превосходную избирательность для Na_v1.7 по сравнению с Na_v1.5, его молекулярный размер, по-видимому, является слишком большим, чтобы иметь хорошее распределение в тканях ЦНС с терапевтической важностью для хронических невропатических болей.

Опубликован обзор избирательных низкомолекулярных ингибиторов Na_v1.7 с точки зрения структурных аспектов [Bioorg. Med. Chem. Lett. vol 24, 3690-3699 (2014)]. Молекулярный размер таких избирательных ингибиторов Na_v1.7 имеет тенденцию значительно превышать размер лидокаина, неизбирательного ингибитора подтипов VGSC. Избирательность для Na_v1.7 улучшали посредством увеличения молекулярного размера. Считают, что каждый избирательный ингибитор Na_v1.7 связывает отдельный домен в белке Na_v1.7, и связывающий домен меняется в зависимости от химической структуры ингибитора. Ирония в том, что анальгетическая эффективность избирательных ингибиторов Na_v1.7 не была сильной и не оправдала ожиданий, предполагаемых после обнаружений для людей с каналопатией из-за SCN9A [Expert Opin. Ther. Targets vol 20(8), 975-983 (2016)].

Другие типы избирательных ингибиторов Na_v1.7: Обнаружено, что пептид яда тарантула ProTx-II избирательно ингибировал Na_v1.7 по сравнению с другими подтипами VGSC. Однако, для яда показана слабая анальгетическая активность в моделях острой воспалительной боли на животных [Mol. Pharmacol. vol 74, 1476-1484 (2008)]. Принимая во внимание, что электрофизиологию пептида яда оценивали в клетках HEK-293, модифицированных для обильной экспрессии каждого подтипа VGSC, ProTx-II может не находить активный участок Na_v1.7 в первичных нейрональных клетках. Первичные нейрональные клетки экспрессируют Nav1.7, состоящий из α- и β-цепи, в то время как клетки HEK-293 обычно модифицируют для стабильной экспрессии только α-цепи каждого подтипа VGSC.

Обнаружено, что Ssm6a, 46-членный пептид, выделенный из яда многоножки, избирательно ингибирует Na_v1.7 по сравнению с другими подтипами VGSC. Наблюдаемая для Na_v1.7 IC₅₀ составляла 0,3 нМ в клетках HEK-293, модифицированных для сверхэкспрессии Na_v1.7. Для пептида из яда многоножки показана анальгетическая эффективность, сравнимая с морфином, в формалиновом тесте на мышах, модели острой воспалительной боли. Этот 46-членный пептид также супрессировал натриевый ток в клетках DRG крысы. Несмотря на то, что для этого пептида яда показана высокая стабильность в сыворотке, анальгетическая активность длилась только несколько часов [Proc. Nat. Acad. Sci. USA vol 110(43), 17534-17539 (2013)].

SVmab1 представляет собой моноклональные антитело, избирательно нацеленное на Na_v1.7 по сравнению с другими подтипами VGSC в клетках HEK-293 со сверхэкспрессией каждого подтипа VGSC. SVmab1 избирательно ингибировало натриевый ток, вызываемый Na_v1.7, с IC₅₀ 30 нМ в клетках HEK-293. Для этого моноклонального антитела показана заметная анальгетическая активность при внутривенном (50 мг/кг) или интратекальном (10 мкг, т.е. приблизительно 0,5 мг/кг) введении в формалиновом тесте на мышах. На основании различий анальгетической активности при двух способах введения, ингибирование Na_v1.7 в спинном мозге или ЦНС должно вносить основной вклад в анальгетическую активность в формалиновом тесте [Cell vol 157(6), 1393-1404 (2014)].

Видовые отличия вклада Na_v1.7 в ощущение боли: Недавно DRG человека от здоровых добровольцев оценивали посредством qПЦР по относительным уровням экспрессии подтипов VGSC [Neurosci. Bull. DOI 10.1007/s12264-017-0132-3, published online 19 April (2017)]. В DRG человека, экспрессия подтипа Na_v1.7 составляла приблизительно 50% от общей экспрессии VGSC. Na_v1.8 составлял приблизительно 12%. 24-часовая инкубация нейрональных клеток DRG человека с паклитакселом приводила к повышающей регуляции Na_v1.7, но не Na_v1.8, показывая, что Na_v1.7 должен являться преобладающим подтипом для невропатии, по сравнению с Na_v1.8, у человека. Эти обнаружения сильно поддерживают фенотипы, наблюдаемые при каналопатии из-за SCN9A у человека [Nature vol 444, 894-898 (2006)].

В то же время, вклад Na_v1.8 являлся преобладающим, занимая 48% от всей экспрессии VGSC в DRG мыши. Вклад Na_v1.7 составлял 18% в DRG от наивных мышей CD (в возрасте 8-10 недель). Таким образом, следует с осторожностью экстраполировать данные для боли у животных на терапевтическую дозу у субъектов-людей. Подобным образом, модели боли на животных необходимо оценивать с осторожностью, принимая во внимание уровень экспрессии Na_v1.7 в ткани-мишени.

Пре-мРНК: Генетическую информацию несет ДНК (2-дезоксирибонуклеиновая кислота). ДНК транскрибируется с получением пре-мРНК (прематричной рибонуклеиновой кислоты) в ядре. Пре-мРНК млекопитающих обычно состоит из экзонов и интронов, и экзон и интрон соединены друг с другом. Экзоны и интроны пронумерованы, как проиллюстрировано на фигуре 1D.

Сплайсинг пре-мРНК: Пре-мРНК процессируется в мРНК после делеции интронов посредством серий комплексных реакций, совместно называемых «сплайсингом», как схематически проиллюстрировано на фигуре 2A [Ann. Rev. Biochem. 72(1), 291-336 (2003); Nature Rev. Mol. Cell Biol. 6(5), 386-398 (2005); Nature Rev. Mol. Cell Biol. 15(2), 108-121 (2014)].

Сплайсинг инициируется посредством формирования «комплекса сплайсингосомы E» (т.е. «раннего комплекса сплайсингосомы») между пре-мРНК и адаптерными факторами сплайсинга. В «комплексе сплайсингосомы E», U1 связывается со стыком экзона N и интрона N, и U2AF³⁵ связывается со стыком интрона N и экзона (N+1). Таким образом, стыки экзон/интрон или интрон/экзон являются критическими для формирования раннего комплекса сплайсингосомы. «Комплекс сплайсингосомы E» эволюционирует до «комплекса сплайсингосомы A» при дополнительном образовании комплекса с U2. «Комплекс сплайсингосомы A» подвергается серии комплексных реакций для делеции или сплайсинга интрона для стыковки соседних экзонов.

Рибосомальный синтез белков: Белки кодированы посредством мРНК (матричной рибонуклеиновой кислоты). В ответ на клеточную стимуляцию или спонтанно, ДНК подвергается транскрипции с получением пре-мРНК (прематричной рибонуклеиновой кислоты) в ядре. Интроны пре-мРНК подвергаются ферментному сплайсингу с получением мРНК, которая затем подвергается транслокации в цитоплазму. В цитоплазме, комплекс аппарата трансляции, называемый рибосомой, связывает мРНК и осуществляет синтез белка, по мере того, как он сканирует генетическую информацию, кодированную на протяжении мРНК [Biochemistry vol 41, 4503-4510 (2002); Cancer Res. vol 48, 2659-2668 (1988)].

Антисмысловой олигонуклеотид (ASO): Олигонуклеотид, связывающийся с нуклеиновой кислотой, включая ДНК, мРНК и пре-мРНК, специфическим для последовательности образом (т.е., комплементарно), называют антисмысловым олигонуклеотидом (ASO).

Если ASO тесно связывается с мРНК в цитоплазме, например, ASO может являться способным ингибировать рибосомальный синтез белка на протяжении мРНК. ASO необходимо присутствовать в цитоплазме, чтобы ингибировать рибосомальный синтез белка для своего белка-мишени.

Если ASO тесно связывается с пре-мРНК в ядре, ASO может являться способным ингибировать или модулировать сплайсинг пре-мРНК до мРНК. ASO необходимо присутствовать в ядре, чтобы ингибировать или модулировать сплайсинг пре-мРНК до мРНК. Такое антисмысловое ингибирование сплайсинга приводит к образованию одной или нескольких мРНК, лишенных экзона, на который нацелен ASO. Такую мРНК(несколько мРНК) называют «вариантом(вариантами) сплайсинга», и она кодирует белок(белки), меньшие, чем белок, кодированнный полноразмерной мРНК.

В принципе, сплайсинг можно прерывать посредством ингибирования формирования «комплекса сплайсингосомы E». Если ASO тесно связывается со стыком (5'→3') экзон-интрон, т.е. «5'-участком сплайсинга», ASO блокирует формирование комплекса между пре-мРНК и фактором U1, и таким образом, формирование «комплекса сплайсингосомы E». Подобным образом, «комплекс сплайсингосомы E» не может быть сформирован, если ASO тесно связывается со стыком (5'→3') интрон-экзон, т.е. «3'-участком сплайсинга». 3'-участок сплайсинга и 5'-участок сплайсинга схематически проиллюстрированы на фигуре 2B.

Неприродные олигонуклеотиды: ДНК- или РНК-олигонуклеотиды являются чувствительными к деградации эндогенными нуклеазами, ограничивающей их терапевтическую полезность. До настоящего времени, множество типов неприродных (т.е., не встречающихся в природе) олигонуклеотидов разработаны и интенсивно изучены [Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. vol 33, 533-540 (2006)]. Для некоторых из них показана усиленная устойчивость к метаболизму по сравнению с ДНК и РНК. На фигуре 3A представлены химические структуры для некоторых из репрезентативных неприродных олигонуклеотидов. Такие олигонуклеотиды предсказуемо связываются с комплементарной нуклеиновой кислотой, как связывается ДНК или РНК.

Фосфоротиоатный олигонуклеотид: Фосфоротиоатный олигонуклеотид (PTO) представляет собой аналог ДНК с одним из атомов кислорода фосфата остова, замененным на атом серы на мономер. Такое небольшое структурное изменение делает PTO сравнительно устойчивым к деградации нуклеазами [Ann. Rev. Biochem. vol 54, 367-402 (1985)].

Как отражение структурного сходства остова PTO и ДНК, они оба плохо проникают через мембрану клетки в большинстве типов клеток млекопитающих. Однако, для некоторых типов клеток, в большом количестве экспрессирующих транспортер(ы) ДНК, для ДНК и PTO показано хорошее проникновение в клетки. Известно, что системно введенные PTO легко распространяются в печень и почки [Nucleic Acids Res. vol 25, 3290-3296 (1997)].

Для облегчения проникновения PTO в клетки in vitro, липофекция является общепринятой. Однако липофекция физически изменяет мембрану клетки, вызывает цитотоксичность, и таким образом, не может являться идеальной для долгосрочного терапевтического применения in vivo.

На протяжении последних 30 лет, антисмысловые PTO и варианты PTO клинически оценивали для лечения злокачественных опухолей, иммунологических нарушений, метаболических заболеваний, и т.д. [Biochemistry vol 41, 4503-4510 (2002); Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. vol 33, 533-540 (2006)]. Множество таких антисмысловых лекарственных средств-кандидатов не были успешно разработаны, частично, из-за плохой проницаемости клеток для PTO. Для преодоления плохой проницаемости клеток, PTO необходимо вводить в высокой дозе для терапевтической активности. Однако, известно, что PTO ассоциированы с ограничивающей дозу токсичностью, включая увеличенное время свертывания, активацию комплемента, тубулярную нефропатию, активацию клеток Купфера и иммуностимуляцию, включая спленомегалию, лимфоидную гиперплазию, инфильтрацию мононуклеарных клеток [Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. vol 33, 533-540 (2006)].

Обнаружено, что многие антисмысловые PTO имеют надлежащую клиническую активность против заболеваний с значительным затрагиванием печени или почек. Мипомерсен представляет собой аналог PTO, ингибирующий синтез apoB-100, белка, вовлеченного в транспорт холестерина LDL. Мипомерсен проявлял надлежащую клиническую активность в популяции пациентов с атеросклерозом, наиболее вероятно, из-за его предпочтительного распределения в печени [Circulation vol 118(7), 743-753 (2008)]. ISIS-113715 представляет собой антисмысловой аналог PTO, который ингибирует синтез белка тирозин-фосфатазы 1B (PTP1B) и, как обнаружено, имеет терапевтическую активность у пациентов с диабетом типа II [Curr. Opin. Mol. Ther. vol 6, 331-336 (2004)].

Запертая нуклеиновая кислота: В запертой нуклеиновой кислоте (ЗНК), рибозное кольцо остова РНК является структурно ограниченным для увеличения аффинности связывания для РНК или ДНК. Таким образом, ЗНК можно рассматривать как высокоаффинный аналог ДНК или РНК [Biochemistry vol 45, 7347-7355 (2006)]. Показана также плохая проницаемость клеток для ЗНК.

Фосфородиамидатный морфолиновый олигонуклеотид: В фосфородиамидатном морфолиновом олигонуклеотиде (PMO), фосфат остова и 2-дезоксирибоза ДНК заменены на фосфорамидат и морфолин соответственно [Appl. Microbiol. Biotechnol. vol 71, 575-586 (2006)]. В то время как остов ДНК заряжен отрицательно, остов PMO не заряжен. Таким образом, связывание между PMO и мРНК является свободным от электростатического отталкивания между остовами, и имеет тенденцию являться более сильным, чем связывание между ДНК и мРНК. Поскольку PMO заметно отличается от ДНК по химической структуре, PMO не могут быть узнаны печеночным транспортером(транспортерами), узнающими ДНК или РНК. Тем не менее, PMO не проникает легко через мембрану клетки.

Пептидная нуклеиновая кислота: Пептидная нуклеиновая кислота (ПНК) представляет собой полипептид с N-(2-аминоэтил)глицином в качестве остова звена, и открыта Peter Nielsen и соавторами [Science vol 254, 1497-1500 (1991)]. Химическая структура и сокращенная номенклатура ПНК проиллюстрированы на фигуре 3B. Подобно ДНК и РНК, ПНК также избирательно связывается с комплементарной нуклеиновой кислотой [Nature (London) vol 365, 566-568 (1992)]. При связывании с комплементарной нуклеиновой кислотой, N-конец ПНК рассматривают как эквивалентный «5'-концу» ДНК или РНК, и C-конец ПНК - как эквивалентный «3'-концу» ДНК или РНК.

Подобно PMO, остов ПНК не заряжен. Таким образом, связывание между ПНК и РНК имеет тенденцию являться более сильным, чем связывание между ДНК и РНК. Поскольку ПНК заметно отличается от ДНК по химической структуре, ПНК не может быть узнана печеночным транспортером(транспортерами), узнающими ДНК, и может иметь профиль распределения в тканях, отличный от профиля ДНК или PTO. Однако, ПНК так же плохо проникает через мембрану клеток млекопитающих (Adv. Drug Delivery Rev. vol 55, 267-280, 2003).

Модифицированные нуклеиновые основания для улучшения проницаемости мембраны для ПНК: ПНК придавали высокую интенсивность проникновения через мембрану клеток млекопитающих посредством введения модифицированных нуклеиновых оснований с ковалентно присоединенными к ним катионным липидом или его эквивалентом. Химическая структура таких модифицированных нуклеиновых оснований представлена на фигуре 3C. Обнаружено, что такие модифицированные нуклеиновые основания из цитозина, аденина и гуанина предсказуемо и комплементарно гибридизуются с гуанином, тимином и цитозином соответственно [PCT Appl. No. PCT/KR2009/001256; EP2268607; US8680253].

Включение таких модифицированных нуклеиновых оснований в ПНК имитирует ситуацию липофекции. Посредством липофекции, молекулы олигонуклеотида с фосфатным остовом оборачивают молекулами катионного липида, такого как липофектамин, и такие комплексы липофектамин/олигонуклеотид проявляют тенденцию к несколько более простому проникновению через мембрану клетки, по сравнению с молекулами голого олигонуклеотида.

Обнаружено, что, в дополнение к хорошей способности к проникновению через мембрану, эти модифицированные производные ПНК имеют сверхсильную аффинность для комплементарной нуклеиновой кислоты. Например, введение от 4 до 5 модифицированных нуклеиновых оснований в 11-членные - 13-членные производные ПНК легко приводит к увеличению T_m на 20°C или выше при формировании дуплекса с комплементарной ДНК. Такие производные ПНК являются высоко чувствительными к одиночному несовпадению оснований. Одиночное несовпадение оснований приводит к уменьшению T_m на 11-22°C, в зависимости от типа модифицированного основания, так же как последовательности ПНК.

Малая интерферирующая РНК (миРНК): Малая интерферирующая РНК (миРНК) относится к двухцепочечной РНК из 20-25 пар оснований [Microbiol. Mol. Biol. Rev. vol 67(4), 657-685 (2003)]. Антисмысловая цепь миРНК некоторым образом взаимодействует с белками с формированием «индуцированного РНК комплекса молчания» (RISC). Затем RISC связывается с определенной частью мРНК, комплементарной антисмысловой цепи миРНК. мРНК в комплексе с RISC подвергается расщеплению. Таким образом, миРНК каталитически индуцирует расщепление своей мРНК-мишени, и следовательно, ингибирует экспрессию белка посредством мРНК. RISC не всегда связывается с полностью комплементарной последовательностью в своей мРНК-мишени, что вызывает опасения относительно неспецифических эффектов терапии миРНК. Подобно другим классам олигонуклеотидов с ДНК- или РНК-остовом, миРНК имеет плохое проникновение в клетки и таким образом, имеет тенденцию к плохой терапевтической активности in vitro или in vivo, если не будет надлежащим образом составлена или химически модифицирована, чтобы иметь хорошее проникновение через мембрану.

миРНК SCN9A: На предшествующем уровне техники описаны миРНК, нацеленные на 19-членную последовательность [(5'→3') GAUUAUGGCUACACGAGCU] внутри экзона 8 мРНК SCN9A человека [Патент США 8183221]. Заявлено, что при интратекальной инфузии, миРНК имеют терапевтическую активность в моделях на животных невропатической боли и воспалительной боли. Указано, что миРНК осуществляли понижающую регуляцию экспрессии Na_v1.7 в клетках DRG крысы.

ASO SCN9A: 2'-O-метоксиэтил-PTO ASO, комплементарно нацеленные на мРНК SCN9A крысы, оценивали по их способности ингибировать экспрессию белка Na_v1.7 в DRG у крыс при однократной подкожной инъекции 30 мг ASO на субъекта. ASO ингибировал экспрессию белка Na_v1.7 в DRG более, чем на 80%, на неделе 4 после дозирования. Эти ASO SCN9A ингибировали мышечную боль по тесту Рэндалла-Селитто. Эффективность в большой степени коррелировала с уровнем экспрессии белка Na_v1.7 в DRG [Pain, Mohan and Fitzsimmons et al. in press].

Антисмысловое ингибирование сплайсинга пре-мРНК SCN9A: До настоящего времени, не опубликовано случаев индукции посредством ASO SCN9A альтернативного сплайсинга пре-мРНК SCN9A.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фигура 1A. Химические структуры лидокаина и тетродотоксина, неизбирательных низкомолекулярных ингибиторов потенциалзависимых натриевых каналов.

Фигура 1B. Ингибитор Na_v1.7 1-бензазепин-2-он, имеющий умеренную избирательность для Na_v1.7 по сравнению с Na_v1.5.

Фигура 1C. Химические структуры фунапида, раксатригина и PF-05089771, избирательных низкомолекулярных ингибиторов потенциалзависимых натриевых каналов.

Фигура 2A. Схематическая иллюстрация нумерации экзонов и интронов в пре-мРНК.

Фигура 2B. Схематическая иллюстрация процесса сплайсинга, приводящего к делеции интрона N.

Фигура 2C. Схематическая иллюстрация 3'-участка сплайсинга и 5'-участка сплайсинга, применительно к комплексу сплайсингосомы E.

Фигура 3A. Репрезентативная химическая структура ДНК и неприродных нуклеиновых кислот.

Фигура 3B. Иллюстрация химической структуры и сокращенной номенклатуры ПНК.

Фигура 3C. Примеры модифицированных нуклеиновых оснований, используемых для улучшения проницаемости клеток для пептидной нуклеиновой кислоты.

Фигура 4. Примеры природных или неприродных (модифицированных) нуклеиновых оснований, которые можно выбирать для производного пептидной нуклеиновой кислоты формулы I.

Фигура 5A. Примеры замещенных или незамещенных алкильных радикалов, которые можно выбирать для производного пептидной нуклеиновой кислоты формулы I.

Фигура 5B. Примеры замещенных или незамещенных алкилацильных, и замещенных или незамещенных арилацильных радикалов, которые можно выбирать для производного пептидной нуклеиновой кислоты формулы I.

Фигура 5C. Примеры замещенных алкиламино-, замещенных ариламино-, замещенных или незамещенных арильных, замещенных или незамещенных алкилсульфонильных, замещенных или незамещенных арилсульфонильных, замещенных или незамещенных алкилфосфонильных, и замещенных или незамещенных арилфосфонильных радикалов, которые можно выбирать для производного пептидной нуклеиновой кислоты формулы I.

Фигура 5D. Примеры замещенных или незамещенных алкилоксикарбонильных, замещенных или незамещенных арилоксикарбонильных, замещенных или незамещенных алкиламинокарбонильных и замещенных или незамещенных ариламинокарбонильных радикалов, которые можно выбирать для производного пептидной нуклеиновой кислоты формулы I.

Фигура 5E. Примеры замещенных или незамещенных алкилокситиокарбонильных, замещенных или незамещенных алкиламинотиокарбонильных, замещенных или незамещенных ариламинотиокарбонильных и замещенных или незамещенных алкилокситиокарбонильных радикалов, которые можно выбирать для производного пептидной нуклеиновой кислоты формулы I.

Фигура 6. Химическая структура мономеров ПНК, сокращенно обозначенных как A (аденин), G (гуанин), T (тимин), C (цитозин), C(pOq), A(p), A(pOq), G(p) и G(pOq).

