Антитела для лечения инфекции гепатитом в и связанных с ней заболеваний

Авторы патента:

ЛО, Вэньсинь (CN)

КАН, Цымин (CN)

ВАН, Ивэнь (CN)

ЮАНЬ, Цюань (CN)

ЧЖАН, Тяньин (CN)

СЯ, Ниншао (CN)

C12P21/08 - моноклональные антитела

C12N5/10 - клетки, модифицированные введением чужеродного генетического материала, например клетки, трансформированные вирусом

C12N15/63 - введение чужеродного генетического материала с использованием векторов; векторы; использование их хозяев; регулирование экспрессии

C12N15/13 - иммуноглобулины

C07K16/08 - против материала из вирусов

A61P31/20 - против вирусов ДНК

A61K39/395 - антитела (агглютинины A61K 38/36); иммуноглобулины; иммунные сыворотки, например антилимфоцитные сыворотки

Владельцы патента RU 2765878:

СЯМЭНЬ ЮНИВЕРСИТИ (CN)
ЯН ШЭН ТАН КОМПАНИ, ЛТД. (CN)

Изобретение относится к области биохимии, в частности к антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, специфически связывающимся с HBsAg. Раскрыты молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая указанное антитело; экспрессирующий вектор и клетка-хозяин, содержащие указанную молекулу; фармацевтическая композиция, содержащая указанное антитело. Также раскрыты способ получения указанного антитела, способ предупреждения или лечения с помощью указанного антитела, применение указанного антитела. Изобретение позволяет эффективно лечить заболевания, ассоциированные с HBsAg. 10 н. и 16 з.п. ф-лы, 27 ил., 31 табл., 12 пр.

Область техники

Настоящее изобретение относится к области молекулярной вирусологии и иммунологии, в частности, к области лечения инфекции вирусом гепатита B (HBV). В частности, настоящее изобретение относится к антителу против поверхностного антигена гепатита B (HBsAg), молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей его, к способу их получения и к содержащей их фармацевтической композиции. Фармацевтическую композицию можно использовать для предупреждения и/или лечения инфекции HBV или заболевания, ассоциированного с инфекцией HBV (например, гепатита B), для нейтрализации вирулентности HBV у индивидуума (например, человека) или для снижения сывороточного уровня ДНК HBV и/или HBsAg у индивидуума. Таким образом, изобретение, кроме того, относится к применению антитела (в частности, гуманизированного антитела) и его варианта для производства фармацевтической композиции, для предупреждения и/или лечения инфекции HBV или заболевания, ассоциированного с инфекцией HBV (например, гепатита B), для нейтрализации вирулентности HBV у индивидуума (например, человека) или для снижения сывороточного уровня ДНК HBV и/или HBsAg у индивидуума.

Уровень техники

Инфекция вирусом гепатита B, особенно хроническая инфекция HBV, является одной из наиболее важных проблем здравоохранения в мире (Dienstag JL. Hepatitis B virus infection. N Engl J Med 2008 Oct 2; 359(14): 1486–1500). Хроническая инфекция HBV может приводить к серии заболеваний печени, таких как хронический гепатит B (CHB), цирроз печени (LC) и печеночно–клеточная карцинома (HCC) (Liaw YF, Chu CM. Hepatitis B virus infection. Lancet 2009 Feb 14;373(9663): 582–592). Согласно сообщаемым данным, приблизительно 2 миллиарда человек по всему миру инфицированы HBV и приблизительно 350 миллионов имеют хронический гепатит B, и эти инфицированные люди в конечном итоге могут умереть в результате связанных с инфекцией HBV заболеваний печени с риском 15%–25%, и каждый год от этих заболеваний может умирать более 1 миллиона человек по всему миру (Dienstag JL., там же; и Liaw YF et al., там же).

В настоящее время терапевтические средства против хронической инфекции HBV могут быть в основном подразделены на интерфероны (IFN) и нуклеозиды или нуклеотиды (NA) (Dienstag JL., там же; Kwon H, Lok AS. Hepatitis B therapy. Nat Rev Gastroenterol Hepatol 2011 May; 8(5): 275–284; и Liaw YF et al., там же). Первые из них включают обычный интерферон (IFN) и пегинтерферон (пег–IFN, также известный как интерферон длительного действия), которые достигают эффекта ингибирования HBV и лечения CHB в основном посредством общего повышения иммунитета у пациента; в то время как последние в основном включают, ламивудин (LMV), адефовир дипивоксил (ADV), энтекавир (ETV), телбувидин (LdT), тенофовир (Tenofovir) и т.п., которые ингибируют репликацию HBV, в основном посредством прямого ингибирования активности полимеразы HBV. Для этих инфицированных HBV пациентов (таких как пациенты с CHB), терапия с использованием описанных выше лекарственных средств отдельно или в комбинации может эффективно ингибировать репликацию вируса in vivo и значительно снижать уровни ДНК HBV; в частности, после проведения терапии в течение 52 недель или более длительного периода времени, уровень вирологического ответа, состоящего в том, что уровни ДНК HBV у пациентов находятся ниже уровня предела обнаружения, может достигать 40–80% (Kwon H et al., там же.). Однако терапия с использованием вышеупомянутых лекарственных средств отдельно или в комбинации, не может полностью устранить вирус HBV у инфицированного пациента, что приводит к уровню ответа, который представляет собой негативную конверсию HBsAg или сероконверсию HBsAg (признак полной элиминации вируса HBV у инфицированного пациент), обычно менее 5% (Kwon H et al., там же). Таким образом, является срочной и необходимой разработка инновационного способа и лекарственного средства для инфицированных HBV пациентов, которые могут более эффективно устранять вирус HBV, особенно HBsAg.

Разработка новых лекарственных средств для лечения хронической инфекции HBV на основе иммунологических способов является одним из важных направлений исследований в данной области. Иммунотерапию хронической инфекции HBV обычно проводят двумя способами: активной иммунотерапией (которая соответствует форме лекарственного средства, такой как вакцина и т.д.) и пассивной иммунотерапией (которая соответствует форме лекарственного средства, такой как антитело, и т.д.). Активная иммунотерапия относится к способу стимуляции индивидуума с хронической инфекцией HBV к активной индукции клеточного иммунного ответа (эффект CTL и т.д.) или/и гуморального иммунного ответа (антитело и т.д.) против HBV путем введения терапевтической вакцины (включая белковую вакцину, полипептидную вакцину, вакцину на основе нуклеиновой кислоты и т.д.), для достижения цели, состоящей в ингибировании или устранении HBV. В настоящее время отсутствуют лекарственные средства или вакцины для активной иммунотерапии, которые являются достаточно эффективными для лечения хронической инфекции HBV. Пассивная иммунотерапия (например, антителом) относится к способу введения терапевтического антитела инфицированному HBV индивидууму, и, таким образом, препятствования инфицированию HBV наивных гепатоцитов посредством опосредуемого антителом иммунного выведения, тем самым достигая терапевтических эффектов. В настоящее время поликлональные антитела против HB, полученные посредством очистки из сыворотки/плазмы индивидуума, отвечающего на профилактическую вакцину против гепатита B, или индивидуума, выжившего после инфекции HBV, а именно, иммуноглобулин против гепатита B высокого титра (HBIG), широко используют для блокирования вертикальной передачи HBV от матери к плоду, для предупреждения повторной инфекции HBV после трансплантации печени у пациента с хронической инфекцией HBV, и для предупреждения инфекции у людей, которые случайным образом столкнулись с HBV. Однако терапия, состоящая в прямом введении HBIG инфицированным HBV пациентам (например, пациентам с CHB), демонстрирует отсутствие значительного эффекта и имеет большое количество ограничений, таких как малое количество источников плазмы с высоким титров, высокая стоимость, нестабильный характер и потенциальные проблемы безопасности.

Таким образом, является срочной и необходимой разработка инновационного способа терапии и лекарственного средства против инфекции HBV, которые являются более эффективными для лечения инфекции HBV.

Сущность изобретения

В одном аспекте изобретение относится к антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, которые могут специфически связываться с HBsAg, содержащим:

(a) одну или несколько (например, 1, 2 или 3) определяющих комплементарность областей (CDR) вариабельной области тяжелой цепи (VH), выбранных из группы, состоящей из:

(i) CDR1 VH, которая состоит из последовательности, выбранной из следующих: SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 18 или последовательность, которая отличается от этих последовательностей одной или несколькими заменами, делециями или вставками аминокислот (например, 1, 2 или 3 заменами, делециями или вставками аминокислот);

(ii) CDR2 VH, которая состоит из последовательности, выбранной из следующих: SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 19 или последовательность, которая отличается от этих последовательностей одной или несколькими заменами, делециями или вставками аминокислот (например, 1, 2 или 3 заменами, делециями или вставками аминокислот), и

(iii) CDR3 VH, которая состоит из последовательности, выбранной из следующих: SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 20, или последовательности с одной или несколькими заменами, делециями или вставками аминокислот (например, 1, 2 или 3 заменами, делециями или вставками аминокислот);

и/или

(b) одну или несколько (например, 1, 2 или 3) CDR вариабельной области легкой цепи (VL), выбранных из группы, состоящей из:

(iv) CDR1 VL, которая состоит из последовательности, выбранной из следующих: SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 15 или последовательность, которая отличается от этих последовательностей одной или несколькими заменами, делециями или вставками аминокислот (например, 1, 2 или 3 заменами, делециями или вставками аминокислот),

(v) CDR2 VL, которая состоит из последовательности, выбранной из следующих: SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 16 или последовательность, которая отличается от этих последовательностей одной или несколькими заменами, делециями или вставками аминокислот (например, 1, 2 или 3 заменами, делециями или вставками аминокислот), и

(vi) CDR3 VL, которая состоит из последовательности, выбранной из следующих: SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 17 или последовательность, которая отличается от этих последовательностей одной или несколькими заменами, делециями или вставками аминокислот (например, 1, 2 или 3 заменами, делециями или вставками аминокислот).

В определенных предпочтительных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению содержит CDR1 VH, CDR2 VH и CDR3 VH, как определено выше. В определенных предпочтительных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению содержит CDR1 VL, CDR2 VL и CDR3 VL, как определено выше. В определенных предпочтительных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению содержит CDR1 VH, CDR2 VH, CDR3 VH, CDR1 VL, CDR2 VL и CDR3 VL, как определено выше.

В определенных предпочтительных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит:

(a) вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую:

(i) CDR2 VH, которая состоит из последовательности, выбранной из следующих: SEQ ID NO: 7 или последовательность, которая отличается от SEQ ID NO: 7 одной или несколькими заменами, делециями или вставками аминокислот (например, 1, 2 или 3 заменами, делециями или вставками аминокислот),

(ii) CDR3 VH, которая состоит из последовательности, выбранной из следующих: SEQ ID NO: 8 или последовательность, которая отличается от SEQ ID NO: 8 одной или несколькими заменами, делециями или вставками аминокислот (например, 1, 2 или 3 заменами, делециями или вставками аминокислот), и

(iii) CDR1 VH, которая состоит из последовательности, выбранной из следующих: последовательность CDR1 VH, содержащаяся в вариабельной области тяжелой цепи любого иммуноглобулина;

и/или

(b) вариабельную область легкой цепи (VL), причем VL содержит:

(iv) CDR1 VL, которая состоит из последовательности, выбранной из следующих: SEQ ID NO: 9 или последовательность, которая отличается от SEQ ID NO: 9 одной или несколькими заменами, делециями или вставками аминокислот (например, 1, 2 или 3 заменами, делециями или вставками аминокислот),

(v) CDR3 VL, которая состоит из последовательности, выбранной из следующих: SEQ ID NO: 11 или последовательность, которая отличается от SEQ ID NO: 11 одной или несколькими заменами, делециями или вставками аминокислот (например, 1, 2 или 3 заменами, делециями или вставками аминокислот), и

(vi) CDR2 VL, которая состоит из последовательности, выбранной из следующих: последовательность CDR2 VL, содержащаяся в вариабельной области легкой цепи любого иммуноглобулина (например, вариабельная область легкой цепи к).

В определенных предпочтительных вариантах осуществления CDR1 VH представляет собой последовательность CDR1 VH, содержащуюся в вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина человека.

В определенных предпочтительных вариантах осуществления CDR1 VH состоит из последовательности, выбранной из следующих: (a) SEQ ID NO: 6 или последовательность, которая отличается от SEQ ID NO: 6 одной или несколькими заменами, делециями или вставками аминокислот (например, 1, 2 или 3 заменами, делециями или вставками аминокислот); или (b) последовательность CDR1 VH, содержащаяся в аминокислотной последовательности, кодируемой геном тяжелой цепи эмбрионального типа человека. В определенных иллюстративных вариантах осуществления ген тяжелой цепи эмбрионального типа человека выбран из группы, состоящей из IGHV4–4*08 и IGHV4–61*01.

В определенных иллюстративных вариантах осуществления VH антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по изобретению содержит: CDR2 VH, как указано в SEQ ID NO: 7; CDR3 VH, как указано в SEQ ID NO: 8; и CDR1 VH, имеющей следующую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 137 или SEQ ID NO: 138.

В определенных предпочтительных вариантах осуществления CDR2 VL представляет собой последовательность CDR2 VL, содержащуюся в вариабельной области легкой цепи иммуногобулина человека (например, вариабельной области легкой цепи к).

В определенных предпочтительных вариантах осуществления CDR2 VL состоит из последовательности, выбранной из следующих: (a) SEQ ID NO: 10 или последовательность, которая отличается от SEQ ID NO: 10 одной или несколькими заменами, делециями или вставками аминокислот (например, 1, 2 или 3 заменами, делециями или вставками аминокислот); или (b) последовательность CDR2 VL, содержащаяся в аминокислотной последовательности, кодируемой геном легкой цепи эмбрионального типа человека, причем ген легкой цепи эмбрионального типа человека выбран из группы, состоящей из IGKV1–39*01 и IGKV1–5*03.

