Выделение нового пестивируса, вызывающего врожденный тремор а
Настоящее изобретение относится к биотехнологии, а именно к новому пестивирусу. Предложены выделенный полинуклеотид для индукции иммунного ответа, композиция для вакцинации для защиты от заболевания, ассоциированного с пестивирусом, вектор на основе свиного пестивируса для доставки гетерологичной полинуклеотидной последовательности, химерный пестивирус для доставки чужеродного полипептида, применение композиции для вакцинации, способ обнаружения пестивируса, диагностическая тест-система для обнаружения пестивируса, способ приготовления вакцины. Изобретение позволяет получить иммуногенный пестивирус с хорошей репликацией вируса и высоким потенциалом для индукции иммунитета. 13 н. и 11 з.п. ф-лы, 11 ил., 2 пр.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Настоящее изобретение относится к новому пестивирусу, полезному в области ветеринарной вирусологии и вакцин. В частности, оно относится к выделенному полинуклеотиду, происходящему из пестивируса, к соответствующим вакцинам и их медицинскому применению, к химерному вирусу, содержащему соответствующий полинуклеотид, и к применению указанного вируса в качестве вирусного вектора для экспрессии гетерологичных полипептидов.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Пестивирусы представляют собой одноцепочечные РНК-вирусы, содержащие смысловую цепь. Геном пестивируса имеет длину от 11,5 до 12,5 т.п.н. и содержит одну большую открытую рамку считывания, которая фланкирована нетранслируемыми областями (NTR) на 5'- и 3'-концах генома. Полученный большой полипротеин ко- и пост-трансляционно процессируется в 12 зрелых вирусных белков: автопротеазу (Npro), капсидный белок (C), три оболочечных белка (Erns, E1, E2) и неструктурные белки (p7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B), которые являются консервативными среди пестивирусов в отношении локализации в геноме и каталитических остатков.
Род Pestivirus относится к семейству Flaviviridae и состоит из четырех видов, согласно классификации Международного комитета по таксономии вирусов. Классификация пестивирусов основана на нуклеотидной последовательности, диапазоне хозяев и серологических различиях. 5'NTR является областью, наиболее часто используемой для филогенетического анализа пестивирусов, но также были использованы более вариабельные гены (Npro или E2). Тем не менее, сравнение полных геномных последовательностей дает возможность наиболее точного филогенетического типирования. Помимо вируса вирусной диареи крупного рогатого скота-1 (BVDV-1) и вируса BVDV-2, вируса пограничной болезни (BDV) и вируса классической чумы свиней (CSFV), несколько неклассифицированных штаммов и/или предполагаемых видов представлены так называемыми атипичными штаммами пестивирусов.
Атипичные пестивирусы были выделены из экзотических видов отряда Artiodactyla, особенно из бычьих, овечьих и свиных хозяев. Недавние исследования выявили пестивирусные последовательности у крыс и летучих мышей, что предполагает более широкий спектр хозяев пестивирусов. Однако до сих пор все выделенные пестивирусы происходили от копытных.
Одна из самых опасных вирусных эпидемий у свиней, CSFV, была искоренена среди одомашненной популяции свиней в большинстве развитых стран еще несколько десятилетий назад. Обнаружены свиньи, инфицированные другими видами пестивирусов, например, выявлены определенные штаммы BDV и BVDV, что указывает на способность к адаптации. "Нетипичный" свиной пестивирус был обнаружен в 2003 году на коммерческой ферме по разведению свиней в Австралии, позже названной вирусом Bungowannah. Этот хорошо изученный вирус вызывал репродуктивные нарушения, мертворождение и внезапную смерть у поросят из-за миокардита. Значительное разнообразие последовательностей этого вируса привело к тому, что его обнаружение не удалось выполнить с помощью общепризнанных методов диагностики панпестивируса (ИФА, тесты перекрестной нейтрализации, ОТ-ПЦР). Документированная патогенность вируса Bungowannah встревожила свиноводческую отрасль из-за потенциального экономического воздействия.
Только две из пострадавших ферм в Австралии сообщили о гибели около 50 000 животных. Вирус Bungowannah по-прежнему присутствует на одной ферме, но этот вирус или родственные ему никогда не были обнаружены в других местах.
Недавно была обнаружена новая группа близкородственных свиных пестивирусов, образующих предполагаемый вид "атипичных свиных пестивирусов (APPV)". Эти вирусы были впервые выявлены в Северной Америке, а затем также обнаружены в Германии, Нидерландах и Австрии (Schwarz et al., 2017. Congenital infection with atypical porcine pestivirus (APPV) is associated with disease and viral persistence. Veterinary Research 48:1). Существуют убедительные доказательства того, что APPV представляют инфекционные агенты, лежащие в основе синдрома врожденного тремора (ВТ) типа A-II у поросят. ВТ A-II широко распространен во всем мире и часто встречается у новорожденных поросят. APPV очень трудно размножать in vitro, и поэтому постулаты Коха были выполнены только частично. Тем не менее передача возбудителя от пораженных поросят беременным свиноматкам приводила к воспроизведению клинических признаков. Клинические признаки характеризуются генерализованным легким или сильным тремором всего тела, что патогистологически ассоциировано с вариабельной гипомиелинизацией головного и спинного мозга. Гипомиелинизация представляет собой характерное поражение головного мозга овец, крупного рогатого скота и свиней после позднего периода беременности при внутриутробной инфекции BDV, BVDV и CSFV, приводящей к появлению новорожденных ягнят с избыточным волосяным покровом и тремором, дрожащих телят и поросят, пораженных ВТ A-I. Заражение большинством, если не всеми, пестивирусами во время беременности, может оказывать вредное воздействие на эмбрион или плод, вызывая мертворождение, пороки развития или неврологические дефекты.
Ввиду важности эффективной и безопасной, а также поддающейся отслеживанию профилактики и лечения пестивирусных инфекций, по-прежнему существует острая и неудовлетворенная потребность в иммуногенном пестивирусе с хорошей репликацией вируса и высоким потенциалом для индукции иммунитета.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Задача настоящего изобретения достигается с помощью заявленного объекта изобретения.
Новый выделенный пестивирус обладает низкой патогенностью для животных и может привести к быстрой и надежной сероконверсии даже после естественных путей заражения. Поэтому вирус в высокой степени применим для целей вакцинации.
Авторы настоящего изобретения назвали новый пестивирус вирусом LINDA.
Согласно настоящему изобретению предложен выделенный полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2 или последовательность, которая по меньшей мере на 60%, в частности, по меньшей мере на 70% идентична указанным последовательностям.
В частности, указанный полинуклеотид представляет собой инфекционный полинуклеотид.
В одном варианте реализации изобретения указанный полинуклеотид присутствует в клетке, в частности, в клетке-хозяине.
Согласно настоящему изобретению также предложен промотор РНК- полимеразы, функционально связанный с указанным полинуклеотидом.
Согласно еще одному варианту реализации полинуклеотид дополнительно содержит экзогенный гетерологичный полинуклеотид.
Согласно одному варианту реализации полинуклеотид входит в состав вектора.
В дополнительном варианте реализации предложен полинуклеотид, который представляет собой кДНК с последовательностью SEQ ID NO: 1.
В дополнительном варианте реализации предложен полинуклеотид, который представляет собой кДНК, и который по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 99%, по меньшей мере на 99,5% идентичен последовательности SEQ ID NO: 1.
В дополнительном варианте реализации предложен полинуклеотид, который по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 99,5% идентичен последовательности SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2.