Фигура 7. Химическая структура для сокращенных наименований, используемых для описания заместителей для N-конца или C-конца соединения формулы I.

Фигура 8. Химическая структура 14-членного производного ПНК, обозначенного как «(N→C) Fethoc-TA(5)A-A(5)TA(5)-CGC(1O2)-AA(5)A-A(5)A-NH₂».

Фигура 9. Химическая структура 16-членного производного ПНК, сокращенно обозначенного как «(N→C) Fethoc-AG(5)C-A(5)CT-TA(5)C-GC(1O2)A-A(5)AA(2O2)-A-Lys-NH₂».

Фигура 10. Химическая структура Fmoc-мономеров ПНК, используемых для синтеза производных ПНК по настоящему изобретению.

Фигура 11. Схематическая иллюстрация типичного цикла удлинения мономера, принятого в SPPS по настоящему изобретению.

Фигура 12A. Хроматограмма C₁₈-обращеннофазовой HPLC для «ASO 2» до очистки посредством HPLC.

Фигура 12B. Хроматограмма C₁₈-обращеннофазовой HPLC для «ASO 2» после очистки посредством HPLC.

Фигура 13. Данные масс-спектрометрии ES-TOF, полученные с использованием «ASO 2» после очистки посредством HPLC.

Фигура 14A. Данные электрофореза продуктов гнездовой ОТ-ПЦР SCN9A в клетках PC3, обработанных с использованием «ASO 7» в течение 5 часов при 0 (отрицательный контроль), 10 или 100 зМ.

Фигура 14B. Данные секвенирования по Сенджеру для продукта ПЦР, приписанного пропуску экзонов 4-5.

Фигура 14C. Данные электрофореза продуктов гнездовой ОТ-ПЦР SCN9A в клетках PC3, обработанных с использованием «ASO 7» в течение 24 часов при 0 (отрицательный контроль), 1, 10, 100 или 1000 aM.

Фигура 15A. Данные qПЦР для полноразмерной мРНК SCN9A в клетках PC3, обработанных с использованием «ASO 7» при 0 (отрицательный контроль), 0,1, 1 или 10 aM в течение 24 часов. кДНК синтезирована посредством одностадийной ПЦР (планки погрешностей для стандартной ошибки; и * для p < 0,05).

Фигура 15B. Данные qПЦР для полноразмерной мРНК SCN9A в клетках PC3, обработанных с использованием «ASO 7» при 0 (отрицательный контроль), 0,1, 1 или 10 aM в течение 24 часов. кДНК синтезировали с использованием случайных гексамеров (планки погрешностей для стандартной ошибки; и ** для p < 0,05).

Фигура 16A. Обращение аллодинии, индуцированной посредством лигирования L5/L6 у крыс SD, которым подкожно вводили «ASO 7» при 0 (отрицательный контроль), 1, 3 или 6 пмоль/кг, один раз в 2 суток. Порог фон Фрея для прегабалина, 30 мг/кг массы тела, добавляли, принимая собственные исторические справочные данные (* для p < 0,05 по t-критерию Стьюдента).

Фигура 16B. Обращение аллодинии, индуцированной посредством SNL (лигирования L5/L6) у крыс SD, которым подкожно вводили «ASO 2» at 0 (отрицательный контроль), 20 пмоль/кг QD, 100 пмоль/кг QD, 500 пмоль/кг QD и 100 пмоль/кг Q2D. Порог фон Фрея для прегабалина, 30 мг/кг массы тела, добавляли, принимая собственные исторические справочные данные (* для p < 0,05 по t-критерию Стьюдента).

Фигура 17A. Средние кривые интенсивности клеточной флуоресценции (слева) в нейрональных клетках DRG L5 крысы с «лигированием L5/L6» после 30-часовой инкубации с «ASO 7» при 0 (отрицательный контроль), 100 или 1,000 зМ, вместе с флуоресцентным изображением образца нейрональной клетки DRG, обработанной «CoroNa зеленым» (справа).

Фигура 17B. Средние кривые интенсивности клеточной флуоресценции в нейрональных клетках DRG L5 крысы без «лигирования L5/L6» после 30-часовой инкубации с «ASO 7» при 0 (отрицательный контроль), 100 или 1000 зМ.

Фигура 18A. Обращение аллодинии, индуцированной с использованием DPNP, у крыс, которым подкожно вводили 100 пмоль/кг «ASO 1» (планки погрешностей для стандартной ошибки; * для p < 0,05 по t-критерию Стьюдента).

Фигура 18B. Обращение аллодинии, индуцированной с использованием DPNP, у крыс, которым подкожно вводили 60 пмоль/кг «ASO 2» или 30 пмоль/кг «ASO 6» на сутки 0, 2 и 4. Порог фон Фрея без DPNP добавляли, принимая собственные исторические справочные данные (планки погрешностей для стандартной ошибки; * и ** для p < 0,05 и p < 0,01 по t-критерию Стьюдента соответственно).

Фигура 19A. Ингибирование боли, индуцированной посредством внутриподошвенной инъекции 5% формалина, у крыс, которым подкожно вводили «ASO 7» at 0 (отрицательный контроль), 10, 30 или 100 пмоль/кг (планки погрешностей для стандартной ошибки; * p < 0,05 по t-критерию Стьюдента).

Фигура 19B. Ингибирование боли, индуцированной посредством внутриподошвенной инъекции 5% формалина у крыс, которым подкожно вводили «ASO 10» при 0 (отрицательный контроль), 15, 50 или 150 пмоль/кг (планки погрешностей для стандартной ошибки; * p < 0,05 по t-критерию Стьюдента).

Фигура 20A. Репрезентативные IHC изображения по группам для экспрессии Na_v1.7 в DRG L5 у крыс, которым подкожно вводили «ASO 7» при 0 (отрицательный контроль), 1, 6 или 30 пмоль/кг.

Фигура 20B. Относительный уровень экспрессии Na_v1.7 в DRG L5 у крыс, которым подкожно вводили «ASO 7» при 0 (отрицательный контроль), 1, 6 или 30 пмоль/кг (планки погрешностей для стандартной ошибки; * для p < 0,05 и ** для p < 0,01 по t-критерию Стьюдента).

Фигура 21A. Обращение аллодинии у крыс с лигированием L5/L6 посредством подкожного введения «ASO 10» при 1 (с увеличением до 30 пмоль/кг на сутки 3 и 7), 3 и 10 пмоль/кг (планки погрешностей для стандартной ошибки; * для p < 0,05 по t-критерию Стьюдента).

Фигура 21B. Обращение аллодинии у крыс с лигированием L5/L6 посредством подкожного введения «ASO 10» при 100 пмоль/кг, один раз в каждые 4 или 5 суток, или посредством перорального введения прегабалина, 30 мг/кг массы тела.

Фигура 22. IHC изображения экспрессии Na_v1.7 (красный), тела нейрональной клетки (зеленый) и ядра (синий) для образцов спинного мозга, полученных из группы обработки «ASO 10», в которой вводили дозы на сутки 0 и 4 (изображения на верхней панели) и из группы отрицательного контроля (изображения на нижней панели) (N=3 на группу).

Фигура 23A. Данные Вестерн-блоттинга для экспрессии Nav1.7 в нейрональных клетках DRG L5, обработанных с использованием «ASO 10» в течение 24 часов при 0 (отрицательный контроль), 10, 100 или 1000 зМ.

Фигура 23B. Данные qПЦР для полноразмерной мРНК SCN9A с синтезом кДНК посредством одностадийной ПЦР (фигура слева) и синтезом кДНК с использованием случайных гексамеров (фигура справа) в нейрональных клетках DRG L5, обработанных с использованием «ASO 10» при 0 (отрицательный контроль), 10, 30, 100 или 300 зМ в течение 24 часов (планки погрешностей для стандартной ошибки; * для p < 0,05 и ** для p < 0,01 по t-критерию Стьюдента)

Фигура 23C. Среднее пулированных данных натриевого тока в нейрональных клетках DRG L5, обработанных с использованием «ASO 10» в течение приблизительно 6 часов при 0 (отрицательный контроль), 10, 30, или 100 зМ (фигура с левой стороны); и усредненные кривые пулированных данных натриевого тока для клеток отрицательного контроля и клеток, обработанных с использованием 100 зМ «ASO 10» в течение приблизительно 6 часов (фигура с правой стороны). Данные натриевого тока пулировали как нормализованные по размеру клеток (N относится к количеству клеток, пулированных для анализа данных, на группу; планки погрешностей для стандартной ошибки; и * для p < 0,05 по t-критерию Стьюдента).

Фигура 24A. Обращение аллодинии, индуцированной посредством лигирования L5/L6 у крыс SD, которым подкожно вводили «ASO 7» при 0 (отрицательный контроль), 5, 25, 125 или 625 фмоль/кг на сутки 0, 3 и 6. Группу обработки прегабалина 30 мг/кг po включали в качестве положительного контроля (N=8 на группу; и планки погрешностей для стандартной ошибки).

Фигура 24B. Изменения болевого порога по тесту Рэндалла-Селитто у крыс, которым подкожно вводили «ASO 2» при 0 (отрицательный контроль) или 100 пмоль/кг на сутки 0 и 1 (планки погрешностей для стандартной ошибки; * для p < 0,05 по t-критерию Стьюдента).

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к производному пептидной нуклеиновой кислоты, представленному формулой I, или его фармацевтически приемлемой соли:

,

где

n представляет собой целое число между 10 и 25;

соединение формулы I имеет по меньшей мере 10-членное комплементарное перекрывание с 14-членной последовательностью пре-мРНК [(5'→3') UGUUUAGGUACACU] в пре-мРНК SCN9A человека;

соединение формулы I является полностью комплементарным пре-мРНК SCN9A человека, или частично комплементарным пре-мРНК SCN9A человека с одним или двумя несовпадениями;

S₁, S₂, …, S_n–1, S_n, T₁, T₂, …, T_n–1 и T_n независимо представляют собой дейтеридо- [D], гидридо- [H], замещенный или незамещенный алкильный, или замещенный или незамещенный арильный радикал;

X и Y независимо представляют собой гидридо-, формильный [H-C(=O)-], аминокарбонильный [NH₂-C(=O)-], аминотиокарбонильный [NH₂-C(=S)–], замещенный или незамещенный алкильный, замещенный или незамещенный арильный, замещенный или незамещенный алкилацильный, замещенный или незамещенный арилацильный, замещенный или незамещенный алкилоксикарбонильный, замещенный или незамещенный арилоксикарбонильный, замещенный или незамещенный алкиламинокарбонильный, замещенный или незамещенный ариламинокарбонильный, замещенный или незамещенный алкиламинотиокарбонильный, замещенный или незамещенный ариламинотиокарбонильный, замещенный или незамещенный алкилокситиокарбонильный, замещенный или незамещенный арилокситиокарбонильный, замещенный или незамещенный алкилсульфонильный, замещенный или незамещенный арилсульфонильный, замещенный или незамещенный алкилфосфонильный радикал, или замещенный или незамещенный арилфосфонильный радикал;

Z представляет собой гидридо-, гидрокси, замещенный или незамещенный алкилокси-, замещенный или незамещенный арилокси-, замещенный или незамещенный амино-, замещенный или незамещенный алкильный, или замещенный или незамещенный арильный радикал;

B₁, B₂, …, B_n–1 и B_n независимо выбраны из природных нуклеиновых оснований, включающих аденин, тимин, гуанин, цитозин и урацил, и неприродных нуклеиновых оснований; и,

по меньшей мере четыре из B₁, B₂, …, B_n–1 и B_n независимо выбраны из неприродных нуклеиновых оснований с замещенным или незамещенным амино-радикалом, ковалентно связанным с группой нуклеинового основания.

Соединение формулы I индуцирует пропуск «экзона 4» в пре-мРНК SCN9A человека, с получением варианта(вариантов) сплайсинга мРНК SCN9A человека, лишенных «экзона 4», и, таким образом, его можно использовать для лечения боли или состояний, вовлекающих активность Na_v1.7.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к производному пептидной нуклеиновой кислоты, представленному формулой I, или его фармацевтически приемлемой соли:

,

где

n представляет собой целое число между 10 и 25;

соединение формулы I имеет по меньшей мере 10-членное комплементарное перекрывание с 14-членной последовательностью пре-мРНК [(5'→3') UGUUUAGGUACACU] в пре-мРНК SCN9A человека;

соединение формулы I является полностью комплементарным пре-мРНК SCN9A человека или частично комплементарным пре-мРНК SCN9A человека с одним или двумя несовпадениями;

S₁, S₂, …, S_n–1, S_n, T₁, T₂, …, T_n–1 и T_n независимо представляют собой дейтеридо- [D], гидридо- [H], замещенный или незамещенный алкильный, или замещенный или незамещенный арильный радикал;

X и Y независимо представляют собой гидридо-, формильный [H-C(=O)-], аминокарбонильный [NH₂-C(=O)-], аминотиокарбонильный [NH₂-C(=S)-], замещенный или незамещенный алкильный, замещенный или незамещенный арильный, замещенный или незамещенный алкилацильный, замещенный или незамещенный арилацильный, замещенный или незамещенный алкилоксикарбонильный, замещенный или незамещенный арилоксикарбонильный, замещенный или незамещенный алкиламинокарбонильный, замещенный или незамещенный ариламинокарбонильный, замещенный или незамещенный алкиламинотиокарбонильный, замещенный или незамещенный ариламинотиокарбонильный, замещенный или незамещенный алкилокситиокарбонильный, замещенный или незамещенный арилокситиокарбонильный, замещенный или незамещенный алкилсульфонильный, замещенный или незамещенный арилсульфонильный, замещенный или незамещенный алкилфосфонильный радикал, или замещенный или незамещенный арилфосфонильный радикал;

Z представляет собой гидридо-, гидрокси-, замещенный или незамещенный алкилокси-, замещенный или незамещенный арилокси-, замещенный или незамещенный амино-, замещенный или незамещенный алкильный, или замещенный или незамещенный арильный радикал;

B₁, B₂, …, B_n–1 и B_n независимо выбраны из природных нуклеиновых оснований, включающих аденин, тимин, гуанин, цитозин и урацил, и неприродных нуклеиновых оснований; и

по меньшей мере четыре из B₁, B₂, …, B_n–1 и B_n независимо выбраны из неприродных нуклеиновых оснований с замещенным или незамещенным амино-радикалом, ковалентно связанным с группой нуклеинового основания.

Соединение формулы I индуцирует пропуск «экзона 4» в пре-мРНК SCN9A человека, с получением варианта(вариантов) сплайсинга мРНК SCN9A человека, лишенных «экзона 4», и, таким образом, его можно использовать для лечения боли или состояний, вовлекающих активность Na_v1.7.

В некоторых вариантах осуществления соединения формулы I, n представляет собой целое число, выбранное из 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 и 24.

Соединение формулы I комплементарно связывается с 3'-участком сплайсинга, перекрывающим стык интрона 3 и экзона 4 внутри пре-мРНК SCN9A человека, считанной с геномной ДНК [Эталонная последовательность в NCBI: NC_000002.12]. 14-членная последовательность [(5'→3') UGUUUAGGUACACU] внутри пре-мРНК SCN9A человека представляет собой последовательность 3'-участка сплайсинга, состоящего из 7-членника из «интрона 3» и 7-членника из «экзона 4». Таким образом 14-членную последовательность пре-мРНК можно общепринятым образом обозначать как [(5'→3') ], где последовательности интрона и экзона обозначены «строчными» и «заглавными» буквами соответственно и стык между «интроном 3» и «экзоном 4» обозначен .

Общепринятое обозначение пре-мРНК дополнительно проиллюстрировано 30-членной последовательностью [(5'→3') ], перекрывающей стык «интрона 3» и «экзона 4» в пре-мРНК SCN9A человека. Нумерация экзонов может меняться в зависимости от опубликованных транскриптов мРНК SCN9A. Предоставление 30-членной последовательности SCN9A предназначено для однозначной идентификации участка сплайсинга - мишени для соединения формулы I, вне зависимости от опубликованной нумерации экзонов мРНК SCN9A.

Химическая структура природных (т.е., встречающихся в природе) или неприродных (т.е., не встречающихся в природе) нуклеиновых оснований в производном ПНК формулы I проиллюстрирована на фигуре 4. Природные или неприродные нуклеиновые основания по настоящему изобретению включают, но без ограничения, нуклеиновые основания, представленные на фигуре 4. Представление природных и неприродных нуклеиновых оснований в качестве примеров предназначено для иллюстрации разнообразия допустимых нуклеиновых оснований, и таким образом, его не следует интерпретировать как ограничение объема настоящего изобретения.

Заместители, принятые для описания производного ПНК формулы I, проиллюстрированы на фигурах 5 A-E. На фигуре 5A представлены примеры замещенных или незамещенных алкильных радикалов. Замещенные или незамещенные алкилацильные и замещенные или незамещенные арилацильные радикалы проиллюстрированы на фигуре 5B. На фигуре 5C проиллюстрированы примеры замещенных алкиламино-, замещенных ариламино-, замещенных или незамещенных арильных, замещенных или незамещенных алкилсульфонильных, замещенных или незамещенных арилсульфонильных, замещенных или незамещенных алкилфосфонильных, и замещенных или незамещенных арилфосфонильных радикалов. На фигуре 5D представлены примеры замещенных или незамещенных алкилоксикарбонильных, замещенных или незамещенных арилоксикарбонильных, замещенных или незамещенных алкиламинокарбонильных, и замещенных или незамещенных ариламинокарбонильных радикалов. На фигуре 5E представлены примеры замещенных или незамещенных алкилокситиокарбонильных, замещенных или незамещенных алкиламинотиокарбонильных, замещенных или незамещенных ариламинотиокарбонильных и замещенных или незамещенных алкилокситиокарбонильных радикалов. Представление таких заместителей в качестве примеров предназначено для иллюстрации разнообразия допустимых заместителей, и таким образом, его не следует интерпретировать как ограничение объема настоящего изобретения. Специалисту в данной области хорошо понятно, что олигонуклеотидная последовательность является более важным фактором для специфического для последовательности связывания олигонуклеотида с последовательностью-мишенью пре-мРНК, чем заместители на N-конце или C-конце.

Соединение формулы I тесно связывается с комплементарной ДНК, как проиллюстрировано на предшествующем уровне техники [PCT/KR2009/001256]. Дуплекс между производным ПНК формулы I и комплементарной ему полноразмерной ДНК или РНК имеет значение T_m, слишком высокое для надежного определения в водном буфере. Для соединения ПНК формулы I получены высокие значения T_m с использованием комплементарных ДНК меньшей длины.

Соединение формулы I тесно связывается с целевым 3'-участком сплайсинга пре-мРНК SCN9A человека, трнскрибированной с гена SCN9A человека, и мешает формированию «раннего комплекса сплайсингосомы», включающего экзон-мишень для соединения. Поскольку соединение по настоящему изобретению пространственно ингибирует формирование «раннего комплекса сплайсингосомы», «экзон 4» SCN9A подвергается сплайсингу с получением варианта(вариантов) сплайсинга мРНК SCN9A, лишенных «экзона 4». Следовательно, соединение по настоящему изобретению индуцирует пропуск «экзона 4» SCN9A мРНК.

Благодаря сильной аффинности указанного соединения для комплементарной последовательности пре-мРНК, соединение по настоящему изобретению может также тесно связываться с частично комплементарной последовательностью пре-мРНК с одним или двумя несовпадениями и индуцировать пропуск экзона-мишени в пре-мРНК SCN9A. Например, даже если 14-членное производное ПНК формулы I имеет одиночное несовпадение с пре-мРНК SCN9A, 14-членный ASO SCN9A все еще индуцирует пропуск «экзона 4» в мРНК SCN9A.

Соединение формулы I имеет хорошую способность к проникновению в клетки, и его можно легко доставлять в клетку в форме «голого» олигонуклеотида, как проиллюстрировано на предшествующем уровне техники [PCT/KR2009/001256]. Таким образом, соединение по настоящему изобретению индуцирует пропуск «экзона 4» в пре-мРНК SCN9A с получением варианта(вариантов) сплайсинга мРНК SCN9A, лишенных «экзона 4» SCN9A, в клетках, обработанных с использованием соединения формулы I в форме «голого» олигонуклеотида. Соединение формулы I не требует никаких средств или составов для доставки в клетку для активной индукции пропуска экзона-мишени в клетках. Соединение формулы I легко индуцирует пропуск «экзона 4» SCN9A в клетках, обработанных с использованием соединения по настоящему изобретению в форме «голого» олигонуклеотида в субфемтомолярной концентрации.

Клетки, обработанные с использованием соединения формулы I в форме «голого олигонуклеотида», экспрессируют более низкий уровень полноразмерной мРНК SCN9A, и таким образом, имеют более слабую функциональную активность Na_v1.7, чем клетки без обработки соединением. Соединение формулы I ингибирует экспрессию Na_v1.7 в нейрональных клетках или тканях при системном введении в форме «голого олигонуклеотида». Таким образом, указанное соединение можно использовать для лечения боли или нарушений, вовлекающих избыточную экспрессию Na_v1.7.

Производное ПНК формулы I можно системно вводить в форме «голого олигонуклеотида» для индукции пропуска «экзона 4» SCN9A в тканях-мишенях, и таким образом, ингибирования экспрессии полноразмерной мРНК SCN9A. Соединение формулы I не требует конкретного состава для увеличения системной доставки к тканям-мишеням для намеченной терапевтической или биологической активности. Обычно соединение формулы I растворяют в PBS или солевом растворе и системно вводят, чтобы вызывать желательную терапевтическую активность в тканях-мишенях. Соединение по настоящему изобретению не обязательно включать в концентрированный или инвазивный состав для проявления системной терапевтической активности.

Соединение формулы I можно использовать в форме комбинации с фармацевтически приемлемыми кислотой или основанием, включая, но без ограничения, гидроксид натрия, гидроксид калия, соляную кислоту, метансульфоновую кислоту, лимонную кислоту, трифторуксусную кислоту и т.д.

