Композиция растворимых мономерных и олигомерных фрагментов пептидогликана клеточной стенки грамотрицательных бактерий, способы ее получения и применения
В изобретении описана фармацевтическая композиция, включающая фрагменты пептидогликана клеточной стенки грамотрицательных бактерий, основными компонентами которой являются олигомеры мурамилпептидов D, E, F, G, Н с молекулярной массой 2000-4000 а.е.м., которые построены из блоков А, В и С, соединённых за счет гликозидных связей, где мурамилпептид А - β-N-ацетил-D-глюкозаминил-(1→4)-N-ацетил-D-мурамоил-L-аланил-D-изоглютаминил-мезо-диаминопимелиновой кислоты, мурамилпептид В - β-N-ацетил-D-глюкозаминил-(1→4)-N-ацетил-D-мурамоил-L-аланил-D-изоглютаминил-мезо-диаминопимелоил-D-аланина и мурамилпептид С, который представляет собой димер мурамилпептида В, в котором связь между мономерными остатками мурамилпептида В осуществляется за счет карбоксильной группы терминального D-аланина одного остатка В и ω-аминогруппы мезо-диаминопимелиновой кислоты другого остатка В, причем тримерные мурамилпептиды D и E образованы за счет соединения димерного блока С с мономерными блоками В и А соответственно, тетрамерные мурамилпетиды F и G образованы за счет соединения димерного блока С с двумя мономерными блоками В или с двумя мономерными блоками А соответственно, а тетрамерный мурамилпетид H образован за счет соединения димерного блока С с мономерными блоками А и В. Также предложен способ получения композиции, включающий экстракцию бактериальных клеток раствором детергента при повышенной температуре, диспергирование полученного высокоочищенного пептидогликана под действием мощного ультразвука с последующей обработкой лизоцимом. Описанная композиция может быть использована в иммунофармакологии, в частности, для создания средств поддерживающей терапии, предназначенных для повышения естественной резистентности организма к инфекциям различной природы. 2 н. и 9 з.п. ф-лы, 7 ил., 6 табл.
Область изобретения
Изобретение относится к области микробиологии и биотехнологии, и может быть использовано в иммунофармакологии, в частности, для создания средств поддерживающей терапии, предназначенных для повышения естественной резистентности организма к инфекциям различной природы.
Уровень техники
В макроорганизме главным источником экзогенных иммуностимулирующих агентов являются бактерии микробиоты кишечника, дыхательных путей, кожи и др. причем от ее качественного и количественного состава напрямую зависит полноценное функционирование иммунной системы. Стерильные животные (гнотобионты), иммунная система которых атрофирована, практически беззащитны при контакте даже с условно-патогенными микроорганизмами.
Известно, что мощным иммуностимулятором бактериальной природы является пептидогликан клеточной стенки (ПКС) бактерии. В зависимости от бактериального источника (грамположительные или грамотрицательные микроорганизмы), способа его обработки и очистки могут быть выделены комплексы биологически активных фрагментов ПКС (мурамилпетидов) с различной структурой, которые могут стать основой для получения препаратов с характерными для каждого комплекса свойствами.
На основании многочисленных данных структурного анализа фрагментов, полученных при гидролизе ПКС лизоцмом - ферментом, избирательно расщепляющим гликозидные связи остатков мурамовой кислоты, установлено, что ПКС представляет собой «сшитый» гетерополимер, который содержит линейные полисахаридные цепи, построенные из чередующихся остатков N-ацетил-D-глюкозамина (GlcNAc) и N-ацетил-D-мурамовой кислоты (MurNAc), присоединенных β-(1→4)-гликозидными связями, причем лактильные группы остатков мурамовой кислоты несут короткие пептиды. В большинстве изученных грамотрицательных микроорганизмов пептидный фрагмент представлен тетрапептидным остатком: L-аланил-D-изоглутаминил-мезодиаминопимелоил-D-аланин. Часть «антенных» олигопептидных фрагментов образуют «мостиковые» структуры, обеспечивая создание сетевидной пространственной структуры ПКС.
Неоднократно отмечалось, что степень «сшитости», т.е. количество «мостиковых» фрагментов в ПКС, зависит не только от вида микроорганизма, но и от типа и условий культивирования.
Ранее было установлено, что мурамоил-L-лизил-D-глутаминовая кислота (мурамилдипептид, МДП), являющийся минимальным компонентом пептидогликана клеточной стенки, обладает таким же адъювантным эффектом, способностью стимулировать антиинфекционную резистентность, противоопухолевый иммунитет, активировать иммунокомпетентные клетки и индуцировать синтез ряда цитокинов, как и целые клетки микобактерий [Ellouz AF, Ciorubaru R, Lederer E. Minimal structural requirements for adjuvant activity of bacterial peptidoglycan subunits. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1974. 59. 1317-1325]. Однако из-за высокой пирогенности он оказался не пригодным для клинического применения. Впоследствии было показано, что полусинтетический β-N-ацетил-D-глюкозаминил-(1→4)-N-ацетил-D-мурамоил-(L-аланил-D-изоглутамин) (глюкозаминилмурамилдипептид, ГМДП), содержащий по сравнению с МДП дополнительный остаток N-ацетил-D-глюкозамина, обладает значительно меньшей пирогенностью и может быть использован в качестве иммуномодулятора широкого спектра действия. Однако, ГМДП представляет собой полусинтетический продукт, лишь имитирующий в пептидной части структуру природных мурамилпетидов. Он, в отличие от нативных компонентов, выделенных из ПКС грамотрицательных бактерий, пептидные антенны которых построены из трех или четырех аминокислотных остатков, включает только два аминокислотных остатка. Более того, природные пептидогликановые фрагменты несут отрицательные и положительные заряды (содержат свободные карбоксильные и аминогруппы), тогда как в ГМДП карбоксильная группа остатка изоглутаминовой кислоты находится в форме амида, т.е. ГМДП - молекула нейтральная. ГМДП является активным компонентом иммуномодулирующего препарата Ликопид.
В патентах RU 2441906 и RU 2478644 описываются способ производства и применение природной композиции, состоящей из трех мурамилпетидов грамотрицательных бактерий с молекулярной массой не более 2 кДа: β-N-ацетил-D-глюкозаминил-(1→4)-N-ацетил-D-мурамоил-(L-аланил-D-изоглутаминил-мезо-диаминопимелиновая кислота) (мурамилпептид А), β-N-ацетил-D-глюкозаминил-(1→4)-N-ацетил-D-мурамоил-(L-аланил-D-изоглутаминил-мезо-диаминопимелоил-D-аланин) (мурамилпептид В), а также димер В (мурамилпептид С), в котором связь между мономерными остатками В осуществляется за счет карбоксильной группы терминального D-аланина одного остатка В и ω-аминогруппы мезо-диаминопимелиновой кислоты другого остатка В.
А - β-N-ацетил-D-глюкозаминил-(1→4)-N-ацетил-D-мурамоил-L-аланил-D-изоглютаминил-мезо-диаминопимелиновая кислота,
В - β-N-ацетил-D-глюкозаминил-(1→4)-N-ацетил-D-мурамоил-(L-аланил-D-изоглутаминил-мезо-диаминопимелоил-D-аланин,
С - димер мурамилпептида В, где связь между мономерными остатками мурамилпептида В осуществляется за счет карбоксильной группы терминального D-аланина одного остатка мурамилпептида В и ω-аминогруппы мезо-диаминопимелиновой кислоты другого остатка мурамилпептида В,
В 2013 году эта композиция была зарегистрирована в РФ в качестве иммуномодулятора Полимурамил®.
Иммуностимуляторы, активирующие врожденную иммунную систему и дающие быструю защиту от широкого круга патогенных микроорганизмов, имеют множество вариантов применения в современной медицине. Они могут быть использованы, например, для лечения или профилактики хронических инфекционно-воспалительных заболеваний, ВИЧ-инфекции, при потенциальном заражении патогенными бактериями, для активации клеток иммунной системы, подавленных опухолевым процессом. Поиск новых, эффективных иммуностимуляторов, обладающих минимумом побочных действий, является актуальной задачей иммунофармакологии.
