Способ выделения сперматозоидов из материала аспирации и/или биопсии из придатка и/или яичка для использования в программах экстракорпорального оплодотворения и/или криоконсервации

Изобретение относится к медицине, а именно к репродуктологии, андрологии и клинической эмбриологии. Способ выделения сперматозоидов из материала аспирации и/или биопсии из придатка и/или яичка для использования в программах экстракорпорального оплодотворения и/или криоконсервации включает отделение сперматозоидов от других клеточных элементов полученного материала путем по меньшей мере двух циклов центрифугирования с отбором для каждого последующего цикла центрифугирования полученного в результате предыдущего цикла центрифугирования супернатанта. Причем центрифугирование проводят при 200-350 g в течение 1-2 мин. Циклы центрифугирования супернатанта проводят до отсутствия видимого осадка. Изобретение обеспечивает получение чистой фракции сперматозоидов, которые можно использовать для оплодотворения ооцитов методом ICSI и/или криоконсервации, из аспирата эпидидимиса или биоптата яичка, в том числе при их критически малом количестве. 5 з.п. ф-лы, 4 ил., 5 пр.

 

Изобретение относится к медицине, а именно к репродуктологии, андрологии и клинической эмбриологии.

В структуре причин бесплодия в парах примерно половина случаев приходится на нарушение фертильности у мужчин. К тяжелому фактору мужского бесплодия относят азооспермию – патологическое состояние, при котором в эякуляте (сперме) отсутствуют сперматозоиды [Лечение женского и мужского бесплодия. Вспомогательные репродуктивные технологии. Под редакцией В.И. Кулакова, Б.В. Леонова, Л.Н.Кузьмичева. Медицинское Информационное агентство. 2005].

Различают обструктивную (экскреторную) азооспермию, при которой нормально созревшие сперматозоиды не попадают в эякулят из-за патологии семявыносящих путей, и необструктивную (секреторную) азооспермию, при которой вследствие нарушения сперматогенеза сперматозоиды в яичках созревают в малом количестве или отсутствуют вовсе. Также возможен вариант смешанной формы азооспермии, связанной одновременно с нарушением как функции яичек, так и проходимости семявыводящих путей [Infertility in the male. Fourth edition. Edited by L.I. Lipshultz, S.S. Howards, C.S. Niederberger. Cambridge University Press. 2009].

В случае обструктивной азооспермии созревшие сперматозоиды часто получают методом аспирации из придатков (эпидидимисов) [Экстракорпоральное оплодотворение. Кей Элдер, Брайан Дэйл. Экстракорпоральное оплодотворение. Москва. МЕДпресс-информ. 2008].

В большинстве случаев при аспирации из эпидидимиса для выделения сперматозоидов выполняют простую отмывку. Принцип метода основан на осаждении всех клеточных элементов, включая сперматозоиды, методом центрифугирования. Полученный в результате центрифугирования супернатант (надосадочную жидкость) удаляют, а из образовавшегося осадка отбирают сперматозоиды для проведения оплодотворения методом внутрицитоплазматической инъекции сперматозоида в яйцеклетку - ICSI (intra-cytoplasmic sperm injection) [Руководство ВОЗ по исследованию и обработке эякулята человека. Пятое издание. Всемирная организация здравоохранения. "Медико-генетический научный центр" РАН. Издательство "Капитал Принт", Москва, 2012].

Если при аспирации из эпидидимиса получено большое число подвижных эпидидимальных сперматозоидов, допускается обработка, применимая к нативному эякуляту (сперме), а именно - центрифугирование в градиенте плотности. Основным критерием возможности применения данного метода является достаточное количество подвижных сперматозоидов. При выполнении этого метода используют центрифугирование аспирата из эпидидимиса в градиенте плотностей, содержащем коллоидные шарики, покрытые силаном, которые разделяют клетки по их плотности. Кроме того, подвижные сперматозоиды активно проникают через градиент и формируют небольшой осадок на дне пробирки. Полученный в результате центрифугирования в градиенте плотности супернатант удаляют, а из образовавшегося под коллоидным слоем осадка отбирают сперматозоиды, которые могут быть использованы при оплодотворении ооцитов [Руководство ВОЗ по исследованию и обработке эякулята человека. Пятое издание. Всемирная организация здравоохранения. "Медико-генетический научный центр" РАН. Издательство "Капитал Принт", Москва, 2012]. Метод центрифугирования в градиенте плотностей имеет ограничение по использованию при обработке материала, полученного при аспирации из придатка: он не применим в случаях с небольшим количеством сперматозоидов в материале, а также при низкой подвижности или полной неподвижности сперматозоидов.