Производное ПНК формулы I или его фармацевтически приемлемую соль можно вводить субъекту в комбинации с фармацевтически приемлемым адъювантом, включая, но без ограничения, лимонную кислоту, соляную кислоту, виннокаменную кислоту, стеариновую кислоту, полиэтиленгликоль, полипропиленгликоль, этанол, изопропанол, бикарбонат натрия, дистиллированную воду, консервант(ы) и т.д.

Соединение по настоящему изобретению можно системно вводить субъекту в терапевтической дозе от 1 фмоль/кг до более, чем 1 нмоль/кг, которая может меняться в зависимости от расписания дозирования, условий или ситуаций для субъекта, и т.д.

Предпочтительным является производное ПНК формулы I или его фармацевтически приемлемая соль,

где

n представляет собой целое число между 10 и 25;

соединение формулы I имеет по меньшей мере 10-членное комплементарное перекрывание с 14-членной последовательностью пре-мРНК [(5'→3') UGUUUAGGUACACU] в пре-мРНК SCN9A человека;

соединение формулы I является полностью комплементарным пре-мРНК SCN9A человека, или частично комплементарным пре-мРНК SCN9A человека с одним или двумя несовпадениями;

S₁, S₂, …, S_n–1, S_n, T₁, T₂, …, T_n–1 и T_n независимо представляют собой дейтеридо-, гидридо-, замещенный или незамещенный алкильный, или замещенный или незамещенный арильный радикал;

X и Y независимо представляют собой гидридо-, формильный, аминокарбонильный, аминотиокарбонильный, замещенный или незамещенный алкильный, замещенный или незамещенный арильный, замещенный или незамещенный алкилацильный, замещенный или незамещенный арилацильный, замещенный или незамещенный алкилоксикарбонильный, замещенный или незамещенный арилоксикарбонильный, замещенный или незамещенный алкиламинокарбонильный, замещенный или незамещенный ариламинокарбонильный, замещенный или незамещенный алкиламинотиокарбонильный, замещенный или незамещенный ариламинотиокарбонильный, замещенный или незамещенный алкилокситиокарбонильный, замещенный или незамещенный арилокситиокарбонильный, замещенный или незамещенный алкилсульфонильный, замещенный или незамещенный арилсульфонильный, замещенный или незамещенный алкилфосфонильный радикал, или замещенный или незамещенный арилфосфонильный радикал;

Z представляет собой гидридо-, гидрокси, замещенный или незамещенный алкилокси, замещенный или незамещенный арилокси, замещенный или незамещенный амино, замещенный или незамещенный алкильный, или замещенный или незамещенный арильный радикал;

B₁, B₂, …, B_n–1 и B_n независимо выбраны из природных нуклеиновых оснований, включающих аденин, тимин, гуанин, цитозин и урацил, и неприродных нуклеиновых оснований; и

по меньшей мере четыре из B₁, B₂, …, B_n–1 и B_n независимо выбраны из неприродных нуклеиновых оснований, представленных формулой II, формулой III или формулой IV:

,

где

R₁, R₂, R₃, R₄, R₅ и R₆ независимо выбраны из гидридо- и замещенного или незамещенного алкильного радикала;

L₁, L₂ и L₃ представляют собой ковалентный линкер, представленный формулой V, ковалентно связывающий основную аминогруппу с группой нуклеинового основания:

,

где

Q₁ и Q_m представляют собой замещенный или незамещенный метиленовый (-CH₂-) радикал, и Q_m напрямую связан с основной аминогруппой;

Q₂, Q₃, … и Q_m–1 независимо выбраны из замещенного или незамещенного метилена, кислорода (-O-), серы (-S-) и замещенного или незамещенного амино-радикала [-N(H)- или -N(заместитель)-]; и

m представляет собой целое число между 1 и 15.

В конкретных таких вариантах осуществления, S₁, S₂, …, S_n–1, S_n, T₁, T₂, …, T_n–1, и T_n независимо представляют собой дейтеридо- или гидридо-радикал, и Z представляет собой гидридо-, гидрокси, замещенный или незамещенный алкилокси, замещенный или незамещенный арилокси, или замещенный или незамещенный амино-радикал. В других таких вариантах осуществления, по меньшей мере один из S₁, S₂, …, S_n–1, S_n, T₁, T₂, …, T_n–1, и T_n независимо представляет собой замещенный или незамещенный алкильный, или замещенный или незамещенный арильный радикал, и/или Z представляет собой замещенный или незамещенный алкильный, или замещенный или незамещенный арильный радикал.

В некоторых вариантах осуществления, m в формуле V представляет собой целое число, выбранное из 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 и 14.

Представляет интерес олигомер ПНК формулы I или его фармацевтически приемлемая соль,

где

n представляет собой целое число между 11 и 21;

соединение формулы I имеет по меньшей мере 10-членное комплементарное перекрывание с 14-членной последовательностью пре-мРНК [(5'→3') UGUUUAGGUACACU] в пре-мРНК SCN9A человека;

соединение формулы I является полностью комплементарным пре-мРНК SCN9A человека или частично комплементарным пре-мРНК SCN9A человека с одним или двумя несовпадениями;

S₁, S₂, …, S_n–1, S_n, T₁, T₂, …, T_n–1 и T_n представляют собой гидридо-радикал;

X и Y независимо представляют собой гидридо-, замещенный или незамещенный алкильный, замещенный или незамещенный арильный, замещенный или незамещенный алкилацильный, замещенный или незамещенный арилацильный, замещенный или незамещенный алкилоксикарбонильный, замещенный или незамещенный арилоксикарбонильный, замещенный или незамещенный алкиламинокарбонильный, замещенный или незамещенный ариламинокарбонильный, замещенный или незамещенный алкилсульфонильный, или замещенный или незамещенный арилсульфонильный радикал;

Z представляет собой замещенный или незамещенный амино-радикал;

B₁, B₂, …, B_n–1 и B_n независимо выбраны из природных нуклеиновых оснований, включающих аденин, тимин, гуанин, цитозин и урацил, и неприродных нуклеиновых оснований;

по меньшей мере четыре из B₁, B₂, …, B_n–1 и B_n независимо выбраны из неприродных нуклеиновых оснований, представленных формулой II, формулой III или формулой IV;

R₁, R₂, R₃, R₄, R₅ и R₆ независимо выбраны из гидридо- и замещенного или незамещенного алкильного радикала;

Q₁ и Q_m представляют собой замещенный или незамещенный метиленовый радикал, и Q_m напрямую связан с основной аминогруппой;

Q₂, Q₃, … и Q_m–1 независимо выбраны из замещенного или незамещенного метилена, кислорода и амино-радикала; и,

m представляет собой целое число между 1 и 11.

В одном варианте осуществления олигомера ПНК формулы I или его фармацевтически приемлемой соли, X и Y независимо представляют собой гидридо-, замещенный или незамещенный алкильный, замещенный или незамещенный арильный, замещенный или незамещенный алкилацильный, замещенный или незамещенный арилацильный, замещенный или незамещенный алкилоксикарбонильный, или замещенный или незамещенный арилоксикарбонильный радикал.

В другом варианте осуществления олигомера ПНК формулы I или его фармацевтически приемлемой соли, по меньшей мере один из X и Y независимо представляет собой замещенный или незамещенный алкиламинокарбонильный, замещенный или незамещенный ариламинокарбонильный, замещенный или незамещенный алкилсульфонильный, или замещенный или незамещенный арилсульфонильный радикал.

Представляет особенный интерес производное ПНК формулы I или его фармацевтически приемлемая соль,

где

n представляет собой целое число между 11 и 19;

соединение формулы I имеет по меньшей мере 10-членное комплементарное перекрывание с 14-членной последовательностью пре-мРНК [(5'→3') UGUUUAGGUACACU] в пре-мРНК SCN9A человека;

соединение формулы I является полностью комплементарным пре-мРНК SCN9A человека;

S₁, S₂, …, S_n–1, S_n, T₁, T₂, …, T_n–1 и T_n представляют собой гидридо-радикал;

X и Y независимо представляют собой гидридо-, замещенный или незамещенный алкильный, замещенный или незамещенный арильный, замещенный или незамещенный алкилацильный, замещенный или незамещенный арилацильный, замещенный или незамещенный алкилоксикарбонильный, замещенный или незамещенный алкиламинокарбонильный, замещенный или незамещенный алкилсульфонильный, или замещенный или незамещенный арилсульфонильный радикал;

Z представляет собой замещенный или незамещенный амино-радикал;

B₁, B₂, …, B_n–1 и B_n независимо выбраны из природных нуклеиновых оснований, включающих аденин, тимин, гуанин, цитозин и урацил, и неприродных нуклеиновых оснований;

по меньшей мере четыре из B₁, B₂, …, B_n–1 и B_n независимо выбраны из неприродных нуклеиновых оснований, представленных формулой II, формулой III или формулой IV;

R₁, R₂, R₃, R₄, R₅ и R₆ независимо выбраны из гидридо- и замещенного или незамещенного алкильного радикала;

Q₁ и Q_m представляют собой метиленовый радикал, и Q_m напрямую связан с основной аминогруппой;

Q₂, Q₃, … и Q_m–1 независимо выбраны из метиленового, кислородного и амино-радикала; и,

m представляет собой целое число между 1 и 9.

В одном варианте осуществления олигомера ПНК формулы I или его фармацевтически приемлемой соли, X и Y независимо представляют собой гидридо-, замещенный или незамещенный алкилацильный, или замещенный или незамещенный алкилоксикарбонильный радикал.

В другом варианте осуществления олигомера ПНК формулы I или его фармацевтически приемлемой соли, по меньшей мере один из X и Y независимо представляет собой замещенный или незамещенный алкильный, замещенный или незамещенный арильный, замещенный или незамещенный арилацильный, замещенный или незамещенный алкиламинокарбонильный, замещенный или незамещенный алкилсульфонильный, или замещенный или незамещенный арилсульфонильный радикал.

Представляет большой интерес олигомер ПНК формулы I или его фармацевтически приемлемая соль,

где

n представляет собой целое число между 11 и 19;

соединение формулы I имеет по меньшей мере 10-членное комплементарное перекрывание с 14-членной последовательностью пре-мРНК [(5'→3') UGUUUAGGUACACU] в пре-мРНК SCN9A человека;

соединение формулы I является полностью комплементарным пре-мРНК SCN9A человека;

S₁, S₂, …, S_n–1, S_n, T₁, T₂, …, T_n–1 и T_n представляют собой гидридо-радикал;

X и Y независимо представляют собой гидридо-, замещенный или незамещенный алкильный, замещенный или незамещенный арильный, замещенный или незамещенный алкилацильный, замещенный или незамещенный арилацильный, или замещенный или незамещенный алкилоксикарбонильный радикал;

Z представляет собой замещенный или незамещенный амино-радикал;

B₁, B₂, …, B_n–1 и B_n независимо выбраны из природных нуклеиновых оснований, включающих аденин, тимин, гуанин, цитозин и урацил, и неприродных нуклеиновых оснований;

по меньшей мере четыре из B₁, B₂, …, B_n–1, и B_n независимо выбраны из неприродных нуклеиновых оснований, представленных формулой II, формулой III или формулой IV;

R₁, R₃ и R₅ представляют собой гидридо-радикал, и R₂, R₄ и R₆ независимо представляют собой гидридо-, или замещенный или незамещенный алкильный радикал;

Q₁ и Q_m представляют собой метиленовый радикал, и Q_m напрямую связан с основной аминогруппой;

Q₂, Q₃ … и Q_m–1 независимо выбраны из метиленового, кислородного радикала; и,

m представляет собой целое число между 1 и 8.

В одном варианте осуществления олигомера ПНК формулы I или его фармацевтически приемлемой соли, X и Y независимо представляют собой гидридо-, замещенный или незамещенный алкилацильный, или замещенный или незамещенный алкилоксикарбонильный радикал.

В другом варианте осуществления олигомера ПНК формулы I или его фармацевтически приемлемой соли, по меньшей мере один из X и Y независимо представляет собой замещенный или незамещенный алкил, замещенный или незамещенный арил, или замещенный или незамещенный арилацил.

Больший интерес представляет производное ПНК формулы I или его фармацевтически приемлемая соль,

где

n представляет собой целое число между 11 и 19;

соединение формулы I имеет по меньшей мере 10-членное комплементарное перекрывание с 14-членной последовательностью пре-мРНК [(5'→3') UGUUUAGGUACACU] в пре-мРНК SCN9A человека;

соединение формулы I является полностью комплементарным пре-мРНК SCN9A человека;

S₁, S₂, …, S_n–1, S_n, T₁, T₂, …, T_n–1 и T_n представляют собой гидридо-радикал;

X и Y независимо представляют собой гидридо-, замещенный или незамещенный алкилацильный, замещенный или незамещенный арилацильный, или замещенный или незамещенный алкилоксикарбонильный радикал;

Z представляет собой замещенный или незамещенный амино-радикал;

B₁, B₂, …, B_n–1 и B_n независимо выбраны из аденина, тимина, гуанина, цитозина и неприродных нуклеиновых оснований;

по меньшей мере пять из B₁, B₂, …, B_n–1 и B_n независимо выбраны из неприродных нуклеиновых оснований, представленных формулой II, формулой III или формулой IV;

R₁, R₂, R₃, R_4, R₅ и R₆ представляют собой гидридо-радикал;

Q₁ и Q_m представляют собой метиленовый радикал, и Q_m напрямую связан с основной аминогруппой;

Q₂, Q₃, … и Q_m–1 независимо выбраны из метиленового и кислородного радикала; и

m представляет собой целое число между 1 и 8.

В одном варианте осуществления олигомера ПНК формулы I или его фармацевтически приемлемой соли, X и Y независимо представляют собой гидридо-, замещенный или незамещенный алкилацильный, или замещенный или незамещенный алкилоксикарбонильный радикал.

В одном варианте осуществления олигомера ПНК формулы I или его фармацевтически приемлемой соли, по меньшей мере один из X и Y независимо представляет собой замещенный или незамещенный арилацильный радикал.

Наибольший интерес представляет производное ПНК формулы I или его фармацевтически приемлемая соль,

где

n представляет собой целое число между 11 и 19;

соединение формулы I имеет по меньшей мере 10-членное комплементарное перекрывание с 14-членной последовательностью пре-мРНК [(5'→3') UGUUUAGGUACACU] в пре-мРНК SCN9A человека;

соединение формулы I является полностью комплементарным пре-мРНК SCN9A человека;

S₁, S₂, …, S_n–1, S_n, T₁, T₂, …, T_n–1 и T_n представляют собой гидридо-радикал;

X представляет собой гидридо-радикал;

Y представляет собой замещенный или незамещенный алкилацильный, замещенный или незамещенный арилацильный или замещенный или незамещенный алкилоксикарбонильный радикал;

Z представляет собой замещенный или незамещенный амино-радикал;

B₁, B₂, …, B_n–1 и B_n независимо выбраны из аденина, тимина, гуанина, цитозина и неприродных нуклеиновых оснований;

по меньшей мере пять из B₁, B₂, …, B_n–1 и B_n независимо выбраны из неприродных нуклеиновых оснований, представленных формулой II, формулой III или формулой IV;

R₁, R₂, R₃, R₄, R₅ и R₆ представляют собой гидридо-радикал;

L₁ представляет собой -(CH₂)₂-O-(CH₂)₂-, -CH₂-O-(CH₂)₂-, -CH₂-O-(CH₂)₃-, -CH₂-O-(CH₂)₄- или -CH₂-O-(CH₂)₅-, с правым концом, напрямую связанным с основной аминогруппой; и,

L₂ и L₃ независимо выбраны из -(CH₂)₂-, -(CH₂)₃-, -(CH₂)₄-, -(CH₂)₅-, –(CH₂)₆-, -(CH₂)₇-, -(CH₂)₈-, -(CH₂)₂-O-(CH₂)₂-, -(CH₂)₃-O-(CH₂)₂- и -(CH₂)₂-O-(CH₂)₃-, с правым концом, напрямую связанным с основной аминогруппой.

В одном варианте осуществления олигомера ПНК формулы I или его фармацевтически приемлемой соли, Y представляет собой замещенный или незамещенный алкилацильный, или замещенный или незамещенный алкилоксикарбонильный радикал.

В другом варианте осуществления олигомера ПНК формулы I или его фармацевтически приемлемой соли, Y представляет собой замещенный или незамещенный арилацил.

Особенный интерес представляет производное ПНК формулы I, выбранное из группы соединений, представленных ниже, или его фармацевтически приемлемая соль:

(N→C) Fethoc-TA(5)A-A(5)AG(6)-TG(6)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)-NH₂;

(N→C) Fethoc-TA(5)A-A(4)AG(6)-TG(6)T-A(5)CC(1O3)-TA(5)A-A-NH₂;

(N→C) Fmoc-TA(5)A-A(4)AG(6)-TG(6)T-A(5)CC(1O3)-TA(5)A-A-NH₂;

(N→C) Piv-Leu-TA(5)A-A(5)AG(3O2)-TG(6)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)-NH₂;

(N→C) Fethoc-TA(5)T-A(5)AG(6)-TG(6)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)-NH₂;

(N→C) Бензоил-Gly-TA(2O2)A-A(5)AG(6)-TG(6)T-A(5)CT-TA(5)A-Lys-NH₂;

(N→C) Fethoc-AA(5)G-TG(6)T-A(5)CC(1O2)-TAA(5)-A-NH₂;

(N→C) Fethoc-AA(5)G-CG(6)T-A(5)CC(1O2)-TAA(5)-A-NH₂;

(N→C) Fmoc-AA(5)G-TG(6)T-A(5)CC(1O2)-TAA(5)-A-NH₂;

(N→C) Бензолсульфонил-AA(5)G-TG(6)T-A(5)CC(1O2)-TAA(5)-A-NH₂;

(N→C) Ac-AA(5)G-TG(6)T-A(5)CC(1O2)-TAA(5)-A-NH₂;

(N→C) Fethoc-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(3)A-A(5)-NH₂;

(N→C) Fmoc-AA(5)G-TG(6)T-AC(1O2)C-TAA(5)-A-NH₂;

(N→C) Метил-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(3)A-A(5)-Gly-Arg-NH₂;

(N→C) Fethoc-A(5)AG-TG(6)T-A(5)CC(1O2)-TAA-A(5)-NH₂;

(N→C) Ac-Val-A(5)AG-TG(6)T-A(5)CC(1O2)-TAA-A(5)-NH₂;

(N→C) Fethoc-AAG(6)-TG(6)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A-NH₂;

(N→C) Fethoc-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)-NH_2;

(N→C) Fethoc-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)C-NH₂;

(N→C) Fethoc-AA(5)G-TG(5)T-A(5)AC(1O2)-TA(5)T-A(5)C-NH₂;

(N→C) H-AA(5)G-TG(2O2)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)C-NH₂;

(N→C) Fethoc-Lys-Leu-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(2O2)A-A(5)C-Lys-NH₂;

(N→C) [N-(2-фенилэтил)амино]карбонил-AA(3)G-TG(5)T-A(5)CC(1O5)-TA(5)A-A(5)C-NH₂;

(N→C) N, N–фенил-Me-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(4)C-NH₂;

(N→C) Fethoc-AA(5)G-TA(5)T-A(5)CC(1O2)-TG(5)A-A(5)C-NH₂;

(N→C) п-толуолсульфонил-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)C-NH₂;

(N→C) п-толуолсульфонил-AA(5)G-TG(2O3)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)C-Lys-NH₂;

(N→C) Fethoc-AA(5)G-TG(2O3)T-A(5)CC(1O3)-TA(7)A-A(5)C-NH₂;

(N→C) н-пропил-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O3)-TA(5)A-A(5)C-NH₂;

(N→C) Бензоил-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)C-NH₂;

(N→C) Бензил-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O3)-TA(5)A-A(5)C-NH₂;

(N→C) Бензоил-AA(5)G-TG(3)T-A(5)CC(2O2)-TA(5)A-A(5)C-NH₂;

(N→C) Fethoc-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)C-Leu-Lys-NH₂;

(N→C) Piv-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)C-NH₂;

(N→C) Fethoc-TA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)C-NH₂;

(N→C) Fethoc-AA(5)C-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)C-NH₂;

(N→C) Метилсульфонил-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)C-NH₂;

(N→C) н-гексил-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)C-NH₂;

(N→C) н-гексаноил-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)C-NH₂;

(N→C) н-гексаноил-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(8)A-A(5)C-NH₂;

(N→C) Fethoc-AA(3)G-TG(2O2)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)C-NH₂;

(N→C) Fethoc-AA(3)G-TG(2O2)T-A(5)CC(1O3)-TA(5)A-A(5)C-NH₂;

(N→C) Fethoc-AA(3)G-TG(2O2)T-A(5)CC(2O2)-TA(5)A-A(5)C-NH₂;

(N→C) FAM-HEX-HEX-AA(3)G-TG(2O2)T-A(5)CC(2O2)-TA(5)A-A(5)C-NH₂;

(N→C) Fethoc-A(5)GT-G(5)TA(5)-CC(1O2)T-A(5)AA(5)-C-NH₂;

(N→C) Fethoc-AG(5)T-G(7)TA-CC(1O2)T-AA(6)A-C-NH₂;

(N→C) Fethoc-AA(6)G-TG(5)T-A(6)CC(1O2)-TA(6)A-A(6)C-NH₂;

(N→C) Fethoc-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(3)CA-C(1O5)AA-NH₂;

(N→C) Fethoc-AA(5)G-TCT-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(3)CA-C(1O5)AA-NH₂;

(N→C) Fethoc-AA(5)G-TCT-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(3)CA(3)-CTA-NH₂;

(N→C) Fethoc-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(3)CA-CA(7)A-NH₂;

(N→C) Fethoc-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(3)CA(5)-C-NH₂;

(N→C) Fethoc-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(3)CA(5)-C-NH₂;

(N→C) п-толуолсульфонил-TG(2O3)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(3)CA-C-Lys-NH₂;

(N→C) Fethoc-TG(5)T-A(5)CC(2O2)-TA(5)A-A(3)CA-CA(5)A-NH₂;

(N→C) Piv-TG(5)T-A(5)CC(2O2)-TA(5)A-A(3)CA-CA(5)A-NH₂;

(N→C) Бензоил-TG(5)T-A(5)CC(2O2)-TA(5)A-A(3)CA-CA(5)A-NH₂;

(N→C) Пропионил-TG(5)T-A(5)CC(2O2)-TA(5)A-A(3)CA-CA(5)A-NH₂;

(N→C) Fethoc-TG(5)T-A(5)CC(2O2)-TA(5)A-A(3)CA-CA(5)A-Arg-Val-NH₂;

(N→C) Fethoc-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)G-NH₂;

(N→C) Fethoc-AG(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)G-NH₂;

(N→C) Fethoc-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)CA-NH₂;

(N→C) Fethoc-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)GG-NH₂; и,

(N→C) Fethoc-AA(5)G-TG(5)T-ACC(1O2)-TA(5)A-A(5)CA(5)-C-NH₂;

где

A, G, T и C представляют собой мономеры ПНК с природным нуклеиновым основанием аденином, гуанином, тимином и цитозином соответственно;

C(pOq), A(p), A(pOq), G(p) и G(pOq) представляют собой мономеры ПНК с неприродным нуклеиновым основанием, представленным формулой VI, формулой VII, формулой VIII, формулой IX и формулой X соответственно;

,

где

p и q представляют собой целые числа; и

сокращенные наименования для N- и C-концевых заместителей конкретно определены следующим образом: «Fmoc-» представляет собой сокращенное наименование для «[(9-флуоренил)метилокси]карбонил-»; «Fethoc-» для «[2-(9-флуоренил)этил-1-окси]карбонил»; «Ac-» для «ацетил-»; «н-гексаноил-» для «1-(н-гексаноил)-»; «Бензоил-» для «бензолкарбонил-»; «Piv-» для «пивалил-»; «н-пропил-» для «1-(н-пропил)-»; «н-гексил-» для «1-(н-гексил)-»; «H-» для «гидридо-»; «п-толуолсульфонил» для «(4-метилбензол)-1-сульфонил-»; «Метилсульфонил» для «метил-1-сульфонил-»; «-Lys-» для аминокислотного остатка «лизин»; «-Val-» для аминокислотного остатка «валин»; «-Leu-» для аминокислотного остатка «лейцин»; «-Arg-» для аминокислотного остатка «аргинин»; «-Gly-» для аминокислотного остатка «глицин»; «[N-(2-фенилэтил)амино]карбонил-» для «[N-1-(2-фенилэтил)амино]карбонил-»; «Бензил-» для «1-(фенил)метил-»; «Фенил-» для «фенил-»; «Me-» для «метил-»; «-HEX-» для «6-амино-1-гексаноил-», «FAM-» для «5, или 6-флуоресцеин-карбонил-» (изомерной смеси), и «-NH₂» для незамещенной «-амино»-группы.