Сущность изобретения
Патенты RU 2478644 и RU 2441906 касаются способа получения и свойств субстанции Полимурамил (далее, ПМ), которая представляет собой комбинацию мурамилпептидов, полученных при обработке ПКС различных грамотрицательных бактерий лизоцимом. Было установлено, что значительная часть ПКС устойчива к ферментативному расщеплению и остается в нерастворимой форме. В раствор переходят в основном низкомолекулярные продукты ферментативного расщепления - антенные мурамилпептиды А и В, которые представляют собой повторяющиеся звенья линейного полимера ПКС, а также «сшитый» димерный мурамилпептид С, характерный для «мостиковых» участков этих линейных полимеров. Наряду с ними гидролизат обычно содержит незначительное количество мурамилпетидов с более высокой молекулярной массой (2 - 5 кДа), которые построены из остатков низкомолекулярных мурамилпетидов А и В.
В патенте RU 2478644 описан метод получения Полимурамила с помощью расщепления ПКС лизоцимом в буфере с рН 7,2 при 10°С в течение трех суток с использованием диализных трубок или полупроницаемых мембран для ультрафильтрации с размером отсечки до 5 кДа.
В процессе расширенного исследования влияния условий получения ПКС и параметров процесса его ферментативной обработки на состав образующейся композиции мурамилпептидов оказалось, что при использовании мощного ультразвука на стадии получения ПКС и изменении условий ферментативной обработки главными продуктами образующейся композиции мурамилпептидов являются более высокомолекулярные тримерные мурамилпептиды D и E с молекулярной массой 2779,2 m/z и 2708,2 m/z, а также тетрамерные мурамилпептиды F, G и H c молекулярной массой 3557,6 m/z, 3699,6 m/z и 3628,6 m/z, которые построены из «первичных» блоков А, В и С, соединенных гликозидными связями между остатками D-GlcNAc и D-MurNAc.
На основании данных масс-спектрометрии установлено, что мурамилпептид D, построен из блоков С и В и представлен четырьмя изомерами положения, в двух из которых присутствует β-гликозидная-связь между С1 одного из остатков N-ацетил-D-мурамовой кислоты из мурамилпептида C и С4 терминального остатка N-ацетил-D-глюкозамина из мурамилпептида В, а в двух других присутствует β-гликозидная-связь между С1 остатка N-ацетил-D-мурамовой кислоты из мурамилпептида В и С4 одного из терминальных остатков N-ацетил-D-глюкозамина из мурамилпептида С (стрелки на схемах ниже означают один из возможных вариантов присоединения мурамилпептида; присоединение возможно по любому из четырех потенциальных мест, образуя четыре потенциальных изомера).
Мурамилпептид Е, построен из блоков С и А и представлен четырьмя изомерами положения, в двух из которых присутствует β-гликозидная-связь между С1 одного из остатков N-ацетил-D-мурамовой кислоты из мурамилпептида С и С4 терминального остатка N-ацетил-D-глюкозамина из мурамилпептида А, а в двух других присутствует β-гликозидная-связь между С1 остатка N-ацетил-D-мурамовой кислоты из мурамилпептида А и С4 одного из терминальных остатков N-ацетил-D-глюкозамина из мурамилпептида С.
В композиции также могут присутствовать тетрамерные изомеры положения F, построенные (по аналогии с тримерными мурамилпептидами D и Е) из блока С и двух блоков В, тетрамерные изомеры положения G, построенные из блока С и двух блоков А, а также тетрамерные изомеры положения H, построенные из блоков С, А и В (также обозначены в дальнейшем как BCB, АСА, АСВ). Необходимо отметить, что обозначения BCB, АСА, АСВ не предполагает определенную последовательность блоков: ВСВ не предполагает, что блоки В расположены слева и справа от С; напротив, в данном описании обозначение ВСВ также включает в себя, например, варианты В2С или СВ2, то есть объединяет различные варианты изомеров положения (прикрепления двух блоков В к блоку С). Весь комплекс таких изомеров положения мурамилпептидов также обозначен как F.
В некоторых вариантах изобретения заявлена композиция для стимулирования иммунного ответа организма млекопитающего, образующаяся в результате ферментативного расщепления высокоочищенного пептидогликана клеточной стенки грамотрицательных бактерий, представляющего собой высокомолекулярный пространственный полимер, построенный из повторяющихся мурамилпептидных звеньев, содержащая эффективное количество смеси растворимых мурамилпептидных олигомеров ВС, AC или смеси растворимых мурамилпептидных олигомеров BCB, АСА, АСВ, при этом А, В и С соединены между собой при помощи β-гликозидной связи и представляют собой мурамилпептиды следующей структуры:
мурамилпептид А: β-N-ацетил-D-глюкозаминил-(1→4)-N-ацетил-D-мурамоил-L-аланил-D-изоглютаминил-мезо-диаминопимелиновой кислоты;
мурамилпептид В: β-N-ацетил-D-глюкозаминил-(1→4)-N-ацетил-D-мурамоил-L-аланил-D-изоглютаминил-мезо-диаминопимелоил-D-аланина;
мурамилпептид С: димер мурамилпептида В, где связь между двумя мурамилпептидами В осуществляется за счет карбоксильной группы терминального D-аланина одной молекулы В и ω-аминогруппы мезо-диаминопимелиновой кислоты другой молекулы В; или состоящая из эффективного количество смеси солей вышеуказанных растворимых мурамилпептидных олигомеров.
Возможны различные варианты фармацевтически приемлемых солей мурамилпептидных олигомеров, например, соли натрия (Na+ - традиционный противоион для карбоксильных групп). Также возможны соликалия или аммония
В некоторых вариантах изобретения композиция содержит эффективное количество смеси растворимых мурамилпептидных олигомеров ВС, AC, BCB, АСА, АСВ, или эффективное количество смеси солей вышеуказанных растворимых мурамилпептидных олигомеров.
В некоторых вариантах изобретения композиция дополнительно содержит смесь растворимых мурамилпептидов А, В и С, или солей вышеуказанных мурамилпептидов, при этом суммарная массовая доля мурамилпептидов А, В и С в композиции составляет не более 50%. При этом, в некоторых предпочтительных вариантах изобретения суммарная массовая доля мурамилпептидов А, В и С в композиции составляет не более 10%. В других вариантах суммарная массовая доля мурамилпептидов А, В и С в составе композиции может составлять не более 3%, не более 5%, не более 7%, не более 15%, не более 20%, не более 30%, не более 40%, не более 50%.
В некоторых вариантах изобретения композиция дополнительно содержит фармацевтически приемлемый носитель или эксципиент.
В некоторых предпочтительных вариантах изобретения композиция содержит смесь мурамилпептидов, включающую мурамилпептиды D, E, F, G, Н с молекулярной массами (а.е.м.) 2779,2; 2708,2; 3557,6; 3699,6 и 3628,6, соответственно, а также до 10% трех мурамилпептидов А, В и С с молекулярными массами (а.е.м.) 867,4, 938,4 и 1858,8, соответственно (далее этот вариант композиции обозначен как ФКМ).
В некоторых вариантах изобретения раскрыт способ получения вышеуказанных композиций, содержащих олигомеры мурамилпептидов, из пептидогликана клеточной стенки (ПКС) грамотрицательных бактерий, включающий следующие стадии: подготавливают полученную биомассу бактерий к разрушению при помощи обработки ультразвуковым диспергатором мощностью 400 - 800 Вт;
подготовленную биомассу обрабатывают буфером, содержащим ионный детергент в концентрации 0,1-1%, при температуре 40 - 90°С;
очищают полученную биомассу от примесей и детергента;
механически измельчают полученную биомассу при помощи механической мельницы; производят ферментативный гидролиз биомассы при помощи лизоцима при рН раствора 4,5-7,0 и температуре от 40 до 60°С;
выделяют целевые продукты ферментативного гидролиза при помощи ультрафильтрации с размером отсечки полупроницаемых мембран до 10 кДа.
В некоторых вариантах изобретения способ дополнительно включает стадию разделения целевых продуктов ферментативного гидролиза при помощи гель-хроматографии, хроматографиинизкого давления или высокоэффективной жидкостной хроматографии.
В некоторых вариантах изобретения способ дополнительно включает стадию лиофилизации выделенных целевых продуктов ферментативного гидролиза.
Также раскрывается применение композиций, содержащих олигомеры мурамилпептидов, для лечения и профилактики заболеваний млекопитающих, при которых необходимо стимулирование иммунной системы.