При необструктивной форме азооспермии, по опубликованным данным, не более чем у 50% пациентов в тестикулярной ткани присутствуют сперматозоиды. В этих случаях возможен благоприятный прогноз на получение тестикулярных сперматозоидов хирургическим путем, при этом вероятность успешного лечение зависит от первоначальной причины нарушения функции яичек (сперматогенеза) и от практической возможности выделения тестикулярных сперматозоидов в конкретном клиническом случае, так как при их малом (единичном количестве) выделение и использование при ЭКО (экстракорпоральном оплодотворении) в ряде случаев невозможно, даже несмотря на их наличие в полученном матреиале [G. Corona et.al., Sperm recovery and ICSI outcomes in men with non-obstructive azoospermia: a systematic review and meta-analysis. Hum Reprod Update. 2019 Nov 5;25(6):733-757. doi:10.1093/humupd/dmz028].

Тестикулярная ткань может быть получена при открытой биопсии яичка с микродиссекцией или без нее, либо с помощью подкожной биопсии иглой [Экстракорпоральное оплодотворение. Кей Элдер, Брайан Дэйл. Эктракорпоральное оплодотворение. Москва. МЕДпресс-информ. 2008]. Тестикулярные образцы всегда контаминированы большим количеством несперматогенных клеток и эритроцитов, часто - клетками сперматогенного эпителия, а также клеточным дебрисом, что требует дополнительных шагов для выделения сперматозоидов. Так, для выделения половых клеток из извитых семенных канальцев яичка на первоначальном этапе обработки для получения однородной суспензии клеток применяют ферментативный (инкубирование биоптата с ферментом коллагеназой) или механический (измельчение) методы.

Дальнейшую обработку суспензии клеток осуществляют методом простой отмывки центрифугированием с последующим поиском и извлечением сперматозоидов из полученного осадка из эритроцитов, несперматогенных клеток, клеток сперматогенного эпителия и клеточного дебриса [Руководство ВОЗ по исследованию и обработке эякулята человека. Пятое издание. Всемирная организация здравоохранения. "Медико-генетический научный центр" РАН. Издательство "Капитал Принт", Москва, 2012].

Таким образом, существующие на сегодняшний день подходы в выделении (получении) эпидидимальных или тестикулярных сперматозоидов из материала аспирации/биопсии основаны на методе центрифугирования с получением клеточного осадка, в котором сперматозоиды (часто единичные) находятся среди преобладающей массы других клеточных элементов, что физически затрудняет, а в ряде случаев делает невозможным поиск и извлечение сперматозоидов (особенно в случаях их изначально малого количества). В связи с этим, даже при наличии сперматозоидов в полученном образце ткани, не всегда возможно их извлечение и использование для ICSI. Таким образом, эффективность общепринятых методов получения сперматозоидов из эпидидимальной или тестикулярной ткани ограничена минимально достаточным количеством сперматозодов в образце, при котором возможны поиск и физическое выделение отдельных половых клеток из осадка после центрифугирования.