На фигуре 6 совместно представлена химическая структура для мономеров ПНК, сокращенно обозначенных как A, G, T, C, C(pOq), A(p), A(pOq), G(p) и G(pOq). Как обсуждали на предшествующем уровне техники [PCT/KR2009/001256], C(pOq) рассматривают как модифицированный мономер ПНК, соответствующий «цитозину» из-за его предпочтительной гибридизации с «гуанином». A(p) и A(pOq) принимают как модифицированные мономеры ПНК, действующие как «аденин», по их прочной аффинности для «тимина». Подобным образом, G(p) и G(pOq) считают модифицированными мономерами ПНК, эквивалентными «гуанину», благодаря комплементарному спариванию их оснований с «цитозином».

На фигуре 7 однозначно представлена химическая структура для множества сокращенных наименований заместителей, используемых для внесения разнообразия на N-конце или C-конце производного ПНК формулы I.

Для иллюстрации сокращенных наименований для производных ПНК, химическая структура для 14-членного производного ПНК, обозначенного как «(N→C) Fethoc-TA(5)A-A(5)TA(5)-CGC(1O2)-AA(5)A-A(5)A-NH₂», представлена на фигуре 8. В качестве другой иллюстрации, химическая структура для 16-членного производного ПНК, обозначенного как «(N→C) Fethoc-AG(5)C-A(5)CT-TA(5)C-GC(1O2)A-A(5)AA(2O2)-A-Lys-NH₂», представлена на фигуре 9.

14-членная последовательность ПНК «(N→C) Fethoc-AA(3)G-TG(2O2)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)C-NH₂» является эквивалентной последовательности ДНК «(5'→3') AAG-TGT-ACC-TAA-AC», которая имеет 14-членное комплементарное перекрывание с 20-членной последовательностью пре-мРНК, как отмечено «жирным» и «подчеркнутым» шрифтом в [(5'→3') uuguguuuag│GUACACUUUU], перекрывающей стык интрона 3 и экзона 4 в пре-мРНК SCN9A человека.

18-членная последовательность ПНК (N→C) Fethoc-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(3)CA-C(1O5)AA-NH₂» является эквивалентной последовательности ДНК «(5'→3') AAG-TGT–ACC-TAA-ACA-CAA», которая имеет 18-членное комплементарное перекрывание с 20-членной последовательностью пре-мРНК SCN9A, как отмечено «жирным» и «подчеркнутым» шрифтом в [(5'→3') uuguguuuag│GUACACUUUU].

18-членная последовательность ПНК «(N→C) Fethoc-AA(5)G-TCT-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(3)CA(3)-CTA-NH₂» является эквивалентной последовательности ДНК «(5'→3') AAG-TCT-ACC-TAA-ACA-CTA», которая имеет 16-членное комплементарное перекрывание с 20-членной последовательностью пре-мРНК SCN9A, как отмечено «жирным» и «подчеркнутым» шрифтом в [(5'→3') u«u»guguuuag│GUA«C»ACUUUU]. Таким образом, 18-членная ПНК имеет два одиночных несовпадения с 3'-участком сплайсинга экзона 4 в пре-мРНК SCN9A человека. Два одиночных несовпадения обнаружены в интроне 3 и в экзоне 4, как отмечено знаком кавычек («»).

14-членная последовательность ПНК «(N→C) Fethoc-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)G-NH₂» является эквивалентной последовательности ДНК «(5'→3') AAG-TGT-ACC-TAA-AG», которая имеет 13-членное комплементарное перекрывание с 20-членной последовательностью пре-мРНК SCN9A, как отмечено «жирным» и «подчеркнутым» шрифтом в [(5'→3') uugu«g»uuuag│GUACACUUUU]. Таким образом, 14-членная ПНК имеет одиночное несовпадение с 3'-участком сплайсинга экзона 4 в пре-мРНК SCN9A человека. Одиночное несовпадение обнаружено в интроне 3, как отмечено знаком кавычек («»).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Общие способы получения олигомеров ПНК

Олигомеры ПНК синтезировали твердофазным пептидным синтезом (SPPS) на основе химических реакций Fmoc, в соответствии со способом, описанным на предшествующем уровне техники [US 6133444; WO 96/40685], с незначительными модификациями, при необходимости. Твердая подложка, используемая в этом исследовании, представляла собой H-Rink Amide-ChemMatrix, закупленную из PCAS BioMatrix Inc. (Quebec, Canada). Fmoc-мономеры ПНК с модифицированным нуклеиновым основанием синтезировали, как описано на предшествующем уровне техники [PCT/KR 2009/001256], или с незначительными модификациями. Такие Fmoc-мономеры ПНК с модифицированным нуклеиновым основанием и Fmoc-мономеры ПНК с природным нуклеиновым основанием использовали для синтеза производных ПНК по настоящему изобретению. Fmoc-мономеры ПНК с модифицированным нуклеиновым основанием представлены на фигуре 10. Для специалиста в данной области, однако, существует множество незначительных изменений, очевидно возможных для защитных групп таких мономеров ПНК. Таким образом Fmoc-мономеры ПНК на фигуре 10 следует принимать в качестве примеров, и таким образом, не следует принимать для ограничения объема настоящего изобретения. Олигомеры ПНК очищали посредством C₁₈–обращеннофазовой HPLC (вода/ацетонитрил или вода/метанол с 0,1% TFA) и характеризовали посредством масс-спектрометрии, включающей ESI/TOF/MS.

На фигуре 11 схематически проиллюстрирован типичный цикл удлинения мономера, принятый в SPPS из этого исследования, и детали синтеза представлены ниже. Для специалиста в данной области, однако, существует множество незначительных изменений, очевидно возможных для эффективного проведения таких реакций SPPS в автоматическом пептидном синтезаторе или в ручном пептидном синтезаторе. Каждая стадия реакции кратко представлена следующим образом.

[Активация смолы H-Rink-ChemMatrix] 0,01 ммоль (приблизительно 20 мг смолы) смолы ChemMatrix в 1,5 мл 20% пиперидине/DMF встряхивали в libra tube в течение 20 мин, и раствор для снятия защиты Fmoc отфильтровывали. Смолу промывали в течение 30 с каждый раз в сериях с использованием 1,5 мл метиленхлорида (MC), 1,5 мл диметилформамида (DMF), 1,5 мл MC, 1,5 мл DMF и 1,5 мл MC. Полученные свободные амины на твердой подложке подвергали связыванию либо с Fmoc-мономером ПНК, либо с Fmoc-защищенным производным аминокислоты.

[Снятие защиты Fmoc] Смолу встряхивали в 1,5 мл 20% пиперидина/DMF в течение 7 мин, и раствор для снятия защиты Fmoc отфильтровывали. Смолу промывали в течение 30 с каждый раз в сериях с использованием 1,5 мл MC, 1,5 мл DMF, 1,5 мл MC, 1,5 мл DMF и 1,5 мл MC. Полученные свободные амины на твердой подложке немедленно подвергали связыванию с Fmoc-мономером ПНК.

[Связывание с Fmoc-мономером ПНК] Свободные амины на твердой подложке подвергали связыванию с Fmoc-мономером ПНК следующим образом. 0,04 ммоль Fmoc-мономера ПНК, 0,05 ммоль HBTU [гексафторфосфата 2-(1H-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилурония] и 10 ммоль DIEA (N, N-диизопропилэтиламина) инкубировали в течение 2 мин в 1 мл безводного DMF, и добавляли к смоле со свободными аминами. Раствор смолы встряхивали в течение 1 часа, и реакционную среду отфильтровывали. Затем смолу промывали в течение 30 с каждый раз в сериях с использованием 1,5 мл MC, 1,5 мл DMF и 1,5 мл MC.

[Кэпирование] После реакции связывания, не вступившие в реакцию свободные амины кэпировали посредством встряхивания в течение 5 мин в 1,5 мл раствора для кэпирования (5% уксусного ангидрида и 6% 2,6-лутидина в DMF). Затем раствор для кэпирования отфильтровывали, и проводили промывку в течение 30 с каждый раз в сериях с использованием 1,5 мл MC, 1,5 мл DMF, и 1,5 мл MC.

[Введение «Fethoc-»радикала на N-конце] «Fethoc-»радикал вводили на N-конце посредством реакции свободных аминов на смоле с «Fethoc-OSu» в условиях обычного связывания оснований. Химическая структура «Fethoc-OSu» [CAS No. 179337-69-0, C₂₀H₁₇NO₅, MW 351,36] представлена следующим образом.

[Отщепление от смолы] Олигомеры ПНК, связанные со смолой, отщепляли от смолы посредством встряхивания в течение 3 часов в 1,5 мл раствора для отщепления (2,5% триизопропилсилана и 2,5% воды в трифторуксусной кислоте). Смолу отфильтровывали, и фильтрат концентрировали при пониженном давлении. Полученный осадок растирали в порошок с диэтилэфиром, и полученный преципитат собирали посредством фильтрации для очистки посредством обращеннофазовой HPLC.

[Анализ и очистка посредством HPLC] После отщепления от смолы, неочищенный продукт каждого производного ПНК очищали посредством C₁₈–обращеннофазовой HPLC с элюцией водой/ацетонитрилом или водой/метанолом (градиентный способ), содержащими 0,1% TFA. Фигуры 12A и 12B представляют собой иллюстративные хроматограммы HPLC для «ASO 2» до и после очистки посредством HPLC соответственно. Последовательность олигомера «ASO 2» является такой, как представлено в таблице 1.

Примеры синтеза для производного ПНК формулы I

Для комплементарного нацеливания на 3'-участок сплайсинга, перекрывающий стык интрона 3 и экзона 4 в пре-мРНК SCN9A человека, производные ПНК по настоящему изобретению получали в соответствии со способами синтеза, представленными выше, или с незначительными модификациями. Представление таких производных ПНК, нацеленных на пре-мРНК SCN9A человека, предназначено для иллюстрации производных ПНК формулы I, и его не следует интерпретировать для ограничения объема настоящего изобретения.

В таблице 1 представлены производные ПНК, комплементарно нацеленные на 3'-участок сплайсинга «экзона 4» в пре-мРНК SCN9A человека, вместе с данными структурной характеризации посредством масс-спектрометрии. Представление ASO SCN9A в таблице 1 предназначено для иллюстрации производных ПНК формулы I, и его не следует интерпретировать для ограничения объема настоящего изобретения.

Таблица 1. производные ПНК, комплементарно нацеленные на 3'-участок сплайсинга, перекрывающий стык интрона 3 и экзона 4 в пре-мРНК SCN9A человека, вместе с данными структурной характеризации посредством масс-спектрометрии.

Пример ПНК	Последовательность ПНК (N→C)	Точная масса, m/z
теор.a	набл.b
ASO 1	Fethoc-TA(5)A-A(5)AG(6)-TG(6)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)-NH2	5398,60	5398,58
ASO 2	Fethoc-AA(5)G-TG(6)T-A(5)CC(1O2)-TAA(5)-A-NH2	4282,97	4284,99
ASO 3	Fethoc-AA(5)G-TG(6)T-AC(1O2)C-TAA(5)-A-NH2	4182,87	4182,89
ASO 4	Fethoc-A(5)AG-TG(6)T-A(5)CC(1O2)-TAA-A(5)-NH2	4282,97	4283,00
ASO 5	Fethoc-AAG(6)-TG(6)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A-NH2	4281,98	4282,05
ASO 6	Fethoc-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)-NH2	4369,06	4369,08
ASO 7	Fethoc-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)C-NH2	4620,16	4620,14
ASO 8	Fethoc-A(5)GT-G(5)TA(5)-CC(1O2)T-A(5)AA(5)-C-NH2	4345,04	4345,08
ASO 9	Fethoc-AA(6)G-TG(5)T-A(6)CC(1O2)-TA(6)A-A(6)C-NH2	4676,22	4676,25
ASO 10	Fethoc-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)G-NH2	4660,16	4660,15
ASO 11	Fethoc-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)CA-NH2	4895,27	4895,20
ASO 12	Fethoc-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)GG-NH2	4951,27	4951,26
ASO 13	Fethoc-AA(5)G-TG(5)T-ACC(1O2)-TA(5)A-A(5)CA(5)-C-NH2	5146,37	5146,35
ASO 14	Бензоил-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)C-NH2	4488,10	4488,06
ASO 15	Piv-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)C-NH2	4468,13	4468,04
ASO 16	Fethoc-AA(5)G-TA(5)T-A(5)CC(1O2)-TG(5)A-A(5)C-NH2	4620,16	4620,14
ASO 17	п-толуолсульфонил-AA(5)G-TG(2O3)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)C-Lys-NH2	4682,17	4682,15
ASO 18	н-гексаноил-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(8)A-A(5)C-NH2	4524,19	4524,20
ASO 19	Fethoc-Lys-Leu-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(2O2)A-A(5)C-Lys-NH2	4991,41	4991,37
ASO 20	[N-(2-Фенилэтил)амино]карбонил-AA(3)G-TG(5)T-A(5)CC(1O5)-TA(5)A-A(5)C-NH2	4545,16	4545,15
ASO 21	H-AA(5)G-TG(2O2)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)C-NH2	4386,05	4386,03
ASO 22	н-пропил-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O3)-TA(5)A-A(5)C-NH2	4440,14	4440,06
ASO 23	N, N-Фенил-Me-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(4)C-NH2	4460,10	4460,09
ASO 24	Бензоил-AA(5)G-TG(3)T-A(5)CC(2O2)-TA(5)A-A(5)C-NH2	4474,08	4474,11
ASO 25	п-толуолсульфонил-TG(2O3)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(3)CA-C-Lys-NH2	4238,92	4238,95
ASO 26	Fethoc-AA(5)G-TG(5)T-A(5)AC(1O2)-TA(5)T-A(5)C-NH2	4635,16	4635,14

^a) теоретическая точная масса, ^b) наблюдаемая точная масса

Фигура 12A представляет собой хроматограмму HPLC, полученную с использованием неочищенного продукта «ASO 2». Неочищенный продукт очищали посредством C₁₈–обращеннофазовой (RP) препаративной HPLC. Фигура 12B представляет собой хроматограмму HPLC для очищенного продукта «ASO 2». Чистоту «ASO 2» заметно улучшали в результате препаративной очистки посредством HPLC. На фигуре 13 представлен масс-спектр ESI-TOF, полученный с использованием очищенного продукта «ASO 2». Предоставление данных анализа для «ASO 2» предназначено для иллюстрации того, как производные ПНК формулы I очищали и идентифицировали по настоящему изобретению, и его не следует интерпретировать для ограничения объема настоящего изобретения.

Аффинность связывания производных ПНК для комплементарной ДНК

Производные ПНК в таблице 1 оценивали по их аффинности связывания для 10-членных ДНК при комплементарном нацеливании либо на N-конец, либо на C-конец ПНК. Аффинность связывания оценивали по значению T_m для дуплекса между ПНК и 10-членной комплементарной ДНК. Для дуплекса между производными ПНК в таблице 1 и полностью комплементарными ДНК показаны значения T_m, слишком высокие для надежного определения в водном буферном растворе, поскольку буферный раствор имел тенденцию к закипанию в ходе измерения T_m.

Значения T_m определяли на спектрометре УФ/видимой областей спектра в следующим образом. Смешанный раствор 4 мкМ олигомера ПНК и 4 мкМ комплементарной 10-членной ДНК в 4 мл водного буфера (pH 7,16, 10 мМ фосфат натрия, 100 мМ NaCl) в 15 мл полипропиленовой пробирке falcon инкубировали при 90°C в течение минуты и медленно охлаждали до температуры окружающей среды. Затем раствор переносили в 3 мл кварцевую кювету для УФ, оборудованную воздухонепроницаемой крышкой, и подвергали измерению T_m на спектрофотометре УФ/видимой областей спектра при 260 нм, как описано на предшествующем уровне техники [PCT/KR2009/001256], или с незначительными модификациями. 10–членные комплементарные ДНК для измерения T_m закупали из Bioneer (www.bioneer.com, Dajeon, South Korea) и использовали без дополнительной очистки.

Наблюдаемые значения T_m для производных ПНК формулы I были очень высокими для комплементарного связывания с 10-членной ДНК, и представлены в таблице 2 как некорректированные. Например, для «ASO 7» показано значение T_m 77,0°C для дуплекса с 10-членной комплементарной ДНК [т.е. (5'→3') AGG-TAC-ACT-T], нацеленной на N-концевой 10-членник в ПНК, как отмечено «жирным» и «подчеркнутым» шрифтом в [(N→C) Fethoc-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)C-NH₂]. В то же время, для «ASO 7» показана T_m 69,0°C для дуплекса с 10-членной комплементарной ДНК [т.е. (5'→3') GTT-TAG-GTA-C], нацеленной на C-концевой 10-членник в ПНК, как отмечено «жирным» и «подчеркнутым» шрифтом в [(N→C) Fethoc-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)C-NH₂].

Таблица 2. Значения T_m между ПНК в таблице 1 и 10-членной комплементарной ДНК, нацеленной либо на N-конец, либо на C-конец ПНК.

ПНК	Значение Tm, °C
10-членная ДНК против N-конца	10-членная ДНК против C-конца
ASO 2	74,0	65,0
ASO 4	77,0	66,0
ASO 5	78,0	66,0
ASO 6	75,0	72,0
ASO 7	77,0	69,0
ASO 8	78,1	70,0
ASO 10	79,0	74,0

Примеры видов биологической активности производных ПНК формулы I

ПНК производные формулы I оценивали по биологической активности in vitro и in vivo. Биологические примеры, представленные ниже, предназначены для иллюстрации антисмысловой активности производных ПНК формулы I в клетках, так же как у животных, и таким образом, их не следует интерпретировать как ограничивающие объем настоящего изобретения соединениями, перечисленными в таблице 1.

Пример 1. Пропуск экзонов, индуцированный «ASO 7», в клетках PC3 (A).

«ASO 7», указанный в таблице 1, представляет собой 14-членный ASO, комплементарно связывающийся с 14-членной последовательностью в 3'-участке сплайсинга, перекрывающей стык интрона 3 и экзона 4 в пре-мРНК SCN9A человека. 14-членная последовательность-мишень в 3'-участке сплайсинга является такой, как отмечено «жирным» и «подчеркнутым» шрифтом в [(5'→3') uuguguuuag│GUACACUUUU]. «ASO 7» имеет 6-членное комплементарное перекрывание с интроном 3 и 8–членное комплементарное перекрывание с экзоном 4.

Поскольку известно, что клетки PC3 (кат. номер CRL1435, ATCC) обильно экспрессируют мРНК SCN9A человека [Br. J. Pharmacol. vol 156, 420-431 (2009)], «ASO 7» оценивали по его способности индуцировать пропуск экзона 4 в клетках PC3 следующим образом.

[Культивирование клеток и обработка ASO] клетки PC3, выращенные в 60 мм культуральной чашке, содержащей 5 мл среды F-12K, обрабатывали «ASO 7» при 0 (отрицательный контроль), 1, 10 или 100 зМ.