В определенных иллюстративных вариантах осуществления VL антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по изобретению содержит: CDR1 VL, как указано в SEQ ID NO: 9; CDR3 VL, как указано в SEQ ID NO: 11; и CDR2 VL, имеющую следующую аминокислотную последовательность: SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 139 или SEQ ID NO: 140.

В определенных предпочтительных вариантах осуществления VH антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по изобретению содержит: CDR2 VH, как указано в SEQ ID NO: 7, CDR3 VH, как указано в SEQ ID NO: 8, и CDR1 VH, имеющую следующую аминокислотную последовательность: SEQ ID NO: 6, 137 или 138; и VL антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит: CDR1 VL, как указано в SEQ ID NO: 9, CDR3 VL, как указано в SEQ ID NO: 11, и CDR2 VL, имеющую аминокислотную последовательность: SEQ ID NO: 10, 139 или 140.

(a) вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую:

(i) CDR1 VH, которая состоит из последовательности, выбранной из следующих: SEQ ID NO: 12 или последовательность, которая отличается от SEQ ID NO: 12 одной или несколькими заменами, делециями или вставками аминокислот (например, 1, 2 или 3 заменами, делециями или вставками аминокислот),

(ii) CDR3 VH, которая состоит из последовательности, выбранной из следующих: SEQ ID NO: 14 или последовательность, которая отличается от SEQ ID NO: 14 одной или несколькими заменами, делециями или вставками аминокислот (например, 1, 2 или 3 заменами, делециями или вставками аминокислот), и

(iii) CDR2 VH, которая состоит из последовательности, выбранной из следующих: последовательность CDR2 VH, содержащаяся в вариабельной области тяжелой цепи любого иммуноглобулина;

и/или

(b) вариабельную область легкой цепи (VL), причем VL содержит:

(iv) CDR1 VL, которая состоит из последовательности, выбранной из следующих: SEQ ID NO: 15 или последовательность, которая отличается от SEQ ID NO: 15 одной или несколькими заменами, делециями или вставками аминокислот (например, 1, 2 или 3 заменами, делециями или вставками аминокислот),

(v) CDR3 VL, которая состоит из последовательности, выбранной из следующих: SEQ ID NO: 17 или последовательность, которая отличается от SEQ ID NO: 17 одной или несколькими заменами, делециями или вставками аминокислот (например, 1, 2 или 3 заменами, делециями или вставками аминокислот), и

В определенных предпочтительных вариантах осуществления CDR2 VH представляет собой последовательность CDR2 VH, содержащуюся в вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина человека.

В определенных предпочтительных вариантах осуществления CDR2 VH состоит из последовательности, выбранной из следующих: (a) SEQ ID NO: 13 или последовательность, которая отличается от SEQ ID NO: 13 одной или несколькими заменами, делециями или вставками аминокислот (например, 1, 2 или 3 заменами, делециями или вставками аминокислот); или (b) последовательность CDR2 VH, содержащаяся в аминокислотной последовательности, кодируемой геном тяжелой цепи эмбрионального типа человека. В определенных иллюстративных вариантах осуществления ген тяжелой цепи эмбрионального типа человека выбран из группы, состоящей из IGHV4–30–4*07 и IGHV4–4*01.

В определенных иллюстративных вариантах осуществления VH антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по изобретению содержит: (a) CDR1 VH, как указано в SEQ ID NO: 12; CDR3 VH, как указано в SEQ ID NO: 14; и CDR2 VH, имеющую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 141 и SEQ ID NO: 142.

В определенных предпочтительных вариантах осуществления CDR2 VL представляет собой последовательность CDR2 VL, содержащуюся в вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина человека (например, вариабельной области легкой цепи к).

В определенных предпочтительных вариантах осуществления CDR2 VL состоит из последовательности, выбранной из следующих: (a) SEQ ID NO: 16 или последовательность, которая отличается от SEQ ID NO: 16 одной или несколькими заменами, делециями или вставками аминокислот (например, 1, 2 или 3 заменами, делециями или вставками аминокислот); или (b) последовательность CDR2 VL, содержащаяся в аминокислотной последовательности, кодируемой геном легкой цепи эмбрионального типа человека. В определенных иллюстративных вариантах осуществления ген легкой цепи эмбрионального типа человека выбран из группы, состоящей из IGKV2–28*01 и IGKV3–15*01.

В определенных иллюстративных вариантах осуществления VL антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по изобретению содержит: CDR1 VL, как указано в SEQ ID NO: 15; CDR3 VL, как указано в SEQ ID NO: 17; и CDR2 VL, имеющую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 143 и SEQ ID NO: 144.

В определенных предпочтительных вариантах осуществления VH антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по изобретению содержит: CDR1 VH, как указано в SEQ ID NO: 12, CDR3 VH, как указано в SEQ ID NO: 14, и CDR2 VH, имеющую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 141 и SEQ ID NO: 142; и VL антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит: CDR1 VL, как указано в SEQ ID NO: 15, CDR3 VL, как указано в SEQ ID NO: 17, и CDR2 VL, имеющую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 143 и SEQ ID NO: 144.

(a) вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую:

(i) CDR1 VH, которая состоит из последовательности, выбранной из следующих: SEQ ID NO: 18 или последовательность, которая отличается от SEQ ID NO: 18 одной или несколькими заменами, делециями или вставками аминокислот (например, 1, 2 или 3 заменами, делециями или вставками аминокислот);

(ii) CDR2 VH, которая состоит из последовательности, выбранной из следующих: SEQ ID NO: 19 или последовательность, которая отличается от SEQ ID NO: 19 одной или несколькими заменами, делециями или вставками аминокислот (например, 1, 2 или 3 заменами, делециями или вставками аминокислот), и

(iii) CDR3 VH, которая состоит из последовательности, выбранной из следующих: SEQ ID NO: 20 или последовательность, которая отличается от SEQ ID NO: 20 одной или несколькими заменами, делециями или вставками аминокислот (например, 1, 2 или 3 заменами, делециями или вставками аминокислот);

и/или

(b) вариабельную область легкой цепи (VL), причем VL содержит:

(v) CDR2 VL, которая состоит из последовательности, выбранной из следующих: SEQ ID NO: 16 или последовательность, которая отличается от SEQ ID NO: 16 одной или несколькими заменами, делециями или вставками аминокислот (например, 1, 2 или 3 заменами, делециями или вставками аминокислот), и

(vi) CDR3 VL, которая состоит из последовательности, выбранной из следующих: SEQ ID NO: 17 или последовательность, которая отличается от SEQ ID NO: 17 одной или несколькими заменами, делециями или вставками аминокислот (например, 1, 2 или 3 заменами, делециями или вставками аминокислот).

В определенных предпочтительных вариантах осуществления VH антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по изобретению содержит: CDR1 VH, как указано в SEQ ID NO: 18, CDR2 VH, как указано в SEQ ID NO: 19, и CDR3 VH, как указано в SEQ ID NO: 20; и VL антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит: CDR1 VL, как указано в SEQ ID NO: 15, CDR2 VL, как указано в SEQ ID NO: 16, и CDR3 VL, как указано в SEQ ID NO: 17.

В определенных предпочтительных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению являются гуманизированными. В определенных предпочтительных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению обладают степенью гуманизации по меньшей мере 89%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97% или по меньшей мере 98%. В определенных предпочтительных вариантах осуществления не являющаяся CDR область антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по изобретению содержит не более 19, не более 15, не более 14, не более 13, не более 12, не более 11, не более 10, не более 9, не более 8, не более 7, не более 6, не более 5, ее более 4 или не более 3 аминокислотных остатков не человека (например, яванского макака).

В определенных предпочтительных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению дополнительно содержат каркасную область (FR).

В определенных предпочтительных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению содержат:

(a) одну или несколько (например, 1, 2, 3 или 4) каркасных областей (FR) вариабельной области тяжелой цепи (VH), выбранных из следующих:

(i) FR1 VH, которая состоит из последовательности, выбранной из следующих: SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 50 или последовательность, которая отличается от этих последовательностей одной или несколькими заменами, делециями или вставками аминокислот (например, 1, 2, 3 или 4 заменами, делециями или вставками аминокислот);

(ii) FR2 VH, которая состоит из последовательности, выбранной из следующих: SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 51 или последовательность, которая отличается от этих последовательностей одной или несколькими заменами, делециями или вставками аминокислот (например, 1, 2, 3 или 4 заменами, делециями или вставками аминокислот);

(iii) FR3 VH, которая состоит из последовательности, выбранной из следующих: SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 52 или последовательность, которая отличается от этих последовательностей одной или несколькими заменами, делециями или вставками аминокислот (например, 1, 2, 3 или 4 заменами, делециями или вставками аминокислот);

(iv) FR4 VH, которая состоит из последовательности, выбранной из следующих: SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 53 или последовательность, которая отличается от этих последовательностей одной или несколькими заменами, делециями или вставками аминокислот (например, 1, 2 или 3 заменами, делециями или вставками аминокислот);

и/или

(b) одну или несколько (например, 1, 2, 3 или 4) каркасных областей (FR) вариабельной области легкой цепи (VL), выбранных из:

(v) FR1 VL, которая состоит из последовательности, выбранной из следующих: SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 54 или последовательность, которая отличается от этих последовательностей одной или несколькими заменами, делециями или вставками аминокислот (например, 1, 2, 3 или 4 заменами, делециями или вставками аминокислот);

(vi) FR2 VL, которая состоит из последовательности, выбранной из следующих: SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 55 или последовательность, которая отличается от этих последовательностей одной или несколькими заменами, делециями или вставками аминокислот (например, 1, 2, 3 или 4 заменами, делециями или вставками аминокислот);

(vii) FR3 VL, которая состоит из последовательности, выбранной из следующих: SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 56 или последовательность, которая отличается от этих последовательностей одной или несколькими заменами, делециями или вставками аминокислот (например, 1, 2, 3 или 4 заменами, делециями или вставками аминокислот); и

(viii) FR4 VL, которая состоит из последовательности, выбранной из следующих: SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 36 или последовательность, которая отличается от этих последовательностей одной или несколькими заменами, делециями или вставками аминокислот (например, 1, 2, 3 или 4 заменами, делециями или вставками аминокислот).

В определенных предпочтительных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению содержат FR1 VH, FR2 VH, FR3 VH и FR4 VH, как определено выше. В определенных предпочтительных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению содержат FR1 VL, FR2 VL, FR3 VL и FR4 VL, как определено выше. В определенных предпочтительных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению содержат FR1 VH, FR2 VH, FR3 VH, FR4 VH, FR1 VL, FR2 VL, FR3 VL и FR4 VL, как определено выше.

(a) каркасную область тяжелой цепи, которая обладает идентичностью последовательности по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% по сравнению с каркасной областью тяжелой цепи, содержащейся в вариабельной области тяжелой цепи, выбранной из следующих: вариабельные области тяжелой цепи, как указано в SEQ ID NO: 1, 3, 5, 57, 59, 157, 158, 163 и 164;

и/или

(b) каркасную область легкой цепи, которая обладает идентичностью последовательности по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% по сравнению с каркасной областью легкой цепи, содержащейся в вариабельной области легкой цепи, выбранной из следующих: вариабельные области легкой цепи, как указано в любой из SEQ ID NO: 2, 4, 58, 60, 159, 160, 165 и 166.

(a) четыре FR, содержащихся в вариабельной области тяжелой цепи, выбранной из следующих:

вариабельные области тяжелой цепи, как указано в любой из SEQ ID NO: 1, 3, 5, 57, 59, 157, 158, 163 и 164;

и/или

(b) четыре FR, содержащихся в вариабельной области легкой цепи, выбранной из следующих:

вариабельные области легкой цепи, как указано в любой из SEQ ID NO: 2, 4, 58, 60, 159, 160, 165 и 166.

В определенных предпочтительных вариантах осуществления VH антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит:

(a) FR1 VH, как указано в SEQ ID NO: 21, FR2 VH, как указано в SEQ ID NO: 22, FR3 VH, как указано в SEQ ID NO: 23, и FR4 VH, как указано в SEQ ID NO: 24;

(b) FR1 VH, как указано в SEQ ID NO: 29, FR2 VH, как указано в SEQ ID NO: 30, FR3 VH, как указано в SEQ ID NO: 31, и FR4 VH, как указано в SEQ ID NO: 32;

(c) FR1 VH, как указано в SEQ ID NO: 37, FR2 VH, как указано в SEQ ID NO: 38, FR3 VH, как указано в SEQ ID NO: 39, и FR4 VH, как указано в SEQ ID NO: 32;

(d) FR1 VH, как указано в SEQ ID NO: 44, FR2 VH, как указано в SEQ ID NO: 22, FR3 VH, как указано в SEQ ID NO: 45, и FR4 VH, как указано в SEQ ID NO: 46; или

(e) FR1 VH, как указано в SEQ ID NO: 50, FR2 VH, как указано в SEQ ID NO: 51, FR3 VH, как указано в SEQ ID NO: 52, и FR4 VH, как указано в SEQ ID NO: 53;

и/или VL антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит:

(a) FR1 VL, как указано в SEQ ID NO: 25, FR2 VL, как указано в SEQ ID NO: 26, FR3 VL, как указано в SEQ ID NO: 27, и FR4 VL, как указано в SEQ ID NO: 28;

(b) FR1 VL, как указано в SEQ ID NO: 33, FR2 VL, как указано в SEQ ID NO: 34, FR3 VL, как указано в SEQ ID NO: 35, и FR4 VL, как указано в SEQ ID NO: 36;

(c) FR1 VL, как указано в SEQ ID NO: 47, FR2 VL, как указано в SEQ ID NO: 48, FR3 VL, как указано в SEQ ID NO: 49, и FR4 VL, как указано в SEQ ID NO: 28; или

(d) FR1 VL, как указано в SEQ ID NO: 54, FR2 VL, как указано в SEQ ID NO: 55, FR3 VL, как указано в SEQ ID NO: 56, и FR4 VL, как указано в SEQ ID NO: 36.

В определенных предпочтительных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит: каркасную область иммуноглобулина человека (например, каркасная область, содержащаяся в аминокислотной последовательности, кодируемой геном антитела эмбрионального типа человека), и каркасная область необязательно содержит одну или несколько обратных мутаций с остатков человека на остатки яванского макака.