Из запатентованных методов, относящихся к выделению сперматозоидов, известен способ удаления вируса иммунодефицита человека из спермы мужчины. Способ предусматривает отделение подвижных сперматозоидов от семенной плазмы и сопутствующих клеток путем центрифугирования и последующей инкубации в специальных средах. Согласно изобретению сперму центрифугируют в градиенте плотности (Sil-Select Plus) при 300 g в растворах в течение 20 минут, затем удаляют супернатант. Осадок, содержащий сперматозоиды, аспирируют пипеткой, добавляют среду для промывки спермы FertiCult Flushing medium и центрифугируют при 300 g 10 минут, после чего удаляют супернатант до осадка. Далее осадок, содержащий сперматозоиды, покрывают 2 мл. среды FertiCult Flushing medium, пробирку помещают в инкубатор на 80-90 минут, наиболее подвижные сперматозоиды передвигаются в среду, их аспирируют в объеме 0,7 мл. [патент РФ 2526494 МПК С12N 7/00, опубл. 20.08.2014 г.]. Данная методика применима к обработке спермы и выделению из нее сперматозоидов, отмытых от вируса, и включает в себя комбинацию общепринятых методов обработки спермы: центрифугирование в градиенте плотности и простую отмывку с последующим самостоятельным всплытием подвижных сперматозоидов из осадка. Метод применим к обработке спермы с относительно нормальными характеристиками, в которой содержатся подвижные сперматозоиды, способные к самостоятельному всплытию в достаточном для их выделения количестве. Метод не применим к сперме со сниженными показателями концентрации и подвижности, а так же к материалу аспирации/биопсии.

Известен способ подготовки спермы для внутриматочной инсеминации [патент РФ 2317072 МПК А61К 31/02, А61Р 15/08, опубл. 20.02.2008 г.] путем забора спермы, добавления физиологического раствора и двухкратного центрифугирования по 10 минут при 1500 оборотах в минуту. После центрифугирования в полученную массу сперматозоидов вводят перфторан в соотношении 1:3, выдерживают в течение 3-5 минут, проводят процедуру инсеминации. В указанном способе использован метод простой отмывки спермы с последующим самостоятельным всплытием подвижных сперматозоидов из осадка. Метод применим к обработке спермы с относительно нормальными характеристиками, в которой содержатся подвижные сперматозоиды, способные к самостоятельному всплытию в достаточном для их выделения количестве. Метод не применим к сперме с выраженным снижением показателей концентрации и подвижности, а так же к материалу аспирации/биопсии.

Технической проблемой, решаемой предлагаемым изобретением, является отделение сперматозоидов, в том числе неподвижных и при их критически малом (единичном) количестве, от массы несперматогенных клеток, эритроцитов, клеток сперматогенного эпителия и клеточного дебриса, полученных при аспирации и/или биопсии из эпидидимиса и/или яичка с возможностью их последующего использования для оплодотворения ооцитов и/или криоконсервации.

Технический результат состоит в получении (выделении) чистой фракции сперматозоидов (в том числе единичных) из аспирата эпидидимиса или биоптата яичка, которые можно использовать для оплодотворения ооцитов методом ICSI и/или криоконсервации, в том числе при их критически малом количестве, когда выделение сперматозоидов стандартными методами, основанными на получении осадка клеток при центрифугировании, не эффективно.

Для достижения вышеуказанного технического результата в способе выделения сперматозоидов из материала аспирации и/или биопсии из эпидидимиса и/или яичка, отделение сперматозоидов от других клеточных элементов осуществляют путем, по меньшей мере, двух циклов центрифугирования, с отбором для каждого последующего цикла центрифугирования полученного в результате предыдущего цикла центрифугирования супернатанта, центрифугирование проводят при 200 - 350 g в течение 1-2 минут, циклы центрифугирования супернатанта проводят до отсутствия видимого осадка.

Материал для поиска и выделения сперматозоидов получают путем аспирации или биопсии из придатка или яичка. Материал биопсии перед центрифугированием предварительно обрабатывают механическим или ферментативным способом для получения клеточной суспензии. Предпочтительно центрифугирование проводить при 280-320 g в течение одной минуты при объеме материала 8-12 мл. Среднее количество последовательных циклов центрифугирования составляет от 5 до 12. При каждом последующем цикле параметры центрифугирования (центробежная сила и время) могут быть сохранены, а могут быть увеличены относительно первого цикла. Циклы центрифугирования проводят до отсутствия видимого осадка, при этом в большинстве случаев получают прозрачный супернатант. Далее, при необходимости концентрирования полученной фракции сперматозоидов в минимальном объеме, полученный в последнем цикле супернатант центрифугируют при 250-350 g в течение 5-10 минут для получения сконцентрированной фракции выделенных сперматозоидов.

Предложенный способ позволяет выделить из материала аспирации/биопсии даже единичные мужские половые клетки и использовать их для оплодотворения, особенно при критически малом количестве, когда общепринятые подходы могут быть неэффективными.