[Выделение РНК и синтез кДНК посредством одностадийной ПЦР] После инкубации с «ASO 7» в течение 5 часов, тотальную РНК выделяли с использованием универсального набора для выделения РНК «Universal RNA Extraction Kit» (кат. номер 9767, Takara), в соответствии с инструкциями производителя. 200 нг РНК-матрицы подвергали реакции обратной транскрипции в объеме 25 мкл с использованием набора для одностадийной ОТ-ПЦР Super Script^® с Taq-полимеразой Platinum^® (кат. номер 10928-042, Invitrogen), с использованием набора специфических для экзонов праймеров [экзон 2_прямой: (5'→3') CTTTCTCCTTTCAGTCCTCT; и экзон 9_обратный: (5'→3') CGTCTGTTGGTAAAGGTTTT], в соответствии со следующими условиями термоциклирования: 50°C в течение 30 мин и 94°C в течение 2 мин, за которыми следовали 15 циклов из 30 с при 94°C, 30 с при 55°C и 2 мин при 72°C.

[Гнездовая амплификация ПЦР] Затем 1 мкл кДНК подвергали гнездовой реакции ПЦР в объеме 20 мкл (кат. номер K2612, Bioneer) с использованием набора специфических для экзонов праймеров [экзон 2n_прямой: (5'→3') CCACCGGACTGGACCAAAAA; и экзон 9n_обратный: (5'→3') GCTAAGAAGGC-CCAGCTGAA], в соответствии со следующими условиями термоциклирования: 95°C в течение 2 мин, за которыми следовали 34 цикла из 30 с при 95°C, 30 с при 55°C и 1 мин при 72°C.

[Идентификация продуктов с пропуском экзонов] Продукты ПЦР подвергали электрофоретическому разделению в 2% агарозном геле. Полосы целевого размера собирали и анализировали посредством секвенирования по Сенджеру.

На фигуре 14A представлены данные электрофореза продуктов гнездовой ПЦР, при котором для клеток, обработанных с использованием «ASO 7», получали сильную полосу продукта ПЦР, которую можно было приписать пропуску экзонов 4-5. Однако, полоса продукта ПЦР для полноразмерной мРНК SCN9A имела тенденцию являться более сильной в образцах, обработанных с использованием 10 или 100 зМ ASO, чем в отрицательном контрольном образце. Странный паттерн зависимости ответа от дозы для данных гнездовой ПЦР мог быть обусловлен повышающей регуляцией транскрипции посредством «кольцевой РНК с экзон-интронной структурой (ЭИкРНК)», накапливаемой в ходе пропуска экзонов с использованием «ASO 7» [Nature Struc. Mol. Biol. vol 22(3), 256-264 (2015)]. Посредством секвенирования по Сенджеру подтвердили, что продукт ПЦР с пропуском экзонов имеет пропуск экзонов 4-5, как показано на фигуре 14B.

Пример 2. Пропуск экзонов, индуцированный «ASO 7», в клетках PC3 (B).

«ASO 7» оценивали по его способности индуцировать пропуск «экзона 4» в клетках PC3, как в «Примере 1», если не указано иное. В этом эксперименте, клетки PC3 обрабатывали «ASO 7» при 0 (отрицательный контроль), 1, 10, 100 и 1000 aM в течение 24 часов. Реакцию гнездовой ПЦР проводили с использованием набора праймеров [экзон 3/6_прямой: (5'→3') GGACCAAAAATGTCGAGCCT; и экзон 9_обратный: (5'→3') GCTAAGAAGGCCCAGCTGAA], разработанного для амплификации продукта, включающего последовательность стыка экзона 3 и экзона 6.

Последовательность праймера «экзон 3/6_прямой» узнает «стык экзона 3 и экзона 6» более избирательно, чем «стык экзона 3 и экзона 4», обнаруженный в полноразмерной мРНК SCN9A. Последовательность праймера разработана для детекции варианта сплайсинга SCN9A, лишенного экзонов 4-5, с большей чувствительностью, чем полноразмерной мРНК SCN9A. Такой праймер для пропуска экзонов можно использовать для детекции вариантов сплайсинга мРНК с плохой устойчивостью к метаболизму, поскольку полноразмерные мРНК имеют тенденцию к наличию хорошей устойчивости к метаболизму, приобретенной за миллиарды лет в ходе эволюции.

На фигуре 14C представлены данные электрофореза продуктов гнездовой ПЦР, при котором для клеток, обработанных с использованием «ASO 7», получали сильную полосу продукта ПЦР, которую можно было приписать пропуску экзонов 4-5. Посредством секвенирования по Сенджеру подтвердили, что продукт ПЦР с пропуском экзонов имеет пропуск экзонов 4-5.

Пример 3. qПЦР для мРНК SCN9A в клетках PC3, обработанных с использованием «ASO 7» (A)

«ASO 7» оценивали посредством гнездовой qПЦР для SCN9A по его способности индуцировать изменения уровня мРНК SCN9A человека в клетках PC3, как описано ниже.

[Обработка ASO] Клетки PC3 обрабатывали «ASO 7» при 0 (отрицательный контроль), 0,1, 1 или 10 aM (2 культуральные чашки на каждую концентрацию ASO).

[Выделение РНК и синтез кДНК посредством одностадийной ПЦР] После инкубации с «ASO 7» в течение 24 часов, тотальную РНК выделяли и подвергали одностадийной амплификации ПЦР, как описано в «Примере 1».

[Гнездовая амплификация ПЦР] Растворы кДНК разводили в 100 раз, и 1 мкл каждого разведенного продукта ПЦР подвергали реакции ПЦР с детекцией в реальном времени в объеме 20 мкл с использованием набора специфических для экзонов праймеров [экзон 3_прямой: (5'→3') TGACCATGAATAACCCAC; и экзон 4_обратный: (5'→3') GCAAGGATTTTTACAAGT], в соответствии со следующими условиями термоциклирования: 95°C в течение 30 с, за которыми следовали 40 циклов из 5 с при 95°C и 30 с при 60°C. Реакцию qПЦР отслеживали с использованием зонда TaqMan [(5'→3') 5,6-FAM-GGACCAAAA-Zen-ATGTCGAGTACAC-3IABkFQ], нацеленного на стык экзона 3 и экзона 4 в полноразмерной мРНК SCN9A.

На Фигуре 15A обобщены наблюдаемые данные qПЦР, в которых уровень полноразмерной мРНК SCN9A значимо уменьшен (t-критерий Стьюдента) в клетках, обработанных с использованием «ASO 7», приблизительно на 35 ~ 45%.

Пример 4. qПЦР для мРНК SCN9A в клетках PC3, обработанных с использованием «ASO 7» (B)

«ASO 7» оценивали посредством гнездовой qПЦР для SCN9A по его способности индуцировать изменения уровня мРНК SCN9A человека в клетках PC3, как в «Примере 3», если не указано иное. кДНК синтезировали с использованием случайных гексамеров и подвергали реакции qПЦР SCN9A с зондом TaqMan.

На Фигуре 15B представлены наблюдаемые данные qПЦР, в которых уровень полноразмерной мРНК SCN9A значимо уменьшен (t-критерий Стьюдента) в клетках, обработанных с использованием «ASO 7», приблизительно на 50~60%.

Пример 5. Индукция спинальной невропатии у крыс посредством лигирования спинномозгового нерва L5/L6.

Лигирование спинномозгового нерва (SNL) индуцирует невропатию в ганглиях задних корешков (DRG) и спинном мозге, и является общепринятым в качестве модели невропатических болей [Pain vol 50(3), 355-363 (1992)]. В зависимости от того, каким образом лигирован спинномозговой нервный узел(узлы), однако, существует несколько вариантов SNL. Степень и длительность невропатии в DRG, по-видимому, меняется в зависимости от того, каким образом лигирован спинномозговой нервный узел(узлы) [Pain vol 43(2), 205-218 (1990)]. В соответствии с собственным опытом авторов настоящего изобретения, двойное лигирование спинномозговых нервов L5 и L6 (т.е., «лигирование L5/L6») индуцирует невропатию, более тяжелую и дольше персистирующую, чем одиночное лигирование спинномозгового нерва (т.е. «лигирование L5»).

[Хирургическая операция SNL посредством лигирования L5/L6] Самцов крыс SD подвергали анестезии с использованием золетила/ромпуна. Затем спинномозговые нервные узлы L5 и L6 (с левой стороны) открывали и тесно связывали. Затем мышцу и кожу закрывали и зашивали в соответствии с надлежащими асептическими способами.

[Индукция невропатической боли] Через 6-7 суток после операции SNL, подушечку лапы со стороны лигирования стимулировали с оценкой в баллах фон Фрея с использованием электронного анестезиометра фон Фрея (модель номер 2390, IITC Inc. Life Science) как описано ниже. Оценку в баллах фон Фрея осуществляли в ежесуточном режиме до разделения по группам для фармакологических оценок.

[Электронная оценка в баллах фон Фрея] После стабилизации в течение менее 30 минут, каждое животное в пластиковой клетке индивидуально подготавливали для оценки в баллах фон Фрея, подушечку левой задней лапы каждого животного подвергали оценке в баллах фон Фрея 6 раз с интервалом в несколько минут между оценками в баллах. Балл из первой оценки в баллах отбрасывали, поскольку животные не являлись стабилизированными во время первой оценки в баллах. Из пяти оставшихся оценок в баллах, наибольший и наименьший баллы исключали. Затем среднее для оставшихся трех оценок принимали в качестве оценки в баллах фон Фрея для животного.

Пример 6. Обращение аллодинии посредством «ASO 7» у крыс со спинальной невропатией (1)

«ASO 7» представляет собой 14-членный ASO SCN9A, частично комплементарный пре-мРНК SCN9A крысы, считанной с геномной ДНК крысы [Эталонная последовательность в NCBI: NC_000002.12] с одиночным несовпадением на 3'-конце последовательности-мишени. 13-членная последовательность-мишень «ASO 7» в пре-мРНК SCN9A крысы указана «жирным» и «подчеркнутым» шрифтом, как отмечено в 20-членной последовательности пре-мРНК SCN9A [(5'→3') , в которой одиночное несовпадение, обнаруженное в интроне 3, отмечено знаком кавычек («»).

«ASO 7» оценивали по его способности обращать аллодинию у крыс со спинальной невропатией, индуцированной посредством «лигирования L5/L6», как описано ниже.

[Хирургическая операция SNL и разделение на группы] На сутки -10, самцов крыс SD (в возрасте 6 недель, Harlan Laboratories, Italy) подвергали «лигированию L5/L6». Животных стимулировали с оценкой в баллах фон Фрея от суток -4 в ежесуточном режиме. На сутки 0, 30 животных отбирали на основании индивидуальных оценок в баллах фон Фрея на сутки 0, и назначали в 4 группы из группы отрицательного контроля (т.е., без обработки ASO), и трех групп обработки 1, 3 и 6 пмоль/кг «ASO 7» (6 или 9 животных на группу).

[Обработка ASO и оценка в баллах фон Фрея] Крысам подкожно вводили «ASO 7» при 0 (отрицательный контроль), 1, 3 или 6 пмоль/кг, вечером на сутки 0, 2, 4, 6, 8 и 10. Аллодинию оценивали в баллах посредством способа электронной оценки в баллах фон Фрея, описанного в «Примере 5», утром. ASO вводили в форме «голого» олигонуклеотида, т.е., в форме растворенного в PBS.

[Обращение аллодинии] На фигуре 16A обобщены наблюдаемые исходы для оценок в баллах фон Фрея. Для животных в группе отрицательного контроля показаны средние оценки в баллах фон Фрея (порог отдергивания), стабилизированные между приблизительно 6 и 7 г в течение периода 12 суток после разделения на группы. «ASO 7» значимо обращал (t-критерий Стьюдента) аллодинию от суток 4 и позже. Даже несмотря на то, что терапевтическая активность являлась сравнимой во всех группах обработки, в группе 6 пмоль/кг начали показывать терапевтическую активность с суток 2 после первого дозирования.

Хотя не присутствовало сравнительного положительного контроля, включенного в эту конкретную оценку, показатели фон Фрея от 10 до 12 г часто наблюдали в соответствии с собственными оценками авторами настоящего изобретения у крыс (с «лигированием L5/L6»), которым перорально вводили прегабалин при 30 мг/кг. Таким образом эффективность «ASO 7» при 1-6 пмоль/кг может являться сравнимой с прегабалином при 30 мг/кг в этой конкретной модели невропатической боли.

Пример 7. Обращение аллодинии посредством «ASO 7» у крыс со спинальной невропатией.

«ASO 2», указанный в таблице 1, представляет собой 13-членный ASO, полностью комплементарный 3'-участку сплайсинга, перекрывающему стык интрона 3 и экзона 4 в пре-мРНК SCN9A человека, как отмечено «жирным» и «подчеркнутым» шрифтом в [(5'→3') . «ASO 2» имеет 5-членное перекрывание с интроном 3 и 8-членное перекрывание с экзоном 4. Последовательность-мишень «ASO 2» является консервативной в пре-мРНК SCN9A крысы.

«ASO 2» оценивали по его способности обращать аллодинию у крыс со спинальной невропатией, индуцированной посредством «лигирования L5/L6», как описано в «Примере 6», если не указано иное.

[Разделение на группы и обработка ASO] Самцов крыс SD (в возрасте 5 недель, Harlan Laboratories, Italy) подвергали операции SNL на сутки -16. На сутки 0, 30 крыс отбирали и назначали в 5 групп из группы отрицательного контроля (т.е., без обработки ASO), и четырех групп обработки 20 пмоль/кг QD (т.е., один раз в сутки), 100 пмоль/кг QD, 500 пмоль/кг QD и 100 пмоль/кг Q2D (т.е., один раз в каждые двое суток) «ASO 2» (6 животных на группу). Животным подкожно вводили «ASO 2» в течение суток 0-13 в соответствии с расписаниями дозирования QD и Q2D. ASO вводили в форме «голого» олигонуклеотида, т.е., в форме растворенного в PBS.

[Оценка в баллах аллодинии] Аллодинию оценивали в баллах в течение суток 0-14, в соответствии со способом фон Фрея, описанным в «Примере 5». На сутки 7, подушечку правой лапы (сторона без лигирования) подвергали оценке в баллах фон Фрея.

[Обращение аллодинии] На фигуре 16B обобщены наблюдаемые исходы для оценок в баллах фон Фрея. Для животных в группе отрицательного контроля показаны средние оценки в баллах порога фон Фрея, стабилизированные между приблизительно 6 и 8 г в течение периода 14 суток после разделения на группы.

В случае подушечки лапы со стороны с лигированием, аллодиния являлась значимо обращенной (t-критерий Стьюдента) на сутки 1 и позже у животных, которым вводили ASO при 20 пмоль/кг QD, 100 пмоль/кг Q2D и 500 пмоль/кг QD, за исключением группы 100 пмоль/кг QD. На сутки 14, однако, аллодиния также являлась значимо обращенной при 100 пмоль/кг QD.

В случае подушечки лапы со стороны без лигирования, фоновые оценки в баллах фон Фрея из групп обработки ASO на сутки 7 были более высокими, чем оценка в баллах для группы отрицательного контроля. Наблюдаемые оценки в баллах фон Фрея составляли 15,3 г (отрицательный контроль), 17,6 г (20 пмоль/кг QD), 19,2 г (100 пмоль/кг QD), 20,1 г (100 пмоль/кг Q2D) и 19,5 г (500 пмоль/кг QD). Однако, не присутствовало значимых различий между группами обработки ASO и группы отрицательного контроля.

Пример 8. Ингибирование натриевого тока посредством «ASO 7» в клетках DRG L5 крысы, активированных с использованием лигирования спинномозгового нерва L5/L6.

Клеточный натриевый ток обычно измеряют посредством точечной фиксации. По мере поглощения ионов натрия клетками, внутриклеточный уровень ионов натрия увеличивается. Внутриклеточный уровень натрия можно оценивать с использованием чувствительного для иона натрия красителя. «CoroNa зеленый» представляет собой краситель со специфическим для иона натрия хелатирующий агентом типа краун-эфира. После образования хелата с ионом натрия, «CoroNa зеленый» испускает зеленую флуоресценцию. «CoroNa зеленый» использовали для непрямого измерения клеточного уровня натрия. Обнаружено, что уровень натрия, измеренный посредством «CoroNa зеленого», хорошо коррелирует с током ионов натрия, измеренным посредством точечной фиксации иона натрия [Proc. Natl. Acad. Sci. USA vol 106(38), 16145-16150 (2009)].

«ASO 7» оценивали по его способности осуществлять понижающую регуляцию тока ионов натрия в клетках DRG крысы с использованием «CoroNa зеленого», следующим образом.

[Выделение DRG] На сутки 0, самцов крыс SD (в возрасте 6 недель, Harlan Laboratories, Italy) подвергали «лигированию L5/L6», как описано в «Примере 5». Крыс время от времени подвергали оценке в баллах фон Фрея в течение периода 4 недель. На сутки 31, крысу, для которой показан низкая оценка в баллах фон Фрея, умерщвляли для выделения левого (сторона с лигированием) и правого (сторона без лигирования) DRG L5. DRG погружали в 0,5 мл PBS немедленно после выделения.

[Получение нейрональных клеток DRG L5] Клетки DRG получали в соответствии со способами, описанными в литературе, [Methods Mol Biol. vol 846, 179-187 (2012); PLoS One vol 8(4); e60558 (2013)], которые кратко описаны в несколько приемов следующим образом: DRG переносили в 1,5 мл e-пробирку, содержащую 0,2 мл 0,125% коллагеназы (коллагеназа типа IV, кат. номер C5138-100MG, Sigma) в HBSS (сбалансированный солевой раствор Хенкса, кат. номер 14025-092, Life Technologies), разрезанный с помощью ножниц на настолько мелкие фрагменты, насколько возможно, и инкубировали в течение 20 мин в CO₂–инкубаторе при 37°C под 5% CO₂ и 95% RH; 50 мкл 0,25% трипсина/ЭДТА добавляли в e-пробирку, которую держали в инкубаторе в течение следующих 10 мин; в e-пробирку загружали 1 мл полной среды DMEM, и подвергали осаждению центрифугированием при 600 g в течение 5 мин; полученный осадок суспендировали в 4 мл среды Neurobasal-A (среда Neurobasal^®, кат. номер 21103-049, Gibco), дополненной 2X B-27 (бессывороточная добавка B–27^®, кат. номер 17504-044, Gibco), 1X пенициллином-стрептомицином, 1X L-глутамином, и 1 мл суспензии клеток осторожно высевали на покрытое ламинином покровное стекло (кат. номер GG-25-1.5-laminin, Neuvitro), помещенное в 35 мм культуральную чашку; через одни сутки после посева, в чашку осторожно загружали следующий 1 мл свежей среды Neurobasal-A; через двое суток после посева, среду заменяли на 2 мл свежей среды Neurobasal-A, дополненной 1 мкМ Ara-C (цитозин β-D-арабинофуранозид, кат. номер C1768-100MG, Sigma), для избирательной супрессии роста клеток, отличных от нейрональных клеток DRG; через четверо суток после посева, среду снова заменяли на 2 мл свежей среды Neurobasal-A, дополненной 1 мкМ Ara-C; и через пять или шесть суток после посева, нейрональные клетки DRG обрабатывали с использованием ASO.

[Обработка ASO и анализ CoroNa] Нейрональные клетки DRG L5 либо с «лигированием L5/L6», либо без «лигирования L5/L6», обрабатывали с использованием «ASO 7» при 0 (отрицательный контроль), 100 или 1000 зМ. Через 30 часов, клетки промывали с использованием 2 мл HBSS, и затем загружали 2 мл свежего HBSS. Затем клетки обрабатывали с использованием 5 мкМ «CoroNa зеленого» (кат. номер C36676, Life Technologies) при 37°C. Через 30 мин, клетки промывали 2 раза с использованием 2 мл HBSS, и загружали 2 мл свежего HBSS. Культуральную чашку устанавливали в флуоресцентный микроскоп Olympus (модель BX53, Olympus), оборудованный CCD-камерой для непрерывного получения изображений клеток с зеленой флуоресценцией. Клетки резко обрабатывали с использованием 10 мМ NaCl, и затем интенсивность флуоресценции клеток регистрировали в цифровой форме в течение периода 300 с. Присутствовало 4-5 клеток на кадр, т.е., на концентрацию ASO. Интенсивность флуоресценции каждой индивидуальной клетки отслеживали с разрешением до секунд. Кривые интенсивности внутриклеточной флуоресценции для индивидуальных клеток усредняли с использованием программы ImageJ (версии 1.50i, NIH), и усредненные кривые представлены на фигурах 13(A) и 13(B) для клеток с «лигированием L5/L6» и без «лигирования L5/L6» соответственно. Усредненную кривую интенсивности флуоресценции принимали за индивидуальную кривую внутриклеточной концентрации натрия для клеток, обработанных с использованием «ASO 7» при 0 (отрицательный контроль), 100 или 1000 зМ.

[Результаты анализа CoroNa] В нейрональных клетках DRG, стимулированных с использованием «лигирования L5/L6» [ср. фигуру 17A], обработка «ASO 7» при 100 зМ или 1 aM заметно ингибировала среднюю интенсивность флуоресценции клеток. Во временной точке 150 с, например, средняя интенсивность флуоресценции клеток (т.е., натриевый ток) уменьшалась на 80 ~ 85% в клетках, обработанных с использованием ASO.

В нейрональных клетках DRG без «лигирования L5/L6» [ср. фигуру 17B], обработка «ASO 7» при 1 aM индуцировала уменьшение средней интенсивности флуоресценции клеток. Однако наблюдаемое уменьшение составляло приблизительно 50% во временной точке 150 с и было не настолько заметным, как в клетках, стимулированных с использованием «лигирования L5/L6». Кроме того, обработка «ASO 7» при 100 зМ не могла ингибировать натриевый ток в нейрональных клетках без «стимуляции L5/L6».