В определенных предпочтительных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит: каркасную область тяжелой цепи, содержащуюся в аминокислотной последовательности, кодируемой геном тяжелой цепи эмбрионального типа человека, и/или каркасную область легкой цепи, содержащуюся в аминокислотной последовательности, кодируемой геном легкой цепи эмбрионального типа человека.

В определенных предпочтительных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит: каркасную область тяжелой цепи, содержащуюся в аминокислотной последовательности, кодируемой IGHV 4–4*08, и каркасную область легкой цепи, содержащуюся в аминокислотной последовательности, кодируемой IGKV 1–39*01, где каркасная область тяжелой цепи и/или каркасная область легкой цепи необязательно содержит одну или несколько обратных мутаций с остатков человека на остатки яванского макака.

В определенных предпочтительных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит: каркасную область тяжелой цепи, содержащуюся в аминокислотной последовательности, кодируемой IGHV 4–4*02, и каркасную область легкой цепи, содержащуюся в аминокислотной последовательности, кодируемой IGKV 4–1*01, где каркасная область тяжелой цепи и/или каркасная область легкой цепи необязательно содержит одну или несколько обратных мутаций с остатков человека на остатки яванского макака.

(a) FR1 VH, как указано в SEQ ID NO: 21, FR2 VH, как указано в SEQ ID NO: 22, FR3 VH, как указано в SEQ ID NO: 23, и FR4 VH, как указано в SEQ ID NO: 24; и, FR1 VL, как указано в SEQ ID NO: 25, FR2 VL, как указано в SEQ ID NO: 26, FR3 VL, как указано в SEQ ID NO: 27, и FR4 VL, как указано в SEQ ID NO: 28;

(b) FR1 VH, как указано в SEQ ID NO: 29, FR2 VH, как указано в SEQ ID NO: 30, FR3 VH, как указано в SEQ ID NO: 31, и FR4 VH, как указано в SEQ ID NO: 32; и, FR1 VL, как указано в SEQ ID NO: 33, FR2 VL, как указано в SEQ ID NO: 34, FR3 VL, как указано в SEQ ID NO: 35, и FR4 VL, как указано в SEQ ID NO: 36;

(c) FR1 VH, как указано в SEQ ID NO: 37, FR2 VH, как указано в SEQ ID NO: 38, FR3 VH, как указано в SEQ ID NO: 39, и FR4 VH, как указано в SEQ ID NO: 32; и, FR1 VL, как указано в SEQ ID NO: 33, FR2 VL, как указано в SEQ ID NO: 34, FR3 VL, как указано в SEQ ID NO: 35, и FR4 VL, как указано в SEQ ID NO: 36;

(d) FR1 VH, как указано в SEQ ID NO: 44, FR2 VH, как указано в SEQ ID NO: 22, FR3 VH, как указано в SEQ ID NO: 45, FR4 VH, как указано в SEQ ID NO: 46; и, FR1 VL, как указано в SEQ ID NO: 47, FR2 VL, как указано в SEQ ID NO: 48, FR3 VL, как указано в SEQ ID NO: 49, и FR4 VL, как указано в SEQ ID NO: 28; или

(e) FR1 VH, как указано в SEQ ID NO: 50, FR2 VH, как указано в SEQ ID NO: 51, FR3 VH, как указано в SEQ ID NO: 52, и FR4 VH, как указано в SEQ ID NO: 53; и FR1 VL, как указано в SEQ ID NO: 54, FR2 VL, как указано в SEQ ID NO: 55, FR3 VL, как указано в SEQ ID NO: 56, и FR4 VL, как указано в SEQ ID NO: 36.

В определенных предпочтительных вариантах осуществления аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по изобретению обладает идентичностью последовательности по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% по сравнению с аминокислотной последовательностью вариабельной области тяжелой цепи выбранный из группы, состоящей из: вариабельных областей тяжелой цепи, указанных в SEQ ID NO: 1, 3, 5, 57, 59, 157, 158, 163 и 164. В определенных предпочтительных вариантах осуществления вариабельная область тяжелой цепи антитела или его антигенсвязывающего фрагмента представляет собой вариабельную область тяжелой цепи, как указано в любой из SEQ ID NO: 1, 3, 5, 57, 59, 157, 158, 163 и 164.

В определенных предпочтительных вариантах осуществления аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по изобретению обладает идентичностью последовательности, составляющей по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% по сравнению с аминокислотной последовательностью вариабельной области легкой цепи, выбранной из группы, состоящей из: вариабельных областей легкой цепи, как указано в любой из SEQ ID NO: 2, 4, 58, 60, 159, 160, 165 и 166. В определенных предпочтительных вариантах осуществления вариабельная область легкой цепи или ее антигенсвязывающий фрагмент представляет собой вариабельную область легкой цепи, как указано в любой из SEQ ID NO: 2, 4, 58, 60, 159, 160, 165 и 166.

В определенных предпочтительных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению содержит вариабельную область тяжелой цепи, как определено выше, и вариабельную область легкой цепи, как определено выше.

В определенных предпочтительных вариантах осуществления вариабельная область тяжелой цепи антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по изобретению представляет собой вариабельную область тяжелой цепи, как указано в любой из SEQ ID NO: 1, 57, 157 и 158; и вариабельная область легкой цепи антитела или его антигенсвязывающего фрагмента представляет собой вариабельную область легкой цепи, как указано в любой из SEQ ID NO: 2, 58, 159 и 160; или

вариабельная область тяжелой цепи антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по настоящему изобретению представляет собой вариабельную область тяжелой цепи, как указано в любой из SEQ ID NO: 3, 59, 163 и 164; и вариабельная область легкой цепи антитела или его антигенсвязывающего фрагмента представляет собой вариабельную область легкой цепи, как указано в любой из SEQ ID NO: 4, 60, 165 и 166.

В определенных предпочтительных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению содержит:

(1) VH, как указано в SEQ ID NO: 1, и VL, как указано в SEQ ID NO: 2;

(2) VH, как указано в SEQ ID NO: 3, и VL, как указано в SEQ ID NO: 4;

(3) VH, как указано в SEQ ID NO: 5, и VL, как указано в SEQ ID NO: 4;

(4) VH, как указано в SEQ ID NO: 57, и VL, как указано в SEQ ID NO: 58;

(5) VH, как указано в SEQ ID NO: 59, и VL, как указано в SEQ ID NO: 60;

(6) VH, как указано в SEQ ID NO: 157, и VL, как указано в SEQ ID NO: 58;

(7) VH, как указано в SEQ ID NO: 158, и VL, как указано в SEQ ID NO: 58;

(8) VH, как указано в SEQ ID NO: 57, и VL, как указано в SEQ ID NO: 159;

(9) VH, как указано в SEQ ID NO: 57, и VL, как указано в SEQ ID NO: 160;

(10) VH, как указано в SEQ ID NO: 163, и VL, как указано в SEQ ID NO: 60;

(11) VH, как указано в SEQ ID NO: 164, и VL, как указано в SEQ ID NO: 60;

(12) VH, как указано в SEQ ID NO: 59, и VL, как указано в SEQ ID NO: 165; или

(13) VH, как указано в SEQ ID NO: 59, и VL, как указано в SEQ ID NO: 166.

В определенных предпочтительных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению выбраны из группы, состоящей из scFv, Fab, Fab', (Fab')₂, фрагментов Fv, диантител, биспецифических антител, мультиспецифических антител, химерных антител и гуманизированных антител. В определенных предпочтительных вариантах осуществления антитело представляет собой химерное антитело или гуманизированное антитело.

В определенных предпочтительных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент класса IgG (например, класса IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4).

В определенных предпочтительных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению способны специфически связываться с HBsAg, нейтрализовывать вирулентность HBV и/или уменьшать сывороточный уровень ДНК HBV и/или HBsAg у индивидуума.

В определенных предпочтительных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению является меченным. В определенных предпочтительных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент является меченным посредством подающейся обнаружению метки, такой как радиоизотоп, флуоресцентное вещество, люминесцентное вещество, хромофорное вещество или фермент (например, пероксидаза хрена).

В другом аспекте изобретение относится к вектору (например, клонирующему вектору или экспрессирующему вектору), содержащему выделенную молекулу нуклеиновой кислоты по изобретению.

В другом аспекте изобретение относится к клетке–хозяину, содержащей выделенную молекулу нуклеиновой кислоты по изобретению или вектор по изобретению.

В другом аспекте предусматривается способ получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по изобретению, включающий культивирование клетки–хозяина по изобретению в условиях, позволяющих экспрессию антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, и выделение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента из культуры культивируемой клетки–хозяина.

В другом аспекте изобретение относится к набору, содержащему антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению. В предпочтительном варианте осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению, кроме того, содержит поддающуюся обнаружению метку. В предпочтительном варианте осуществления набор дополнительно содержит второе антитело, которое специфически распознает антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению. Предпочтительно, второе антитело дополнительно содержит поддающуюся обнаружению метку. Такие поддающиеся обнаружению метки, которые хорошо известны специалисту в данной области, включают, но не ограничиваются ими, радиоизотоп, флуоресцентное вещество, люминесцентное вещество. хромофорное вещество и фермент (например, пероксидаза хрена) и т.д.

В другом аспекте изобретение относится к способу обнаружения присутствия или уровня белка HBsAg в образце, включающему использование антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по изобретению. В предпочтительном варианте осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению дополнительно содержит поддающуюся обнаружению метку. В другом предпочтительном варианте осуществления способ дополнительно включает использование второго антитела, содержащего поддающуюся обнаружению метку, для обнаружения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по изобретению. Способ можно использовать для диагностических целей или для не диагностических целей (например, указанный образец представляет собой образец клеток, а на образец от пациента).

В другом аспекте изобретение относится к способу диагностики того, инфицирован ли индивидуум HBV, включающему: использование антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по изобретению для обнаружения присутствия белка HBsAg в образце от индивидуума. В предпочтительном варианте осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению дополнительно содержит поддающуюся обнаружению метку. В другом предпочтительном варианте осуществления способ дополнительно включает использование второго антитела, содержащего поддающуюся обнаружению метку, для обнаружения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по изобретению.

В другом аспекте предусматривается применение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по изобретению для производства набора для обнаружения присутствия или уровня HBsAg в образце для диагностики того, инфицирован ли индивидуум HBV.

Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению можно использовать для предупреждения или лечения инфекции HBV или заболевания, ассоциированного с инфекцией HBV (такого как гепатит B) у индивидуума (такого как человек), для нейтрализации вирулентности HBV in vitro или у индивидуума (такого как человек), и для снижения сывороточного уровня ДНК HBV и/или HBsAg у индивидуума (такого как человек).

Таким образом, в другом аспекте изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению, и фармацевтически приемлемый носитель и/или эксципиент. В предпочтительном варианте осуществления фармацевтическая композиция по изобретению может дополнительно содержать дополнительное фармацевтически активное средство. В предпочтительном варианте осуществления дополнительное фармацевтически активное средство представляет собой средство для предупреждения или лечения инфекции HBV или заболевания, ассоциированного с инфекцией HBV (такого как гепатит B), например, средства на основе интерферонов, такие как интерферон или пегилированный интерферон.

В другом аспекте предусматривается применение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по изобретению или фармацевтической композиции по изобретению для производства лекарственного средства для предупреждения или лечения инфекции HBV или заболевания, ассоциированного с инфекцией HBV (такого как B) у индивидуума (такого как человека), для нейтрализации вирулентности HBV in vitro или у индивидуума (такого как человек), и/или для снижения сывороточного уровня ДНК HBV и/или HBsAg у индивидуума (такого как человек).

В другом аспекте изобретение относится к способу предупреждения или лечения инфекции HBV или заболевания, ассоциированного с инфекцией HBV (такого как гепатит B) у индивидуума (такого как человек), для нейтрализации вирулентности HBV у индивидуума (такого как человек) и/или для снижения сывороточного уровня ДНК HBV и/или HBsAg у индивидуума (такого как человек), включающему введение индивидууму, нуждающемуся в этом, эффективного количества антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по изобретению или фармацевтической композиции по изобретению.

Лекарственное средство и фармацевтическую композицию по изобретению можно использовать отдельно или в комбинации или можно использовать в комбинации с дополнительным фармацевтически активным средством (например, другие противовирусные средства, например средства типа интерферона, такие как интерферон или пегилированный интерферон).

Варианты осуществления настоящего изобретения подробно описаны ниже с отсылкой на прилагаемые чертежи и примеры, однако специалистам в данной области будет понятно, что приведенные ниже чертежи и примеры только иллюстрируют настоящее изобретение и не ограничивают объем настоящего изобретения. Различные задачи и преимущественные аспекты настоящего изобретения станут очевидными специалистам в данной области из приведенного ниже подробного описания предпочтительных вариантов осуществления и прилагаемых чертежей.

Описание чертежей

На фиг.1 представлены результаты анализа ELISA для определения активности связывания трех химерных моноклональных антител яванский макак–человек M1–23, M3–23 и M3–13 с антигеном HBsAg согласно примеру 2, где по оси абсцисс приведена концентрация антитела (Log₁₀ нг/мл) и по оси ординат представлена величина OD. Результаты показали, что все из трех химерных моноклональных антител яванского макака–человека имели хорошую активность связывания антигена.

На фиг.2 представлены результаты конкурентного анализа ELISA для перекрестного блокирования связывания трех химерных моноклональных антител яванского макака–человека M1–23, M3–23 и M3–13 с антигеном HBsAg посредством антитела мыши 6D11 согласно примеру 2. Результаты показали, что связывание M1–23, M3–23 и M3–13 с HBsAg могло значительно ингибироваться посредством 6D11.