В отличие от полусинтетического препарата Ликопид, а также его синтетических аналогов (Ромуртид, Мифамуртид, Мурабутид, вещество B30-MDP), композиция, содержащая олигомеры мурамилпептидов, такая, как, например, ФКМ, представляет собой полностью природный иммуностимулятор. Поскольку иммунная система человека и млекопитающих «настроена» на распознавание веществ естественного происхождения, воздействие на иммунную систему такой комбинации природных мурамилпетидов, как ФКМ, будет более сбалансированным по соотношению терапевтического и побочного действий.
Технический результат, достигаемый при осуществлении изобретения, заключается в более эффективном стимулировании иммунного ответа организма млекопитающего в ответ на композицию, содержащую олигомеры мурамилпептидов, такую, как, например, ФКМ, а также упрощении процедуры получения и увеличении выхода указанной композиции из ПКС грамотрицательных бактерий.
Указанный технический результат достигается повышенным содержанием олигомерных структур растворимых мурамилпептидов в составе композиции, а также улучшенным методом ее выделения из ПКС грамотрицательных бактерий.
Краткое описание фигур.
Фиг. 1. Картина аналитической ВЭЖХ препарата ФКМ.
Фиг. 2. Картина аналитической ВЭЖХ препарата Полимурамил.
Фиг. 3. Картина препаративного разделения препарата ФКМ.
Фиг. 4. 1Н-ЯМР спектр ФКМ (D2O).
Фиг. 5. 1H-ЯМР спектр субстанции ПМ (D2O).
Фиг. 6. Картина ВЭЖХ препарата 2 (для препарата 1 картина аналогична).
Фиг. 7. Картина ВЭЖХ препарата 3.
РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В описании данного изобретения термины «включает» и «включающий» интерпретируются как означающие «включает, помимо всего прочего». Указанные термины не предназначены для того, чтобы их истолковывали как «состоит только из». Если не определено отдельно, технические и научные термины в данной заявке имеют стандартные значения, общепринятые в научной и технической литературе.
В изобретении описана фармацевтическая композиция, включающая фрагменты пептидогликана клеточной стенки (олигомеры мурамилпептидов) грамотрицательных бактерий, основными компонентами которой являются мурамилпептиды D, E, F, G, Н с молекулярной массой 2000 - 4000 а.е.м., которые построены из блоков А, В и С, где мурамилпептид А - β-N-ацетил-D-глюкозаминил-(1→4)-N-ацетил-D-мурамоил-L-аланил-D-изоглютаминил-мезо-диаминопимелиновой кислоты, мурамилпептид В - β-N-ацетил-D-глюкозаминил-(1→4)-N-ацетил-D-мурамоил-L-аланил-D-изоглютаминил-мезо-диаминопимелоил-D-аланина и мурамилпептид С, который представляет собой димер мурамилпептида В, в котором связь между мономерными остатками мурамилпептида В осуществляется за счет карбоксильной группы терминального D-аланина одного остатка В и ω-аминогруппы мезо-диаминопимелиновой кислоты другого остатка В, причем тримерные мурамилпептиды D и E образованы за счет соединения димерного блока С с мономерными блоками В и А, соответственно, тетрамерные мурамилпетиды F и G образованы за счет соединения димерного блока С с двумя мономерными блоками В или с двумя мономерными блоками А, соответственно, а тетрамерный мурамилпетид H образован за счет соединения димерного блока С с мономерными блоками А и В. В мурамилпептидах D, E, F, G и Н связь между димерным блоком С и блоками А и В осуществляется за счет гликозидных связей между остатками D-GlcNAc и D-MurNAc. Тримерные мурамилпептиды D и Е представляют собой набор изомеров положения с молекулярной массой 2779,2 m/z и 2708,2 m/z, соответственно, тетрамерные мурамилпептиды F, G и Н представляют собой набор изомеров положения с молекулярной массой 3557,6 m/z, 3699,6 m/z и 3628,6 m/z, соответственно.
Способ получения этой композиции предполагает использование комбинации стадий выделения фармакологически приемлемой ФКМ из ПКС грамотрицательных бактерий, включающей приготовление биомассы, содержащей вещества бактериальной природы, выделение ПКС бактерий, расщепление нерастворимого ПКС препаративным ферментативным гидролизом с применением лизоцима и выделение фармакологически приемлемой ФКМ, при этом подготовку биомассы к экстракции осуществляют с помощью обработки ультразвуком, выделение ПКС проводят с помощью экстракции биомассы буферами, содержащими детергенты, механическое измельчение полученного ПКС проводят с помощью механической мельницы, расщепление нерастворимого ПКС проводят с помощью фермента лизоцима, расщепляющего гликозидные связи остатков мурамовой кислоты, при температуре выше 40°С с последующим выделением ФКМ ультрафильтрацией.
Для осуществления процесса согласно данному изобретению приготавливают биомассу, содержащую вещества бактериальной природы, в качестве которых применены грамотрицательные бактерии семейства Enterobacteriacea (например, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Escherichia coli) посредством их культивирования в питательной среде, последующего выделения бактериальных клеток центрифугированием или микрофильтрацией и тщательной отмывкой бактериальных клеток от компонентов питательной среды.
При использовании различных бактериальных источников имеется возможность получать фармакологически приемлемую смесь мурамилпептидных олигомеров с различным содержанием отдельных компонентов. Также, относительное содержание отдельных олигомерных компонентов (таких как ВС, AC, BCB, АСА, АСВ) можно изменять в процессе получения композиции при помощи хроматографического разделения получаемой смеси и последующего отделения фракций, содержащих различные олигомерные компоненты (см. ниже, например, Фиг. 3).
Соматический антиген грамотрицательных бактерий - высоко эндотоксичный липополисахарид (ЛПС), расположенный на внешней мембране клеточной стенки бактерии, может быть удален с помощью различных экстракционных процедур, причем на этой же стадии происходит освобождение от белков, нуклеиновых кислот и других нековалентно связанных с ПКС компонентов бактериальной клетки. В качестве экстрагента чаще всего используют 45%-ный водный фенол при температуре от 65-68°С, так как при этой температуре происходит полная гомогенизация смеси фенола и воды. Кроме того, для экстракции бактериальных клеток могут быть использованы водные растворы хаотропных соединений, а также детергентов, обладающих способностью разрушать агрегаты, образующиеся амфифильными полимерными молекулами.
Описанный в патенте RU 2478644 способ получения Полимурамила обладает рядом недостатков: использование в качестве экстрагента токсичного и агрессивного 45%-ного водного раствора фенола при температуре 68-70°С, в результате экстракции водным фенолом ПКС образуется в резиноподобной форме, с трудом подвергающейся последующей очистке от примесей различной природы. В рамках данного изобретения более безопасным оказалось использование вместо горячего водного фенола буферированных растворов ионных детергентов. Для повышения эффективности экстракции использовали предварительную обработку бактериальной клеточной массы ультразвуком. Такая обработка позволяет существенно уменьшить размер экстрагируемых частиц ПКС, что приводит к существенному повышению эффективности процесса экстракции.
Ультразвуковую обработку водной суспензии биомассы можно проводить при температуре 10 - 50°С, мощности ультразвукового диспергатора 400 - 800 Вт, в течение 30 - 90 мин, предпочтительно при температуре 30 - 40°С, мощности ультразвукового диспергатора 500 - 600 Вт, в течение 40 - 60 мин. Оптимизацию процесса ультразвуковой обработки можно проводить с помощью определения размера частиц методами световой микроскопии и динамического светорассеяния.
В рамках данного способа для получения ПКС экстракцию обработанной ультразвуком биомассы с целью удаления примесей ЛПС, белков и нуклеиновых кислот можно проводить с использованием ионных детергентов(, предпочтительно с использованием 0,1-1% раствора дезоксихолатом натрия в буфере с молярностью 0,2 - 2,0, лучше 0,5 - 1,0 М и рН 8,0 - 9,0, при температуре 40 - 90°С, лучше при температуре 40 - 60°С, в течение 0,5 - 2 часа. В другом варианте в качестве ионных детергенов могут быть использованы децилсульфат натрия, додецилсульфат натрия или N-лаурилсаркозинат.
В некоторых вариантах изобретения, полученную таким образом суспензию далее подвергают концентрированию с помощью центрифугирования, предпочтительно, проточного центрифугирования (центрифуга HSTC GQ75, 12000 об/мин). Концентрированную суспензию ПКС вновь подвергают экстракции в описанных выше условиях. Для повышения степени очистки ПКС экстракцию биомассы предпочтительно проводят 2 - 3 раза.