Известно, что нейрональные клетки DRG невропатической стимуляции экспрессируют различные подтипы VGSC, включая Na_v1.7, Na_v1.8, Na_v1.2 и т.д. Для подтипа Na_v1.7 показан ограниченный вклад в суммарный натриевый ток в нейрональных клетках DRG без стимуляции [Nat Comm. vol 3, Article Number 791: DOI:10.1038/ncomms1795 (2012)]. Нейрональные клетки DRG крысы без «лигирования L5/L6» могут стимулировать такие нейрональные клетки DRG без невропатии. Наблюдаемое ингибирование натриевого тока в клетках DRG без «лигирования L5/L6» может отражать единственно вклад в натриевый ток подтипа Na_v1.7.

В то же время, известно, что нейрональные клетки осуществляют повышающую регуляцию экспрессии Na_v1.7 в ответ на персистирующую невропатию [J Biol Chem. vol 279(28), 29341-29350 (2004); J Neurosci. vol 28(26), 6652-6658 (2008)]. Нейрональные клетки DRG крысы с «лигированием L5/L6» могут стимулировать нейрональные клетки DRG с невропатией. «ASO 7» как при 100 зМ, так и при 1 aM, ингибировал натриевый ток на 80 ~ 85% в нейрональных клетках, стимулированных посредством «лигирования L5/L6». Более сильное ингибирование натриевого тока посредством «ASO 7» в клетках DRG с «лигированием L5/L6» согласуется с повышающей регуляцией Na_v1.7 в нейрональных клетках посредством хронической невропатии.

Принимая во внимание совместные обнаружения, наблюдаемые в нейрональных клетках DRG крысы в присутствии и в отсутствие «лигирования L5/L6», заключили, что «ASO 7» избирательно ингибирует экспрессию подтипа Na_v1.7. «ASO 7», по-видимому, ингибирует экспрессию Na_v1.7 более сильно в нейрональных клетках с невропатией, чем в этих клетках без невропатии.

Пример 9. Обращение аллодинии посредством «ASO 1» у крыс с DPNP.

«ASO 1», указанный в таблице 1, представляет собой 16-членный ASO, полностью комплементарный 3'-участку сплайсинга, перекрывающему стык интрона 3 и экзона 4 в пре-мРНК SCN9A человека, как отмечено «жирным» и «подчеркнутым» шрифтом в 25-членной последовательности пре-мРНК SCN9A [(5'→3') . «ASO 1» имеет 5-членное перекрывание с интроном 3 и 11-членное перекрывание с экзоном 4. «ASO 1» является полностью комплементарным пре-мРНК SCN9A крысы.

«ASO 1» оценивали по его способности обращать аллодинию, вызванную диабетической периферической невропатической болью (DPNP) у крыс.

[Индукция DPNP и разделение на группы] на сутки 0, стрептозотоцин, растворенный в цитратном буфере (pH 6), внутрибрюшинно вводили при 60 мг/кг самцам крыс SD массой приблизительно 200 г, чтобы индуцировать диабет типа I [J. Ethnopharmacol. vol 72(1-2), 69-76 (2000)]. На сутки 10, крыс с DPNP случайным образом назначали в 2 группы из групп отрицательного контроля (только носитель, PBS) и 100 пмоль/кг «ASO 1», и на основании оценок в баллах фон Фрея индивидуальных животных на сутки 10 с использованием микронитей фон Фрея, как описано ниже (N=8 на группу).

[Оценка в баллах фон Фрея способом вверх-вниз] Аллодинию оценивали в баллах с использованием набора микронитей фон Фрея (Touch Test^®) в соответствии со способом «вверх-вниз» [J Neurosci. Methods vol 53(1), 55-63 (1994)].

[Введение ASO и оценка в баллах аллодинии] «ASO 1» растворяли в PBS и подкожно вводили крысам на сутки 11, 13, 15, 17 и 19. Аллодинию оценивали в баллах через 2 часа после дозирования на сутки 11, 13, 15, 17 и 19, и кроме того, на сутки 21 и 23, для оценки длительности терапевтической активности после последней дозы.

[Обращение аллодинии] На фигуре 18A обобщены наблюдаемые исходы для оценок в баллах фон Фрея. Для животных в группе отрицательного контроля показаны средние пороги фон Фрея, стабилизированные между 6 и 7 г в течение периода от суток 10 до 23. У животных, которым вводили «ASO 1» при 100 пмоль/кг, аллодиния являлась значимо (t-критерий Стьюдента) обращенной на приблизительно 80% через 2 часа после первой дозы, т.е., на сутки 11. Терапевтическая активность слабо, но непрерывно увеличивалась до приблизительно 90% по мере повторного введения ASO до суток 19. С учетом полного прекращения терапевтической активности через 2 суток после последней дозы, т.е. на сутки 21, «ASO 1» может не обладать фармакодинамическим временем полужизни, достаточно длительным для поддержания расписания дозирования один раз в двое суток, т.е. Q2D.

Тем не менее, для «ASO 1» показано время начала обращения аллодинии через несколько часов, если судить по оценкам в баллах фон Фрея на сутки 11.

Пример 10. Обращение аллодинии посредством «ASO 2» и «ASO 6» у крыс с DPNP.

«ASO 6» представляет собой 13-членный ASO, комплементарно связывающийся с 13-членной последовательностью 3'-участка сплайсинга, перекрывающей стык интрона 3 и экзона 4 в пре-мРНК SCN9A человека, как отмечено «жирным» и «подчеркнутым» шрифтом в 25-членной последовательности пре-мРНК SCN9A of [(5'→3') . «ASO 6» имеет 5-членное перекрывание с интроном 3 и 8-членное перекрывание с экзоном 4. Несмотря на то, что «ASO 2» и «ASO 6» нацелены на одну и ту же последовательность в пре-мРНК SCN9A человека, считают, что «ASO 6» имеет более сильную аффинность для комплементарной РНК, чем «ASO 2».

«ASO 2» и «ASO 6» оценивали по их способности обращать аллодинию, вызванную DPNP у крыс, как описано в «Примере 9», если не указано иное.

Диабет индуцировали у самцов крыс SD (в возрасте 6 недель, Harlan Laboratories, Italy) посредством внутрибрюшинной инъекции стрептозотоцина при 60 мг/кг на сутки -10. На сутки 0, 18 животных, для которых показаны самые низкие оценки в баллах фон Фрея, отбирали и назначали в три группы из групп отрицательного контроля (только носитель, PBS), 60 пмоль/кг «ASO 2» и 30 пмоль/кг «ASO 6» (N=6 на группу). Крысам подкожно вводили носитель или ASO, растворенный в PBS, на сутки 0, 2 и 4. Аллодинию оценивали в баллах способом электронной оценки фон Фрея, как описано в «Примере 5».

[Обращение аллодинии] На фигуре 18B обобщены наблюдаемые оценки в баллах фон Фрея. Для животных в группе отрицательного контроля показаны средние пороги фон Фрея, стабилизированные при приблизительно 10-12 г в течение периода суток 0-9.

У животных, которым вводили 60 пмоль/кг «ASO 2», аллодиния подвергалась постепенному обращению до исходного уровня без диабетической невропатии (т.е. до уровня полного восстановления по собственным историческим данным для порога) на сутки 4 после первой дозы на сутки 0. Терапевтическая активность значимо (t-критерий Стьюдента) персистировала в течение следующих 3 суток после последней дозы на сутки 4.

У животных, которым вводили 30 пмоль/кг «ASO 6», терапевтическая активность значимо (t-критерий Стьюдента) достигала максимума на сутки 2, и персистировала в течение следующих 4 суток после последней дозы на сутки 4. Таким образом, «ASO 6» обращал аллодинию более сильно, чем «ASO 2». В отличие от «ASO 1» в «Примере 9», для «ASO 6» показана длительность терапевтической активности, достаточно долгая для поддержания расписания дозирования 2 раза в неделю у крыс.

[Прочее] По мере персистенции диабета, для животных в группе отрицательного контроля показывали признаки физического изнеможения в ходе оценок в баллах фон Фрея. Животные в группах обработки являлись оживленными и способными отвечать на тестирование фон Фрея, что согласуется с терапевтической активностью ASO.

Пример 11. Анальгетическая активность «ASO 7» в формалиновом тесте на крысах.

Боль, индуцированную посредством внутриподошвенной инъекции 20 мкл 2% формалина, заметно уменьшали у мышей с глобальным KO SCN9A. Степень ингибирования составляла 73% и 86% для фазы I (0-10 мин после инъекции формалина) и фазы II (15-45 мин после инъекции формалина) соответственно [PLoS One vol 9(9), e105895 (Sep 2014)].

«ASO 7» имеет одиночное несовпадение на 5'-конце пре-мРНК SCN9A крысы, и его оценивали по анальгетической активности в формалиновом тесте на крысах следующим образом.

[Разделение на группы и обработка ASO] На сутки -6, 24 самцов крыс SD (в возрасте 6 недель, Harlan Laboratories, Italy) случайным образом назначали в 4 группы из группы отрицательного контроля (без обработки ASO) и трех групп обработки «ASO 7» при 10, 30 и 100 пмоль/кг (N=6 на группу). В каждой группе животных подкожно вводили «ASO 7» при 0 (отрицательный контроль), 10, 30 или 100 пмоль/кг на сутки -6 и -2. «ASO 7» разводили в PBS для инъекции.

[Формалиновый тест] На сутки 0, острую боль индуцировали посредством внутриподошвенной инъекции 50 мкл 5% формалина в подушечку левой задней лапы. Немедленно после инъекции формалина, для каждой крысы получали индивидуальную видеозапись в течение одного часа после инъекции формалина. Видео воспроизводили для визуальной оценки в баллах ответов на боль для каждого подвергнутого причинению боли животного.

[Анальгетическая активность] На фигуре 19A обобщены наблюдаемые оценки в баллах боли по группам в различных временных точках после инъекции формалина. Ответы на боль в фазе II (AUC между 10 и 40 мин) были значимо уменьшены (*p < 0,05 по t-критерию Стьюдента) на 33%, 36% и 32% в группах обработки при 10, 30 и 100 пмоль/кг соответственно. В то же время, ответы на боль в фазе I (AUC между 0 и 10 мин) были уменьшены на 14%, 40% и 43% в отсутствие статистической значимости в группах обработки при 10, 30 и 100 пмоль/кг соответственно.

Пример 12. Анальгетическая активность «ASO 10» в формалиновом тесте на крысах.

«ASO 10», указанный в таблице 1, представляет собой 14-членный ASO SCN9A, частично комплементарный пре-мРНК SCN9A человека с одиночным несовпадением на 5'-конце последовательности пре-мРНК, как отмечено «жирным» и «подчеркнутым» шрифтом в 25-членной последовательности пре-мРНК SCN9A [(5'→3') , где одиночное несовпадение в интроне 3 отмечено знаком кавычек («»). В то же время, «ASO 10» является полностью комплементарным 3'-участку сплайсинга, перекрывающему стык интрона 3 и экзона 4 в пре-мРНК SCN9A крысы, как отмечено «жирным» и «подчеркнутым» шрифтом в 20-членной последовательности пре-мРНК SCN9A крысы [(5'→3') . «ASO 10» имеет 6-членное перекрывание с интроном 3 и 8-членное перекрывание с экзоном 4.

«ASO 10» оценивали по его анальгетической активности в формалиновом тесте на крысах, как описано в «Примере 11», если не указано иное.

[Разделение на группы и обработка ASO] 36 самцов крыс SD (в возрасте 7 недель, Harlan Laboratories, Italy) случайным образом назначали в четыре группы из групп отрицательного контроля (без обработки ASO) и трех групп обработки «ASO 10» при 15, 50 и 150 пмоль/кг (N=9 на группу). В каждой группе животных подкожно вводили «ASO 10» при 0 (отрицательный контроль), 15, 50 или 150 пмоль/кг на сутки -6 и -2. ASO вводили в форме растворенного в PBS.

[Анальгетическая активность] На фигуре 19B обобщены наблюдаемые оценки в баллах боли по группам в различных временных точках. Ответы на боль в фазе II (AUC между 10 и 40 мин) были значимо уменьшены (t-критерий Стьюдента) на 17% и 41% в группах обработки 15 и 50 пмоль/кг соответственно. В то же время, ответы на боль в фазе I (AUC между 0 и 10 мин) были значимо уменьшены на 38% и 50% в группах обработки 15 и 50 пмоль/кг соответственно.

Интересно, что для группы 150 пмоль/кг не удалось показать терапевтической активности как в фазе I, так и в фазе II. «ASO 10» при 150 пмоль/кг может являться избыточной дозой, индуцирующей повышающую регуляцию транскрипции посредством «кольцевой РНК с экзон-интронной структурой (ЭИкРНК)», накапливаемой в ходе пропуска экзонов с использованием «ASO 10» [Nature Struc. Mol. Biol. vol 22(3), 256-264 (2015)].

Пример 13. Ингибирование экспрессии Na_v1.7 в DRG L5 посредством «ASO 7» у крыс, которым причиняли боль посредством внутриподошвенной инъекции формалина.

«ASO 7» оценивали посредством IHC (иммуногистохимии) по его способности ингибировать экспрессию Na_v1.7 в DRG L5 самцов крыс SD, которым причиняли боль посредством внутриподошвенной инъекции формалина, следующим образом.

[Обработка ASO и инъекция формалина] На сутки -5, самцов крыс SD (в возрасте 6 недель, Harlan Laboratories, Italy) случайным образом назначали в 4 группы из групп отрицательного контроля (без обработки ASO) и трех групп обработки «ASO 7» при 1, 6 и 30 пмоль/кг. В каждой группе животных подкожно вводили «ASO 7» при 0 (отрицательный контроль), 1, 6 или 30 пмоль/кг на сутки -5 и -1. «ASO 7» разводили в PBS и использовали для инъекции. На сутки 0, всем животным вводили однократную внутриподошвенную инъекцию 50 мкл 5% формалина.

[Выделение DRG L5 и IHC Na_v1.7] На сутки 8, крыс подвергали анестезии с использованием золетила/ромпуна и подвергали отбору образцов DRG L5 со стороны инъекции формалина (N=2 на группу). Образцы DRG подвергали IHC Na_v1.7, как кратко описано ниже.

Для образцов DRG получали криосрезы и подвергали иммунному окрашиванию в сериях с использованием первичного антитела против Na_v1.7 (кат. номер ASC-008, Alomone) в разведении 1:500, с использованием вторичного антитела против IgG (кат. номер BA-1100, Vector) в разведении 1:200, и затем с использованием Dylight 594-стрептавидина (кат. номер SA-5594, Vector, CA, USA) в разведении 1:200 для мечения красной флуоресцентной меткой. Изображения IHC получали на сканере для предметных стекол Zeiss для экспрессии Na_v1.7 в DRG.

[Ингибирование экспрессии Na_v1.7 в DRG L5] На фигуре 20A представлен репрезентативный набор IHC изображений Na_v1.7 по группам. Экспрессия Na_v1.7 в DRG являлась заметно выше в группе отрицательного контроля, по сравнению с экспрессией в группах обработки ASO.

Уровень красного окрашивания на каждом индивидуальном IHC изображении подвергали цифровой оценке в баллах с использованием программы NIH ImageJ, и индивидуальные уровни подвергали статистическому анализу по группам (N=2 на группу). На фигуре 20B обобщен уровень экспрессии Na_v1.7 после цифровой количественной оценки по группам. Уровень экспрессии Na_v1.7 был значимо уменьшен (t-критерий Стьюдента) на приблизительно 50 ~ 60% во всех группах обработки ASO.

Пример 14. Обращение аллодинии у крыс со спинальной невропатией посредством «ASO 10» (1).

«ASO 10» оценивали по его способности обращать аллодинию у крыс со спинальной невропатией, индуцированной посредством «лигирования L5/L6», как описано в «Примере 6», если не указано иное.

[Разделение на группы] На сутки -14, самцов крыс SD (в возрасте 5 недель, Harlan Laboratories, Italy) подвергали «лигированию L5/L6». На сутки 0, 36 животных отбирали на основании их индивидуальных оценок в баллах фон Фрея на сутки 0, и назначали в 4 группы из группы отрицательного контроля (т.е., без обработки ASO), трех групп обработки ASO при 1, 3 и 10 пмоль/кг (N=9 на группу).

[Обработка ASO и оценка в баллах фон Фрея] Крысам подкожно вводили вечером «ASO 10» при 0 (отрицательный контроль), 3 и 10 пмоль/кг на сутки 0, 3 и 7. В группе обработки 1 пмоль/кг, доза первоначально составляла 1 пмоль/кг на сутки 0, и затем была увеличена до 30 пмоль/кг на сутки 3 и 7 из-за отсутствия терапевтической активности при 1 пмоль/кг на сутки 2 и 3.

[Обращение аллодинии] На фигуре 21A обобщены наблюдаемые оценки в баллах фон Фрея. Для животных в группе отрицательного контроля показаны средние оценки в баллах фон Фрея (порог отдергивания), стабилизированные между приблизительно 6 и 7 г в течение периода 9 суток после разделения на группы.

Аллодиния подвергалась постепенному и значимому обращению в течение периода одной недели посредством введений «ASO 10» при 3-30 пмоль/кг. Терапевтическая активность вышла на плато оценки в баллах фон Фрея приблизительно 13 г для всех групп обработки.

В группе 1 пмоль/кг, однако, терапевтическая активность начала увеличиваться после увеличения дозы от 1 пмоль/кг до 30 пмоль/кг на сутки 3. Аллодиния являлась значимо обращенной на приблизительно 40% на сутки 6 после увеличения дозы до 30 пмоль/кг, если собственные исторические данные для порога приблизительно 18 г принимали за оценку в баллах фон Фрея без лигирования «L5/L6». Анальгетическая эффективность увеличивалась до приблизительно 60% на сутки 8.

В группе 3 пмоль/кг, аллодиния являлась значимо обращенной (t-критерий Стьюдента) на сутки 6 с умеренной (приблизительно 40~50%) эффективностью. Терапевтическая эффективность увеличивалась до 65+% на сутки 8.

В группе 10 пмоль/кг, аллодиния являлась значимо обращенной на сутки 4 с эффективностью приблизительно 25~30%. Терапевтическая эффективность увеличивалась до приблизительно 60% на сутки 9. Однако эффективность оставалась неизменной с суток 6.

Пример 15. Обращение аллодинии у крыс со спинальной невропатией посредством «ASO 10» (2).

«ASO 10» оценивали по его способности обращать аллодинию у крыс со спинальной невропатией, индуцированной посредством «лигирования L5/L6», как описано в «Примере 6», если не указано иное.

[Разделение на группы] На сутки -10, самцов крыс SD (в возрасте 6 недель, Harlan Laboratories, Italy) подвергали «лигированию L5/L6». На сутки 0, 36 животных отбирали на основании их индивидуальных оценок в баллах фон Фрея на сутки 0, и случайным образом назначали в 4 группы из группы отрицательного контроля (т.е., без обработки ASO), двух групп обработки ASO 100 пмоль/кг один раз в каждые 4 или 5 суток, и группа положительного контроля прегабалина 30 мг/кг (N=9 на группу).

[Обработка ASO и оценка в баллах фон Фрея] Крысам подкожно вводили вечером «ASO 10» при 0 (отрицательный контроль), 100 пмоль/кг на сутки 0 и 4, 100 пмоль/кг на сутки 0 и 5. Аллодинию оценивали в баллах утром в ежесуточном режиме. Крысам из группы положительного контроля перорально вводили прегабалин, 30 мг/кг, за один час до оценки в баллах фон Фрея. ASO вводили в форме растворенного в PBS.

[Обращение аллодинии] На фигуре 21B обобщены наблюдаемые оценки в баллах фон Фрея. Для животных в группе отрицательного контроля показаны средние оценки в баллах фон Фрея (порог отдергивания), стабилизированные между приблизительно 6 и 7 г в течение периода 7 суток после первой обработки ASO. Для крыс в группе прегабалина, 30 мг/кг, показаны средние оценки в баллах фон Фрея приблизительно 10~11 г, хотя наблюдаемая оценка в баллах на сутки 7 составляла приблизительно 13 г из-за седативного эффекта.

В группе обработки ASO один раз в каждые 4 суток, аллодиния являлась значимо обращенной (t-критерий Стьюдента) во всех тестируемых случаях на сутки 3, 6 и 7, и это значимо превосходило прегабалин, 30 мг/кг, на сутки 3 и 6. Таким образом частота дозирования один раз в каждые 4 суток у крыс, по-видимому, является подходящей для поддержания терапевтической активности, превосходящей активность прегабалина, 30 мг/кг массы тела. Следует отметить, что аллодиния являлась обращенной на сутки 8 до приблизительно 90% от исходного уровня без спинальной невропатии, по сравнению с собственными историческими данными.

В группе обработки ASO один раз в каждые 5 суток, аллодиния являлась значимо обращенной (t-критерий Стьюдента) во всех тестируемых случаях на сутки 3, 6 и 7, и это значимо превосходило прегабалин, 30 мг/кг, только на сутки 3. Таким образом частота дозирования один раз в каждые 5 суток, по-видимому, является слишком длительной для сохранения терапевтической активности, значимо превосходящей активность прегабалина, 30 мг/кг.

[Экспрессия Na_v1.7 в спинном мозге] На сутки 7, животных подвергали анестезии с использованием золетила/ромпуна, подвергали перфузии с использованием PBS, дополненного формалином, для сохранения структурной целостности спинного мозга, и подвергали отбору образцов спинного мозга (N=3 на группу). Образцы спинного мозга обрабатывали в парафиновом блоке и подвергали IHC в сериях для экспрессии Na_v1.7 (красное окрашивание) с использованием антитела Na_v1.7 (кат. номер ASC-008, Alomone) и для тела нейрональной клетки (зеленое окрашивание) с использованием антитела Neu (кат. номер Ab104224, Abcam). Ядро окрашивали с использованием DAPI (синий).