В настоящей заявке также предложен полинуклеотид, содержащий последовательность, выбранную из группы SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, или любые их комбинации или последовательность, по меньшей мере, на 90%, в частности, по меньшей мере на 95%, идентична указанным последовательностям, или любые их комбинации.
Большим преимуществом является то, что пестивирус согласно настоящему изобретению явно отличается от других вирусов, таких как Bungowannah или APPV. Пестивирус согласно настоящему изобретению можно легко размножать с применением клеток-хозяев, таких как клетки SK-6 или PK-15, до высоких титров, таких как титр > 107 TCID50, без необходимости адаптации.
В рамках настоящей заявки также предложена композиция, содержащая свиной пестивирус, имеющий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2, или последовательность, которая по меньшей мере на 60%, в частности, по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% идентична последовательности SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2. Согласно конкретному варианту реализации, указанные по меньшей мере 60%, конкретно по меньшей мере 70%, 75%, 80%, 85%, 90 %, 95%, 99% идентичности с SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2 определяют по всей длине последовательностей.
Согласно настоящему изобретению также предложена композиция, содержащая свиной пестивирус, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3 или последовательность, которая по меньшей мере на 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90 %, 95%, 99%, 99,5% идентична SEQ ID NO: 3. Согласно конкретному варианту реализации указанные по меньшей мере 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 99%, 99,5% идентичности с SEQ ID NO: 3 определяют по всей длине последовательности.
Согласно настоящему изобретению также предложена композиция, содержащая свиной пестивирус, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 4 (Npro), SEQ ID NO: 5 (Core), SEQ ID NO: 6 (Erns), SEQ ID NO: 7 (E1), SEQ ID NO: 8 (E2), SEQ ID NO: 9 (P7), SEQ ID NO: 10 (NS2), SEQ ID NO: 11 (NS3), SEQ ID NO: 12 (NS4A ), SEQ ID NO: 13 (NS4B), SEQ ID NO: 14 (NS5A), SEQ ID NO: 15 (NS5B), или любые их комбинации.
В частности, композиция содержит 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 последовательностей из SEQ ID NO: 4 (Npro), SEQ ID NO: 5 (Core), SEQ ID NO: 6 (Erns), SEQ ID NO: 7 (E1), SEQ ID NO: 8 (E2), SEQ ID NO: 9 (P7), SEQ ID NO: 10 (NS2), SEQ ID NO: 11 (NS3), SEQ ID NO: 12 (NS4A), SEQ ID NO: 13 (NS4B), SEQ ID NO: 14 (NS5A), SEQ ID NO: 15 (NS5B).
В соответствии с дополнительным вариантом реализации изобретения предложена композиция, в которой свиной пестивирус инактивирован или ослаблен (аттенюирован), в частности, предложен химически инактивированный вирус, который инактивируют обработкой инактивирующим агентом, выбранным из группы, состоящей из бинарного этиленимина, этиленимина, ацетилэтиленимина, бета-этиленимина, бета-пропиолактона, глутар-альдегида, озона и формальдегида.
Также предложена композиция, содержащая пестивирус согласно настоящему изобретению, в которой пестивирус представляет собой физически инактивированный пестивирус, специфически инактивированный обработкой УФ-излучением, рентгеновским излучением, гамма-излучением, замораживанием- оттаиванием и/или нагреванием.
Согласно альтернативному варианту реализации настоящего изобретения пестивирус ослаблен путем модификации гена Npro, Erns или N2-3.
Согласно конкретному варианту реализации указанный пестивирус находится в лиофилизированной форме.
Для введения композиция содержит титр по меньшей мере приблизительно 104, в частности, по меньшей мере 105, 106, 107, 108 TCID50 на дозу.
Согласно следующему варианту реализации изобретения также предложена фармацевтическая композиция, содержащая полинуклеотид, композицию, вектор или химерный пестивирус, описанные в настоящем документе.
Настоящее изобретение также относится к вектору на основе свиного пестивируса, который содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1 или последовательность, которая по меньшей мере на 60%, конкретно по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99 % идентична последовательности SEQ ID NO: 1, и последовательность, кодирующую гетерологичную последовательность.
Настоящее изобретение также относится к вектору на основе свиного пестивируса, содержащему нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 2 или последовательность, кторая имеет по меньшей мере 60%, конкретно по меньшей мере 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99 % идентичности с SEQ ID NO: 2, и последовательность, кодирующую гетерологичную последовательность.
Указанные гетерологичные последовательности могут представлять собой любую регуляторную последовательность или последовательность, кодирующую селективные маркеры. В частности, гетерологичная последовательность выбрана из одного или нескольких вирусов, состоящих из группы вируса бычьей вирусной диареи-1 (BVDV-1) и BVDV-2, вируса пограничной болезни (BDV), вируса классической чумы свиней (CSFV), атипичного пестивируса (APPV), в частности NRPV, PEDV, RaPV, вируса пограничной болезни, изолятов от северного оленя, жирафа, пестивируса HoBi и вируса Bungowannah.
В частности, указанная гетерологичная последовательность кодирует поверхностный антиген из указанных вирусов. Более конкретно, гетерологичная последовательность кодирует поверхностный антиген, выбранный из группы последовательностей, включающей SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47 и SEQ ID NO: 48, или любой их комбинации или их фрагмента или части.
В соответствии с альтернативным вариантом реализации указанная гетерологичная последовательность кодирует поверхностный антиген любого представляющего интерес вируса, такого как, среди прочего, PEDV, цирковирус свиной африканской чумы свиней и PRRSV.
В частности, гетерологичная последовательность вставлена в 5'- или 3'- концевой области или на 5'- или 3'-конце Npro или E2.
Согласно альтернативному варианту реализации указанная гетерологичная последовательность кодирует слитый пептид с белком Npro, E2 или E1 пестивируса.
Настоящее изобретение также относится к химерному пестивирусу, содержащему нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2, или последовательность, которая по меньшей мере на 60%, в частности, по меньшей мере на 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90 %, 95%, 99% идентична SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2, и чужеродный полипептид.
Согласно настоящему изобретению предложена вакцина для животных, содержащая полинуклеотид, композицию, вектор или химерный пестивирус, описанные здесь.
Кроме того, в настоящем документе предложен набор для индукции иммунного ответа против свиной пестивирусной инфекции у животного, в частности у свиньи, причем указанный набор включает композицию или вакцину, описанные в настоящем документе, и инструкции по введению указанной композиции указанному животному.
Кроме того, в настоящем документе предложен способ защиты животного, в частности свиньи, в частности поросенка, от заболевания, ассоциированного с пестивирусом, причем этот способ включает введение супопросой свиноматке, хряку, отъемышу или ремсвинке, или свиноматке или ремсвинке до размножения, композиции или вакцины, описанных в настоящей заявке, в количестве, достаточном для защиты животного, в частности, для защиты или лечения животного от врожденного тремора, в частности - врожденного тремора A-II.
Согласно конкретному варианту реализации изобретения композицию вводят парентерально, в частности, внутримышечно, подкожно, внутрикожно или внутривенно, с использованием иглы и шприца или безыгольного инъекционного устройства; и с помощью введения через слизистую оболочку носа или перорально.
В соответствии с одним из вариантов реализации настоящего изобретения предложен способ обнаружения пестивируса, при котором образец тестируют с помощью ОТ-ПЦР с использованием по меньшей мере одного из праймеров, выбранных из 5'-GTKATHCAATACCCTGARGC-3' (SEQ ID NO: 32) и 5'- GGRTTCCAGGARTACATCA-3' (SEQ ID NO: 33).
Далее, в настоящем документе предложен диагностическая тест-система для обнаружения пестивируса, включающая по меньшей мере один праймер, выбранный из SEQ ID NO: 32 и SEQ ID NO: 33.