На фиг.3A–3B представлены результаты оценки терапевтических эффектов in vivo химерных моноклональных антител яванского макака–человека M1–23, M3–23 у трансгенных мышей с HBV согласно примеру 2. На фиг.3A представлено изменение уровня HBsAg в сыворотке мышей, где по оси абсцисс представлено количество суток после инъекции химерного антитела и по оси ординат представлено относительное снижение уровня HBsAg в сыворотке мышей (Log₁₀ МЕ/мл); на фиг.3B представлено изменение уровня ДНК HBV в сыворотке мышей, где по оси абсцисс представлено количество суток после инъекции химерного антитела, и по оси ординат представлено относительное снижение уровня ДНК HBV в сыворотке мышей (Log₁₀ МЕ/мл). Результаты показали, что M1–23 и M3–23 могли заметно снижать уровень HBsAg и ДНК HBV у животного.

На фиг.4 представлены результаты анализа посредством ELISA активности связывания гуманизированных антител M1D, M3D с антигеном HBsAg согласно примеру 4, где по оси абсцисс представлена концентрация антитела (Log₁₀ нг/мл) и по оси ординат представлена величина OD. Результаты показали, что оба из двух гуманизированных антител имели высокую активность связывания антигена и их аффинность к HBsAg была более высокой, чем аффинность эталонного антитела 162.

На фиг.5 представлены результаты конкурентного анализа ELISA в отношении перекрестного блокирования связывания гуманизированных антител M1D, M3D с антигеном HBsAg посредством антитела мыши 6D11 согласно примеру 4. Результаты показали, что связывание гуманизированных антител M1D, M3D с антигеном HBsAg могло значительно ингибироваться посредством 6D11.

На фиг.6A–6B представлены результаты определения активности гуманизированного антитела M1D в отношении нейтрализации вируса HBV согласно примеру 4, где на фиг.6A представлена стандартная кривая, построенная с использованием HBIG в качестве стандарта, и на фиг.6B представлены результаты определения активности нейтрализации в образцах, где по оси ординат представлено количество стандартных единиц (мМЕ) HBIG, которое обладает активностью нейтрализации, равной активности нейтрализации на мг антитела. Результаты показали, что активность M1D в отношении нейтрализации HBV была сравнимой с активностью нейтрализации эталонного антитела 162.

На фиг.7 представлены результаты оценки терапевтических эффектов in vivo гуманизированных антител M1D и M3D и химерного антитела M3–13 у трансгенных мышей с HBV согласно примеру 5. На фиг.7A представлено изменение уровня HBsAg в сыворотке мышей, где по оси абсцисс представлено количество суток после инъекции гуманизированных антител и по оси ординат представлено относительное снижение уровня HBsAg в сыворотке мышей (Log₁₀ МЕ/мл); на фиг.7B представлено изменение уровня ДНК HBV в сыворотке мышей, где по оси абсцисс представлено количество суток после инъекции химерного антитела и по оси ординат представлено относительное снижение уровня ДНК HBV в сыворотке мышей (Log₁₀ МЕ/мл). Результаты показали, что все три антитела могли заметно снижать уровень HBsAg и ДНК HBV у животного, и их эффекты были лучшими, чем у эталонного антитела 162.

На фиг.8A–8E представлены результаты анализа посредством ELISA активности связывания антитела, которое содержало замену области CDR по сравнению с гуманизированным антителом M1D, с антигеном HBsAg согласно примеру 6, где по оси абсцисс представлена концентрация антитела (Log₁₀ нг/мл) и по оси ординат представлена величина OD. Результаты показали, что замена областей HCDR1 и LCDR2 антитела M1D не влияла на активность связывания с антигеном HBsAg, что указывает на то, что области HCDR1 и LCDR2 антитела M1D не были ключевыми областями CDR для связывания с антигеном HBsAg.

На фиг.9A–9E представлены результаты анализа посредством ELISA активности связывания антитела, которое содержало замену области CDR по сравнению с гуманизированным антителом M3D, с антигеном HBsAg согласно примеру 6, где по оси абсцисс представлена концентрация антитела (Log₁₀ нг/мл) и по оси ординат представлена величина OD. Результаты показали, что замена тяжелой цепи CDR2 (HCDR2) и легкой цепи CDR2 (LCDR2) не влияла на активность связывания с антигеном HBsAg, что указывает на то, что области HCDR2 и LCDR2 антитела M3D не были ключевыми областями CDR для связывания с антигеном HBsAg.

На фиг.10 представлены результаты анализа с использованием вестерн–блоттинга связывания антител M1D, M3D, 162 с различными полипептидными фрагментами HBsAg а.к. 113–135 с мутацией одного участка согласно примеру 8. Результаты показали, что антитело 162 утрачивало активность связывания с HBsAg, когда в участки в а.к. 120, а.к. 122 и а.к. 123 вносили мутации на аланин, и его основным эпитопом был CKTC (а.к.121–124); M1D утрачивало активность связывания с HBsAg, когда в участки в а.к.118–124 вносили мутацию на аланин, и связываемый им основной эпитоп представлял собой TGPCKTCT (а.к. 118–124), который был более длинным, чем у эталонного антитела 162, и находился после положения эпитопа у эталонного антитела 162; M3D утрачивало активность связывания с HBsAg, когда в участки в а.к. 121–125 вносили мутацию на аланин, и его центральный эпитоп представлял собой CKTCT (а.к. 121–125), который находился перед положением эпитопа антитела 162.

На фиг.11A–11B представлены результаты анализа посредством ELISA активности связывания гуманизированных антител M1D, M3D с HBsAg а.к. 113–135 различных подтипов согласно примеру 9, где по оси абсцисс представлена концентрация антитела (Log₁₀ нг/мл) и по оси ординат представлена величина OD. Результаты показали, что M1D и M3D могли связываться с большинством подтипов HBV.

На фиг.12A–12B представлены кривые для концентраций в крови гуманизированного антитела M1D в сыворотке каждого яванского макака (группа 1) в зависимости от времени после однократной внутривенной инъекции 20 мг/кг гуманизированных антител M1D, M3D согласно примеру 11, где по оси абсцисс представлено время (ч) и по оси ординат представлена концентрация в крови (нг/мл).

На фиг.13A–13B представлены величины Tm для гуманизированных антител M1D, M3D в трех различных буферах согласно примеру 12. По оси абсцисс представлена температура (°C) и по оси ординат представлена CP (кал/°C). Результаты показали, что Tm начала для гуманизированного антитела M1D была выше 61,7°С, и все величины Tm начала для M3D превышали 61,6°С, что указывает на то, что M1D и M3D имели высокую термостабильность.

Информация о последовательности

Информация о некоторых последовательностях, вовлеченных в настоящее изобретение, представлена в таблице 1 ниже.