На фигуре 22 представлены IHC изображения, полученные на сканере для предметных стекол Zeiss. Уровень экспрессии Na_v1.7 заметно уменьшался в образцах спинного мозга из группы обработки ASO с дозированием на сутки 0 и 4, по сравнению с уровнем экспрессии в образцах спинного мозга из группы отрицательного контроля. Таким образом, ASO, по-видимому, легко распространялся в спинном мозге и ингибировал экспрессию Na_v1.7 в спинном мозге при подкожном введении.

Пример 16. Ингибирование экспрессии Na_v1.7 в нейрональных клетках DRG крысы посредством «ASO 10».

«ASO 10» оценивали по его способности ингибировать экспрессию Na_v1.7 в нейрональных клетках DRG L5 крысы, как описано ниже.

[Получение нейрональных клеток DRG L5] Самцов крыс SD (в возрасте 7 недель, Harlan Laboratories, Italy) подвергали тесному «лигированию L5/L6», как описано в «Примере 5». Через 7 суток, 4 крыс подвергали анестезии с использованием золетила/ромпуна для выделения DRG L5 со стороны лигирования. DRG пулировали и перерабатывали для получения нейрональных клеток DRG, как описано в «Примере 8».

[Обработка ASO] Нейрональные клетки DRG обрабатывали с использованием «ASO 10» при 0 (отрицательный контроль), 10, 100 или 1000 зМ в течение 24 часов, и затем подвергали лизису для Вестерн-блоттинга с использованием антитела против Na_v1.7 (кат. номер ab85015, Abcam), являющегося зондом для C-конца белка Na_v1.7. β-актин анализировали с использованием зонда для контроля. Растворы «ASO 10» для хранения растворяли в DDW и аликвотировали в культуральной среде.

[Ингибирование экспрессии Na_v1.7] На фигуре 23A представлены данные Вестерн-блоттинга, полученные с использованием нейрональных клеток DRG, обработанных с использованием «ASO 10» при 0 (отрицательный контроль), 10, 100 или 1000 зМ. Для всех лизатов получили сильную полосу при 170~200K, которая может представлять собой метаболиты белка Na_v1.7. Полосу полноразмерного белка Na_v1.7 детектировали при 220~240K только с использованием лизатов для отрицательного контроля и 10 зМ «ASO 10». Таким образом, экспрессия Na_v1.7 являлась полностью ингибированной в нейрональных клетках DRG крысы после 24-часовой инкубации с «ASO 10» при 100-1000 зМ.

«ASO 10» представляет собой 14-членный ASO, полностью комплементарный пре-мРНК SCN9A крысы, в то время как «ASO 7» представляет собой 14-членный ASO, полностью комплементарный пре-мРНК SCN9A человека. Профили ингибирования SCN9A, полученные с использованием «ASO 10» в нейрональных клетках крысы, можно прогностически экстраполировать на профили ингибирования SCN9A для «ASO 7» в нейрональных клетках.

Пример 17. qПЦР для мРНК SCN9A в нейрональных клетках DRG крысы, обработанных с использованием «ASO 10», с синтезом кДНК посредством одностадийной ПЦР.

«ASO 10» оценивали посредством гнездовой qПЦР SCN9A по его способности индуцировать изменения уровня мРНК SCN9A крысы в клетках DRG крысы, как описано ниже.

[Получение нейрональных клеток DRG L5] Самцов крыс SD (в возрасте 6 недель, Harlan Laboratories, Italy) подвергали анестезии с использованием золетила/ромпуна для выделения DRG L5. Образцы DRG L5 перерабатывали, как описано в «Примере 8», для получения нейрональных клеток DRG L5.

[Обработка ASO] Нейрональные клетки DRG L5 крысы обрабатывали с использованием «ASO 10» при 0 (отрицательный контроль), 10, 30, 100 или 300 зМ (1 культуральная чашка на каждую концентрацию ASO). Растворы «ASO 10» для хранения растворяли в DDW и аликвотировали в культуральной среде.

[Выделение РНК и синтез кДНК посредством одностадийной ПЦР] После инкубации с «ASO 10» в течение 24 часов, тотальную РНК выделяли из клеток с использованием универсального набора для выделения РНК «Universal RNA Extraction Kit» (кат. номер 9767, Takara) в соответствии с инструкциями производителя. 200 нг РНК-матрицы подвергали реакции обратной транскрипции в объеме 25 мкл с использованием набора для одностадийной ОТ-ПЦР (Invitrogen, USA) с использованием набора специфических для экзонов праймеров [экзон 2_прямой: (5'→3') CAATCTTCCG-TTTCAACGCC, и экзон 10_обратный: (5'→3') ACCACAGCCAGGATCAAGTT], в соответствии со следующими условиями термоциклирования: 50°C в течение 30 мин и 94°C в течение 2 мин, за которыми следовали 15 циклов из 30 с при 94°C, 30 с при 55°C и 2 мин при 72°C.

[Гнездовая амплификация кПЦР] Растворы кДНК (два повтора на концентрацию ASO) разводили в 100 раз, и 1 мкл каждого разведенного раствора кДНК подвергали реакции ПЦР с детекцией в реальном времени в объеме 20 мкл с использованием зонда TaqMan (кат. номер Rn01514993_mH, ThermoFisher), нацеленного на стык экзона 3 и экзона 4 в пре-мРНК SCN9A в соответствии со следующими условиями термоциклирования: 95°C в течение 30 с, за которыми следовали 40 циклов из 5 с при 95°C и 30 с при 60°C.

На фигуре с левой стороны на фигуре 23B обобщены наблюдаемые данные qПЦР, в которых уровень полноразмерной мРНК SCN9A был значимо уменьшен (t-критерий Стьюдента) в клетках, обработанных с использованием «ASO 10» , на приблизительно 50~60%.

Пример 18. qПЦР для мРНК SCN9A в нейрональных клетках DRG крысы, обработанных с использованием «ASO 10», с синтезом кДНК посредством случайных гексамеров.

«ASO 10» оценивали посредством qПЦР SCN9A по его способности ингибировать экспрессию мРНК SCN9A в нейрональных клетках DRG L5 крысы. Тотальную РНК получали, как описано в «Примере 17», и подвергали синтезу кДНК с использованием случайных гексамеров. Растворы кДНК (два повтора на концентрацию ASO) разводили в 100 раз, и 1 мкл каждого разведенного продукта ПЦР подвергали реакции ПЦР с детекцией в реальном времени в объеме 20 мкл с использованием зонда TaqMan, нацеленного на стык экзона 3 и экзона 4 SCN9A в соответствии со следующими условиями термоциклирования: 95°C в течение 30 с, за которыми следовали 40 циклов из 5 с при 95°C и 30 с при 60°C.

Растворы кДНК подвергали также амплификации qПЦР для мРНК GAPDH. Значения Ct для мРНК SCN9A нормализовали по значениям Ct для мРНК GAPDH.

На фигуре с правой стороны на фигуре 23B представлены данные qПЦР SCN9A, нормализованные по GAPDH. Уровень экспрессии полноразмерной мРНК SCN9A был значимо уменьшен (t-критерий Стьюдента) в клетках, обработанных с использованием «ASO 10», на приблизительно 45~75%.

Пример 19. Ингибирование натриевого тока в нейрональных клетках DRG L5 посредством «ASO 10» (1).

«ASO 10» оценивали по его способности ингибировать натриевый ток в нейрональных клетках DRG L5 крысы следующим образом.

[Получение нейрональных клеток DRG] Самцов крыс SD (в возрасте 5 недель, Daehan Biolink, South Korea, www.dbl.co.kr) подвергали тесному «лигированию L5/L6», как описано в «Примере 5». Через 10-14 суток после лигирования, крыс подвергали анестезии с использованием золетила/ромпуна для выделения DRG L5 со стороны лигирования. Нейрональные клетки DRG L5 получали, как описано ниже.

DRG L5, быстро выделенный из крысы, переносили в 1,5 мл e-пробирку, содержащую 0,2 мл 0,125% коллагеназы (коллагеназа типа IV, кат. номер C5138-100MG, Sigma) в HBSS (сбалансированный солевой раствор Хенкса, кат. номер 14025-092, Life Technologies), разрезанный с помощью ножниц на настолько мелкие фрагменты, насколько возможно, и затем инкубировали в течение 20 мин в CO₂–инкубаторе при 37°C под 5% CO₂ и 95% RH; затем 50 мкл 0,25% трипсина/ЭДТА добавляли в e-пробирку, которую держали в инкубаторе в течение следующих 10 мин; в e-пробирку загружали 1 мл полной среды DMEM и подвергали осаждению центрифугированием при 600 g в течение 5 мин; затем полученный осадок суспендировали и транспортировали в форме герметично закрытого в 15 мл пробирке falcon, содержащей приблизительно 15 мл среды Neurobasal-A; после транспортировки в течение приблизительно одного часа, 0,5 мл суспензии клеток осторожно высевали на покрытое ламинином покровное стекло, помещенное в лунку 24-луночного культурального планшета; культуральный планшет инкубировали в CO₂–инкубаторе при 37°C в течение 2 часов для прикрепления клеток к покровному стеклу.

[Обработка ASO] Нейрональные клетки DRG L5, полученные, как выше, обрабатывали с использованием «ASO 10» при 0 (отрицательный контроль), 10, 30 или 100 зМ, и содержали в инкубаторе в течение 4 часов. Растворы ASO для хранения получали в DDW, дополненной 0,1% (об./об.) Tween80. Каждый раствор для хранения (включая только носитель для отрицательного контроля) аликвотировали в культуральной среде, так чтобы он содержал 0,0001%(об./об.) Tween80, для анализов точечной фиксации.

[Анализ точечной фиксации вручную] Затем нейрональные клетки DRG подвергали анализам точечной фиксации натриевого тока вручную на устройстве для точечной фиксации натрия (Axopatch 200B Amplifier, Axon Instruments). Анализы точечной фиксации обычно занимают 4 часа. Таким образом, клетки считали обработанными с использованием ASO в течение 4-8 часов (т.е., в среднем приблизительно 6 часов).

[Пулирование и анализ данных] Вышеописанный эксперимент повторяли для нескольких независимых случаев для увеличения статистической мощности на дозу ASO. Только данные натриевого для чувствительных к TTX клеток включали в пулирование для статистического анализа.

На фигуре 23C обобщены пулированные данные натриевого тока, нормализованные по размеру клеток, для нейрональных клеток DRG. Натриевый ток постепенно уменьшался по мере увеличения концентрации ASO от 10 зМ до 100 зМ. Натриевый ток был значимо уменьшен на приблизительно 40% в клетках, обработанных с использованием 100 зМ «ASO 10» в течение в среднем приблизительно 6 часов. Принимая во внимание, что нейрональные клетки DRG экспрессируют не только Na_v1.7, но также другие подтипы потенциалзависимого натриевого канала, наблюдаемое уменьшение на приблизительно 40% натриевого тока при 100 зМ «ASO 10» не следует принимать как маркерное для нокдауна Na_v1.7 посредством «ASO 10».

Пример 20. Ингибирование натриевого тока в нейрональных клетках DRG L5 посредством «ASO 10» (2).

Собственные оценки крыс от ряда поставщиков показывают, что уровень экспрессии Na_v1.7 в DRG L5 может сильно меняться в зависимости от возраста и поставщика. «ASO 10» оценивали по его способности ингибировать натриевый ток в нейрональных клетках DRG L5 крысы из различных источников, как описано в «Примере 19», если не указано иное.

[Получение нейрональных клеток DRG] Самцов крыс SD (в возрасте 5 недель, Harlan Laboratories/Envigo, Denmark) подвергали тесному «лигированию L5/L6», как описано в «Примере 5». Через 10-14 суток после лигирования, крыс подвергали анестезии с использованием золетила/ромпуна для выделения DRG L5 со стороны лигирования. Нейрональные клетки DRG получали, как описано ниже.

[Обработка ASO] Нейрональные клетки DRG L5, полученные, как выше, обрабатывали с использованием «ASO 10» при 0 (отрицательный контроль) или 100 зМ, и держали в инкубаторе в течение 4 часов. Растворы ASO для хранения получали в DDW.

Натриевый ток, нормализованный по размеру клеток, был значимо (p < 0,05) уменьшен приблизительно на 55% в клетках, обработанных с использованием 100 зМ «ASO 10» в течение в среднем приблизительно 6 часов (N=14 для отрицательного контроля; и N=15 для 100 зМ «ASO 10»). Нормализованный натриевый ток для отрицательного контроля был выше на 37% в этом примере, чем в «Примере 19». Таким образом, вклад Na_v1.7 в натриевый ток в нейрональных клетках DRG должен быть существенно выше у крыс из Harlan Laboratories из этого примера, чем у крыс из Daehan Biolink из «Примера 19».

Пример 21. Обращение аллодинии посредством «ASO 7» у крыс со спинальной невропатией (2).

«ASO 7» оценивали по его способности обращать аллодинию у крыс со спинальной невропатией, индуцированной посредством «лигирования L5/L6», как описано в «Примере 6», если не указано иное.

[Хирургическая операция SNL и разделение на группы] На сутки -10, самцов крыс SD (в возрасте 5 недель, Daehan Biolink, South Korea, www.dbl.co.kr) подвергали «лигированию L5/L6». На сутки 0, 48 животных were отбирали на основании самых низких индивидуальных оценок в баллах фон Фрея на сутки 0, и случайным образом назначали в 6 групп из группы отрицательного контроля (т.е., без обработки ASO), прегабалина 30 мг/кг, и четырех групп обработки 5, 25, 125 и 625 фмоль/кг «ASO 7» (8 животных на группу).

[Обработка ASO и оценка в баллах фон Фрея] Крысам подкожно вводили «ASO 7» при 0 (отрицательный контроль), 1, 3 или 6 пмоль/кг вечером на сутки 0, 3, 6 и 9. Аллодинию оценивали в баллах посредством способа электронной оценки в баллах фон Фрея, описанного в «Примере 5», утром. Прегабалин перорально вводили за один час до каждого события оценки в баллах фон Фрея. ASO вводили в форме растворенного в PBS, дополненного 0,1% Tween80.

[Обращение аллодинии] На фигуре 24A обобщены наблюдаемые исходы для оценок в баллах фон Фрея. Для животных в группе отрицательного контроля показаны средние оценки в баллах фон Фрея (порог отдергивания), стабилизированные при приблизительно 6 г в течение суток 4-8. В то же время, в группе прегабалина, 30 мг/кг (т.е., в группе положительного контроля), показаны средние оценки в баллах фон Фрея, стабилизированные при приблизительно 10 г. С учетом того, что средние оценки в баллах фон Фрея приблизительно 21 г наблюдали для наивных животных (т.е. без лигирования и обработки), аллодиния являлась значимо обращенной на сутки 2, 4, и 6, на 20-30% в группе обработки прегабалином.

«ASO 7» значимо обращал (t-критерий Стьюдента) аллодинию на сутки 2-8 при 5 фмоль/кг, на сутки 2, 4 и 6 при 25 и 125 фмоль/кг, и на сутки 4 и 6 при 625 фмоль/кг. Наиболее активной группой являлась группа 5 фмоль/кг, даже несмотря на то, что не присутствовало значимых различий между группами обработки ASO. Прегабалин также значимо обращал аллодинию на 20-30% в течение суток 2-8. Наиболее активной группой являлась группа 5 фмоль/кг, для которой показано приблизительно 40% обращение аллодинии, даже несмотря на то, что не присутствовало значимых различий между группами обработки ASO. Однако эффективности для групп обработки значимо не отличались от эффективности в группе прегабалина.

Пример 22. Анальгетическая активность «ASO 2» против субхронической воспалительной боли у крыс.

«ASO 2» оценивали по его способности ингибировать субхроническую воспалительную боль у крыс, которым причиняли боль посредством внутриподошвенной инъекции полного адъюванта Фрейнда (FCA), как описано ниже.

[Индукция субхронического воспаления] На сутки -17, самцам крыс SD (в возрасте 7 недель) вводили внутриподошвенную инъекцию 100 мкл FCA (кат. номер F5881-6X10 МЛ, Sigma) в подушечку левой задней лапы.

[Оценка в баллах воспалительной боли и разделение на группы] Воспалительную боль в подушечке левой задней лапы оценивали в баллах посредством теста Рэндалла-Селитто с использованием электронного устройства Рэндалла-Селитто [модель 2390, IITC Life sciences]. Крысам позволяли акклиматизироваться в гамаке в течение 10 мин перед оценкой в баллах боли (N=5 на группу).

На сутки 0, 10 животных, для которых стабильно показывали самый низкие оценки в баллах болевого порога в течение нескольких суток, отбирали для разделения на группы. 10 животных назначали в две группы из группы отрицательного контроля (без обработки ASO) и группы обработки («ASO 2» 100 пмоль/кг).

[Обработка ASO и оценка боли] В группе обработки животным вводили «ASO 2» при 100 пмоль/кг, вечером на сутки 0 и утром на сутки 1. ASO растворяли в PBS и вводили подкожно. Боль оценивали через 2 часа после дозирования на сутки 1, и утром на сутки 4.

[Анальгетическая активность] На фигуре 24B обобщены наблюдаемые оценки в баллах боли. Болевой порог в группе обработки ASO на сутки 1 увеличивался до приблизительно 27 г, по сравнению с значением на сутки 0, в то время как порог для группы отрицательного контроля уменьшался до приблизительно 3 г. Болевой порог до индукции отека подушечки лапы составлял приблизительно 23 г. Таким образом введение ASO полностью обращало воспалительную боль до уровня в отсутствие отека подушечки лапы. Однако, анальгетическая активность «ASO 2» полностью прекращалась на сутки 4

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> OLIPASS CORPORATION

<120> АНТИСМЫСЛОВОЕ ДЛЯ SCN9A ОБЕЗБОЛИВАЮЩЕЕ СРЕДСТВО

<130> OSH-00730 (32567-00730)

<140>

<141>

<150> PCT/IB2018/000160

<151> 2018-01-23

<150> 62/449,738

<151> 2017-01-24

<160> 23

<170> PatentIn версии 3.5

<210> 1

<211> 19

<212> РНК

<213> Homo sapiens

<400> 1

gauuauggcu acacgagcu 19

<210> 2

<211> 14

<212> РНК

<213> Homo sapiens

<400> 2

uguuuaggua cacu 14

<210> 3

<211> 30

<212> РНК

<213> Homo sapiens

<400> 3

gaaucuugug uuuagguaca cuuuuacugg 30

<210> 4

<211> 14

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 4

aagtgtacct aaac 14

<210> 5

<211> 20

<212> РНК

<213> Homo sapiens

<400> 5

uuguguuuag guacacuuuu 20

<210> 6

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 6

aagtgtacct aaacacaa 18

<210> 7

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 7

aagtctacct aaacacta 18

<210> 8

<211> 14

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 8

aagtgtacct aaag 14

<210> 9

<211> 10

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 9

aggtacactt 10

<210> 10

<211> 10

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 10

gtttaggtac 10

<210> 11

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

праймер

<400> 11

ctttctcctt tcagtcctct 20

<210> 12

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

праймер

<400> 12

cgtctgttgg taaaggtttt 20

<210> 13

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

праймер

<400> 13

ccaccggact ggaccaaaaa 20

<210> 14

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

праймер

<400> 14

gctaagaagg cccagctgaa 20

<210> 15

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

праймер

<400> 15

ggaccaaaaa tgtcgagcct 20

<210> 16

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

праймер

<400> 16

tgaccatgaa taacccac 18

<210> 17

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

праймер

<400> 17

gcaaggattt ttacaagt 18

<210> 18

<211> 13

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

зонд

<400> 18

atgtcgagta cac 13

<210> 19

<211> 20

<212> РНК

<213> Rattus sp.

<400> 19

uuuccuuuag guacacuuuu 20

<210> 20

<211> 25

<212> РНК

<213> Homo sapiens

<400> 20

uuguguuuag guacacuuuu acugg 25

<210> 21

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

праймер

<400> 21

caatcttccg tttcaacgcc 20

<210> 22

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

праймер

<400> 22

accacagcca ggatcaagtt 20

<210> 23

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 23

ggaccaaaaa tgtcgagcct gaaga 25

<---

1. Производное пептидной нуклеиновой кислоты, представленное формулой I, или его фармацевтически приемлемая соль для индуцирования пропуска экзона в пре–мРНК SCN9A человека:

,

где

n представляет собой целое число между 10 и 25;

соединение формулы I имеет по меньшей мере 10–членное комплементарное перекрывание с 14–членной последовательностью пре–мРНК [(5'→3') UGUUUAGGUACACU] в пре–мРНК SCN9A человека;

соединение формулы I является полностью комплементарным пре–мРНК SCN9A человека или частично комплементарным пре–мРНК SCN9A человека с одним или двумя несовпадениями;

S₁, S₂, …, S_n–1, S_n, T₁, T₂, …, T_n–1 и T_n представляют собой гидридо[H]-радикал;

X и Y независимо представляют собой гидридо–,замещенный или незамещенный алкильный, замещенный или незамещенный арильный, замещенный или незамещенный алкилацильный, замещенный или незамещенный арилацильный, замещенный или незамещенный алкилоксикарбонильный, замещенный или незамещенный алкиламинокарбонильный, замещенный или незамещенный арилсульфонильный радикал;

Z представляет собой замещенный или незамещенный аминорадикал;

где незамещенный алкильный радикал выбран из:

а замещенный алкильный радикал выбран из:

незамещенный или замещенный арильный радикал выбран из:

незамещенный алкилацильный радикал выбран из:

, n-гексаноил- и

замещенный алкилацильный радикал выбран из:

, Ac-Val-, Piv-Leu-, Fethoc-Lys-Leu-, -FAM-HEX-HEX- и бензоил-Gly-;

незамещенный или замещенный арилацильный радикал выбран из:

замещенный или незамещенный алкилоксикарбонильный радикал выбран из:

замещенный или незамещенный алкиламинокарбонильный радикал выбран из:

замещенный или незамещенный арилсульфонильный радикал выбран из:

;

замещенный аминорадикал выбран из:

-Lys-NH_2, -Leu-Lys-NH₂, -Gly-Arg-NH₂, -Arg-Val-NH₂ и ;

B₁, B₂, …, B_n–1 и B_n независимо выбраны из природных нуклеиновых оснований, включающих аденин, тимин, гуанин, цитозин и урацил, и неприродных нуклеиновых оснований; и,

по меньшей мере четыре из B₁, B₂, …, B_n–1 и B_n независимо выбраны из неприродных нуклеиновых оснований, представленных формулой II, формулой III или формулой IV:

,

где

R₁, R₂, R₃, R₄, R₅ и R₆ независимо выбраны из гидридо– и замещенного или незамещенного алкильного радикала;

L₁, L₂ и L₃ представляют собой ковалентный линкер, представленный формулой V, ковалентно связывающий основную аминогруппу с группой нуклеинового основания:

,

где

Q₁ и Q_m представляют собой замещенный или незамещенный метиленовый (–CH₂–) радикал и Q_m напрямую связан с основной аминогруппой;

Q₂, Q₃, … и Q_m–1 независимо выбраны из замещенного или незамещенного метилена, кислорода (–O–), серы (–S–) и замещенного или незамещенного аминорадикала [–N(H)– или –N(заместитель)–]; и

m представляет собой целое число между 1 и 15.