Предложенный способ основан на методе дифференциального центрифугирования, который ранее никогда не был применен в работе с мужскими половыми клетками человека, в том числе при их получении из придатка или яичка.

Дифференциальное центрифугирование - это широко используемый метод выделения и очистки различных биологических объектов, таких как вирусы, клетки, субклеточные органеллы, белки и нуклеиновые кислоты, которые растворены или диспергированы в биологически релевантных растворителях [De Duve, C. Exploring cells with a centrifuge. Nobel Lecture. 1974, http://www.nobelprize.org/nobel_prizes/medicine/ laureates/1974/duve-lecture.html.].

Центрифугирование вызывает осаждение частиц, которые тяжелее растворителя. Исходный раствор обычно содержит многокомпонентную смесь частиц, которые различаются по размеру и плотности, а, следовательно, и по скорости их осаждения. Метод дифференциального центрифугирования позволяет выборочно осаждать интересующие компоненты в результате повторяющихся циклов центрифугирования - в центробежном поле все частицы (в данном случае клетки) оседают по-разному: крупные быстрее мелких. На дне пробирки в результате центрифугирования образуется осадок, или седимент, частиц. Жидкость над осадком называется супернатантом, из него можно собрать достаточно чистую фракцию самых маленьких частиц. Таким образом клетки, у которых имеется достаточная разница в размере и скорости седиментации, можно отделить друг от друга, при этом необходима определенная комбинация относительного центробежного ускорения и времени центрифугирования, эффективная для выделения компонентов данной многокомпонентной смеси [Ohlendieck, Kay; Harding, Stephen E. (19 April 2018). "Centrifugation and Ultracentrifugation". Wilson and Walker's Principles and Techniques of Biochemistry and Molecular Biology: 424–453. doi:10.1017/9781316677056.014. ISBN 9781107162273].

Принцип дифференциального центрифугирования в изобретении впервые применяют к выделению сперматозоидов из тестикулярной или эпидидимальной ткани: сперматозоиды по массе меньше других клеток, в преобладающем количестве присутствующих в материале биопсии/аспирации (эритроцитов, несперматогенных клеток и клеток сперматогенного эпителия), поэтому их можно эффективно отделить от этих клеток. В результате дифференциального центрифугирования при подобранном для данной клеточной суспензии экспериментальным путем режиме центрифугирования, возможно получение верхней фракции (супернатанта), свободной от других элементов (эритроцитов, несперматогенных клеток, клеток сперматогенного эпителия и клеточного дебриса), но содержащей сперматозоиды.

Предложенный дифференциальный подход в выделении мужских половых клеток значительно более эффективен по сравнению с традиционным методом центрифугирования (простой отмывки), так как позволяет избежать осадка, в котором теряются или залипают сперматозоиды,что делает их последующее выделение в ряде случаев невозможным ввиду их критически малого количества..

Изобретение поясняется следующими материалами:

Фиг. 1. Материал биопсии яичка после механической обработки (х200). В поле зрения 1 сперматозоид (указан стрелкой).

Фиг. 2. Применение способов простой отмывки (А) и дифференциального центрифугирования (Б) к обработке двух частей одного материала биопсии яичка.

Фиг. 3. Осадок эритроцитов, клеток сперматогенного эпителия, несперматогенных клеток и клеточного дебриса после простой отмывки, содержащий единичные сперматозоиды (х400). Представлено 6 полей зрения со сперматозоидами (обозначены стрелками).

Фиг. 4. Сконцентрированная фракция сперматозоидов, свободная от большей части эритроцитов, клеток сперматогенного эпителия и несперматогенных клеток, полученная в результате дифференциального центрифугирования (х400). Представлено 6 полей зрения со сперматозоидами (обозначены стрелками).

Способ выделения сперматозоидов из материала аспирации и/или биопсии из придатка (эпидидимиса) и/или яичка для использования в программах экстракорпорального оплодотворения и/или криоконсервации, осуществляют следующим образом.