Таблица 1: Описание последовательностей

SEQ ID NO	Информация о последовательности
1	QVQLQESGPGLVKPSEILSVTCSVSGGSITSNFWSWIRQPPGKGLEWIGYISGSGTYTDYNPSLRSRVTLSVDTSKNQLSLKLSSVTAADTAVYYCARSHDYGSNDYAFDFWGQGLRVTVSS
2	EIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCRATQDISSSLNWYQQKPGKAPQLLIYYANRLESGVPSRFRGSGSGTEFTLTISSLQPEDFTTYYCQQYHSLPLTFGGGTKVEIK
3	QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCAVSGVSISSPYDWTWIRQPPGKGLEWIGRIHGNGGSTSYNPSLKNRVTISKDTSKNQFSLILSSVTAADTAVYYCVRDETWGQGVLVTVSS
4	DIQMSQSPDSLAVSLGERVTINCKSSQSLLYSSNNKNYLAWYQQKPGQAPKLLFYWASTRESGVPNRFSGSGSGTDFTLTIRGLQAEDVAVYYCQQHYTTPLTFGQGTKVEIK
5	QVQLQESGPRLVKSSETLPLTCAVSGASNSSNYWSWIRQPPGKGLEWIGRIYGNSGSTDYNPSLKSRVSISTDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYFCARGSVYTYSWGQGVLVTVSS
6	GGSITSNF
7	ISGSGTYT
8	ARSHDYGSNDYAFDF
9	QDISSS
10	YAN
11	QQYHSLPLT
12	GVSISSPYDW
13	IHGNGGST
14	VRDET
15	QSLLYSSNNKNY
16	WAS
17	QQHYTTPLT
18	GASNSSNY
19	IYGNSGST
20	ARGSVYTYS
21	QVQLQESGPGLVKPSEILSVTCSVS
22	WSWIRQPPGKGLEWIGY
23	DYNPSLRSRVTLSVDTSKNQLSLKLSSVTAADTAVYYC
24	WGQGLRVTVSS
25	EIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCRAT
26	LNWYQQKPGKAPQLLIY
27	RLESGVPSRFRGSGSGTEFTLTISSLQPEDFTTYYC
28	FGGGTKVEIK
29	QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCAVS
30	TWIRQPPGKGLEWIGR
31	SYNPSLKNRVTISKDTSKNQFSLILSSVTAADTAVYYC
32	WGQGVLVTVSS
33	DIQMSQSPDSLAVSLGERVTINCKSS
34	LAWYQQKPGQAPKLLFY
35	TRESGVPNRFSGSGSGTDFTLTIRGLQAEDVAVYYC
36	FGQGTKVEIK
37	QVQLQESGPRLVKSSETLPLTCAVS
38	WSWIRQPPGKGLEWIGR
39	DYNPSLKSRVSISTDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYFC
40	QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYTSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR
41	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTP
42	QVQLQESGPGLVKPSGTLSLTCAVSGGSISSSNWWSWVRQPPGKGLEWIGEIYHSGSTNYNPSLKSRVTISVDKSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR
43	DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSTP
44	QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVS
45	DYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYC
46	WGQGTTVTVSS
47	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRAT
48	LNWYQQKPGKAPKLLIY
49	RLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC
50	QVQLQESGPGLVKPSGTLSLTCAVS
51	TWVRQPPGKGLEWIGR
52	SYNPSLKSRVTISVDKSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYC
53	GQGTLVTVSS
54	DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSS
55	LAWYQQKPGQPPKLLFY
56	TRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYC
57	QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSITSNFWSWIRQPPGKGLEWIGYISGSGTYTDYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARSHDYGSNDYAFDFWGQGTTVTVSS
58	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRATQDISSSLNWYQQKPGKAPKLLIYYANRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYHSLPLTFGGGTKVEIK
59	QVQLQESGPGLVKPSGTLSLTCAVSGVSISSPYDWTWVRQPPGKGLEWIGRIHGNGGSTSYNPSLKSRVTISVDKSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCVRDETWGQGTLVTVSS
60	DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLFYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQHYTTPLTFGQGTKVEIK
61	GGACAGCCKGGAAGGTGTGC
62	GAGGCAGTTCCAGATTTCAA
63	CCGCGTACTTGTTGTTGCTCTGT
64	5’– AGTAGCAACTGCAACCGGTGTACATTCTcaggtgcagctgcaggagtcaggcccag
65	5’– caggagtcaggcccaggactggtgaagccttcggagaCCCTGTCCCTCACCTGCAC
66	5’– aagccttcggagaCCCTGTCCCTCACCTGCACtgtctctggtggctccatc
67	5’– GTTCTTGGACGTGTCTACGGATATGGTGACTCGACTCTTGAGGGAGGGGTTGTAGT
68	5’– TCCGTAGACACGTCCAAGAACCAGTtctccctgaaactgagctc
69	5’– GATGGGCCCTTGGTCGACGCtgaagagacggtgacGGTGGTcccttggccccagaaatc
70	5’– AGTAGCAACTGCAACCGGTGTACATTCTGACATACAGATGACGCAGTCTCCATCC
71	5’– CAGCAAAAACCGGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATTATGC
72	5’– GAACCTTGATGGGACCCCACTTTGCAAACGATTTGCATAATAGATCAGGAGC
73	5’– CTGTCCCAGATCCACTGCCACTGAACCTTGATGGGACCCC
74	5’– GCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAACCTGAGG
75	5’– GCAGCCTGCAACCTGAGGATTTTGCAACTTATTACTGTCAAC
76	5’– GACCAAGGTGGAAATCAAACGTACGGTGGCTGCACCAT
77	5’–AGTAGCAACTGCAACCGGTGTACATTCTCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCC
78	5’– ATTCCCGGGTagatgcccaGTAAAAGAGCAGCTTAGGAGGCTGTCCTGGTTTCTGCTG
79	5’– ggtgtctccatcagcagtccttatgacTGGACCTGGGTCCGCCAGCCCCCAGGGAAG
80	5’– AACTGGTTCTTGGACTTGTCTACTGAAATGGTGACTCGACTCTTGAGGGAGGGGTTG
81	5’– AGACAAGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACCGCCGC
82	5’– gaaaccTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCGTCGACCAAGGGCCCATC
83	5’– AGTAGCAACTGCAACCGGTGTACATTCTGACATCGTGATGACCCAGTCTCCAGACTCC
84	5’– CCCAGTCTCCAGACTCCCTGGCTGTGTCTCTGGGAGAGAGGGCCACCATCAACTGCAAGTCCAG
85	5’– CAGCAGAAACCAGGACAGCCTCCTAAGCTGCTCTTTTACtgggcatctACCCGGGAAT
86	5’– GTGAAATCTGTCCCAGATCCACTGCCACTGAATCGGTCAGGGACCCCGGATTCCCGGGTagatgcc
87	5’– GGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGGCTGAAGATG
88	5’– ATGGTGCAGCCACCGTACGTTTGATTTCCACCTTGGTCC
89	5’–AGTAGCAACTGCAACCGGTGTACATTCTCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCAGGC
90	5’– GATGGGCCCTTGGTCGACGCTGAAGAGACGGTGAC
91	5’– AGTAGCAACTGCAACCGGTGTACATTCTGACATACAGATGACGCAGTC
92	5’– ATGGTGCAGCCACCGTACGTTTGATTTCCACCTTGGTCCC
93	5’– GTAGTAACTACTGATGGAGCCACCAGAGACAGTGCAGGTGAG
94	5’– GgtggctccatcagtagttactacTGGAGCTGGATCCGCCAG
95	5’– ATAGTAACTACCACTGCTGACGGAGCCACCAGAGACAGTGCAGGTGAG
96	5’– GgtggctccgtcagcagtggtagttactATTGGAGCTGGATCCGCCAG
97	5’– GGTGCTCCCACTGGTATAGATATACCCAATCCACTCCAG
98	5’– AtctataccagtgggagcaccGACTACAACCCCTCCCTC
99	5’– TGTGTAACTACTACTACTACTAATATACCCAATCCACTCCAG
100	5’– AttagtagtagtagtagttacacaGACTACAACCCCTCCCTC
101	5’– GTAGCTGCTGCTAACACTCTGAGTTGCCCGGCAAGTGATGG
102	5’– CagagtgttagcagcagctacTTAAATTGGTATCAGC
103	5’– AGTATTACTTCCGATGTTGGAGCTAGTTGCCCGGCAAGTGATGG
104	5’– AgctccaacatcggaagtaatactTTAAATTGGTATCAGC
105	5’– GACCCCACTTTGCAAACGGGATGCAGCATAGATCAGGAGCTTAGG
106	5’– CCTAAGCTCCTGATCTATGctgcatccCGTTTGCAAAGTGGGGTC
107	5’– GACCCCACTTTGCAAACGAGACGCCTTATAGATCAGGAGCTTAGG
108	5’– CCTAAGCTCCTGATCTATAaggcgtctCGTTTGCAAAGTGGGGTC
109	5’– AGTGAGAGGGTAATTGTAATCTTGTAGACAGTAATAAGTTGCAAAATC
110	5’– CtacaagattacaattaccctCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAG
111	5’– AGTGAGAGGTAAACTACTACTCTGATGACAGTAATAAGTTGCAAAATC
112	5’– catcagagtagtagtttacctCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAG
113	5’–AGTAGCAACTGCAACCGGTGTACATTCTCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCG
114	5’– GATGGGCCCTTGGTCGACGCTGAGGAGACGGTGACCAG
115	5’– AGTAGCAACTGCAACCGGTGTACATTCTGACATCGTGATGACCCAGTCTC
116	5’– ATGGTGCAGCCACCGTACGTTTGATTTCCACCTTGGTC
117	5’– GGAGTAACCACCACTGCTGATGGAGCCACCAGAGACAGCGCAGGTGAGGGACAG
118	5’– ggtggctccatcagcagtggtggttactccACCTGGGTCCGCCAGCCC
119	5’– CCAGTTACTACTGCTGATGGAGCCACCAGAGACAGCGCAGGTGAGGGACAG
120	5’– GgtggctccatcagcagtagtaactggACCTGGGTCCGCCAGCCC
121	5’– GGTGCTCCCACTATGATAGATTCGTCCAATCCACTCCAG
122	5’– AtctatcatagtgggagcaccAGCTACAACCCCTCCCTCAAG
123	5’– TGTGCTACCACCACTACCACTAATTCGTCCAATCCACTCCAG
124	5’– attagtggtagtggtggtagcacaAGCTACAACCCCTCCCTCAAG
125	5’– ATAGGTCTTTCCATCACTATGCAGGAGGCTCTGGCTGGACTTGCAGTTGATGGTGGC
126	5’– cagagcctcctgcatagtgatggaaagacctatTTAGCCTGGTACCAGCAGAAAC
127	5’– GTAGCTGCTGCTAACACTCTGGCTGGACTTGCAGTTGATGGTGGC
128	5’– CagagtgttagcagcagctacTTAGCCTGGTACCAGCAGAAAC
129	5’– GGGACCCCGGATTCCCGGGTAGAACCCAAGTAAAAGAGCAGCTTAGGAGG
130	5’– CCTCCTAAGCTGCTCTTTTACTtgggttctACCCGGGAATCCGGGGTCCC
131	5’– GGGACCCCGGATTCCCGGGTGGATGCACCGTAAAAGAGCAGCTTAGGAGG
132	5’– CCTCCTAAGCTGCTCTTTTACGgtgcatccACCCGGGAATCCGGGGTCCC
133	5’– CGTCCAAGGAGTACTATAATATTGCTGACAGTAATACACTGCCACATC
134	5’– CagcaatattatagtactccttggacgTTCGGCCAAGGGACCAAG
135	5’– CGTCCAAGGAGTTTGTAGAGCTTGCATACAGTAATACACTGCCACATC
136	5’– AtgcaagctctacaaactccttggacgTTCGGCCAAGGGACCAAG
137	GGSISSYY
138	GGSVSSGSYY
139	AAS
140	KAS
141	IYHSGST
142	ISGSGGST
143	LGS
144	GAS
145	IYTSGST
146	ISSSSSYT
147	QSVSSSY
148	SSNIGSNT
149	LQDYNYPLT
150	HQSSSLPLT
151	GGSISSGGYS
152	GGSISSSNW
153	QSLLHSDGKTY
154	QSVSSSY
155	QQYYSTPWT
156	MQALQTPWT
157	QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSYYWSWIRQPPGKGLEWIGYISGSGTYTDYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARSHDYGSNDYAFDFWGQGTTVTVSS
158	QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSVSSGSYYWSWIRQPPGKGLEWIGYISGSGTYTDYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARSHDYGSNDYAFDFWGQGTTVTVSS
159	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRATQDISSSLNWYQQKPGKAPKLLIYAASRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYHSLPLTFGGGTKVEIK
160	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRATQDISSSLNWYQQKPGKAPKLLIYKASRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYHSLPLTFGGGTKVEIK
161	QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSITSNFWSWIRQPPGKGLEWIGYISSSSSYTDYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARSHDYGSNDYAFDFWGQGTTVTVSS
162	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRATSSNIGSNTLNWYQQKPGKAPKLLIYYANRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYHSLPLTFGGGTKVEIK
163	QVQLQESGPGLVKPSGTLSLTCAVSGVSISSPYDWTWVRQPPGKGLEWIGRIYTSGSTSYNPSLKSRVTISVDKSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCVRDETWGQGTLVTVSS
164	QVQLQESGPGLVKPSGTLSLTCAVSGVSISSPYDWTWVRQPPGKGLEWIGRISGSGGSTSYNPSLKSRVTISVDKSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCVRDETWGQGTLVTVSS
165	DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLFYLGSTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQHYTTPLTFGQGTKVEIK
166	DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLFYGASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQHYTTPLTFGQGTKVEIK
167	DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLHSDGKTYLAWYQQKPGQPPKLLFYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQHYTTPLTFGQGTKVEIK
168	SSTTSTGPCKTCTTPAQGTSMFP
169	SSTTATGPCKTCTTPAQGTSMFP
170	SSTTSAGPCKTCTTPAQGTSMFP
171	SSTTSTAPCKTCTTPAQGTSMFP
172	SSTTSTGACKTCTTPAQGTSMFP
173	SSTTSTGPSKTCTTPAQGTSMFP
174	SSTTSTGPCATCTTPAQGTSMFP
175	SSTTSTGPCKACTTPAQGTSMFP
176	SSTTSTGPCKTSTTPAQGTSMFP
177	SSTTSTGPCKTCATPAQGTSMFP
178	SSTTSTGPCKTCTAPAQGTSMFP
179	SSTTSTGPCKTCTTAAQGTSMFP
180	SSTTSTGPCKTCTTPAAGTSMFP
181	SSTTSTGPCKTCTTPAQGASMFP
182	SSTTSTGPCKTCTTPAQGTAMFP
183	ATCAACTACCGCCACGGGACCATGCAAGACCTGCAC
184	GGTCCCGTGGCGGTAGTTGATGTTCCTGGAAGTAGA
185	AACTACCAGCGCGGGACCATGCAAGACCTGCACGAT
186	CATGGTCCCGCGCTGGTAGTTGATGTTCCTGGAAGT
187	ACCAGCACGGCACCATGCAAGACCTGCACGATTCCT
188	CTTGCATGGTGCCGTGCTGGTAGTTGATGTTCCTGG
189	CAGCACGGGAGCATGCAAGACCTGCACGATTCCTGC
190	GTCTTGCATGCTCCCGTGCTGGTAGTTGATGTTCCT
191	ACGGGACCATCCAAGACCTGCACGATTCCTGCTCAA
192	GCAGGTCTTGGATGGTCCCGTGCTGGTAGTTGATGT
193	GGGACCATGCCGGACCTGCACGATTCCTGCTCAAGG
194	GTGCAGGTCCGGCATGGTCCCGTGCTGGTAGTTGAT
195	GGGACCATGCGCGACCTGCACGATTCCTGCTCAAGG
196	GTGCAGGTCGCGCATGGTCCCGTGCTGGTAGTTGAT
197	ACCATGCAAGGCCTGCACGATTCCTGCTCAAGGAAC
198	ATCGTGCAGGCCTTGCATGGTCCCGTGCTGGTAGTT
199	TGCAAGACCTCCACGATTCCTGCTCAAGGAACCTCT
200	AGGAATCGTGGAGGTCTTGCATGGTCCCGTGCTGGT
201	CAAGACCTGCGCGATTCCTGCTCAAGGAACCTCTAT
202	GCAGGAATCGCGCAGGTCTTGCATGGTCCCGTGCTG
203	GACCTGCACGGCTCCTGCTCAAGGAACCTCTATGTT
204	TGAGCAGGAGCCGTGCAGGTCTTGCATGGTCCCGTG
205	CTGCACGATTGCTGCTCAAGGAACCTCTATGTTTCC
206	CCTTGAGCAGCAATCGTGCAGGTCTTGCATGGTCCC
207	GATTCCTGCTGCAGGAACCTCTATGTTTCCCTCTTG
208	GAGGTTCCTGCAGCAGGAATCGTGCAGGTCTTGCAT
209	TGCTCAAGGAGCCTCTATGTTTCCCTCTTGTTGCTG
210	AACATAGAGGCTCCTTGAGCAGGAATCGTGCAGGTC
211	TCAAGGAACCGCTATGTTTCCCTCTTGTTGCTGTAC
212	GGAAACATAGCGGTTCCTTGAGCAGGAATCGTGCAG
213	STTTSTGPCKTCTTPAQGNSMFP
214	TSTTSTGPCKTCTIPAQGTSMFP
215	SSTTSTGPCRTCTTPAQGTSMYP
216	SSTTSTGPCRTCTTLAQGTSMFP
217	STTTSTGPCKTCTTLAQGTSMFP
218	STTTSTGPCKTCTALAQGTSMFP
219	STTTSTGPCRTCTTLAQGTSMLP
220	SSTTSTGPCKTCTTPAQGNSMYP

Подробное описание изобретения

Определение терминов

В рамках настоящего изобретения научные и технические термины, используемые в настоящем описании, имеют значения, обычно подразумеваемые специалистами в данной области, если нет иных указаний. Более того, стадии работы с клеточными культурами, экспериментов по биохимии, химии нуклеиновых кислот, иммунологии и т.п., используемые в настоящем описании, представляют собой стандартные стадии, широко используемые в соответствующих областях. Также для лучшего понимания настоящего изобретения ниже предоставлены определения и пояснения связанных с ним терминов.

Как используют в рамках изобретения, термин "антитело" относится к молекуле иммуноглобулина, которая, как правило, состоит из двух пар полипептидных цепей (каждая пара имеет "легкую" (L) цепь и "тяжелую" (H) цепь). Легкие цепи антител можно классифицировать как легкие цепи к и л. Тяжелые цепи антител можно классифицировать как µ, д, г, б или е, и изотипы антител определяют как IgM, IgD, IgG, IgA и IgE, соответственно. В легких и тяжелых цепях вариабельная область и константная область соединены областью "J" приблизительно из 12 или более аминокислот, и тяжелая цепь дополнительно содержит область "D" приблизительно из 3 или более аминокислот. Каждая тяжелая цепь состоит из вариабельной области тяжелой цепи (V_H) и константной области тяжелой цепи (C_H). Константная область тяжелой цепи состоит из трех доменов (C_H1, C_H2 и C_H3). Каждая легкая цепь состоит из вариабельной области легкой цепи (VL) и константной области легкой цепи (C_L). Константная область легкой цепи состоит из одного домена C_L. Константная область антитела может опосредовать связывание иммуноглобулина с тканями хозяина или фактором, включающим различные клетки (например, эффекторные клетки) иммунной системы и первый компонент (C1q) классической системы комплемента. Области V_H и V_L также можно подразделить на гипервариабельные (называемые определяющими комплементарность областями (CDR)), между которыми располагаются относительно консервативные области, называемые каркасными областями (FR). Каждая из V_H и V_L состоит из трех CDR и четырех FR, расположенных в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 от N–конца к С–концу. Вариабельные области (V_H и V_L) каждой пары тяжелая/легкая цепь образуют связывающий участок антитела, соответственно. Распределение аминокислот в различных областях или доменах соответствует определению по Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 и 1991)), или Chothia & Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196: 901–917; Chothia et al. (1989) Nature 342: 878–883.

Как используют в рамках изобретения, термин "определяющая комплементарность область" или "CDR" относится к аминокислотным остаткам в вариабельных областях антитела, которые ответственны за связывание антигена, которые, главным образом, могут включать остатки 24–34 {LCDR1}, 50–56 {LCDR2}, 89–97 {LCDR3} в вариабельной области легкой цепи, и остатки 31–35 {HCDR1}, 50–65 {HCDR2}, 95–102 {HCDR3} в вариабельной области тяжелой цепи (см., например, Kabat et al, Sequences of Proteins of lmmunological lnterest, 5^th edition, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Maryland (1991), или остатки 26–32 {Ll}, 50–52 {L2}, 91–96 {L3} в вариабельной области легкой цепи и остатки 26–32 {H1}, 53–55 {H2}, 96–101 {H3} в вариабельной области тяжелой цепи (см., Chothia и Lesk J. Mol. Biol. 196: 901–917 (1987)).

Как используют в рамках изобретения, термин остатки "каркасной области" или "FR" относятся к аминокислотным остаткам, отличным от остатков CDR, как определено выше, в вариабельных областях антитела.

Термин "антитело" не ограничивается конкретным способом получения антитела. Например, он включает рекомбинантные антитела, моноклональные антитела и поликлональные антитела. Антитела могут представлять собой антитела различных изотипов, например, антитела IgG (например, подтип IgGl, IgG2, IgG3 или IgG4), IgA1, IgA2, IgD, IgE или IgM.