2. Производное пептидной нуклеиновой кислоты по п. 1 или его фармацевтически приемлемая соль,

где

n представляет собой целое число между 11 и 21;

соединение формулы I имеет по меньшей мере 10–членное комплементарное перекрывание с 14–членной последовательностью пре–мРНК [(5'→3') UGUUUAGGUACACU] в пре–мРНК SCN9A человека;

соединение формулы I является полностью комплементарным пре–мРНК SCN9A человека или частично комплементарным пре–мРНК SCN9A человека с одним или двумя несовпадениями;

S₁, S₂, …, S_n–1, S_n, T₁, T₂, …, T_n–1 и T_n представляют собой гидридорадикал;

X и Y независимо представляют собой гидридо–, замещенный или незамещенный алкильный, замещенный или незамещенный арильный, замещенный или незамещенный алкилацильный, замещенный или незамещенный арилацильный, замещенный или незамещенный алкилоксикарбонильный, замещенный или незамещенный алкиламинокарбонильный, или замещенный или незамещенный арилсульфонильный радикал;

Z представляет собой замещенный или незамещенный аминорадикал;

B₁, B₂, …, B_n–1 и B_n независимо выбраны из природных нуклеиновых оснований, включающих аденин, тимин, гуанин, цитозин и урацил, и неприродных нуклеиновых оснований;

по меньшей мере четыре из B₁, B₂, …, B_n–1 и B_n независимо выбраны из неприродных нуклеиновых оснований, представленных формулой II, формулой III или формулой IV;

R₁, R₂, R₃, R₄, R₅ и R₆ независимо выбраны из гидридо– и замещенного или незамещенного алкильного радикала;

Q₁ и Q_m представляют собой замещенный или незамещенный метиленовый радикал и Q_m напрямую связан с основной аминогруппой;

Q₂, Q₃, … и Q_m–1 независимо выбраны из замещенного или незамещенного метилена, кислорода и аминорадикала; и

m представляет собой целое число между 1 и 11.

3. Производное пептидной нуклеиновой кислоты по п. 1 или его фармацевтически приемлемая соль,

где

n представляет собой целое число между 11 и 19;

соединение формулы I имеет по меньшей мере 10–членное комплементарное перекрывание с 14–членной последовательностью пре–мРНК [(5' → 3') UGUUUAGGUACACU] в пре–мРНК SCN9A человека;

соединение формулы I является полностью комплементарным пре–мРНК SCN9A человека;

S₁, S₂, …, S_n–1, S_n, T₁, T₂, …, T_n–1 и T_n представляют собой гидридорадикал;

X и Y независимо представляют собой гидридо–, замещенный или незамещенный алкильный, замещенный или незамещенный арильный, замещенный или незамещенный алкилацильный, замещенный или незамещенный арилацильный, замещенный или незамещенный алкилоксикарбонильный, замещенный или незамещенный алкиламинокарбонильный, или замещенный или незамещенный арилсульфонильный радикал;

Z представляет собой замещенный или незамещенный аминорадикал;

B₁, B₂, …, B_n–1 и B_n независимо выбраны из природных нуклеиновых оснований, включающих аденин, тимин, гуанин, цитозин и урацил, и неприродных нуклеиновых оснований;

по меньшей мере четыре из B₁, B₂, …, B_n–1 и B_n независимо выбраны из неприродных нуклеиновых оснований, представленных формулой II, формулой III или формулой IV;

R₁, R₂, R₃, R₄, R₅ и R₆ независимо выбраны из гидридо– и замещенного или незамещенного алкильного радикала;

Q₁ и Q_m представляют собой метиленовый радикал и Q_m напрямую связан с основной аминогруппой;

Q₂, Q₃, … и Q_m–1 независимо выбраны из метиленового, кислородного и аминорадикала; и

m представляет собой целое число между 1 и 9.

4. Производное пептидной нуклеиновой кислоты по п. 1 или его фармацевтически приемлемая соль,

где

n представляет собой целое число между 11 и 19;

соединение формулы I имеет по меньшей мере 10–членное комплементарное перекрывание с 14–членной последовательностью пре–мРНК [(5'→3') UGUUUAGGUACACU] в пре–мРНК SCN9A человека;

соединение формулы I является полностью комплементарным пре–мРНК SCN9A человека;

S₁, S₂, …, S_n–1, S_n, T₁, T₂, …, T_n–1 и T_n представляют собой гидридорадикал;

X и Y независимо представляют собой гидридо–, замещенный или незамещенный алкильный, замещенный или незамещенный арильный, замещенный или незамещенный алкилацильный, замещенный или незамещенный арилацильный или замещенный или незамещенный алкилоксикарбонильный радикал;

Z представляет собой замещенный или незамещенный аминорадикал;

B₁, B₂, …, B_n–1 и B_n независимо выбраны из природных нуклеиновых оснований, включающих аденин, тимин, гуанин, цитозин и урацил, и неприродных нуклеиновых оснований;

по меньшей мере четыре из B₁, B₂, …, B_n–1 и B_n независимо выбраны из неприродных нуклеиновых оснований, представленных формулой II, формулой III или формулой IV;

R₁, R₃ и R₅ представляют собой гидридорадикал и R₂, R₄ и R₆ независимо представляют собой гидридо– или замещенный или незамещенный алкильный радикал;

Q₁ и Q_m представляют собой метиленовый радикал и Q_m напрямую связан с основной аминогруппой;

Q₂, Q₃, … и Q_m–1 независимо выбраны из метиленового, кислородного радикала; и

m представляет собой целое число между 1 и 8.

5. Производное пептидной нуклеиновой кислоты по п. 1 или его фармацевтически приемлемая соль,

где

n представляет собой целое число между 11 и 19;

соединение формулы I имеет по меньшей мере 10–членное комплементарное перекрывание с 14–членной последовательностью пре–мРНК [(5'→3') UGUUUAGGUACACU] в пре–мРНК SCN9A человека;

соединение формулы I является полностью комплементарным пре–мРНК SCN9A человека;

S₁, S₂, …, S_n–1, S_n, T₁, T₂, …, T_n–1 и T_n представляют собой гидридорадикал;

X и Y независимо представляют собой гидридо–, замещенный или незамещенный алкилацильный, замещенный или незамещенный арилацильный или замещенный или незамещенный алкилоксикарбонильный радикал;

Z представляет собой замещенный или незамещенный аминорадикал;

B₁, B₂, …, B_n–1, и B_n независимо выбраны из аденина, тимина, гуанина, цитозина и неприродных нуклеиновых оснований;

по меньшей мере пять из B₁, B₂, …, B_n–1 и B_n независимо выбраны из неприродных нуклеиновых оснований, представленных формулой II, формулой III или формулой IV;

R₁, R₂, R₃, R_4, R₅ и R₆ представляют собой гидридорадикал;

Q₁ и Q_m представляют собой метиленовый радикал и Q_m напрямую связан с основной аминогруппой;

Q₂, Q₃, … и Q_m–1 независимо выбраны из метиленового и кислородного радикала; и

m представляет собой целое число между 1 и 8.

6. Производное пептидной нуклеиновой кислоты по п. 1 или его фармацевтически приемлемая соль,

где

n представляет собой целое число между 11 и 19;

соединение формулы I имеет по меньшей мере 10–членное комплементарное перекрывание с 14–членной последовательностью пре–мРНК [(5'→3') UGUUUAGGUACACU] в пре–мРНК SCN9A человека;

соединение формулы I является полностью комплементарным пре–мРНК SCN9A человека;

S₁, S₂, …, S_n–1, S_n, T₁, T₂, …, T_n–1 и T_n представляют собой гидридорадикал;

X представляет собой гидридорадикал;

Y представляет собой замещенный или незамещенный алкилацильный, замещенный или незамещенный арилацильный или замещенный или незамещенный алкилоксикарбонильный радикал;

Z представляет собой замещенный или незамещенный аминорадикал;

B₁, B₂, …, B_n–1 и B_n независимо выбраны из аденина, тимина, гуанина, цитозина и неприродных нуклеиновых оснований;

по меньшей мере пять из B₁, B₂, …, B_n–1 и B_n независимо выбраны из неприродных нуклеиновых оснований, представленных формулой II, формулой III или формулой IV;

R₁, R₂, R₃, R₄, R₅ и R₆ представляют собой гидридорадикал;

L₁ представляет собой –(CH₂)₂–O–(CH₂)₂–, –CH₂–O–(CH₂)₂–, –CH₂–O–(CH₂)₃–, –CH₂–O–(CH₂)₄– или –CH₂–O–(CH₂)₅– с правым концом, напрямую связанным с основной аминогруппой; и

L₂ и L₃ независимо выбраны из –(CH₂)₂–, –(CH₂)₃–, –(CH₂)₄–, –(CH₂)₅–, –(CH₂)₆–, –(CH₂)₇–, –(CH₂)₈–, –(CH₂)₂–O–(CH₂)₂–, –(CH₂)₃–O–(CH₂)₂– и –(CH₂)₂–O–(CH₂)₃–, с правым концом, напрямую связанным с основной аминогруппой.

7. Производное пептидной нуклеиновой кислоты по п. 1, выбранное из группы производных пептидной нуклеиновой кислоты, представленных ниже, или его фармацевтически приемлемая соль:

(N → C) Fethoc–TA(5)A–A(5)AG(6)–TG(6)T–A(5)CC(1O2)–TA(5)A–A(5)–NH₂;

(N → C) Fethoc–TA(5)A–A(4)AG(6)–TG(6)T–A(5)CC(1O3)–TA(5)A–A–NH₂;

(N → C) Fmoc–TA(5)A–A(4)AG(6)–TG(6)T–A(5)CC(1O3)–TA(5)A–A–NH₂;

(N → C) Piv–Leu–TA(5)A–A(5)AG(3O2)–TG(6)T–A(5)CC(1O2)–TA(5)A–A(5)–NH₂;

(N → C) Fethoc–TA(5)T–A(5)AG(6)–TG(6)T–A(5)CC(1O2)–TA(5)A–A(5)–NH₂;

(N → C) Бензоил–Gly–TA(2O2)A–A(5)AG(6)–TG(6)T–A(5)CT–TA(5)A–Lys–NH₂;

(N → C) Fethoc–AA(5)G–TG(6)T–A(5)CC(1O2)–TAA(5)–A–NH₂;

(N → C) Fethoc–AA(5)G–CG(6)T–A(5)CC(1O2)–TAA(5)–A–NH₂;

(N → C) Fmoc–AA(5)G–TG(6)T–A(5)CC(1O2)–TAA(5)–A–NH₂;

(N → C) Бензолсульфонил–AA(5)G–TG(6)T–A(5)CC(1O2)–TAA(5)–A–NH₂;

(N → C) Ac–AA(5)G–TG(6)T–A(5)CC(1O2)–TAA(5)–A–NH₂;

(N → C) Fethoc–AA(5)G–TG(5)T–A(5)CC(1O2)–TA(3)A–A(5)–NH₂;

(N → C) Fmoc–AA(5)G–TG(6)T–AC(1O2)C–TAA(5)–A–NH₂;

(N → C) Метил–AA(5)G–TG(5)T–A(5)CC(1O2)–TA(3)A–A(5)–Gly–Arg–NH₂;

(N → C) Fethoc–A(5)AG–TG(6)T–A(5)CC(1O2)–TAA–A(5)–NH₂;

(N → C) Ac–Val–A(5)AG–TG(6)T–A(5)CC(1O2)–TAA–A(5)–NH₂;

(N → C) Fethoc–AAG(6)–TG(6)T–A(5)CC(1O2)–TA(5)A–A–NH₂;

(N → C) Fethoc–AA(5)G–TG(5)T–A(5)CC(1O2)–TA(5)A–A(5)–NH_2;

(N → C) Fethoc–AA(5)G–TG(5)T–A(5)CC(1O2)–TA(5)A–A(5)C–NH₂;

(N → C) Fethoc–AA(5)G–TG(5)T–A(5)AC(1O2)–TA(5)T–A(5)C–NH₂;

(N → C) H–AA(5)G–TG(2O2)T–A(5)CC(1O2)–TA(5)A–A(5)C–NH₂;

(N → C) Fethoc–Lys–Leu–AA(5)G–TG(5)T–A(5)CC(1O2)–TA(2O2)A–A(5)C–Lys–NH₂;

(N → C) [N–(2–фенилэтил)амино]карбонил–AA(3)G–TG(5)T–A(5)CC(1O5)–TA(5)A–A(5)C–NH₂;

(N → C) N, N–фенил–Me–AA(5)G–TG(5)T–A(5)CC(1O2)–TA(5)A–A(4)C–NH₂;

(N → C) Fethoc–AA(5)G–TA(5)T–A(5)CC(1O2)–TG(5)A–A(5)C–NH₂;

(N → C) п–толуолсульфонил–AA(5)G–TG(5)T–A(5)CC(1O2)–TA(5)A–A(5)C–NH₂;

(N → C) п–толуолсульфонил–AA(5)G–TG(2O3)T–A(5)CC(1O2)–TA(5)A–A(5)C–Lys–NH₂;

(N → C) Fethoc–AA(5)G–TG(2O3)T–A(5)CC(1O3)–TA(7)A–A(5)C–NH₂;

(N → C) н–пропил–AA(5)G–TG(5)T–A(5)CC(1O3)–TA(5)A–A(5)C–NH₂;

(N → C) Бензоил–AA(5)G–TG(5)T–A(5)CC(1O2)–TA(5)A–A(5)C–NH₂;

(N → C) Бензил–AA(5)G–TG(5)T–A(5)CC(1O3)–TA(5)A–A(5)C–NH₂;

(N → C) Бензоил–AA(5)G–TG(3)T–A(5)CC(2O2)–TA(5)A–A(5)C–NH₂;

(N → C) Fethoc–AA(5)G–TG(5)T–A(5)CC(1O2)–TA(5)A–A(5)C–Leu–Lys–NH₂;

(N → C) Piv–AA(5)G–TG(5)T–A(5)CC(1O2)–TA(5)A–A(5)C–NH₂;

(N → C) Fethoc–TA(5)G–TG(5)T–A(5)CC(1O2)–TA(5)A–A(5)C–NH₂;

(N → C) Fethoc–AA(5)C–TG(5)T–A(5)CC(1O2)–TA(5)A–A(5)C–NH₂;

(N → C) Метилсульфонил–AA(5)G–TG(5)T–A(5)CC(1O2)–TA(5)A–A(5)C–NH₂;

(N → C) н–гексил–AA(5)G–TG(5)T–A(5)CC(1O2)–TA(5)A–A(5)C–NH₂;

(N → C) н–гексаноил–AA(5)G–TG(5)T–A(5)CC(1O2)–TA(5)A–A(5)C–NH₂;

(N → C) н–гексаноил–AA(5)G–TG(5)T–A(5)CC(1O2)–TA(8)A–A(5)C–NH₂;

(N → C) Fethoc–AA(3)G–TG(2O2)T–A(5)CC(1O2)–TA(5)A–A(5)C–NH₂;

(N → C) Fethoc–AA(3)G–TG(2O2)T–A(5)CC(1O3)–TA(5)A–A(5)C–NH₂;

(N → C) Fethoc–AA(3)G–TG(2O2)T–A(5)CC(2O2)–TA(5)A–A(5)C–NH₂;

(N → C) FAM–HEX–HEX–AA(3)G–TG(2O2)T–A(5)CC(2O2)–TA(5)A–A(5)C–NH₂;

(N → C) Fethoc–A(5)GT–G(5)TA(5)–CC(1O2)T–A(5)AA(5)–C–NH₂;

(N → C) Fethoc–AG(5)T–G(7)TA–CC(1O2)T–AA(6)A–C–NH₂;

(N → C) Fethoc–AA(6)G–TG(5)T–A(6)CC(1O2)–TA(6)A–A(6)C–NH₂;

(N → C) Fethoc–AA(5)G–TG(5)T–A(5)CC(1O2)–TA(5)A–A(3)CA–C(1O5)AA–NH₂;

(N → C) Fethoc–AA(5)G–TCT–A(5)CC(1O2)–TA(5)A–A(3)CA–C(1O5)AA–NH₂;

(N → C) Fethoc–AA(5)G–TCT–A(5)CC(1O2)–TA(5)A–A(3)CA(3)–CTA–NH₂;

(N → C) Fethoc–TG(5)T–A(5)CC(1O2)–TA(5)A–A(3)CA–CA(7)A–NH₂;

(N → C) Fethoc–AA(5)G–TG(5)T–A(5)CC(1O2)–TA(5)A–A(3)CA(5)–C–NH₂;

(N → C) Fethoc–TG(5)T–A(5)CC(1O2)–TA(5)A–A(3)CA(5)–C–NH₂;

(N → C) п–толуолсульфонил–TG(2O3)T–A(5)CC(1O2)–TA(5)A–A(3)CA–C–Lys–NH₂;

(N → C) Fethoc–TG(5)T–A(5)CC(2O2)–TA(5)A–A(3)CA–CA(5)A–NH₂;

(N → C) Piv–TG(5)T–A(5)CC(2O2)–TA(5)A–A(3)CA–CA(5)A–NH₂;

(N → C) Бензоил–TG(5)T–A(5)CC(2O2)–TA(5)A–A(3)CA–CA(5)A–NH₂;

(N → C) Пропионил–TG(5)T–A(5)CC(2O2)–TA(5)A–A(3)CA–CA(5)A–NH₂;

(N → C) Fethoc–TG(5)T–A(5)CC(2O2)–TA(5)A–A(3)CA–CA(5)A–Arg–Val–NH₂;

(N → C) Fethoc–AA(5)G–TG(5)T–A(5)CC(1O2)–TA(5)A–A(5)G–NH₂;

(N → C) Fethoc–AG(5)G–TG(5)T–A(5)CC(1O2)–TA(5)A–A(5)G–NH₂;

(N → C) Fethoc–AA(5)G–TG(5)T–A(5)CC(1O2)–TA(5)A–A(5)CA–NH₂;

(N → C) Fethoc–AA(5)G–TG(5)T–A(5)CC(1O2)–TA(5)A–A(5)GG–NH₂; и,

(N → C) Fethoc–AA(5)G–TG(5)T–ACC(1O2)–TA(5)A–A(5)CA(5)–C–NH₂,

где

A, G, T и C представляют собой мономеры ПНК с природным нуклеиновым основанием аденином, гуанином, тимином и цитозином соответственно;

C(pOq), A(p), A(pOq), G(p) и G(pOq) представляют собой мономеры ПНК с неприродным нуклеиновым основанием, представленным формулой VI, формулой VII, формулой VIII, формулой IX и формулой X соответственно;

где

p и q представляют собой целые числа; и

сокращенные наименования для N– и C–концевых заместителей конкретно определены следующим образом: «Fmoc–» представляет собой сокращенное наименование для «[(9–флуоренил)метилокси]карбонил–»; «Fethoc–» для «[2–(9–флуоренил)этил–1–окси]карбонил»; «Ac–» для «ацетил–»; «н–гексаноил–» для «1–(н–гексаноил)–»; «Бензоил–» для «бензолкарбонил–»; «Piv–» для «пивалил–»; «н–пропил–» для «1–(н–пропил)–»; «н–гексил–» для «1–(н–гексил)–»; «H–» для «гидридо–»; «п–толуолсульфонил» для «(4–метилбензол)–1–сульфонил–»; «Метилсульфонил» для «метил–1–сульфонил–»; «–Lys–» для аминокислотного остатка «лизин»; «–Val–» для аминокислотного остатка «валин»; «–Leu–» для аминокислотного остатка «лейцин»; «–Arg–» для аминокислотного остатка «аргинин»; «–Gly–» для аминокислотного остатка «глицин»; «[N–(2–фенилэтил)амино]карбонил–» для «[N–1–(2–фенилэтил)амино]карбонил–»; «Бензил–» для «1–(фенил)метил–»; «Фенил–» для «фенил–»; «Me–» для «метил–»; «–HEX–» для «6–амино–1–гексаноил–», «FAM–» для «5– или 6–флуоресцеин–карбонил–» (изомерной смеси), и «–NH₂» для незамещенной «–амино»группы.

8. Способ лечения хронической боли, включающий введение производного пептидной нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-7.

9. Способ лечения невропатической боли, включающий введение производного пептидной нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-7.

10. Способ лечения боли посредством понижающей регуляции активности Na_v1.7, включающий введение посредством введения производного пептидной нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-7.

11. Применение производного пептидной нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-7 для производства лекарственного средства для лечения хронической боли.

12. Применение производного пептидной нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-7 для производства лекарственного средства для лечения нейропатической боли.

13. Применение производного пептидной нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-7 для производства лекарственного средства для лечения боли посредством понижающей регуляции активности Na_v1.7.

14. Применение производного пептидной нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-7 для лечения хронической боли.

15. Применение производного пептидной нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-7 для лечения нейропатической боли.

16. Применение производного пептидной нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-7 для лечения боли посредством понижающей регуляции активности Na_v1.7.