В данном документе также предложен диагностический набор для обнаружения пестивируса, содержащий по меньшей мере один праймер, выбранный из SEQ ID NO: 32 и SEQ ID NO: 33, дополнительно содержащий соответствующие устройства и инструкции.
В соответствии с дополнительным вариантом реализации также предложен способ обнаружения антигена пестивируса, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3 или аминокислотную последовательность которая по меньшей мере на 60% ей идентична в биологическом образце, причем указанный способ включает осуществление контакта биологического образца, в частности образцов крови, органов или экскреции с антителом, специфически связывающимся с антигеном указанного пестивируса, если он присутствует в указанном образце; и обнаружение связывания указанного антитела с указанным антигеном в указанном образце.
Согласно конкретному варианту реализации указанное антитело представляет собой моноклональное антитело, в частности, оно представляет собой моноклональное антитело 6А5, как описано Gilmartin A.A. et al., 2012, Protein Eng Des Sel 25.
Согласно настоящему изобретению также предложен способ получения вакцины согласно настоящему изобретению, включающий следующие последовательные этапы
a) заражение культуры клеток-хозяев полинуклеотидом, вектором или химерным пестивирусом, описанными здесь,
b) инкубирование указанной культуры клеток-хозяев для размножения вируса,
c) сбор культуры клеток-хозяев и, необязательно, d) выделение вируса из культуры и
e) смешивание культуры с фармацевтически приемлемым носителем.
Один из вариантов реализации изобретения также предусматривает применение полинуклеотида, вектора, композиции или химерного пестивируса, описанных в настоящей заявке, для приготовления вакцины для животных.
Кроме того, в настоящем документе предложен полинуклеотид, вектор, композиция или химерный пестивирус, описанные в настоящей заявке, или любые их комбинации, для использования в вакцине или для лечения животных.
В настоящем документе также предложен способ борьбы с инфекцией пестивирусом у животных, при котором вакцину, как описано в настоящем документе, комбинируют с диагностическим набором или тест-системой, описанными в настоящем документе.
ФИГУРЫ
Фигура 1: Результаты гистопатологического исследования у поросят с врожденным тремором (ВТ).
Фигура 2: Филогенетический анализ генома вируса LINDA, атипичных штаммов пестивируса и штаммов пестивирусного типа.
Фигура 3: Филогенетический анализ пестивирусных полипротеинов.
Фигура 4: Сравнение аминокислот белка E вируса LINDA. Последовательности E2 вируса LINDA (SEQ ID NO: 8), вируса Bungowannah (SEQ ID NO: 36), вилорога (SEQ ID NO: 37), жирафа (SEQ ID NO: 38), BDV (SEQ ID NO: 39), северного оленя (SEQ ID NO: 40), овцы (SEQ ID NO: 41), CSFV (SEQ ID NO: 42), BVDV-1 (SEQ ID NO: 43), BVDV-2 (SEQ ID NO: 44), BVDV- 3 (SEQ ID NO: 45), крысы E2 (SEQ ID NO: 46), летучей мыши E2 (SEQ ID NO: 47), APPV E2 (SEQ ID NO: 48)
Фигура 5: Рост пестивируса LINDA в клеточной культуре.
Фигура 6: Валидация перекрестно-реактивного моноклонального антитела.
Фигура 7: Полноразмерная ДНК-последовательность вируса LINDA (SEQ ID NO: 1).
Фигура 8: Полноразмерная РНК-последовательность вируса LINDA (SEQ ID NO: 2).
Фигура 9: Аминокислотная последовательность вируса LINDA (SEQ ID NO: 3), аминокислоты, выделенные жирным шрифтом, обозначают возможные сайты вставки. Npro последовательность выделена курсивом.
Фигура 10: Аминокислотные последовательности вируса LINDA a) Npro (SEQ ID NO: 4), b) Core (SEQ ID NO: 5), c) Erns (SEQ ID NO: 6), d) E1 (SEQ ID NO: 7), e) E2 (SEQ ID NO: 8), f) P7 (SEQ ID NO: 9), g) NS2 (SEQ ID NO: 10), h) NS3 (SEQ ID NO: 11), i) NS4A (SEQ ID NO: 12), j) NS4B (SEQ ID NO: 13), k) NS5A (SEQ ID NO: 14), l) NS5B (SEQ ID NO: 15).
Фигура 11: Последовательности ДНК белков вируса LINDA и нетранслируемых областей. a) 5'-UTR (SEQ ID 16), Npro (SEQ ID 17), c) Core (SEQ ID 18), d) Erns (SEQ ID 19), e) E1 (SEQ ID 20), f) E2 (SEQ ID 21), g) P7 (SEQ ID 22), h) NS2 (SEQ ID 23), i) NS3 (SEQ ID 24), j) NS4A (SEQ ID 25), k) NS4B (SEQ ID 26), l) NS5A (SEQ ID 27), m) NS5B (SEQ ID 28), n) 3´- UTR (SEQ ID 29).
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ
Специальные термины, используемые в описании, имеют следующее значение.
Термины "содержать", "иметь" и "включать", используемые в данном документе, могут использоваться как синонимы и должны пониматься как открытое определение, допускающее дополнительные элементы или части или элементы. "Состоящий" считается наиболее близким определением без дополнительных элементов признака определения "состояния из". Таким образом, "содержащий" является более широким и включает в себя определение "состоящий".
Используемый в настоящей заявке термин "приблизительно" относится к тому же значению или значению, отличающемуся на +/- 5% от указанного значения.
В предложенных в настоящей заявке идентификаторах последовательностей нуклеотиды представлены в стандартном коде ДНК lUPAC- IUB. Однако, как понятно специалисту, геномные последовательности пестивируса в природе находятся в форме РНК, где Т будет соответствовать U.
Последовательность РНК пестивируса согласно настоящему изобретению, в частности, представляет собой SEQ ID NO: 2.
Термин "инфекционный" относится к полинуклеотиду, имеющему последовательность SEQ ID NO. 2 или по меньшей мере их части или фрагменты, такие как область кодирования NSP, которая может быть полностью реплицирована в клетке-хозяине или животном.
Термины "гомология" или "идентичность" могут использоваться взаимозаменяемо и относятся к идентичности соответствующих остатков нуклеиновой кислоты. Процент идентичных остатков (процент идентичности) используют для количественной оценки гомологии/идентичности.
Используемый в настоящей заявке термин "ослабленный" относится к вирусу, имеющему полинуклеотидную последовательность, происходящую из пестивируса или происходящему из нее, имеющему нуклеотидную последовательность SEQ ID No. 1 или SEQ ID NO. 2 или по меньшей мере их части или фрагменты, где вирус обладает пониженной вирулентностью по сравнению с другим вирусом того же вида или изолята, таким как вирус или изолят дикого типа. Фактически, "ослабленный" означает уменьшенное распространение через тело зараженного целевого животного, например инфекция плода; вызывая меньше патологий, например (признаков) заболевания; и/или для обозначения уменьшенного распространения в окружающую среду. Является ли пестивирус ослабленным и является ли этот уровень ослабления достаточным для использования в соответствии с изобретением, например, относительно его использования в живой вакцине, может быть определено с использованием стандартных процедур in vitro или in vivo. Например, сравнивая вирусы, сравнивая влияние модификации на скорость репликации вируса в клеточной культуре или в зараженном животном, тестируя наличие вируса в различных тканях или органах или в кале указанного животного, и отслеживая клинические, макроскопические или микроскопические признаки заболевания у животного или плода.