В некоторых вариантах изобретения, выделение и очистку ПКС от примесей бактериальной природы и от компонентов экстракционного буфера, в частности, дезоксихолата натрия, проводят с помощью центрифугирования, предпочтительно, проточного центрифугирования, промыванием суспензии ПКС буфером, не содержащим детергент, а затем водой. При необходимости водная суспензия ПКС может быть лиофилизована или высушена ацетоном и далее эфиром.
В некоторых вариантах изобретения, для повышения выхода ФКМ в процессе последующей ферментативной обработки лизоцимом порошок ПКС подвергают измельчению с помощью планетарной шаровой мельницы (RETSCH PM 200) в сухом виде или в виде суспензии в воде или преимущественно в буфере, который используется для последующей обработки лизоцимом. Эффективность измельчения ПКС контролируют определением размера частиц с помощью методов световой микроскопии и динамического светорассеяния.
В некоторых вариантах изобретения, для получения ФКМ суспензию ПКС в буферном водном растворе подвергают ферментативному гидролизу с применением эндо-N-ацетилмурамидаз, предпочтительно лизоцима. Применение лизоцима обусловлено избирательностью расщепления гликозидных связей остатков мурамовой кислоты в полисахаридной части ПКС в сочетании с относительно низкой стоимостью, высокой эффективностью в широком диапазоне значений pH.
С целью поиска условий проведения ферментативного гидролиза ПКС, позволяющих повысить выход мурамилпептидов, было проведено исследование влияния температуры и времени реакции на количественный и качественный состав продуктов расщепления с помощью высоко эффективной жидкостной хроматографии (колонка G2000PW, элюент 0,05М NaOAc). Оказалось, что в отличие от стандартного интервала проведения реакции (10 - 40°С) , при температурах от 40 до 60°С наряду с обычно наблюдающимися низко молекулярными мурамилпептидами (пики III и IV) в заметных количествах образуются также их более высокомолекулярные гомологи (пики I и II), и именно эта композиция далее обозначена как ФКМ. В процессе оптимизации установлено, что проведение процесса при 45 - 55°С, предпочтительно при 50°С в течение 15 - 60 мин, предпочтительно в течение 30 мин, обеспечивает максимальный выход ФКМ. Типичная картина разделения ФКМ с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на колонке G2000SW приведена на Фиг. 1.
Сравнительный ВЭЖХ анализ ФКМ и препарата Полимурамил (ПМ) показал, что вещества пиков III и IV представляют собой Полимурамил (Фиг. 2).
В некоторых вариантах изобретения, при проведении ферментативного гидролиза в качестве растворителя используют лиофилизующийся буферный водный раствор с рН 4,5-7,0, предпочтительно 4,5-5,0, (например, пиридин-ацетатный буфер).
В некоторых вариантах изобретения, после обработки лизоцимом не подвергшуюся деградации, нерастворимую фракцию ПКС удаляют с помощью центрифугирования (9000 об/мин, 30 мин) и полученный супернатант подвергают ультрафильтрации, предпочтительно тангенциальной ультрафильтрации, с использованием мембраны с размером отсечки 10 кДа для удаления полимерных фрагментов ПКС и лизоцима. Фильтрат, содержащий ФКМ, далее лиофилизуют, для удаления следовых количеств компонентов буфера продукт подвергают повторной лиофилизации.
Структура всех компонентов ФКМ была подтверждена данными электроспрей масс-спектрометрии и спектроскопии 13С-ЯМР. Для этого образец ФКМ был подвергнут препаративной гель-хроматографии c помощью последовательно соединенных колонок (0,9х60 см), наполненных гелем Toyopearl TSK40(SF) и TSK50(SF). Элюция проводилась 0,05 М аммоний-бикарбонатным буфером, детектирование - с помощью проточного УФ-детектора, длина волны 220 нм. Картины препаративного и аналитического разделения (Фиг. 1) практически совпали.
В результате препаративного разделения было получено 4 фракции (см. Фиг. 3), каждая из которых была подвергнута лиофилизации. Данные о составе каждой фракции и молекулярной массе компонентов приведены в Таблице 1.
Таблица 1. Молекулярные массы компонентов ФКМ.
| № фракции | Фракции | Молекулярные массы компонентов |
| I | F, G, Н | 3557,6*, 3699,6*, 3628,6* |
| II | D и E | 2779,2 и 2708,2 |
| III | С | 1858,8 |
| IV | А и В | 867,4 и 938,4 |
*значение вычислено, исходя из m/z соответствующих многозарядных ионов
Из полученных данных следовало, что в состав ФКМ входят гомологичные мурамилпептиды, отличающиеся лишь числом мономерных звеньев А и В.
Аналогичный вывод следовал из данных сравнительного анализа 13С1Н-ЯМР спектров ФКМ (Фиг. 4) и пяти выделенных фракций, т.к. все спектры содержали практически одинаковый набор сигналов (Фиг. 4). Почти полное совпадение сигналов было также установлено при сопоставлении 13С-ЯМР спектров ФКМ и субстанции препарата Полимурамил (Фиг. 5), компоненты которого мурамилпептиды А, В и В 2 входят в состав ФКМ.
Специалисту известно, что относительное содержание отдельных олигомерных компонентов (таких как ВС, AC, BCB, АСА, АСВ) в составе композиции можно изменять в процессе получения композиции при помощи хроматографического разделения получаемой смеси и последующего отделения фракций, содержащих различные олигомерные компоненты (см. Фиг. 3). Можно применять различные известные методы разделения компонентов. В частности, может быть использована колоночная препаративная гель-проникающая хроматография низкого давления с использованием Сефадексов, TSK-гелей или Bio-гелей и ионно-обменная хроматография с использованием как анионо- так и катионообменных гелей, а также препаративная высокоэффективная жидкостная хроматография. В качестве альтернативы может быть использован метод последовательной ультрафильтрации с использованием мембран с пределом отсечения 1, 3 и 5 кДа (Millipore).
Такие композиции с изменённым относительным содержанием отдельных олигомерных компонентов (ВС, AC, BCB, АСА, АСВ) обозначены в настоящем описании как композиции, подобные ФКМ. Относительное содержание каждого из отдельных олигомерных компонентов в составе композиций, подобных ФКМ, может меняться в широких пределах от 0 до 99%.
Биологическая активность композиций, подобных ФКМ, определялась в иммунологических исследованиях, после подтверждения его безопасности при применении (контроль токсичности и пирогенности).
Таким образом, предлагается композиция фрагментов ПКС с выраженной иммуностимулирующей активностью, включающая вместо низкомолекулярных мурамилпептидов их более высокомолекулярные аналоги. В рамках проведенного исследования было показано, что все компоненты фармакологически приемлемой смеси веществ обладают сходным уровнем иммунологической активности. Результаты химического и физико-химического исследования показали, что фармакологически приемлемая смесь веществ содержит минимальные количества примесей и что, следовательно, предлагаемая технологическая схема позволяет удалить из целевого продукта практически все компоненты, наличие которых могло бы придать фармакологически приемлемой смеси веществ нежелательные свойства.
Предложенный способ выделения ФКМ отличается повышенным уровнем безопасности проведения экстракции за счет замены концентрированного водного фенола на буфера, содержащие ионные детергенты, а также повышением выхода мурамилпептидных компонентов за счет уменьшения размера частиц бактериальной массы перед экстракцией с помощью ультразвуковой обработки, а также за счет измельчения частиц ПКС механическим способом перед обработкой лизоцимом.
Предложенный способ может быть реализован в крупномасштабном производстве, т.к. каждая стадия, описанная ниже в приведенных примерах, является адекватной промышленной моделью.