Полученный методами аспирации или биопсии материал эпидидимиса/яичка помещают в отмывочную среду для гамет человека на основе ХЕПЕС-буфера. При необходимости осуществляют стандартную механическую или ферментативную обработку ткани с целью ее гомогенизации (получения суспензии).

Материал аспирации/биопсии или полученную после стандартной обработки суспензию клеток в отмывочной среде в объеме 8-12 мл. помещают в пробирку для центрифугирования с коническим дном и центрифугируют при заданных параметрах центробежной силы и времени при 200-350 g в течение 1-2 минут. Центробежная сила и время центрифугирования зависят от исходного объема образца, концентрации сперматозоидов, степени контаминации несперматогенными клетками, эритроцитами, клетками сперматогенного эпителия. При выборе режима дифференциального центрифугирования для каждого случая учитывают, что сильно контаминированные образцы следует доводить отмывочной средой до большего объема (10-12 мл). Применение центробежной силы ниже 200 g и/или времени центрифугирования менее 1 минуты является малоэффективным, так как эритроциты, несперматогенные клетки и клетки сперматогенного эпителия не оседают в полной мере на дно пробирки; применение центробежной силы выше 350 g и/или времени более 2 минут приводит к одновременному осаждению как эритроцитов, несперматогенных клеток и клеток сперматогенного эпителия, так и сперматозоидов, что не позволяет эффективно выделить чистую фракцию последних. Так, для полученного при открытой биопсии яичка с микродиссекцией материала биопсии яичка, после механической обработки оптимальным является сочетание следующих параметров последовательного центрифугирования: 300 g в течение 1 минуты в объеме 8-10 мл.

После каждого центрифугирования супернатант переносят в новую пробирку и повторно центрифугируют при исходных параметрах или при увеличенной центробежной силе и/или увеличенном времени в зависимости от кондиции образца, при этом режимы центрифугирования не должны выходить за установленный интервал: центробежная сила 200-350 g, время 1-2 минуты. Повторяющиеся раунды центрифугирования супернатанта производят до получения чистой (прозрачной) надосадочной жидкости (супернатанта) и/или до момента отсутствия видимого осадка; количество раундов центрифугирования в среднем варьирует от 5 до 12 и зависит от исходной степени контаминации образца эритроцитами, несперматогенными клетками и клетками сперматогенного эпителия.

Полученный в результате дифференциального центрифугирования чистый (прозрачный) супернатант, в котором содержатся сперматозоиды, но из которого удалена основная масса других клеток, в полученном объеме может быть криоконсервирован или использован для отбора из него сперматозоидов при проведении оплодотворения. При необходимости получения концентрированной фракции выделенных сперматозоидов супернатант центрифугируют при 250-350 g в течение 5-10 минут (в зависимости от объема пробы) с целью их концентрации в минимальном объеме. Полученный в результате последнего раунда центрифугирования осадок представляет собой чистую концентрированную фракцию сперматозоидов, которая также может быть использована для оплодотворения ооцитов методом ICSI и/или криоконсервирована для отложенного использования в программе ЭКО.

Реализация предложенного способа подтверждена клиническими данными. Всего было выполнено 257 операций по получению материала из яичка/эпидидимиса у пациентов с азооспермией. 223 пациентам с диагнозом необструктивная (секреторная) азооспермия (НОА) была проведена операция биопсии из яичка с микродиссекцией под контролем операционного микроскопа (micro-TESE). 34 пациентам с диагнозом обструктивная азооспермия (ОА) была проведена аспирация/биопсия из эпидидимиса (придатка), в том числе под контролем операционного микроскопа (MESA/micro-MESE).

Полученный материал обрабатывали механическим способом (за исключением аспирата из эпидидимиса) и исследовали под микроскопом. При визуализации хотя бы одного сперматозоида во всем объеме пробы считали, что сперматозоиды обнаружены.

Частота обнаружения (наличия) сперматозоидов при НОА составила 39,9%, что согласуется с опубликованными данными. В группе с НОА сперматозоиды во всех случаях обнаружения были представлены в малом или единичном количестве.

Частота обнаружения (наличия) сперматозоидов при ОА составила 100%. Указанная эффективность обнаружения сперматозоидов при ОА обусловлена сохраненным сперматогенезом при нарушенной проходимости семявыносящих путей. Качество материала в группе ОА варьировало от высокого содержания сперматозоидов до их присутствия в единичном количестве.