Ослабление может быть выполнено путем, среди прочего, модификации гена Npro или гена NS2-3 вируса по настоящему изобретению, в результате чего у пестивируса появится модификация, в частности мутация эпитопа, расположенного в белке Npro, белке NS2 или дупликации. определенных областей генома, так что усиливается расщепление NS2-3. На это не влияют мутации эпитопа, расположенного в геликазном домене белка NS3, так что эпитоп не является реактивным или является менее реактивным в отношении антитела против этого эпитопа по сравнению с пестивирусом дикого типа.
Используемый в настоящей заявке термин "инактивированный" относится к вирусу, имеющему полинуклеотидную последовательность, происходящую из пестивируса или происходящему из нее, имеющую нуклеотидную последовательность SEQ ID No. 1 или SEQ ID NO. 2 или по меньшей мере их части или фрагменты, причем вирус утратил свою вирулентность по сравнению с другим вирусом того же вида или изолятом, таким как вирус или изолят дикого типа, путем убийства вируса химическими веществами, теплом или радиацией.
Инактивацию можно выполнить, среди прочего, такими способами, как обработка инактивирующим агентом, выбранным из группы, состоящей из бинарного этиленимина, этиленимина, ацетилэтиленимина, бета-этиленимина, бета-пропиолактона, глутаральдегида, озона и формальдегида.
В качестве альтернативы может быть выполнена физическая инактивация, такая как, среди прочего, обработка УФ-излучением, рентгеновским излучением, гамма-излучением, оттаиванием и/или нагреванием.
Полинуклеотидная молекула представляет собой биополимер, состоящий из 13 или более нуклеотидных мономеров, ковалентно связанных в цепи.
Примерами полинуклеотидов являются ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота) и РНК (рибонуклеиновая кислота). Используемый в настоящей заявке термин "экзогенный полинуклеотид" или "гетерологичный полинуклеотид" относится к любой полинуклеотидной последовательности, не встречающейся в природе в пестивирусе, кодируемом последовательностями согласно настоящему изобретению.
Используемый в настоящей заявке термин "аминокислота" означает одну из встречающихся в природе аминокислот, из которых состоят белки. Термин "полипептид", как описано в настоящем документе, относится к полимеру из аминокислотных остатков, соединенных пептидными связями, независимо от того, получен ли он природным или синтетическим путем. Полипептиды с менее чем 10 аминокислотными остатками обычно называют "пептидами".
"Белок" представляет собой макромолекулу, содержащую одну или несколько полипептидных цепей. Белок также может содержать непептидные компоненты, такие как углеводные группы. Углеводы и другие непептидные заместители могут быть добавлены к белку клеткой, в которой продуцируются белки, и будут варьироваться в зависимости от типа клетки. Белки определены в настоящем документе исходя из их аминокислотных каркасных структур; заместители, такие как углеводные группы, обычно не указаны, но, тем не менее, могут присутствовать.
Полипептидная или аминокислотная последовательность, "полученная из" указанной последовательности нуклеиновой кислоты, относится к полипептиду, имеющему аминокислотную последовательность, идентичную аминокислотной последовательности полипептида, кодируемого в этой последовательности, или его части, причем часть состоит по меньшей мере из 15 аминокислот, конкретно по меньшей мере 20 аминокислот, более конкретно по меньшей мере 30 аминокислот, более конкретно по меньшей мере 50 аминокислот, или которые иммунологически идентифицируются с полипептидом, кодируемым в последовательности. Эта терминология также включает полипептид, экспрессируемый из обозначенной последовательности нуклеиновой кислоты.
В частности, гетерологичный полипептид представляет собой иммуногенный полипептид.
Как правило, иммунный ответ вырабатывается на антиген посредством взаимодействия антигена с клетками иммунной системы. Иммунные ответы можно широко разделить на две категории: гуморальные и клеточно- опосредованные иммунные ответы (например, традиционно характеризуемые антителами и клеточными эффекторными механизмами защиты, соответственно). Эти категории ответа были названы ответом Th1-типа (клеточно-опосредованный ответ) и иммунным ответом Th2-типа (гуморальный ответ). Стимуляция иммунного ответа может быть результатом прямой или непрямой реакции клетки или компонента иммунной системы на воздействие иммуногена. Иммунные ответы могут быть измерены многими способами, включая активацию, пролиферацию или дифференцировку клеток иммунной системы (например, B-клетки, T-клетки, дендритные клетки, APC, макрофаги, NK-клетки, NKT-клетки и т. Д.); повышенную или пониженную экспрессию маркеров и цитокинов; стимуляцию титра IgA, IgM или IgG; спленомегалию (включая повышенную клеточность селезенки); гиперплазию и смешанные клеточные инфильтраты в различных органах. Другие ответы, клетки и компоненты иммунной системы, которые можно оценить в отношении иммуностимуляции, известны в данной области техники.
"Промотор РНК-полимеразы" согласно изобретению может представлять собой любую область, содержащую последовательность, специфически распознаваемую РНК-полимеразой (РНКП). Промотор может быть функционально связан с последовательностью, кодирующей РНК-мишень. Одной из особенностей настоящих вариантов реализации является использование промотора РНК-полимеразы и РНК-полимеразы, таких как любая РНК- полимераза и промотор, известные в данной области техники. Некоторыми примерами в данном документе, хотя и не ограничивающими, являются T7 RNAP промотор и T7 RNAP. Другие примеры полимераз с промоторами включают T7 RNAP с промотором T7 RNAP класса III или промотором T7 phi 2.5 RNAP, SP6 RNAP с промотором SP6 RNAP, T3 RNAP с промотором T3 RNAP, Syn5 RNAP с промотором Syn5 RNAP, E.coli RNAP с промотором T5.
Термин "вектор" или "плазмидный вектор" в настоящем документе обозначает систему, содержащую по меньшей мере один вектор, подходящий для трансформации, трансфекции или трансдукции клетки-хозяина. Таким образом, "вектор" как таковой обозначает груз для доставки биомолекулы в целевую клетку-хозяина, причем биомолекула включает молекулу нуклеиновой кислоты, включая ДНК, РНК и кДНК, или, в случае системы трансфекции в качестве вектора, молекулу аминокислоты, или их комбинацию. Пестивирус согласно настоящему изобретению можно использовать в качестве вектора согласно настоящему изобретению, поскольку он содержит все регуляторные элементы, необходимые для репликации. Альтернативным вектором по настоящему изобретению является плазмида или вектор экспрессии, который может быть круговым или линейным. Вектор экспрессии может содержать один вектор, кодирующий по меньшей мере одну молекулу-мишень, предпочтительно молекулу нуклеиновой кислоты, подлежащую введению в клетку-хозяина. Вектор векторной системы также может содержать более одной молекулы-мишени, подлежащей введению. В качестве альтернативы, векторная система может быть построена из нескольких отдельных векторов, несущих по меньшей мере одну целевую молекулу, подлежащую введению. Вектор экспрессии дополнительно содержит все элементы, необходимые для управления транскрипцией и/или трансляцией рассматриваемой последовательности в клетке-хозяине, для которой предназначен этот вектор экспрессии. Эти элементы включают, среди прочего, регуляторные элементы, которые участвуют в регуляции транскрипции, включая промоторы и тому подобное, функционирующие в рассматриваемой клетке-хозяине. Кроме того, вектор экспрессии содержит источник репликации и, необязательно, в зависимости от типа вектора и предполагаемого использования, селектируемый маркерный ген, сайт множественного клонирования, метку, которая должна быть прикреплена к рассматриваемой последовательности, хромосомную интеграционную кассету и т.п. Выбор и возможная модификация подходящего вектора экспрессии для использования с соответствующей клеткой-хозяином и рассматриваемой последовательностью, которая должна быть вставлена в вектор экспрессии, находится в пределах возможностей специалиста в данной области техники.