Как используют в рамках изобретения, термин "антигенсвязывающий фрагмент" антитела относится к полипептиду, содержащему фрагмент полноразмерного антитела, который сохраняет способность специфически связываться с тем же антигеном, с которым связывается полноразмерное антитело, и/или конкурирует с полноразмерным антителом за специфическое связывание с антигеном, и который также называется "антигенсвязывающей частью". См., главным образом, Fundamental Immunology, Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed., Raven Press, NY (1989), которая включена в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме для любых целей. Антигенсвязывающий фрагмент антитела можно получать способами рекомбинантных ДНК или посредством ферментативного или химического расщепления интактного антитела. В некоторых случаях антигенсвязывающий фрагмент включает Fab, Fab', F(ab')₂, Fd, Fv, dAb и фрагменты определяющих комплементарность областей (CDR), одноцепочечные антитела (например, scFv), химерные антитела, диантитела и полипептиды, содержащие по меньшей мере часть антитела, которая является достаточной для сообщения полипептиду способности к специфическому связыванию антигена.

Как используют в рамках изобретения, термин "Fd–фрагмент" относится к фрагменту антитела, состоящему из доменов V_H и C_H1; термин "dAb–фрагмент" относится к фрагменту антитела, состоящему из V_H–домена (Ward et al, Nature 341:544 546 (1989)); термин "Fab–фрагмент" относится к фрагменту антитела, состоящему из доменов V_L, V_H, C_L и C_H1; термин "F(ab')₂–фрагмент" относится к фрагменту антитела, содержащему два Fab–фрагмента, связанных дисульфидным мостиком в шарнирной области.

Как используют в рамках изобретения, термин "Fv–фрагмент" относится к фрагменту антитела, состоящему из доменов V_L и V_H одного плеча антитела. Fv–фрагментом обычно считается наименьший фрагмент антитела, который может образовывать полный антигенсвязывающий центр. Полагают, что шесть CDR сообщают антителу специфичность связывания антигена. Однако даже одна вариабельная область (например, Fd–фрагмент, который содержит только три CDR, специфичных к антигену) способна распознавать и связывать антиген, хотя и с меньшей аффинностью, чем полный связывающий участок.

В некоторых случаях антигенсвязывающий фрагмент антитела представляет собой одноцепочечное антитело (например, scFv), где домены V_L и V_H спарены с образованием одновалентной молекулы через линкер, который позволяет им образовать единую полипептидную цепь (см., например, Bird et al., Science 242: 423–426 (1988); Huston et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879–5883 (1988); и Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, под редакцией Roseburg and Moore, Springer–Verlag, New York, pp. 269–315 (1994)). Такая молекула scFv может иметь общую структуру: NH₂–V_L–линкер–V_H–COOH или NH₂–V_H–линкер–V_L–COOH. Подходящий линкер уровня техники может состоять из повторяющейся аминокислотной последовательности GGGGS или ее варианта. Например, можно использовать линкер, имеющий аминокислотную последовательность (GGGGS)₄, а также можно использовать его варианты (Holliger et al. (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444–6448). Другие линкеры, пригодные в рамках настоящего изобретения, описаны Alfthan et al. (1995), Protein Eng. 8: 725–731, Choi et al. (2001), Eur. J. Immunol. 31: 94–106, Hu et al. (1996), Cancer Res. 56: 3055–3061, Kipriyanov et al. (1999), J. Mol. Biol. 293: 41–56 и Roovers et al. (2001), Cancer Immunol.

Как используют в рамках изобретения, термин "одноцепочечное антитело–Fc" или "scFv–Fc" относится к сконструированному антителу, образованному путем связывания scFv с Fc–фрагментом антитела. Как используют в рамках изобретения, термин "Fc–фрагмент" относится к фрагменту антитела, образованному связыванием второй и третьей константных областей первой тяжелой цепи антитела с второй и третьей константными областями второй тяжелой цепи через дисульфидные связи. Fc–фрагмент антитела обладает различными функциями, но он не вовлечен в связывание антигена.

В некоторых случаях антигенсвязывающий фрагмент антитела представляет собой диантитело, т.е. двухвалентное антитело, в котором домены V_H и V_L экспрессируются на одной полипептидной цепи, однако используемый линкер является слишком коротким, чтобы позволить образование пары между двумя доменами одной цепи, тем самым вынуждая домен образовывать пару с комплементарным доменом другой цепи и создавая два антигенсвязывающих центра (см., например, Holliger P.et al., Proc. Natl. Acad.Sci.USA 90: 6444–6448 (1993), и Poljak R.J.et al., Structure 2: 1121–1123 (1994)).

Антигенсвязывающий фрагмент (например, фрагменты антител, описанные выше) антитела можно получать из данного антитела (например, моноклонального антитела, описанного в настоящем описании) с использованием общепринятых способов, известных специалистам в данной области (например, способы рекомбинантных ДНК или способы ферментативного или химического расщепления), и их можно подвергать скринингу в отношении специфичности тем же способом, посредством которого проводят скрининг интактных антител.

В этом контексте, если конкретно не указано, когда упоминается термин "антитело", он включает не только интактные антитела, но также и антигенсвязывающие фрагменты антител.

Как используют в рамках изобретения, термины "mAb" и "моноклональные антитело" относятся к антителу или фрагменту антитела из совокупности высокогомологичных молекул антител, т.е. совокупности полностью идентичных молекул антител за исключением природной мутации, которая может возникнуть спонтанно. Моноклональное антитело обладает высокой специфичностью в отношении одного эпитопа антигена. Поликлональное антитело, относительно моноклонального антитела, обычно содержит по меньшей мере два или более различных антител, которые обычно распознают различные эпитопы на антигене. Моноклональные антитела обычно получают способом гибридом, впервые описанным Kohler et al. (Nature, 256:495, 1975), а также их можно получить способом рекомбинантных ДНК (см., например, U.S.P 4816567).

Например, моноклональные антитела можно получать следующим образом. Во–первых, не являющегося человеком примата (например, яванского макака) или других подходящих животных–хозяев иммунизируют посредством инъекции иммуногена (если необходимо, добавляют адъюванты). Способы инъекции иммуногенов или адъювантов представляют собой подкожную инъекцию в несколько точек или внутрибрюшинную инъекцию. Предварительная конъюгация иммуногенов с некоторыми известными белками (например, сывороточным альбумином или ингибитором трипсина сои) может обеспечить иммуногенность антигенов у хозяина. Адъюванты могут представлять собой адъювант Фрейнда или MPL–TDM и т.д. После иммунизации животного у животного продуцируются лимфоциты, секретирующие антитела, которые специфически связываются с иммуногеном. Кроме того, лимфоциты также можно получать посредством иммунизации in vitro. Представляющие интерес лимфоциты собирают и подвергают слиянию с миеломными клетками с использованием подходящего агента слияния (такого как ПЭГ), тем самым получая гибридомные клетки (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles и Practice, pp.59–103, Academic Press, 1996). Гибридомные клетки, полученные, как описано выше, высевают в подходящую культуральную среду и выращивают в среде, и культуральная среда предпочтительно содержит одно или несколько веществ, способных ингибировать рост неслитых родительских миеломных клеток. Например, в случае родительских миеломных клеток с дефицитом гипоксантингуанинфосфориозилтрансферазы (HGPRT или HPRT), рост клеток с дефицитом HGPRT ингибируется посредством добавления веществ, таких как гипоксантин, аминоптерин и тимидин (культуральная среда HAT) в культуральную среду. Предпочтительные миеломные клетки должны иметь высокую частоту слияния, стабильную способность секретировать антитела, должны быть чувствительными к культуральной среде HAT и т.п. Культуральные среды для выращивания гибридомных клеток используют для обнаружения продукции моноклональных антител против конкретных антигенов. Для определения специфичности связывания моноклональных антител, продуцированных гибридомными клетками, можно использовать следующие способы: иммунопреципитация или анализы связывания in vitro, такие как радиоиммунный анализ (RIA) и твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA). Например, для определения аффинности моноклональных антител можно использовать анализ Скэтчарда, описанный в Munson et al., Anal. Biochem. 107: 220 (1980). После определения специфичности, аффинности и реактивности антител, продуцированных гибридомами, представляющие интерес клеточные линии можно субклонировать стандартным способом лимитирующих разведений, описанным в Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59–103, Academic Press, 1996. Подходящая культуральная среда может представлять собой DMEM или RPMI–1640 и т.д. Кроме того, гибридомные клетки можно выращивать в форме асцитных опухолей в организмах животных. С использованием традиционных способов очистки иммуноглобулинов, таких как хроматография на агарозном геле с белком A, хроматография с гидроксиапатитом, гель–электрофорез, диализ и аффинная хроматография, из клеточной культуры, асцитной жидкости или сыворотки можно выделять моноклональные антитела, секретируемые клетками субклона.

Моноклональные антитела также можно получать рекомбинантными способами генной инженерии. Праймеры нуклеиновых кислот, которые специфически связываются с генами тяжелой цепи и легкой цепи Mab, подвергают амплификации способом ПЦР с получением молекул ДНК, кодирующих тяжелую цепь и легкую цепь Mab из гибридомных клеток. Полученные молекулы ДНК встраивают в экспрессирующий вектор, клетки–хозяева (например, клетки E. coli, клетки COS, клетки CHO или другие миеломные клетки, которые не продуцируют иммуноглобулин) трансфицируют ими и культивируют в подходящих условиях с получением представляющих интерес антител посредством рекомбинантной экспрессии.

Как используют в рамках изобретения термины "антигенный эпитоп" и "эпитоп" относятся к части антигена, с которой специфически связывается иммуноглобулин или антитело. "Эпитоп" также известен как "антигенная детерминанта". Эпитоп или антигенная детерминанта в основном состоит из химических активных поверхностных групп молекулы, таких как аминокислоты, углеводы или сахарные боковые цепи, и, как правило, обладает определенной трехмерной структурой и определенными зарядовыми характеристиками. Например, эпитоп, как правило, содержит по меньшей мере 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15 последовательно расположенных или не расположенных последовательно аминокислот в уникальной пространственной конформации, которая может быть "линейной" или "конформационной". См., например, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996). В линейном эпитопе все участки взаимодействия между белком и взаимодействующей с ним молекулой (например, антителом) присутствуют линейно вдоль первичной аминокислотной последовательности белка. В конформационном эпитопе участки взаимодействия охватывают аминокислотные остатки, которые отделяют друг от друга участки взаимодействия в белке. Антитела можно подвергать скринингу в зависимости от способности к конкуренции за связывание с одним и тем же эпитопом общепринятыми способами, известными специалисту в данной области. Например, исследование конкуренции или перекрестной конкуренции можно проводить для получения антител, которые конкурируют или перекрестно конкурируют друг с другом за связывание с антигенами. Высокопрозводительные способы получения антител, связывающихся с одним и тем же эпитопом, которые основаны на их перекрестной конкуренции, описаны в международной патентной заявке WO 03/48731.

Как используют в рамках изобретения, термин "ген антитела эмбрионального типа" или "сегмент гена антитела эмбрионального типа" относится к последовательности, присутствующей в геноме организма, кодирующего иммуноглобулин, который не подвергался процессу созревания, который может приводить к генетическим перестройкам и мутациям для экспрессии конкретного иммуноглобулина. В рамках настоящего изобретения, выражение "ген тяжелой цепи эмбрионального типа" относится к гену или фрагменту гена антитела эмбрионального типа, кодирующему тяжелую цепь иммуноглобулина, который включает V–ген (вариабельный), D–ген (разнообразие), J–ген (соединение) и C–ген (константный); аналогично, выражение "ген легкой цепи эмбрионального типа" относится к гену или фрагменту гена антитела эмбрионального типа, кодирующему легкую цепь, который включает V–ген (вариабельный), J–ген (соединение) и C–ген (константный). В рамках настоящего изобретения аминокислотная последовательность, кодирующая геном антитела эмбрионального типа или фрагментом гена эмбрионального типа, также называется "последовательностью эмбрионального типа". Ген антитела эмбрионального типа или фрагмент гена антитела эмбрионального типа и их соответствующие последовательности эмбрионального типа хорошо известны специалистам в данной области и могут быть получены или запрошены из профессиональных баз данных (например, IMGT, unswag, NCBI или VBASE2).

Как используют в рамках изобретения, термин "специфически связывать" или "специфически связывающийся" относится к связыванию двух молекул неслучайным образом, например, путем реакции между антителом и антигеном, на который оно направлено. В некоторых вариантах осуществления антитело, которое специфически связывается с антигеном (или антитело, специфичное к антигену), относится к антителу, которое связывается с антигеном с аффинностью (K_D) менее чем приблизительно 10^–5 M, например, менее чем приблизительно 10^–6 M, 10^–7 M, 10^–8 M, 10^–9 M или 10^–10 M или менее.

Как используют в рамках изобретения, термин "K_D" относится к константе диссоциации конкретного взаимодействия антитело–антиген, которую используют для описания аффинности связывания антитела с антигеном. Чем меньшей является константа диссоциации, тем более прочно связывается антитело, и тем выше аффинность между антителом и антигеном. Как правило, антитело (например, антитело по изобретению) связывается с антигеном (например, HBsAg) с K_D менее чем приблизительно 10^–5 M, например, менее чем приблизительно 10^–6 M, 10^–7 M, 10^–8 M, 10^–9 M или 10^–10 M или менее, при определении, например, посредством поверхностного плазмонного резонанса (SPR) в устройстве BIACORE.