Настоящее изобретение относится к применению композиций, подобных ФКМ, для лечения и профилактики заболеваний, при которых необходимо стимулирование иммунной системы. Список этих заболеваний определен, исходя из установленных авторами видов активности ФКМ. По данным этих исследований ФКМ обладает следующими видами активности: 1) индуцирует выработку активационных цитокинов (интерлейкин [ИЛ]-1β, ИЛ-6, ИЛ-17, ИФН-γ, ФНО-α) и воспалительных хемокинов (IP-10, ИЛ-8, MIP-1α, MIP-1β, RANTES) клетками врожденной иммунной системы, что ведет к быстрому повышению противоинфекционной резистентности организма; 2) усиливает способность лейкоцитов крови убивать бактерии; 3) усиливает выработку естественных антител к общим антигенным детерминантам бактерий; 4) защищает экспериментальных животных от летальных инфекций, вызванных грамположительными и грамотрицательными бактериями; 5) индуцирует выработку миелопоэтинов и усиливает миелопоэз; 6) индуцирует выработку хемокинов, являющихся естественными антагонистами вируса иммунодефицита человека; 7) повышает функциональную активность NK-клеток, играющих одну из ключевых ролей в защите организма от вирусных инфекций и злокачественных новообразований; 8) замедляет рост перевиваемых злокачественных опухолей у экспериментальных животных. При этом ФКМ не обладает пирогенным и другими серьезными побочными эффектами при парентеральном введении человеку в дозе до 10 мкг/кг/сут.
Композиции, подобные ФКМ, являясь смесью амфотерных соединений, могут применяться в нейтральной, анионной и катионной формах. В анионной форме все или часть протонов в концевых карбоксильных группах замещены другими катионами, в качестве которых могут быть использованы, например, катионы натрия, калия, аммония, триэтиламмония. В катионной форме все или часть свободных аминогрупп переведены в аммонийную форму, а в качестве противоиона могут быть использованы, например, хлорид-, сульфат- или ацетат-анионы.
Уникальные свойства полученных композиций обеспечивают предоставление новых лекарственных средств - иммуностимуляторов, которые, исходя из их эффективности, обеспечивают усиление гуморального иммунного ответа, определяемого по количеству антителопродуцирующих клеток (АОК) и по уровню специфических антител, а также способность стимулировать факторы врожденного иммунитета (неспецифической резистентности), что определяется по защите экспериментальных животных, стимулированных исследуемым веществом, от смертельной инфекции, вызванной патогенными бактериями.
Ранее было установлено, что мурамилпетидные препараты, к числу которых относится и ФКМ, способны проникать через эпителиальные барьеры в кровоток [Андронова Т.М., Пинегин Б.В. Ликопид (ГМДП) - современный отечественный высокоэффективный иммуномодулятор. Россия, 2005]. Этим обусловлена возможность выпуска композиций, подобных ФКМ в виде фармацевтических композиций для трансмукозального и чрескожного применения. Так, композиции, подобные ФКМ, могут выпускаться в виде фармацевтических композиций для перорального и орального применения, в частности, в виде таблеток, капсул, растворов для перорального приема, пастилок и трансбуккальных форм. Капсулы могут содержать смеси композиций, подобных ФКМ, с инертными наполнителями и/или разбавителями, такими как фармацевтически приемлемые крахмалы, сахара, синтетические подслащивающие агенты, порошкообразные целлюлозы, различные типы муки, желатины, камеди. Пригодные таблетированные препараты могут быть изготовлены общепринятыми способами прессования, мокрой грануляции или сухой грануляции с применением фармацевтически приемлемых эксципиентов, разбавителей, связующих, лубрикантов, дезинтегрантов, модификаторов поверхности (включая поверхностно-активные вещества), суспендирующих или стабилизирующих агентов. Пероральный препарат может состоять также из активного ингредиента, который вводят в воде или фруктовом соке, содержащем, если нужно, подходящие растворители или эмульгаторы. Фасовка препарата может варьировать от 0,01 до 20 мг на таблетку или капсулу или от 0,01 до 20 мг на 1 мл раствора.
ФКМ может выпускаться в виде раствора для интраназального применения с концентрацией активного вещества от 0,01 до 20 мг/мл в сочетании с фармакологически приемлемыми добавками.
Фармацевтические композиции, подобные ФКМ, для наружного применения включают в себя мази, кремы и гели, содержащие ФКМ в концентрации от 0,01 до 20 мг/мл, необязательно в сочетании с традиционными веществами, улучшающими проникновение препарата через кожный барьер (пенетраторами).
Еще одной формой выпуска композиций, подобных ФКМ, могут быть суппозитории для ректального или вагинального применения, содержащие композицию в дозе от 0,01 до 20 мг на суппозиторий, в сочетании с фармакологически приемлемыми добавками. Состав композиций-носителей для суппозиториев известен из уровня техники.
Еще одним вариантом фармацевтической композиции может являться готовый стерильный раствор для парентерального введения. Концентрация ФКМ в указанном растворе может варьировать от 0,01 до 20 мг/мл. Раствор необязательно может содержать фармакологически приемлемые эксципиенты, в том числе вещества, повышающие стабильность препарата, регуляторы pH, регуляторы тоничности. Раствор фасуется в стерильные ампулы или готовые к употреблению инъекторы, содержащие ФКМ в количестве от 0,01 до 20 мг на ампулу/инъектор. Инъекторы для парентерального введения описаны в уровне техники и поставляются на рынок различными фирмами. Эти инъекторы снаряжаются раствором для введения, проходят при необходимости стерилизацию и упаковываются в коробки, контейнеры и т.п. Достоинство инъектора состоит в том, что он представляет собой готовое для применения устройство, использовать которое может даже неподготовленный человек.
Готовые формы препаратов и композиций на основе ФКМ упаковываются в коробки, пакеты, тубы, флаконы и т.п. в зависимости от традиций и потребностей рынка.
Например, таблетки могут быть упакованы в блистер из расчета на одну или несколько курсовых доз. Блистер может содержать напечатанную на нем инструкцию по применению и быть упакованным в контейнер или коробку, в которую отдельно вложена инструкция по применению.
Различные варианты упаковок известны из уровня техники и не требуют дополнительного описания.
Назначение композиций, подобных ФКМ, а также контроль состояния больного в ходе лечения осуществляются лечащим врачом. Исходя из открытого авторами механизма действия препарата, композиции, подобные ФКМ, могут быть показаны при перечисленных ниже группах заболеваний.
I. Лечение и профилактика заболеваний, вызванных бактериями:
1) лечение острых и хронических заболеваний кожи, мягких тканей, дыхательных путей и легких, желудочно-кишечного тракта, почек, мочевыводящих путей, женских половых органов и предстательной железы, вызванных бактериями;
2) профилактика и лечение гнойных осложнений хирургических операций;
3) профилактика заразных инфекционных заболеваний, вызванных патогенными бактериями и проявляющихся в виде эпидемий.
Применение композиций, подобных ФКМ, для лечения и профилактики заболеваний бактериального генеза обосновано следующими видами их активности: 1) усиление способности фагоцитов убивать бактерии; 2) индукция выработки цитокинов (ИЛ-1β, ИЛ-6, ИЛ-17, ИФН-γ, ФНО-α) и хемокинов (IP-10, ИЛ-8, MIP-1α, MIP-1β, RANTES), необходимых для развития оптимального врожденного иммунного ответа против бактерий; 3) индукция выработки антимикробных пептидов - дефензинов; 4) усиление выработки естественных антител к общим антигенным детерминантам бактерий; 5) индукция выработки миелопоэтинов (Г-КСФ, ГМ-КСФ) и усиление выхода миелоидных клеток (моноцитов, гранулоцитов) из костного мозга; 6) защита экспериментальных животных от инфекции летальными дозами патогенных грамположительных и грамотрицательных бактерий. Как будет продемонстрировано в Примерах, эффект ФКМ развивается быстро, появляясь уже на 1-е - 3-и сутки ежедневного введения, что важно при использовании препарата в профилактических целях в группах риска.
II. Лечение заболеваний кожи, мягких тканей, дыхательных путей и легких, желудочно-кишечного тракта, почек, мочевыводящих путей и женских половых органов, вызванных патогенными и условно патогенными грибами.
Применение композиций, подобных ФКМ, для лечения и профилактики заболеваний грибкового генеза обосновано следующими видами его активности: 1) индукция выработки цитокинов (ИЛ-1β, ИЛ-6, ИЛ-17) и хемокинов (ИЛ-8), необходимых для развития оптимального врожденного иммунного ответа против грибов; 2) индукция выработки антимикробных пептидов - дефензинов; 3) индукция выработки миелопоэтинов (Г-КСФ, ГМ-КСФ) и усиление выхода миелоидных клеток (моноцитов, гранулоцитов) из костного мозга.