Выделение сперматозоидов во всех случаях осуществляли методом дифференциального центрифугирования. В группе с НОА эффективность выделения сперматозоидов предложенным способом (с последующим использованием для ЭКО и/или криоконсервацией) составила 98,8%. Сопоставимый по эффективности уровень выделения сперматозоидов из хирургически полученного материала общепринятыми методами ранее никогда заявлен не был. Высокая эффективность выделения сперматозоидов обусловлена особенностью метода дифференциального центрифугирования: в ходе обработки удается избежать концентрированного клеточного осадка, из которого выделение сперматозоидов крайне затруднено или технически невозможно, особенно в случаях их малого (штучного) количества.

Выделенные из материала биопсии/аспирации методом дифференциального центрифугирования сперматозоиды использовали для оплодотворения ооцитов супруги, полученных в тот же день (синхронный цикл ЭКО) и/или криоконсервировали для отсроченного использования в программе ЭКО/ICSI (несинхронный цикл ЭКО). Избыточные эмбрионы, полученные в программах ЭКО, криоконсервировали для отсроченного использования в программах переноса размороженных эмбрионов (ПРЭ).

В группах НОА и ОА всего было проведено 147 и 47 циклов ВРТ с переносом эмбрионов соответственно, которые включали в себя три вида программ: синхронный цикл ЭКО, несинхронный цикл ЭКО и перенос размороженных эмбрионов (ПРЭ), полученных и криоконсервированных в первых двух видах программ.

Получено 47 беременностей у 88 пациентов с НОА в 147 циклах ВРТ (52,8% на пациента; 31,9% на цикл ВРТ) и 18 беременностей у 34 пациентов с ОА в 47 циклах ВРТ (52,9% на пациента; 38,3% на цикл ВРТ).

Таким образом, предложенный способ выделения сперматозоидов из материала аспирации/биопсии из эпидидимиса /яичка с использованием подхода дифференциального центрифугирования показал высокую эффективность как в получении сперматозоидов (в том числе в случаях их единичного количества), так и при их использовании в программах ВРТ и криоконсервации.

КЛИНИЧЕСКИЕ ПРИМЕРЫ

Пример 1. Пациент А., 34 г., азооспермия, секреторная форма (НОА). В результате биопсии из яичка под контролем операционного микроскопа (micro-TESE) был получен достаточный объем материала, в котором после первичной механической обработки были визуализированы единичные сперматозоиды (1 на 20 полей зрения, х200), Фиг. 1. Механически обработанный материал биопсии был разделен на две части. Одна часть была обработана традиционным способом простой отмывки, вторая часть была обработана методом дифференциального центрифугирования с последующим концентрированием в минимальном объеме. В результате простой отмывки получен осадок (Фиг. 2А) из эритроцитов, клеток сперматогенного эпителия и несперматогенных клеток, содержащий единичные сперматозоиды (1 на 7 полей зрения, х400), Фиг. 3. В результате дифференциального центрифугирования фракция сперматозоидов была отделена от эритроцитов, клеток сперматогенного эпителия и несперматогенных клеток и сконцентрирована в минимальном объеме (Фиг. 2Б), содержание сперматозоидов составило 2-5 в поле зрения (х400) (Фиг. 4). Из материала, обработанного методом дифференциального центрифугирования (Фиг. 4), удалось извлечь сперматозоиды для оплодотворения ооцитов супруги Пациента А., Пациентки А., методом ICSI в синхронном цикле ЭКО (получены эмбрионы), часть сперматозоидов криоконсервирована. Из осадка, полученного в результате простого центрифугирования (Фиг. 3), извлечение сперматозоидов для ICSI было крайне затруднено и не проводилось, криоконсервация данного материала не была рекомендована.