Термин "кДНК" обозначает комплементарную ДНК и относится к последовательности/молекуле нуклеиновой кислоты, полученной обратной транскрипцией из молекулы РНК, поскольку для специалиста в данной области техники это является стандартным способом получения кДНК из данной последовательности и дальнейшего использования этой кДНК или клонирования указанной кДНК в вектор, предпочтительно представляющий интерес плазмидный вектор.
Используемый в настоящей заявке термин "функционально связанный" используется для описания связи между регуляторными элементами и геном или его кодирующей областью. Как правило, экспрессия гена находится под контролем одного или нескольких регуляторных элементов, например, без ограничения, конститутивных или индуцибельных промоторов, тканеспецифических регуляторных элементов и энхансеров. Говорят, что ген или кодирующая область "функционально связаны" или "функционально ассоциированы с" регуляторными элементами, что означает, что ген или кодирующая область находятся под контролем или влиянием регуляторного элемента. Например, промотор функционально связан с кодирующей последовательностью, если этот промотор осуществляет транскрипцию или экспрессию этой кодирующей последовательности.
Полинуклеотид согласно настоящему изобретению содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 60%, в частности по меньшей мере 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97 %, 98%, 99%, 99,5% или 100% идентичности SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2.
В определенном варианте реализации полинуклеотид состоит из нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2.
Далее в данном документе предлагается композиция, содержащая пестивирус свиньи, имеющий нуклеотидную последовательность по меньшей мере с 60%, в частности по меньшей мере с 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% или 100% идентичности SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2.
Полинуклеотидные последовательности согласно настоящему изобретению можно использовать для кодирования пестивирусных белков или полипептидов, в частности, Npro, Core, Erns, E1, E2, P7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B пестивируса согласно настоящему изобретению.
В настоящей заявке предложен свиной пестивирус, содержащий полипротеин, имеющий аминокислотную последовательность по меньшей мере на 55% идентичную SEQ ID NO: 3, в частности, имеющий по меньшей мере 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62 %, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 100% идентичности SEQ ID NO: 3.
В настоящей заявке также предложен полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4 (Npro) или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 65%, конкретно имеющую по меньшей мере 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% идентичности SEQ ID NO: 4.
В настоящей заявке также предложен полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5 (белок Core) или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85%, конкретно имеющую по меньшей мере 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% идентичности SEQ ID NO: 5.
В настоящей заявке также предложен полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6 (белок Erns) или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 75%, конкретно имеющую по меньшей мере 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97 %, 98%, 99%, 99,5% идентичности SEQ ID NO: 6.
В настоящей заявке также предложен полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7 (белок E1) или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 75%, конкретно имеющую по меньшей мере 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97 %, 98%, 99%, 99,5% идентичности SEQ ID NO: 7.
В настоящей заявке также предложен полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8 (E2) или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 55%, конкретно имеющую по меньшей мере 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94 %, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% идентичности SEQ ID NO: 8.
В настоящей заявке также предложен полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9 (P7) или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 65%, конкретно имеющую по меньшей мере 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% идентичности SEQ ID NO: 9.
В настоящей заявке также предложен полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10 (NS2) или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 65%, конкретно имеющую по меньшей мере 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% идентичности SEQ ID NO: 10.
В настоящей заявке также предложен полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11 (NS3) или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90%, конкретно имеющую по меньшей мере 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% идентичности SEQ ID NO: 11.
В настоящей заявке также предложен полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12 (NS4A) или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85%, конкретно имеющую по меньшей мере 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% идентичности SEQ ID NO: 12.
В настоящей заявке также предложен полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13 (NS4B) или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, конкретно имеющую по меньшей мере 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% идентичности SEQ ID NO: 13.
В настоящей заявке также предложен полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14 (NS5A) или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 55%, конкретно имеющую по меньшей мере 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94 %, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% идентичности SEQ ID NO: 14.
В настоящей заявке также предложен полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15 (NS5B) или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 75%, конкретно имеющую по меньшей мере 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% идентичности SEQ ID NO: 15.
Как описано в настоящем документе, пестивирус согласно настоящему изобретению и полинуклеотид, кодирующий указанный вирус, могут быть использованы для экспрессии одной или нескольких гетерологичных последовательностей.
Указанной гетерологичной последовательностью может быть любая последовательность, которая не происходит или не получена из пестивируса по настоящему изобретению или из полинуклеотида SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2. Указанная гетерологичная последовательность может кодировать гетерологичный полипептид или белок или его часть из цирковируса свиней 2 (PCV2), вируса вирусной диареи крупного рогатого скота-1 (BVDV-1) и BVDV-2, вируса пограничной болезни (BDV), вируса классической чумы свиней (CSFV), атипичного пестивируса (APPV), в частности NRPV, RaPV и вируса пограничной болезни. Такая гетерологичная последовательность может кодировать поверхностный антиген из любых вирусов или полученных из них синтетических последовательностей, как указано выше. В частности, гетерологичная последовательность вставлена в 5´- или 3'-конец Npro или E2. Более конкретно, гетерологичная последовательность кодирует слитый пептид с Npro, E2 или E1 или частью или фрагментом Npro, E2 или E1 пестивируса.
Еще более конкретно, последовательности могут содержать любую из SEQ ID NO: 61 (Bungowannah), SEQ ID NO: 49 (вилорог), SEQ ID NO: 50 (жираф), SEQ ID NO: 51 (BDV), SEQ ID NO: 52 (северный олень), SEQ ID NO: 53 (овца), SEQ ID NO: 54 (CSFV), SEQ ID NO: 55 (BVDV-1), SEQ ID NO: 56 (BVDV-2), SEQ ID NO: 57 (BVDV-3), SEQ ID NO: 58 (крыса), SEQ ID NO: 59 (летучая мышь), SEQ ID NO: 60 (APPV) или любую их комбинацию или часть соответствующей последовательности, кодирующую белок Npro, core, Erns, E1, E2, P7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A и NS5B любого из перечисленных выше пестивирусов. Таким образом, хотя в любой из SEQ ID NO: 48 - SEQ ID NO: 60 приведена полноразмерная аминокислотная последовательность, специалист в данной области техники может легко определить соответствующую частичную последовательность представляющего интерес белка. Таким образом, в пределах объема изобретения также гетерологичный белок или полипептид, кодируемый вирусом согласно настоящему изобретению, имеющий последовательность белка Npro, ядра, Erns, E1, E2, P7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A и NS5B SEQ ID NO: 48-60 или последовательность, имеющую по меньшей мере 90%, конкретно по меньшей мере 95, более конкретно по меньшей мере 99% идентичности с ними.
Гетерологичная последовательность может быть вставлена в полинуклеотид последовательности SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2 согласно настоящему изобретению. Вставка может быть выполнена любым способом, известным специалисту в данной области техники.
Согласно одному варианту реализации, гетерологичный полипептид встроен в N-концевую или С-концевую область.
Используемый в настоящей заявке термин "область" в связи с N-концом, в частности, означает, что полипептид встроен в первые 15, в частности, в 10, в частности, в 5 N-концевых аминокислот. В связи с С-концом, гетерологичная последовательность вставлена в 15, в частности в 10, в частности в 5 С- концевых аминокислот.
В контексте изобретения гетерологичный полипептид может быть вставлен в N-концевую последовательность MEFK (SEQ ID NO: 30) белка Npro или С- концевую последовательность SCSD (SEQ ID NO: 31) белка NPro. Гетерологичная последовательность также может быть вставлена между N- концевым метионином и глутаминовой кислотой (ME) и/или между C-концевым цистеином и серином (CS) белка Npro.