III. Профилактика и лечение заболеваний, вызванных вирусами:
профилактика и лечение ВИЧ-инфекции;
лечение хронической рецидивирующей герпес-вирусной инфекции (ХРГВИ), вызванной вирусом простого герпеса 1 и 2 типов (ВПГ-1 и -2).
Применение композиций, подобных ФКМ, при инфекциях указанными вирусами обусловлено способностью препарата повышать активность NK-клеток, являющихся одним из ключевых эффекторов противовирусного иммунитета, индуцировать выработку хемокина IP-10, который является хемоаттрактантом для естественных интерферонпродуцирующих клеток - важнейших эффекторов противовирусного иммунитета, а также индуцировать выработку дефензинов - антимикробных пептидов, способных ингибировать проникновение ВПГ и ВИЧ в клетки-мишени и/или внутриклеточную репликацию этих вирусов [Mackewicz C et al. alpha-Defensins can have anti-HIV activity but are not CD8 cell anti-HIV factors. AIDS 2003; 17: F23-32. Hazrati E et al. Human α- and β-defensins block multiple steps in herpes simplex virus infection. J Immunol 2006; 177: 8658-66]. Кроме того, ФКМ индуцирует секрецию хемокинов RANTES, MIP-1α и MIP-1β, которые блокируют клеточные корецепторы для ВИЧ и препятствуют проникновению ВИЧ в клетки.
IV. Адъювантная иммунотерапия солидных злокачественных новообразований различной локализации. Применение композиций, подобных ФКМ, для лечения злокачественных образований обусловлено следующими видами активности: 1) подавление роста солидных злокачественных опухолей у экспериментальных животных; 2) индукция выработки цитокинов, участвующих в отторжении опухоли, в частности ФНО-α; 3) повышение активности NK-клеток.
V. Лечение состояний, сопровождающихся подавлением миелопоэза (острая и хроническая лучевая болезнь, отравления миелотоксическими субстанциями, состояния при или после лучевой терапии или химиотерапии злокачественных новообразований). Применение ФКМ при данной группе заболеваний обусловлено способностью препарата вызывать выработку колониестимулирующих факторов (Г-КСФ, ГМ-КСФ), необходимых для дифференцировки клеток миелоидного ряда в костном мозге, что ведет к повышению уровней нейтрофилов и моноцитов в кровотоке.
Однако приведенный перечень заболеваний не носит ограничительного характера. Выбор конкретных состояний, при которых требуется назначение композиций, подобных ФКМ, находится в пределах компетенции специалиста, исходя из выявленной и описанной биологической активности указанных композиций.
Предпочтительным способом применения композиций, подобных ФКМ, при большинстве нозологических форм является парентеральный. Как правило, ФКМ вводят внутримышечно, однако в зависимости от нозологической формы, тяжести состояния больного и прочих факторов возможно внутрикожное, подкожное и внутривенное введение препарата. Дозировка может варьировать в пределах приблизительно от 0,1 до 100 мкг/кг/сут в зависимости от состояния пациента и индивидуальной переносимости ФКМ.
В некоторых случаях, например для лечения воспалительно-инфекционных заболеваний и злокачественных новообразований желудочно-кишечного тракта, ФКМ может применяться в виде таблеток, капсул или растворов для перорального применения. Дозировка препарата при пероральном приеме составляет, как правило, от 0,1 до 300 мкг/кг/сут в зависимости от состояния пациента и индивидуальной переносимости ФКМ.
Для лечения заболеваний прямой кишки, простаты и женских половых органов, а также для профилактики заражения ВИЧ ФКМ может применяться в виде ректальных и вагинальных суппозиториев.
Для лечения заболеваний кожи ФКМ может применяться наружно в виде кремов и мазей.
Для лечения заболеваний верхних дыхательных путей ФКМ может применяться в виде капель для интраназального применения.
При назначении композиций, подобных ФКМ, придерживаются традиционной тактики выбора доз. Факторами, влияющими на выбор параметров лечения, являются вид и тяжесть основного заболевания, индивидуальная восприимчивость к действию указанных композиций, наличие сопутствующих заболеваний. Длительность применения препарата в лечебных целях составляет, как правило, 5-7 суток, однако в зависимости от нозологической формы, состояния и реактивности больного может варьировать от 1 до 30 суток.
ПРИМЕРЫ
Нижеследующие примеры приведены в целях раскрытия характеристик настоящего изобретения и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения.
Пример I. Получение композиций, подобных ФКМ.
50 г высушенных ацетоном бактериальных клеток S.typhi суспензировали при интенсивном перемешивании в 500 мл дистилированной воды. Полученную суспензию в течение 60 мин подвергали ультразвуковой обработке с помощью лабораторного ультразвукового диспергатора ЛУЗД-1,5-1П (мощность 500 Вт, температура 10°С). К полученной суспензии прибавили 500 мл воды, а затем ДОХ до концентрации 0,5%, хлористый натрий до концентрации 0,2 М, трисгидроксиметиламинометан до концентрации 0,05 М, динатриевую соль этилендиаминтетрауксусной кислоты до концентрации 0,01 М и азид натрия до концентрации 0,01% и довели рН до значения 8,3. Суспензию перемешивали 1 час при температуре 60°С, центрифугировали (8000 об/мин, 30 мин, 14°С), полученный осадок ПКС вновь экстрагировали в описанных выше условиях буфером, содержащим ДОХ (1000 мл), осадок, полученный после центрифугирования 3 - 4 раза промывали 1000 мл описанным выше буфером, не содержащего ДОХ, центрифугировали, описанную процедуру повторяли еще 4 раза и далее осадок отмывали от компонентов буфера водой до отсутствия в супернатанте Cl-иона. Полученный осадок очищенного ПКС суспезировали в 1000 мл пиридин-ацетатного буфера (рН 5,2) и подвергали измельчению с помощью планетарной шаровой мельницы (RETSCH PM 200) в течение 30 мин при комнатной температуре. Измельченную массу извлекали, стаканы мельницы промывали пиридин-ацетатным буфером, доводили до общего объема 1200 мл, после прибавления 50 мг лизоцима полученную суспензию разделяли на три части по 400 мл и перемешивали при 50°С в течение 15, 30 и 45 мин, нерастворимые фракции ПКС удаляли с помощью центрифугирования (9000 об/мин, 30 мин) и полученные супернатанты подвергали тангенциальной ультрафильтрации с использованием мембран с размером отсечки 10 кДа для удаления полимерных фрагментов ПКС, фильтраты далее лиофилизовали, После обработки лизоцимом в течение 15, 30 и 45 минут получены препараты ФКМ с выходом 150, 730 и 860 мг, соответственно. Анализ полученных препаратов проводили с помощью ВЭЖХ на приборе Beckman Coulter с использованием колонки G2000SW при элюции 0,05 М натрий-ацетатным буфером рН 8,0 со скоростью 1,0 мл/мин. Детектирование проводилось с помощью УФ-детектора при длине волны 220 нм. Анализ препаратов 1 - 3 показал, что картины ВЭЖХ препаратов 1 и 2, полученных при обработке лизоцимом в течение 15 и 30 минут практически совпадает (Фиг. 6), причем по данным интегрирования аналитических хроматограмм препаратов 1 и 2, содержание примеси ПМ в них составляло 5,0 - 7,5%, тогда как выход препарата 3 при более длительной обработке лизоцимом существенно выше, но по данным интегрирования аналитической хроматограммы, содержание примеси ПМ в препарате 3 составило 48,7 %.
Увеличение продолжительности ферментативной реакции приводит к некоторому повышению выхода мурамилпептидных олигомеров, но при этом растет количество низкомолекулярных мурамилпептидов (ПМ), см. Фиг.7.
Пример 2. ФКМ индуцирует выработку широкого спектра активационных цитокинов и хемокинов дендритными клетками (ДК) и макрофагами (МФ) человека in vitro.