Пример 2. Пациент М., 38 л., азооспермия, секреторная форма (НОА). В анамнезе Пациента М. две неудачные операции биопсии яичка: сперматозоиды в биоптате присутствуют, но, ввиду их малого количества, попытки их выделения методом простой отмывки ранее были неуспешны. В результате очередной биопсии из яичка под контролем операционного микроскопа (micro-TESE) был получен материал, в котором после первичной механической обработки были визуализированы единичные сперматозоиды (1 на 30 полей зрения, х200), материал обработан методом дифференциального центрифугирования с последующим концентрированием в минимальном объеме. В результате обработки получена фракция сперматозоидов (1 на поле зрения, х200), сперматозоиды выделены и использованы для оплодотворения ооцитов супруги Пациента М., Пациентки И., методом ICSI в синхронном цикле ЭКО, в результате лечения получена беременность.

Пример 3. Пациент П., 35 л., азооспермия, секреторная форма (НОА). В анамнезе Пациента П. биопсия яичка, при которой был получен материал, содержащий сперматозоиды. Методом простой отмывки была получена концентрированная проба небольшого объема, содержащая сперматозоиды. В связи с крайне низкой концентрацией сперматозоидов на фоне высокого содержания эритроцитов и других клеток, материал был сконцентрирован до минимального объема, равного объему одной криосоломины (200 мкл); выполнена криоконсервация. Данный криоматериал был разморожен и использован в программе ЭКО, беременность у супруги не наступила. При повторной биопсии яичка полученный материал был обработан методом дифференциального центрифугирования, в результате чего была выделена чистая фракция сперматозоидов в количестве, достаточном для использования в программе ЭКО/ICSI и для криоконсервации. Выделенные сперматозоиды криоконсервированы в восьми криосоломинах, осуществляется хранение полученного материала с целью использования в предстоящих программах ЭКО.

Пример 4. Пациент А., 28 лет, азооспермия, генетически обусловленная секреторная форма (делеция AZF-локуса). В биоптате яичка обнаружены единичные сперматозоиды. В результате дифференциального центрифугирования выделены единичные сперматозоиды и использованы для оплодотворения ооцитов супруги Пациента А., Пациентки Е., методом ICSI. Полученные эмбрионы криоконсервированы для отсроченного переноса в программе ПРЭ.

Пример 5. Пациент С., 42 г., азооспермия, обструктивная форма (ОА). Из аспирата эпидидимиса методом дифференциального центрифугирования выделена чистая фракция сперматозоидов в достоточном для использования в программе ЭКО/ICSI и криоконсервации количестве. Криоконсеврация выделенных сперматозоидов осуществлена в 12 криосоломинах. В несинхронном цикле ЭКО проведено оплодотворение ооцитов супруги Пациента С., Пациентки С. методом ICSI с использованием размороженного материала одной криосоломины, осуществлен перенос одного эмбриона из полученных шести, беременность наступила. Избыточные эмбрионы криоконсервированы.

1. Способ выделения сперматозоидов из материала аспирации и/или биопсии из придатка и/или яичка для использования в программах экстракорпорального оплодотворения и/или криоконсервации, включающий отделение сперматозоидов от других клеточных элементов полученного материала путем по меньшей мере двух циклов центрифугирования с отбором для каждого последующего цикла центрифугирования полученного в результате предыдущего цикла центрифугирования супернатанта, причем центрифугирование проводят при 200-350 g в течение 1-2 мин, циклы центрифугирования супернатанта проводят до отсутствия видимого осадка.

2. Способ выделения сперматозоидов по п.1, отличающийся тем, что центрифугирование проводят при 300 g в течение 1 мин при объеме материала 8-12 мл.

3. Способ выделения сперматозоидов по п.1, отличающийся тем, что количество последовательных циклов центрифугирования составляет от 5 до 12.

4. Способ выделения сперматозоидов по п.1, отличающийся тем, что при каждом последующем цикле центрифугирования увеличивают относительно первого и/или предыдущего цикла центробежную силу в пределах 200-350 g и/или время в течение 1-2 мин.

5. Способ выделения сперматозоидов по п.1, отличающийся тем, что материал биопсии предварительно обрабатывают механическим или ферментативным способом для получения клеточной суспензии.

6. Способ выделения сперматозоидов по п.1, отличающийся тем, что супернатант, отобранный после последнего цикла центрифугирования при 200-350 g в течение 1-2 мин, концентрируют путем центрифугирования при 250-350 g в течение 5-10 мин.