Чтобы обеспечить достаточное расщепление гетерологичного полипептида, дополнительно вставляют пролиферативные последовательности в С-концевую область гетерологичного полипептида, например, среди прочего, дополнительно вводят белок убиквитин или белок пикорнавируса 2А.
В качестве альтернативы, гетерологичный полипептид также может быть вставлен в N-концевые 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 аминокислоты последовательности E2, конкретно между N-концевыми аминокислотами лейцин и глютаминовая кислота.
Ген является "химерным", если он представляет собой совокупность частей, которые изначально не были связаны. Например, совокупность частей одного и того же гена из разных вирусных изолятов или видов. Химерный ген кодирует химерный белок, который фактически является слитым белком.
Термин "химерный пестивирус" в соответствии с изобретением относится к пестивирусу согласно настоящему изобретению, содержащему одну или несколько из SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 или любые их комбинации или последовательности, по меньшей мере на 90%, в частности, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 99% идентичные им или любым их комбинациям, дополнительно содержащему нуклеотидную последовательность из чужеродного полипептида. Указанный чужеродный полипептид может происходить из генетически отличного пестивируса. Инородный полипептид может происходить, среди прочего, из вируса вирусной диареи крупного рогатого скота-1 (BVDV-1) и BVDV-2, вируса пограничной болезни (BDV), вируса классической чумы свиней (CSFV), атипичного пестивируса (APPV), в частности, NRPV, PEDV, RaPV, вируса пограничной болезни, изолятов от северного оленя, жирафа, пестивируса HoBi и вируса Bungowannah или любого их фрагмента или производного.
Описанные в настоящей заявке пестивирус, композиция, вектор или химерный вирус могут быть использованы для приготовления фармацевтической композиции, в частности вакцины. "Вакцина" представляет собой иммуногенную композицию, которая обладает неотъемлемым медицинским эффектом. Вакцина содержит иммунологически активный компонент и фармацевтически приемлемый носитель. "Иммунологически активный компонент" представляет собой одну или несколько антигенных молекул, которые распознаются иммунной системой- мишенью, то есть непосредственно пестивирусом по настоящему изобретению, или вектором или химерным пестивирусом, описанным в настоящей заявке, и которые индуцируют защитный иммунологический ответ. Вакцина, как правило, эффективна для снижения уровня или степени инфекции, например, путем снижения вирусной нагрузки или сокращения продолжительности репликации вируса у животного-хозяина. Также вакцина, как правило, эффективна в уменьшении или ослаблении симптомов заболевания, которое может быть вызвано или может быть результатом такой вирусной инфекции или репликации, или реакцией животного на эту инфекцию.
Эффект вакцины согласно настоящему изобретению заключается в предотвращении или уменьшении у животных инфекции, вызванной пестивирусом, и/или признаков заболевания, которые ассоциированы с такой вирусной инфекцией или репликацией, посредством индукции иммунологического ответа, такого как индукция вирус-нейтрализующих антител и/или индукция клеточного иммунного ответа.
Вакцины, в частности живые ослабленные или инактивированные вакцины, могут быть получены в лиофилизированной форме. Методы лиофилизации вымораживанием хорошо известны в данной области техники. Лиофилизированная форма может представлять собой, но не ограничена, лепешку или лиосферу. Для восстановления вакцину можно ресуспендировать в физиологически приемлемом разбавителе. Разбавитель может содержать дополнительные соединения, такие как адъювант.
"Животные", для которых предназначена вакцина согласно изобретению, представляют собой животных, подверженных заражению пестивирусом. В основном это будут животные-млекопитающие (не люди), а также члены отряда Artiodactyla. Предпочтительными животными-мишенями для вакцины согласно настоящему изобретению являются жвачные животные и свиньи; особенно поросята. Термин "поросята", в частности, относится к поросятам-отъемышам, более конкретно ранним отъемышам, возрастом от приблизительно 10 дней до 3 недель, весом приблизительно 4-5 кг, или обычным отъемышам, от приблизительно 3 до 5 недель, от приблизительно 5 до 10 кг. Однако отъемыши могут быть возрастом приблизительно 12 недель.
Термин "хряк" относится к самцу свиньи без кастрации.
Термин "ремсвинка" относится к молодой самке свиньи. В настоящем описании ремсвинка - это свинья до первого опороса, возрастом всего несколько месяцев или приблизительно года. Ремсвинка является интактной или способна размножаться и давать потомство, и ее репродуктивные органы не подвергались хирургическому или химическому изменению. Термин "свиноматка" относится к взрослой самке свиньи.
Вакцина согласно изобретению может представлять собой живую, живую ослабленную, инактивированную или субъединичную вакцину или любую их комбинацию.
В качестве альтернативы, вакцина согласно настоящему изобретению или ее часть может быть субъединичной вакциной. Ее можно получить либо из живого, либо из инактивированного вируса, применяя одну или несколько (дополнительных) стадий для фракционирования или выделения одной или нескольких частей вирусной частицы. Это включает, например, получение экстракта, фракции, гомогената или сониката, все подробности чего хорошо известны в данной области техники.
Вакцина согласно настоящему изобретению также может быть живой вакциной. Для целей изобретения термин "живой" относится к пестивирусу согласно настоящему изобретению, который способен к репликации.
Вакцина согласно настоящему изобретению также может содержать адъювант. Это особенно полезно, когда вакцина является инактивированной или субъединичной вакциной. Однако живые вакцины также могут содержать адъювант, хотя его следует тщательно выбирать, чтобы не снизить жизнеспособность вакцинного вируса даже при длительном хранении.
"Адъювант" представляет собой хорошо известный ингредиент вакцины, который, как правило, представляет собой вещество, стимулирующее иммунный ответ мишени неспецифическим образом. Примерами адъювантов для инактивированных/субъединичных вакцин являются, среди прочего, полные или неполные адъюванты Фрейнда, витамин Е, алюминий-содержащие композиции, такие как фосфат алюминия или гидроксид алюминия, Polygen™, неионные блок-полимеры и полиамины, такие как декстрансульфат, полиакриловая кислота, сапонин. Кроме того в качестве адъюванта часто используются пептиды, такие как мурамилдипептиды, диметилглицин, туфтсин, и масляные эмульсии с использованием минерального масла или легкого минерального (парафинового) масла; или неминеральное масло, такое как сквален, сквалан, или растительные масла, например, этил-олеат. Эмульсия вакцины может быть в форме вода-в- масле (в/м), масло-в-воде (м/в), вода-в-масле-в-воде (в/м/в), или двойная масляная эмульсия (DOE) и т. д. В качестве альтернативных и более подходящих для использования с живой вакциной, к вакцине согласно настоящему изобретению могут быть добавлены другие иммуностимулирующие компоненты, такие как цитокин или иммуностимулирующий олигодезоксинуклеотид. Иммуностимулирующий олигодезоксинуклеотид предпочтительно представляет собой иммуностимулирующий неметилированный CpG-содержащий олигодезоксинуклеотид (INO).
Вакцина может быть составлена в виде жидкости для инъекций, такой как:
суспензия, раствор, дисперсия или эмульсия. В качестве альтернативы, вакцина может быть составлена в лиофилизированной форме. Обычно вакцины готовят стерильными. Надлежащий состав может зависеть от различных факторов, таких как выбранный путь введения.