Как используют в рамках изобретения, термин "иммуногенность" относится к способности стимулировать образование специфических антител или сенсибилизированных лимфоцитов в организмах. Он не только относится к свойству антигена стимулировать конкретный иммуноцит к активации, пролиферации и дифференцировке с образованием в итоге иммунологического эффекторного вещества, такого как антитело и сенсибилизированный лимфоцит, но также относится к специфическому иммунному ответу, при котором в иммунной системе организма после стимуляции антигеном может образовываться антитело или сенсибилизированный T–лимфоцит. Когда гетерологичное антитело вводят индивидууму, иммуногенность гетерологичного антитела является нежелательной у индивидуума. Такая иммуногенность может приводить к отторжению гетерологичного антитела иммунной системой/иммунной клеткой индивидуума, что, тем самым, приводит к снижению эффективности гетерологичного антитела у индивидуума или нежелательным побочным эффектам у индивидуума. Таким образом, перед введением человеку, как правило, гетерологичное антитело (например, антитело, происходящее из яванского макака) необходимо модифицировать для снижения его иммуногенности настолько, насколько это возможно.

Как используют в рамках изобретения, термин "химерное антитело" относится к такому антителу, где часть его легкой цепи и/или тяжелой цепи происходит из антитела (которое может происходить из конкретного вида или принадлежать к конкретному типу или подтипу антител), и другая часть его легкой цепи и/или тяжелой цепи происходит из другого антитела (которое может происходить из идентичного или отличающегося вида или принадлежать к идентичному или отличающемуся типу или подтипу антител), при условии, что антитело все еще сохраняет активность связывания с представляющим интерес антигеном (U.S.P 4816567, выданный Cabilly et al.; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851–6855 (1984)). Например, термин "химерное антитело" может включать такое антитело (например, химерное антитело человека–обезьяны), где вариабельная область тяжелой цепи и легкой цепи антитела происходит из первого антитела (например, антитело, происходящее из яванского макака), в то время как константная область тяжелой цепи и легкой цепи антитела происходит из второго антитела (например, антитела человека).

Как используют в рамках изобретения, термин "гуманизированное антитело" относится к генетически модифицированному не являющемуся человеческим антителу, аминокислотная последовательность которого модифицирована для повышения его гомологии с последовательностью антитела человека. Как правило, все или часть областей CDR гуманизированного антитела происходят из не являющегося человеческим антитела (донорное антитело), и все или часть областей не CDR (например, FR вариабельной области и/или константная область) происходят из не являющегося человеческим иммуноглобулина (реципиентное антитело). Гуманизированное антитело как правило, сохраняет предполагаемые свойства донорного антитела, включая, но не ограничиваясь ими, антигенную специфичность, аффинность, реактивность, способность нейтрализовывать и/или расщеплять вирус и т.п. Донорное антитело может представлять собой антитело мыши, крысы, кролика или не являющегося человеком примата (например, яванского макака), которое обладает предполагаемыми свойствами (например, антигенная специфичность, аффинность, реактивность, способность к нейтрализации вируса и/или способность к выведению вируса).

Гуманизированное антитело является особенно преимущественным, поскольку оно способно сохранять предполагаемые свойства не являющегося человеческим донорного антитела (например, происходящего из яванского макака антитела) и является эффективным в отношении снижения иммуногенности не являющегося человеческим донорного антитела (например, происходящего из яванского макака антитела) у человека. Однако вследствие проблем соответствия между CDR донорного антитела и FR реципиентного антитела, предполагаемые свойства гуманизированного антитела (например, антигенная специфичность, аффинность, реактивность, способность к нейтрализации вируса и/или способность к выведению вируса), как правило, являются худшими, чем предполагаемые свойства не являющегося человеческим донорного антитела (например, происходящего из яванского макака антитела).

Таким образом, хотя исследователи данной области провели тщательные исследования, касающиеся гуманизации антител, и достигли некоторого прогресса (см., например, Jones et al., Nature, 321:522 525 (1986); Reichmann et al., Nature, 332:323 329 (1988); Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593 596 (1992); и Clark, Immunol. Today 21: 397 402 (2000)), в данной области отсутствует детальное руководство, касающееся того, каким образом можно в достаточной степени гуманизировать определенное донорное антитело, чтобы позволить полученному гуманизированному антителу иметь настолько высокую степень гуманизации, насколько это возможно, при сохранении ожидаемых свойств донорного антитела настолько, насколько это возможно. Специалисты в данной области должны исследовать, изучать и модифицировать конкретное донорное антитело и должны осуществить большую творческую деятельность для получения гуманизированного антитела, которое не только обладает высокой степенью гуманизации (например, степенью гуманизации по меньшей мере 89%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100%), но также сохраняет предусматриваемые свойства донорного антитела.

В рамках настоящего изобретения, чтобы обеспечить сохранение гуманизированным антителом свойств донорного антитела (включая, например, специфичность, аффинность, реактивность, способность к нейтрализации вируса и/или способность к выведению вируса) настолько, насколько это возможно, каркасная область (FR) в гуманизированном антителе по настоящему изобретению может содержать как аминокислотные остатки реципиентного антитела, происходящего из человека, так и аминокислотные остатки соответствующего донорного антитела, происходящего не из человека.

Более того, чтобы далее увеличить степень гуманизации так, чтобы снизить иммуногенность, вызываемую не являющимися человеческими аминокислотными остатками, настолько, насколько это возможно, часть аминокислотных остатков, происходящих из областей CDR донорного антитела, в гуманизированном антителе в рамках настоящего изобретения, может быть заменена, например, на соответствующие аминокислотные остатки областей CDR иммуноглобулина человека или другие аминокислотные остатки.

Кроме того, чтобы далее улучшить или оптимизировать характеристики гуманизированного антитела, часть аминокислотных остатков в вариабельных областях тяжелой и легкой цепей гуманизированного антитела по изобретению может быть далее заменена, например, на аминокислотные остатки, которые не происходят ни из реципиентного антитела, ни из донорного антитела.

В частности, в рамках настоящей заявки авторы изобретения впервые разработали три химерных моноклональных антитела яванского макака–человека с превосходными свойствами, названных M1–23, M3–23 и M3–13, соответственно (их вариабельные области тяжелой и легкой цепей указаны в SEQ ID NO: 1–5, соответственно): три антитела могут не только специфически распознавать/связывать HBsAg и нейтрализовывать вирулентность HBV, но также снижать сывороточный уровень ДНК HBV и/или HBsAg у индивидуума, и могут эффективно устранять HBV и клетки, инфицированные HBV, в организме. Таким образом, антитела M1–23, M3–23 и M3–13 обладают потенциалом к применению для предупреждения и лечения инфекции HBV и заболевания, ассоциированного с инфекцией HBV, такого как гепатит B.

Исходя из этого, авторы изобретения приложили тщательные творческие усилия для глубокого исследования и модификации двух химерных антител: M1–23 и M3–23, и, таким образом, разработали гуманизированные антитела M1–23 и M3–23: гуманизированные антитела по настоящему изобретению не только обладают высокой степенью гуманизации (степень гуманизации может составлять вплоть до 98%), но также обладают по существу теми же (или даже лучшими) предусматриваемыми свойствами, что и исходное антитело (включая, но не ограничиваясь ими, активность связывания HBsAg, активность нейтрализации HBV, активность устранения ДНК HBV или HBsAg in vivo, или активность устранения HBV и клеток, инфицированных HBV, in vivo и т.д.).

Таким образом, антитела по настоящему изобретению (в частности, гуманизированные антитела) являются в высокой степени преимущественными, поскольку они могут сохранять функции и свойства исходного антитела и, таким образом, обладают потенциалом к предупреждению и лечению инфекции HBV и заболевания, ассоциированного с инфекцией HBV (такого как гепатит B); более того, антитела могут обладать очень высокой степенью гуманизации (степень гуманизации вплоть до 98%), и, таким образом, их можно вводить человеку безопасно без индукции иммунологического ответа. Антитело по изобретению (в частности, гуманизированное антитело) может иметь значительную клиническую ценность.

В рамках настоящей заявки предусматриваемые свойства антитела по настоящему изобретению включают активность специфического связывания с HBsAg, активность нейтрализации HBV, активность устранения ДНК HBV или HBsAg in vivo, и/или активность устранения HBV и клеток, инфицированных HBV, in vivo. Гуманизированное антитело в соответствии с настоящим изобретением сохраняет одно или несколько из описанных выше предусматриваемых свойств их исходного антитела (химерного антитела яванского макака–человека), предпочтительно сохраняет все из описанных выше предусматриваемых свойств их исходного антитела (химерного антитела яванского макака–человека).

В рамках настоящей заявки гуманизированное антитело по настоящему изобретению получают путем модификации исходного антитела (химерное антитело яванского макака–человека) по настоящему изобретению. Например, некоторые аминокислотные остатки в их FR подвергают заменам (например, консервативным заменам). Такая замена может, например, (1) уменьшать чувствительность антител к протеолизу; (2) уменьшать чувствительность антител к окислению; (3) изменять (например, усиливать) антигенсвязывающую аффинность антител; (4) изменять (например, усиливать) активность антител в отношении нейтрализации HBV; (5) изменять (например, усиливать) активность антител в отношении устранения HBV; (6) дополнительно повышать степень гуманизации антител для уменьшения иммуногенности антител; или (7) изменять другие биохимические характеристики или функциональные свойства антител; но все еще сохранять предполагаемые свойства антител. Такие замены могут присутствовать в CDR и/или FR и могут представлять собой замену одной аминокислоты или замену нескольких аминокислот.

Как используют в рамках изобретения, термин "степень гуманизации" представляет собой показатель, указывающий на количество не являющихся человеческими аминокислотных остатков в гуманизированном антителе. Степень гуманизации гуманизированного антитела можно вычислять, например, по следующей формуле: степень гуманизации = (количество аминокислот FR – количество не являющихся человеческими аминокислот в FR)/количество аминокислот в FRЧ100%.

Как используют в рамках изобретения, термин "нейтрализующее антитело" относится к антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, которые могут значительно снижать или полностью ингибировать вирулентность (например, способность инфицировать клетки) вируса–мишени. Как правило, нейтрализующее антитело может распознавать и связываться с вирусом–мишенью и предотвращать проникновение/инфицирование вирусом–мишенью клетки у индивидуума. Антитело по изобретению представляет собой нейтрализующее антитело.

Однако следует понимать, что в рамках настоящей заявки способность антитела к нейтрализации вируса не является прямо эквивалентной способности антитела устранять вирус. Как используют в рамках изобретения, "нейтрализация вируса" означает, что вирулентность вируса–мишени нейтрализуется (т.е. вирулентность вируса–мишени значительно снижается или полностью ингибируется) посредством ингибирования проникновения/инфицирования вирусом–мишенью клетки индивидуума. Как используют в рамках изобретения, "устранение вируса" означает, что вирус–мишень (независимо от того, инфицирует он клетку или нет) выводится из организма и, таким образом, организм возвращается к состоянию до инфицирования вирусом (например, результат серологического теста на вирус становится отрицательным). Таким образом, как правило, нейтрализующие антитела не обязательно обладают способностью устранять вирус. Однако в рамках настоящей заявки автор изобретения неожиданно обнаружил, что антитела по изобретению могут не только нейтрализовывать HBV, но также устранять вирус (т.е. могут устранять ДНК HBV и/или HBsAg in vivo, устранять HBV и инфицированные HBV клетки in vivo), и таким образом, обладают высокой клинической ценностью.

Как используют в рамках изобретения, термин "выделенный" относится к состоянию, получаемому из природного состояния, искусственными способами. Если определенное "выделенное" вещество или компонент присутствует в природе, это является возможным, поскольку его природное окружение изменяется или вещество выделяют из природного окружения, или и то, и другое. Например, определенный невыделенный полинуклеотид или полипептид естественным образом существует в определенном живом организме животного и тот же полинуклеотид или полипептид, выделенный с высокой чистотой из такого неприродного состояния, называют выделенным полинуклеотидом или полипептидом. Термин "выделенный" не включает ни смешанное искусственное или синтезированное вещество, ни другие вещества с примесями, которые не влияют на активность выделенного вещества.

Как используют в рамках изобретения, термин "вектор" относится к носителю на основе нуклеиновой кислоты, который может иметь полинуклеотид, встроенный в него. Когда вектор позволяет экспрессию белка, кодируемого полинуклеотидом, встроенным в него, вектор называют экспрессирующим вектором. Вектор может иметь переносимые элементы генетического материала, экспрессируемые в клетке–хозяине при трансформации, трансдукции или трансфекции в клетку–хозяина. Векторы хорошо известны специалисту в данной области, включая, но не ограничиваясь ими плазмиды, фаги, космиды, искусственную хромосому, такую как дрожжевая искусственная хромосома (YAC), бактериальная искусственная хромосома (BAC) или происходящая из P1 искусственная хромосома (PAC); фаг, такой как фаг л или фаг M13, и вирус животного. Вирусы животных, которые можно использовать в качестве векторов, включают, но не ограничиваются ими, ретровирус (включая лентивирус), аденовирус, аденоассоциированный вирус, вирус герпеса (такой как вирус простого герпеса), поксвирус, бакуловирус, вирус папилломы, паповавирус (такой как SV40). Вектор может содержать множество элементов для контроля экспрессии, включая, но не ограничиваясь ими, промоторную последовательность, последовательность инициации транскрипции, энхансерную последовательность, селективный элемент и репортерный ген. Кроме того, вектор может содержать ориджин репликации.

Как используют в рамках изобретения, термин "клетка–хозяин" относится к клетке, в которую может быть введен вектор, включая, но не ограничиваясь ими, прокариотическую клетку, такую как E. coli или Bacillus subtilis, и клетку грибов, такую как клетка дрожжей или Aspergillus, клетку насекомых, такую как клетка Drosophila S2 или Sf9, или клетку животных, такую как фибробласт, клетка CHO, клетка COS, клетка NSO, клетка HeLa, клетка BHK, клетка HEK 293 или клетка человека.