В патенте RU 2441906 была раскрыта способность субстанции Полимурамил (ПМ) вызывать выработку дендритными клетками и макрофагами набора цитокинов и хемокинов, передающих активационный сигнал на разные звенья иммунной системы. В данном примере мы сравнивали ПМ (содержание примеси высокомолекулярных мурамилпептидов 4,0%) и ФКМ (содержание примеси низкомолекулярных мурамилпептидов 4,8%) по способности индуцировать синтез цитокинов и хемокинов. ДК и МФ получали из МНКК здоровых доноров in vitro, используя общепринятую методику [Sallusto F, Lanzavecchia A. Efficient presentation of soluble antigen by cultured human dendritic cells is maintained by granulocyte/macrophage colony-stimulating factor plus interleukin 4 and downregulated by tumor necrosis factor alpha. J Exp Med 1994; 179: 1109-18]. ДК и МФ культивировали в течение 24 ч без добавления в среду ПМ и ФКМ или с добавлением ПМ и ФКМ в концентрации 10 мкг/мл, после чего собирали супернатанты и анализировали в них уровни цитокинов методом мультиплексного анализа (Табл. 2).
Таблица 2. Уровни цитокинов и хемокинов (пг/мл) в супернатантах ДК и МФ после 24 часов инкубирования с ПМ/ФКМ (М±σ, n=4)
| ДК | МФ | |||
| ПМ/ФКМ, мкг/мл | 0/0 | 10/10 | 0/0 | 10/10 |
| Цитокины | ||||
| Интерлейкин-1β | 12±7 | 20±2/22±2 | 42±38 | 113±110*/135±111* |
| Интерлейкин-6 | 10±6 | 59±23*/83±21* | 675±306 | 4537±1103*/5376±1013* |
| Интерлейкин-17 | 11±8 | 34±9*/42±11* | 38±21 | 74±28*/110±49* |
| Интерферон-γ | 6±5 | 64±29*/67±41* | 221±127 | 805±228*/953±321* |
| ФНО-α | 91±51 | 247±132*/287±134* | 531±223 | 20351±8987*/22539±9547* |
| Интерферон-α | 7±2 | 6±1/75±19 | 5±4 | 6±4/68±41 |
| Хемокины | ||||
| Интерлейкин-8 | 1142±621 | 12637±6723*/14865±6836* | 24312±9043 | 28523±5034*/31593±5672* |
| IP-10 | 53±32 | 468±283*/582±256* | 4942±2705 | 6581±5692*/8201±6523* |
*p<0,05 по сравнению с культивированием тех же клеток в отсутствии ПМ/ФКМ (парный t-тест)
Данные в Табл. 2 показывают, что уже в первые 24 ч контакта с клетками иммунной системы и ПМ, и ФКМ индуцируют выработку набора цитокинов и хемокинов дендритными клетками и/или макрофагами. Указанные цитокины необходимы для успешного ответа иммунной системы на бактериальные, грибковые и некоторые вирусные инфекции.
ФКМ активнее, чем ПМ индуцировал выработку всего набора исследованных цитокинов и хемокинов, в том числе и выработку интерферона-α, уровень которого не повышался при культивировании ДК и МФ в среде с добавлением ПМ. В этой связи можно предположить, что ФКМ будет эффективен и при лечении/профилактике вирусных инфекций.
Пример 3. Сравнение индукции выработки ФНО-α дендритными клетками и макрофагами при их культивировании с ФКМ и ПМ.
В эксперименте исследовали интенсивность индукции выработки ФНО-α дендритными клетками и макрофагами в присутствии смесей ФКМ : ПМ различного состава. ФКМ была получена, как описано в Примере 1, и по данным интегрирования аналитической хроматограммы, аналогичной Фиг. 1, содержала 7,3 % примеси ПМ. ПМ был получен, как описано в патенте RU 2478644, и по данным интегрирования аналитической хроматограммы, аналогичной Фиг. 2, содержал около 3,3 % примеси высокомолекулярных мурамилпептидов. Выделение ДК и МФ из МНК здоровых доноров и их последующее культивирование с ФКМ и ПМ проводили так, как описано в Примере 2. Результаты эксперимента представлены в Табл. 3.
Таблица 3. Уровни ФНО-α (пг/мл) в супернатантах ДК и МФ после 24 часов инкубирования в присутствии смесей ФКМ : ПМ (М±σ, n=4) при общей концентрации мурамилпептидов 10 мкг/мл.
| ФКМ:ПМ | ДК | МФ |
| 100:0 | 387±134* | 32539±9547* |
| 75:25 | 358±133* | 28735±9326* |
| 50:50 | 324±125* | 26359±9127* |
| 25:75 | 283±128* | 24647±8547* |
| 0:100 | 247±132* | 20351±8987* |
*p<0,05 по сравнению с культивированием тех же клеток в отсутствии ПМ/ФКМ (парный t-тест)
Пример 4. ФКМ стимулирует миелопоэз
Способностью к поглощению и внутриклеточному киллингу микробов обладают в основном нейтрофилы, моноциты и макрофаги. В частности, падение уровней нейтрофилов в крови ниже 1000/мм3 (нейтропения) резко усиливает риск локальных и системных бактериальных и грибковых инфекций, который тем выше, чем выраженнее и длительнее нейтропения. В отсутствие лечения такое состояние ведет к гибели больного. Причинами нейтропении являются лучевая болезнь, отравления миелотоксическими субстанциями, а также проведенная лучевая или химиотерапия злокачественных новообразований. Для лечения нейтропении относительно успешно применяют ростовые факторы, необходимые для дифференцировки миелоцитов в костном мозге: гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (ГМ-КСФ, молграстим) и гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (Г-КСФ, филграстим). Оба препарата являются крайне дорогостоящими, т.к. их получение основано на рекомбинантной технологии. Индукция тех же факторов in vivo представляется адекватной и менее дорогостоящей заменой рекомбинантных белков.
В эксперименте использовали образцы ФКМ с содержанием примеси низкомолекулярных мурамилпептидов 2,4 % и ПМ с содержанием примеси высокомолекулярных мурамилпептидов 2,8%.
Мы установили, что ФКМ так же, как и ПМ вызывает значимую выработку Г-КСФ и ГМ-КСФ ДК и МФ in vitro (таблица 3). Опыты проводили, как в Примере 2. Результаты представлены в Табл. 4.
Таблица 4. Уровни Г-КСФ и ГМ-КСФ (пг/мл) в супернатантах ДК и МФ через 24 часа культивирования в присутствии ПМ/ФКМ (М±σ, n=4).
| ДК | МФ | |||
| ПМ/ФКМ, мкг/мл | 0/0 | 10/10 | 0/0 | 10/10 |
| Г-КСФ | 11±3/10±4 | 326±98/576±113 | 71±32/85±44 | 3286±2745/5127±3142 |
| ГМ-КСФ | 13±5/18±5 | 136±29/221±73 | 23±9/28±7 | 1845±841/2741±959 |
* p<0,05 по сравнению с инкубацией в отсутствие ПМ и ФКМ (t-тест)
Пример 5. ФКМ повышает резистентность мышей к летальной инфекции грамположительными и грамотрицательными бактериями.
Интегральным показателем иммуностимулирующей активности вещества является его способность повышать резистентность макроорганизма к летальным инфекциям, вызванным различными типами патогенных микроорганизмов. Повышение резистентности к инфекции может быть обусловлено несколькими механизмами, в том числе описанными в Примерах 1-4. Бактериальные иммуностимуляторы, такие как в данном изобретении, воздействуют в основном на врожденный компонент иммунной системы и потому вызывают немедленную, относительно неизбирательную, но преходящую резистентность к патогенным микроорганизмам.
В данном примере изучение влияния ФКМ на неспецифическую резистентность и сравнение с влиянием ПМ на этот показатель иммуностимулирующей активности проводили на беспородных мышах массой 12-14 г (препарат ФКМ содержал 3,5% примеси низкомолекулярных мурамилпептидов, примесь высокомолекулярных мурамилпептидов в препарате ПМ составляла 4,2%) . Группам из 10 мышей вводили ФКМ/ПМ однократно, подкожно, в дозах 100, 10 и 1 мкг/мышь. Контрольной группе вводили стерильный физиологический раствор. Через 24 ч после инъекции мышей заражали внутрибрюшинно 1 DCL (абсолютно смертельной дозой) Salmonella typhimurium (штамм 415) или Staphylococcus aureus (штамм Wood 46). Данные микроорганизмы являются типичными представителями соответственно грамотрицательных и грамположительных патогенных бактерий и традиционно используются в такого рода опытах.