Животное, в частности поросенок, может быть защищено путем вакцинации против любого заболевания, ассоциированного с пестивирусом, путем введения животному, особенно беременной свиноматке, хряку, отъемышу, ремсвинке или свиноматке или ремсвинке до опороса, композиции, описанной в настоящей заявке, в количестве, достаточном для защиты поросенка. "Заболевание" представляет собой любое заболевание, вызванное пестивирусом, в частности, это врожденный тремор, более конкретно, врожденный тремор A-II, классическая чума свиней и диарея крупного рогатого скота.
Для введения композиция, например, вакцина может содержать титр вируса TCID50, равный по меньшей мере приблизительно 1×104, в частности по меньшей мере 1×105, 1×106, 1×107, 1×108. Определение дозировки, то есть количества вводимого вируса, может зависеть от способа введения. Например, при введении вируса пероральным или интраназальным путем на дозу следует вводить TCID50 не менее 1x106, а при введении вируса внутримышечно - TCID50 не менее 1×104 на дозу, однако изобретение также охватывает более высокие титры, например, титр 1×105, 1×106, 1×107 или более. Соответствующая доза может быть определена специалистом в данной области техники.
Настоящее изобретение также относится к новой системе анализа с применением ОТ-ПЦР панпестивируса для выявления APPV, BDV, CSFV, BVDV-1, BVDV-2 и вируса LINDA. В частности, обнаружение геномов связано с наличием специфических для пестивируса генов (Npro и Erns), а также с гомологией последовательности к другим пестивирусам в консервативных геномных областях (NS3 и NS5B). Общая нуклеотидная идентичность между выделенным пестивирусом согласно настоящему изобретению (вирус LINDA) и наиболее близким известным пестивирусом (вирус Bungowannah) составляет ниже 68,0%.
В качестве альтернативы может быть разработана тест-система для специфического выявления пестивируса согласно настоящему изобретению в виде скрининга на положительный маркер для эффективной вакцинации. Такая тест-система будет использовать антитела против белка, экспрессируемого пестивирусом в соответствии с изобретением, или будет использовать пестивирус в качестве антигена для обнаружения антител.
В контексте изобретения "антитела" представляют собой белки иммуноглобулина или их части, которые могут специфически связываться с эпитопом. Для серодиагностики антитела обычно имеют тип IgG или IgM. Такими антителами могут быть интактные или частичные антитела, например, одноцепочечное антитело или часть иммуноглобулина, содержащая антигенсвязывающую область. Они могут иметь различную форму: (синтетическую) конструкцию таких частей при условии, что части антитела все еще содержат антигенсвязывающий сайт. Хорошо известными субфрагментами иммуноглобулинов являются: фрагменты Fab, Fv, scFv, dAb или Fd, домены Vh или мультимеры таких фрагментов или доменов. Также антитела могут быть помечены одним или несколькими способами для облегчения или усиления обнаружения.
Таким образом, в одном варианте реализации способа обеспечивают дифференцировку вакцинированных и невакцинированных или инфицированных и неинфицированных животных с использованием либо праймера, описанного здесь, антитела 6А5, либо анализов нейтрализации сыворотки с использованием вируса LINDA и чувствительных клеточных культур. Способ дифференцировки согласно изобретению может быть осуществлен с использованием любого подходящего метода иммунодиагностических анализов. Часто такие иммунодиагностические системы анализа включают этап для усиления уровня сигнала и один или несколько этапов для вымывания несвязанных, неспецифических или нежелательных компонентов. Обнаружение положительного сигнала может быть выполнено различными способами, например оптически путем обнаружения изменения цвета, флуоресценции или изменения размера частиц, или, в качестве альтернативы, путем обнаружения радиоактивно меченных антигенов или антител в иммунных комплексах. Аналогично физическая форма теста может широко варьироваться и может, например, использовать микротитрационную пластину, мембрану, тест-полоску, биосенсорный чип, гелевую матрицу или раствор, содержащий (микро-) частицы носителя, такие как латекс, металл или полистирол и т. д.
Выбор конкретной схемы такого иммунодиагностического анализа обычно определяется типом входного образца, желаемой чувствительностью теста (правильная идентификация положительного образца) и специфичностью теста (правильное различение истинно положительного и истинно отрицательного образца). Такие свойства зависят от силы и скорости иммунного ответа или наличия микроорганизма. Кроме того, решающее значение для выбора конкретного формата могут иметь требования к экономичности при тестировании, такие как применимость в больших масштабах и затраты.
Хорошо известными иммуно-диагностическими тестами являются: радиоиммуноанализ, иммуно-диффузия, иммунофлюоресценция, иммуноосаждение, агглютинация, гемолиз, нейтрализация и "иммуноферментный твердофазный анализ" или ИФА. Особенно для крупномасштабного тестирования может потребоваться автоматизация работы с жидкостями и/или считывания и обработки результатов. Системы анализа ИФА легко масштабируются и могут быть очень чувствительными. Еще одним преимуществом является динамический диапазон результатов, поскольку образцы можно тестировать в диапазоне разведений. Результаты выражаются в произвольных единицах оптической плотности, обычно от 0,1 до 2,5 единиц оптической плотности (OD) или в виде "% блокирования", в зависимости от свойств теста и настроек технического оборудования, используемого для считывания. Обычно в анализ включают положительные и отрицательные контрольные образцы, и в большинстве случаев образцы тестируют в многократном порядке. Стандартизация достигается путем включения (диапазона разведения) определенного эталонного образца, что также позволяет сопоставить определенную оценку с предварительно установленными значениями для определения положительных или отрицательных образцов и обеспечивает корреляцию с биологическим значением, например: количество антигена с активностью, или количество антител с уровнем иммунной защиты.
Известно много вариантов выполнения ИФА, но обычно в них используют иммобилизация антигена или антитела в твердой фазе, например в лунке микротитрационного планшета. Когда антитело иммобилизовано, тест называется ИФА с "захватом" или "сэндвичем". Затем добавляют тестовый образец, обеспечивая связывание лиганда (например, детектируемого антигена или антитела). Затем добавляют детектор (антитело, антиген или другой связывающий компонент), который часто конъюгирован с меткой, например, с ферментом, способным вызывать цветную реакцию, которая может быть прочитана спектрофотометрически. Другие типы меток могут использовать люминесценцию, флуоресценцию или радиоактивность. Использование маркированного детектора предназначено для обеспечения усиления уровня сигнала для повышения чувствительности теста, однако оно также может вводить фоновый сигнал, уменьшая отношение сигнал/шум.
Способы сбора и приготовления образцов хорошо известны в данной области техники. Такими образцами может быть биологический образец любого типа, в котором присутствует достаточное количество обнаруживаемого вируса или антитела. Обычно такими образцами могут быть: кровь, сыворотка, молоко, сперма, моча, кал или образец ткани, такой как ушная пункция.
Конкретные подробности "подходящего иммуноанализа", например, для обнаружения невакцинного пестивируса могут зависеть от особенностей образца, вируса или других параметров теста, который должен быть выполнен.
Также для выполнения диагностического анализа предлагается "диагностический набор", который относится к набору деталей для выполнения способов дифференциации или способа диагностики в соответствии с изобретением. Набор содержит один или несколько компонентов для применения описываемых способов, в частности все части, необходимые для проведения ОТ-ПЦР, и праймеры, выбранные из SEQ ID NO: 26 и SEQ ID NO: 27. Необязательно, в набор включены инструкции, как выполнить способ и как читать и интерпретировать результаты.
Как указано выше, пестивирус согласно настоящему изобретению может эффективно размножаться в клеточной культуре.
В способе согласно изобретению и для амплификации пестивируса согласно изобретению вирус продуцируют в подходящих клетках-хозяевах. Это может быть выполнено путем инокуляции на клетки-хозяева и амплификации путем естественной репликации.
Клеткой-хозяином может быть первичная клетка, например полученная из ткани животного. Подходящие клетки-хозяева для репликации пестивируса хорошо известны в данной области техники и, как правило, общедоступны. Способы, среды и материалы для получения и культивирования клеток-хозяев согласно изобретению хорошо известны в данной области техники. Примерами подходящих клеток-хозяев являются клеточные линии, такие как: бычьи клеточные линии, такие как: MDBK (клетки бычьих почек Madin Darby); клеточные линии свиней, такие как: PK15 или SK-6 (свиная почка) или STE (эпителиоид яичка у свиньи); или клеточные линии общего назначения, такие как: Vero (клетки почки африканской зеленой обезьяны), MDCK (почка собаки Madin Darby) или клетки PT (эпителиальные клетки почки овцы). Предпочтительными клетками- хозяевами являются клетки SK-6 или PK-15. В частности, пестивирус согласно настоящему изобретению можно легко размножать на клетках SK-6 или PK-15 до высоких титров (> 107) без необходимости адаптации. Это делает заявляемый пестивирус очень выгодным для эффективного приготовления вакцинных композиций, а также для использования в качестве вирусного вектора.
В определенные моменты цикла репликации вируса такие клетки-хозяева будут содержать пестивирус согласно настоящему изобретению. Таким образом, в дополнительном аспекте изобретение относится к клетке-хозяину, содержащей пестивирус в соответствии с изобретением или получаемый способом согласно настоящему изобретению.
Для размножения культуру клетки-хозяина инфицируют полинуклеотидом, вектором или химерным пестивирусом, описанными здесь, затем культуру клетки-хозяина инкубируют для размножения вируса в соответствующих условиях, культуру клетки-хозяина собирают полностью или частично, и выделяют вирус из клеточной культуры или ее супернатанта. Необязательно, к вирусу или клеточной культуре добавляют фармацевтически приемлемый носитель.
Настоящее изобретение также относится к следующим пунктам:
1. Выделенный полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2 или последовательность по меньшей мере с 60%, в частности, с 70% идентичностью с ними.
2. Полинуклеотид по п. 1, который является инфекционным полинуклеотидом.
3. Полинуклеотид по п. 1 или 2, отличающийся тем, что полинуклеотид присутствует в клетке.
4. Полинуклеотид по любому из пп. 1-3, отличающийся тем, что промотор РНК-полимеразы функционально связан с полинуклеотидом.
5. Полинуклеотид по любому из пп. 1-4, отличающийся тем, что полинуклеотид дополнительно содержит экзогенный полинуклеотид.
6. Полинуклеотид по любому из пп. 1-4, отличающийся тем, что полинуклеотид присутствует в векторе.
7. Полинуклеотид кДНК с последовательностью SEQ ID NO: 1.
8. Полинуклеотид кДНК, имеющий по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% гомологии с SEQ ID NO: 1.
9. Инфекционный полинуклеотид, содержащий последовательность, выбранную из группы SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 или любые их комбинации или последовательность с идентичностью не менее 95% с ними.
10. Композиция, содержащая свиной пестивирус, имеющий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2 или последовательность по меньшей мере с 60%, конкретно по меньшей мере с 70% идентичностью с ними.
11. Композиция, содержащая свиной пестивирус, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3 или последовательность, идентичную ей по меньшей мере на 60%.
12. Композиция, содержащая свиной пестивирус, содержащий одну или несколько аминокислотных последовательностей, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 4 (Npro), SEQ ID NO: 5 (Core), SEQ ID NO: 6 (Erns), SEQ ID NO: 7 (E1), SEQ ID NO: 8 (E2), SEQ ID NO: 9 (P7), SEQ ID NO: 10 (NS2), SEQ ID NO: 11 (NS3), SEQ ID NO: 12 (NS4A ), SEQ ID NO: 13 (NS4B), SEQ ID NO: 14 (NS5A) и SEQ ID NO: 15 (NS5B).
13. Композиция по любому из пп. 10-12, в которой свиной пестивирус инактивирован или ослаблен.
14. Композиция по п. 13, в которой указанный пестивирус представляет собой химически инактивированный вирус, который специфически инактивирован путем обработки инактивирующим агентом, выбранным из группы, состоящей из бинарного этиленимина, этиленимина, ацетилэтиленимина, бета-этиленимина, бета-пропиолактона, глутаральдегида, озона и формальдегида.
15. Композиция по п. 13, в которой пестивирус представляет собой физически инактивированный пестивирус, который инактивирован обработкой ультрафиолетовым излучением, рентгеновским излучением, гамма-излучением, оттаиванием и/или нагреванием.
16. Композиция по п. 13, отличающаяся тем, что пестивирус ослаблен путем модификации генов Npro, Erns или N2-3.
17. Композиция по любому из пп. 10-16, содержащая пестивирус в лиофилизированной форме.
18. Композиция по любому из пп. 10-17, содержащая TCID50 по меньшей мере приблизительно 1×104.
19. Фармацевтическая композиция, содержащая композицию по любому из пп. 10-18.
20. Вектор свиного пестивируса, содержащий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 2 или последовательность, имеющую по меньшей мере 60%, в частности по меньшей мере 70% идентичности с ней, и последовательность, кодирующую гетерологичную последовательность.
21. Вектор по п. 20, отличающийся тем, что гетерологичная последовательность выбрана из вируса, выбранного из группы, состоящей из APPV, NRPV, свиного цирковируса 2 (PCV2), вируса Bungowannah, вируса вирусной диареи крупного рогатого скота (BVDV), в частности BVDV-1, BVDV -2, вируса классической чумы свиней (CSFV), RaPV и вируса пограничной болезни, причем в частности, указанная гетерологичная последовательность кодирует поверхностный антиген из указанных вирусов.
22. Вектор по любому из пп. 20 или 21, отличающийся тем, что гетерологичная последовательность вставлена в 5'- или 3'-конец Npro.
23. Вектор по любому из пп. 25 или 27, отличающийся тем, что гетерологичная последовательность кодирует слитый пептид с белком Npro, E2 или E1 пестивируса.
24. Химерный пестивирус, содержащий нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 60%, конкретно по меньшей мере 70% идентичности с SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2, и чужеродный полипептид.
25. Вакцина для животных, содержащая полинуклеотид по любому из пп. 1-9, или композицию по любому из пп. 10-18, или вектор по любому из пп. 20-23, или химерный пестивирус по пункту 24 26. Набор для индукции иммунного ответа против свиной пестивирусной инфекции у свиньи, причем указанный набор содержит композицию по любому из пп. 10-18 и инструкции по введению указанной композиции указанной свинье.
27. Способ защиты поросенка от заболевания, ассоциированного с пестивирусом, в котором указанный способ включает введение любой супопросой свиноматке, хряку, отъемышу или ремсвинке, или свиноматке или ремсвинке до размножения композиции по любому из из пп. 10-18, в количестве, достаточном для защиты поросенка.
28. Способ по п. 27, отличающийся тем, что заболевание представляет собой врожденный тремор, конкретно врожденный тремор A-II.
29. Способ по п. 27 или 28, в котором композицию вводят парентерально, конкретно внутримышечно, подкожно, внутрикожно или внутривенно, с использованием иглы и шприца или безыгольного инъекционного устройства; или путем введения через слизистую оболочку, в частности через нос или через рот.
30. Способ обнаружения пестивируса, отличающийся тем, что образец тестируют с помощью ОТ-ПЦР с использованием по меньшей мере одного из праймеров, выбранных из SEQ ID NO: 32 и SEQ ID NO: 33.
3