Из Таблицы 5 видно, что ФКМ так же, как и ПМ в дозе 100 мкг/мышь повышает устойчивость мышей к инфекциям, вызванным S. typhimurium и St. aureus, защищая от гибели на 70% и 60% соответственно (защита с помощью ПМ в опыте составила 60% и 50%). Меньшие дозы оказывают более слабый протективный эффект, но выживаемость в группах, получивших ФКМ, была выше, чем в группах, получивших ПМ. Таким образом, ФКМ обладает выраженной способностью защищать экспериментальных животных от смертельной инфекции, вызванной грамотрицательными и грамположительными бактериями.
Таблица 5. Влияние ФКМ и ПМ на выживаемость мышей после инфицирования летальными дозами патогенных бактерий.
| препарат | Доза (мкг/мышь) | Бактерии | Гибель мышей (сутки) | Выжило, % | |||
| 1-е | 2-е | 3-и | 4-е | ||||
| ПМ | 100 | S. typhimurium |
0 | 0 | 3 | 1 | 60 |
| 10 | 0 | 5 | 2 | 2 | 10 | ||
| 1 | 0 | 8 | 1 | 1 | 0 | ||
| физ. р-р | - | 1 | 9 | 0 | 0 | 0 | |
| ПМ | 100 | St. aureus |
3 | 2 | 0 | 0 | 50 |
| 10 | 5 | 2 | 1 | 2 | 0 | ||
| 1 | 5 | 4 | 1 | 0 | 0 | ||
| физ. р-р | - | 8 | 1 | 0 | 1 | 0 | |
| ФКМ | 100 | S. typhimurium |
0 | 0 | 2 | 1 | 70 |
| 10 | 0 | 4 | 2 | 1 | 30 | ||
| 1 | 0 | 6 | 1 | 1 | 20 | ||
| физ. р-р | - | 0 | 8 | 1 | 1 | 0 | |
| ФКМ | 100 | St. aureus | 3 | 1 | 0 | 0 | 60 |
| 10 | 5 | 2 | 0 | 0 | 30 | ||
| 1 | 5 | 2 | 2 | 0 | 10 | ||
| физ. р-р | - | 8 | 1 | 1 | 0 | 0 |
Пример 6. ФКМ эффективна в терапии подрывного фолликулита на мышах.
Было изучено действие ФКМ (содержание примеси низкомолекулярных мурамилпептидов 8,7%) при инфекции, вызванной S. aureus. Мышам линии BALB/c в области спины выбривали участок кожи 1,5×1,5 см, вносили суспензию штамма-возбудителя подкожно в объеме 200 мкл. Терапию проводили, нанося на выбритый участок крем, содержащий ФКМ в различных концентрациях.
Для приготовления инокулята колонии бактерий второго пассажа суспендировали в стерильном изотоническом растворе до плотности 5.6 по стандарту мутности МакФарланда. Культуру готовили непосредственно перед процедурой заражения. Для контроля жизнеспособности бактерий из рабочего разведения осуществляли высев 0.1мл на чашку с питательной средой перед началом процедуры заражения. Методом высева из серийных разведений опытным путем установлено, что взвесь бактерий S.aureus с оптической плотностью 5.6 содержит около 20 млрд КОЕ/мл.
Результаты оценивали в течение 21 суток по эффекту ФКМ на развитие воспалительного процесса в коже (оценка размера абсцесса, исхода локального воспаления, восстановления волосяного покрова). Результаты представлены в Табл. 6.
Эксперимент показал наибольшую эффективность терапии кремом с содержанием ФКМ 5,0%.
Таблица 6. Влияние терапии кремом с ФКМ на заживление фолликул и восстановление волосяного покрова.
Экспериментально было показано, что при использовании крема с ФКМ абсцесс развивался относительно небольшого размера и намного быстрее рассасывался относительно аналогичных показателей в группах сравнения. При этом полное восстановление волосяного покрова наблюдалось более чем у 67% лабораторных животных (в группах с использованием крема с препаратом ФКМ 1 % и 5%). В группах контроля наблюдалось неполное восстановление, или волосной покров не восстанавливался - у 83%. Наибольшую активность относительно заживления фолликулов и восстановления волосяного покрова показала композиция крема и 5% ФКМ. Таким образом, в результате проведенных экспериментов на мышиной модели была показана высокая эффективность ФКМ при терапии гнойного процесса в мягких тканях.
1. Композиция для стимулирования иммунного ответа организма млекопитающего, образующаяся в результате ферментативного расщепления высокоочищенного пептидогликана клеточной стенки грамотрицательных бактерий, представляющего собой высокомолекулярный пространственный полимер, построенный из повторяющихся мурамилпептидных звеньев,
включающая эффективное количество смеси растворимых мурамилпептидных олигомеров ВСВ, АСА, АСВ и/или их фармацевтически приемлемых солей, в которых А, В и С соединены между собой при помощи β-гликозидной связи и представляют собой мурамилпептиды следующей структуры:
мурамилпептид А: β-N-ацетил-D-глюкозаминил-(1→4)-N-ацетил-D-мурамоил-L-аланил-D-изоглютаминил-мезо-диаминопимелиновой кислоты;
мурамилпептид В: β-N-ацетил-D-глюкозаминил-(1→4)-N-ацетил-D-мурамоил-L-аланил-D-изоглютаминил-мезо-диаминопимелоил-D-аланина;
мурамилпептид С: димер мурамилпептида В, где связь между двумя мурамилпептидами В осуществляется за счет карбоксильной группы терминального D-аланина одной молекулы В и ω-аминогруппы мезо-диаминопимелиновой кислоты другой молекулы В;
при этом остатки мурамилпептидов А, В и С внутри олигомеров могут быть соединены в любом порядке, образуя разные изомеры положения.
2. Композиция по п. 1, дополнительно включающая смесь растворимых мурамилпептидных олигомеров ВС и AC и/или их фармацевтически приемлемых солей, причем остатки мурамилпептидов А, В и С внутри олигомеров могут быть соединены в любом порядке, образуя разные изомеры положения.
3. Композиция по п. 1 или 2, дополнительно включающая растворимые мурамилпептиды А, В и С и/или их фармацевтически приемлемые соли, при этом суммарная массовая доля мурамилпептидов А, В и С и/или их фармацевтически приемлемых солей в композиции составляет не более 50%.
4. Композиция по п. 3, в которой суммарная массовая доля мурамилпептидов А, В и С в композиции составляет не более 10%.
5. Композиция по п. 4, включающая мурамилпептидные олигомеры ВСВ, АСА, АСВ, ВС и AC, а также мурамилпептиды А, В и С, причем суммарная массовая доля мурамилпептидов А, В и С в композиции составляет не более 10%.
6. Композиция по п. 1, дополнительно содержащая фармацевтически приемлемый носитель и/или эксципиент.
7. Способ получения композиции по любому из пп. 1-6 из пептидогликана клеточной стенки (ПКС) грамотрицательных бактерий, включающий следующие стадии:
- подготавливают полученную биомассу бактерий к разрушению при помощи обработки ультразвуковым диспергатором мощностью 400-800 Вт;
- подготовленную биомассу обрабатывают буфером, имеющим рН 8,0-9,0 и содержащим ионный детергент в концентрации 0,1-1%, при температуре 40-90°С, при этом ионный детергент представляет собой дезоксихолат натрия, децилсульфат натрия, додецилсульфат натрия или N-лаурилсаркозинат;
- очищают полученную биомассу от примесей и детергента;
- механически измельчают полученную биомассу;
- производят ферментативный гидролиз биомассы при помощи лизоцима при рН раствора 4,5-7,0 и температуре от 40 до 60°С;
- выделяют целевые продукты ферментативного гидролиза при помощи ультрафильтрации с размером отсечки полупроницаемых мембран до 10 кДа;
- при необходимости разделяют целевые продукты ферментативного гидролиза с отделением смеси, включающей по меньшей мере растворимые мурамилпептидные олигомеры ВСВ, АСА, АСВ и/или их фармацевтически приемлемые соли.
8. Способ по п. 7, в котором ферментативный гидролиз биомассы при помощи лизоцима проводят при температуре 45-55°С.
9. Способ по п. 7, в котором разделение целевых продуктов ферментативного гидролиза проводят при помощи гель-проникающей или ионообменной хроматографии низкого давления или с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии.
10. Способ по п. 7, в котором механическое измельчение полученной биомассы осуществляют при помощи механической мельницы
11. Способ по п. 7, дополнительно включающий стадию лиофилизации выделенных целевых продуктов ферментативного гидролиза.