Как используют в рамках изобретения, термин "идентичность" относится к степени соответствия между двумя полипептидами или между двумя нуклеиновыми кислотами. Когда две последовательности для сравнения имеют одну и ту же мономерную субъединицу основания или аминокислоты в определенном участке (например, каждая из двух молекул ДНК имеет аденин в определенном участке или каждый из двух полипептидов имеет лизин в определенном участке), две молекулы в этом участки являются идентичными. Процентная идентичность двух последовательностей является функцией количества идентичных участков между двумя последовательностями на протяжении общего количества участков для сравнения Ч 100. Например, если 6 из 10 участков двух последовательностей совпадают, эти две последовательности обладают идентичностью 60%. Например, последовательности ДНК CTGACT и CAGGTT обладают идентичностью 50% (3 из 6 участков совпадают). Как правило, сравнение двух последовательностей проводят так, чтобы обеспечить максимальную идентичность. Такое выравнивание можно проводить с использованием компьютерной программы, такой как программа Align (DNAstar, Inc.), которая основана на способе Needleman, et al. (J. Mol. Biol. 48:443–453, 1970). Процентную идентичность между двумя аминокислотными последовательностями также можно определять с использованием алгоритма E. Meyers и W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4:11–17 (1988)), который включен в программу ALIGN (версия 2.0), с использованием таблицы веса остатков PAM120, штрафа за продолжение пропуска 12 и штрафа за делецию 4. Кроме того, процент идентичности между двумя аминокислотными последовательностями можно определять с использованием алгоритма Needleman и Wunsch (J. Mol. Biol. 48:444–453 (1970)), который включен в программу GAP пакета программ GCG (доступную на http://www.gcg.com), с использованием либо матрицы Blossum 62, либо матрицы PAM250, и веса пропуска 16, 14, 12, 10, 8, 6 или 4 и веса продолжения пропуска 1, 2, 3, 4, 5 или 6.

Как используют в рамках изобретения, термины "консервативная замена" и "консервативная аминокислотная замена" относятся к аминокислотным заменам, которые преимущественно не влияют или не изменяют предполагаемые свойства белка/полипептида, содержащего аминокислотную последовательность. Например, консервативную замену можно вносить стандартными способами, известными в данной области, такими как сайт–направленный мутагенез и ПЦР–опосредуемый мутагенез. Консервативные аминокислотные замены включают замены, где аминокислотный остаток заменен другим аминокислотным остатком, имеющим сходную боковую цепь, например, остатком, физически или функционально сходным (таким как имеющий сходный размер, форму, заряд, химические свойства, включая способность образовывать ковалентную связь или водородную связь, и т.д.) с соответствующим аминокислотным остатком. Семейства аминокислотных остатков, имеющих сходные боковые цепи, определены в данной области. Эти семейства включают аминокислоты, имеющие основные боковые цепи (например, лизин, аргинин и гистидин), аминокислоты, имеющие кислотные боковые цепи (например, аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота), аминокислоты, имеющие незаряженные боковые цепи (например, глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин, триптофан), аминокислоты, имеющие неполярные боковые цепи (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин), аминокислоты, имеющие в–разветвленные боковые цепи (такие как треонин, валин, изолейцин) и аминокислоты, имеющие ароматические боковые цепи (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Таким образом, соответствующий аминокислотный остаток предпочтительно заменяют другим аминокислотным остатком из того же семейства боковых цепей. Способы идентификации консервативных замен аминокислот хорошо известны в данной области (см., например, Brummell et al., Biochem. 32: 1180–1187 (1993); Kobayashi et al., Protein Eng. 12(10): 879–884 (1999); и Burks et al., Proc. Natl Acad. Set USA 94: 412–417 (1997), которые включены в настоящее описание в качестве ссылок).

20 общепринятый аминокислоты, вовлеченные в настоящее изобретение, обозначают стандартными способами. См., например, Immunology–A Synthesis (2nd Edition, E. S. Golub and D. R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991)), который включен в настоящее описание в качестве ссылки. В рамках изобретения термины "полипептид" и "белок" имеют одинаковое значение и могут быть использованы взаимозаменяемо. Более того, в рамках изобретения аминокислоты обычно обозначают с использованием однобуквенных кодов и трехбуквенных кодов. Например, аланин может быть обозначен как A или Ala. Кроме того, как используют в рамках изобретения, термины "моноклональное антитело" и "mAb" имеют одинаковые значения и могут быть использованы взаимозаменяемо; термины "поликлональное антитело" и "pAb" имеют одинаковые значения и могут быть использованы взаимозаменяемо.

Как используют в рамках изобретения, термин "фармацевтически приемлемый носитель и/или эксципиент" относится к носителю и/или эксципиенту, фармакологически и/или физиологически совместимому с индивидуумом и активным веществом, который хорошо известен в данной области (см., например, Remington's Pharmaceutical Sciences. Edited by Gennaro AR, 19th ed. Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1995), и включает, но не ограничивается ими средство для коррекции pH, поверхностно–активное вещество, адъювант, средство, повышающее ионную силу, разбавитель, средство контроля осмотического давления, средство, замедляющее всасывание, и консервант. Например, средство для коррекции pH включает, но не ограничивается ими, фосфатный буфер. Поверхностно–активное вещество включает, но не ограничивается ими, катионное, анионное или неионное поверхностно–активное вещество, например Tween–80. Средство, повышающее ионную силу, включает, но не ограничивается ими, хлорид натрия. Консервант включает, но не ограничивается ими, различные антибактериальные средства и противогрибковые средства, такие как парабен, хлорбутанол, фенол и сорбиновая кислота. Средство контроля осмотического давления включает, но не ограничивается ими, сахар, NaCl и их аналоги. Замедляющее всасывание средство включает, но не ограничивается ими, моностеарат и желатин.

Как используют в рамках изобретения, термин "адъювант" относится к неспецифическому иммуностимулятору, который может усиливать иммунный ответ на антиген или изменять тип иммунного ответа в организме, когда его доставляют вместе с антигеном в организм или доставляют в организм заранее. Существует множество адъювантов, включая, но не ограничиваясь ими, адъюванты на основе алюминия (например, гидроксид алюминия), адъюванты Фрейнда (например, полный адъювант Фрейнда и неполный адъювант Фрейнда), corynebacterium parvum, липополисахарид, цитокины и т.п. Адъювант Фрейнда в настоящее время является наиболее часто используемым адъювантом в экспериментах на животных. Адъювант на основе гидроксида алюминия чаще используют в клинических испытаниях.

Как используют в рамках изобретения, термин "предупреждение/предупреждающий" относится к способу, который проводят для подавления или замедления возникновения заболевания, нарушения или симптома (такого как инфекция HBV или заболевание, ассоциированное с инфекцией HBV) у индивидуума. Как используют в рамках изобретения, термин "лечение/лечащий" относится к способу, который проводят для получения благоприятного или желаемого клинического исхода. Для целей настоящего изобретения, благоприятный или желаемый исход включает, но не ограничивается ими, облегчение симптома, сужение масштаба заболевания, стабилизацию (т.е. не ухудшение) состояния заболевания, отсрочивание или замедление прогрессирования заболевания и смягчение симптомов (либо частично, либо полностью), как поддающихся обнаружению, так и не поддающихся обнаружению. Кроме того, "лечение" также относится к продлению выживаемости по сравнению с ожидаемой выживаемостью (без лечения). В рамках настоящей заявки антитело по изобретению обладает способностью нейтрализовывать HBV, и, таким образом, может быть использовано для предупреждения/защиты не страдающего заболеванием индивидуума или его клетки от инфекции HBV. Кроме того, антитело по изобретению обладает способностью устранять HBV (т.е. способно устранять ДНК HBV и/или HBsAg in vivo, устранять HBV и клетки, инфицированные HBV in vivo), и, таким образом, его можно использовать для лечения инфекции HBV или заболевания, ассоциированного с инфекцией HBV, у инфицированного индивидуума.

Как используют в рамках изобретения, термин "индивидуум" относится к млекопитающему, например, примату, такому как человек.

Как используют в рамках изобретения, термин "эффективное количество" относится к количеству, которое является достаточным для достижения или по меньшей мере частичного достижения предполагаемого эффекта. Например, количество, эффективное для предупреждения заболевания (такого как инфекция HBV или заболевания, ассоциированные с инфекцией HBV), относится к количеству, эффективному для предупреждения, подавления или отсрочивания возникновения заболевания (такого как инфекция HBV или заболевания, ассоциированные с инфекцией HBV). Эффективное количество для лечения заболевания относится к количеству, эффективному для излечения или по меньшей мере частичного блокирования заболевания и его осложнения у пациента, имеющего заболевание. Определение такого эффективного количества входит в пределы способностей специалиста в данной области. Например, количество, эффективное для терапевтического применения, зависит от тяжести заболевания, подвергаемого лечению, общего состояния иммунной системы у пациента, общих характеристик пациента, таких как возраст, масса тела и пол, способов введения лекарственных средств, дополнительных способов терапии, используемых одновременно, и т.п.

Антитела по изобретению

В рамках настоящей заявки авторы изобретения впервые разработали три химерных моноклональных антитела яванского макака–человека с превосходными свойствами, названных M1–23, M3–23 и M3–13, соответственно (их вариабельные области тяжелых и легких цепей указаны в SEQ ID NO: 1–5, соответственно): эти три антитела не только специфически распознают/связывают HBsAg и нейтрализуют вирулентность HBV, но также уменьшают сывороточный уровень ДНК HBV и/или HBsAg у индивидуума и, таким образом, могут эффективно устранять HBV и клетки, инфицированные HBV, в организме. Таким образом, антитела M1–23, M3–23 и M3–13 обладают потенциалом для применения для предупреждения и лечения инфекции HBV и заболевания, ассоциированного с инфекцией HBV, такого как гепатит B.

Исходя из этого, авторы изобретения провели тщательные исследования и модификации двух антител: M1–23 и M3–23, и разработали гуманизированные антитела для антител M1–23 и M3–23: гуманизированные антитела по настоящему изобретению не только обладают чрезвычайно высокой степенью гуманизации (степень гуманизации может составлять вплоть до 98%), но также обладают по существу такими же (или даже лучшими) ожидаемыми свойствами, что и их исходные антитела (включая, но не ограничиваясь ими, активность связывания HBsAg, активность нейтрализации HBV, активность устранения ДНК HBV или HBsAg in vivo, или активность устранения HBV и клеток, инфицированных HBV, in vivo, и т.д.).

Таким образом, антитела по настоящему изобретению (в частности, гуманизированные антитела) являются в высокой степени преимущественными не только потому, что они сохраняют функции и свойства их исходных антител и, таким образом обладают потенциалом для применения для предупреждения и лечения инфекции HBV и заболевания, ассоциированного с инфекцией HBV (например, гепатита B); но также потому, что они обладают высокой степенью гуманизации (вплоть до 98%) и, таким образом, могут быть безопасным образом введены человеку без индукции иммуногенного ответа. Антитела по изобретению (в частности, гуманизированные антитела) обладают значительной клинической ценностью.

Таким образом, в одном аспекте изобретение относится к антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, которые могут специфически связываться с HBsAg, причем антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит:

(iii) CDR3 VH, которая состоит из последовательности, выбранной из следующих: SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 20 или последовательность, которая отличается от этих последовательностей одной или несколькими заменами, делециями или вставками аминокислот (например, 1, 2 или 3 заменами, делециями или вставками аминокислот);

и/или

(iv) CDR1 VL, которая состоит из последовательности, выбранной из следующих: SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 15, или последовательности с одной или несколькими заменами, делециями или вставками аминокислот (например, 1, 2 или 3 заменами, делециями или вставками аминокислот) по сравнению с ими,

В определенных предпочтительных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению содержит CDR1 VH, CDR2 VH и CDR3 VH, как определено выше. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению содержит CDR1 VL, CDR2 VL и CDR3 VL, как определено выше. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению содержит CDR1 VH, CDR2 VH, CDR3 VH, CDR1 VL, CDR2 VL и CDR3 VL, как определено выше.

(a) вариабельную область тяжелой цепи (VH), причем VH содержит:

и/или

(b) вариабельную область легкой цепи (VL), причем VL содержит:

В определенных предпочтительных вариантах осуществления CDR1 VH состоит из последовательности, выбранной из следующих: (a) SEQ ID NO: 6 или последовательность, которая отличается от SEQ ID NO: 6 одной или несколькими заменами, делециями или вставками аминокислот (например, 1, 2 или 3 заменами, делециями или вставками аминокислот); или (b) последовательность CDR1 VH, которая содержится в аминокислотной последовательности, кодируемой геном тяжелой цепи эмбрионального типа человека. В определенных иллюстративных вариантах осуществления ген тяжелой цепи эмбрионального типа человека выбран из группы, состоящей из IGHV4–4*08 и IGHV4–61*01.

В определенных иллюстративных вариантах осуществления VH антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по изобретению содержит: CDR2 VH, как указано в SEQ ID NO: 7; CDR3 VH, как указано в SEQ ID NO: 8; и CDR1 VH, имеющую следующую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 137 или SEQ ID NO: 138.

В определенных предпочтительных вариантах осуществления CDR2 VL состоит из последовательности, выбранной из следующих: (a) SEQ ID NO: 10 или последовательность, которая отличается от SEQ ID NO: 10 одной или несколькими заменами, делециями или вставками аминокислот (например, 1, 2 или 3 заменами, делециями или вставками аминокислот); или (b) последовательность CDR2 VL, содержащаяся в аминокислотной последовательности, кодируемой геном легкой цепи эмбрионального типа человека. В определенных иллюстративных вариантах осуществления ген легкой цепи эмбрионального типа человека выбран из группы, состоящей из IGKV1–39*01 и IGKV1–5*03.

В определенных предпочтительных вариантах осуществления VH антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по настоящему изобретению содержит: CDR2 VH, как указано в SEQ ID NO: 7; CDR3 VH, как указано в SEQ ID NO: 8; и CDR1 VH, которая состоит из последовательности, выбранной из следующих: последовательность CDR1 VH, содержащаяся в вариабельной области тяжелой цепи любого иммуноглобулина (например, SEQ ID NO: 6, 137 или 138);

и VL антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит: CDR1 VL, как указано в SEQ ID NO: 9, CDR3 VL, как указано в SEQ ID NO: 11, и CDR2 VL, как указано в SEQ ID NO: 10.

и VL антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит: CDR1 VL, как указано в SEQ ID NO: 9, CDR3 VL, как указано в SEQ ID NO: 11, и CDR2 VL, которая состоит из последовательности, выбранной из следующих: последовательность CDR2 VL (например, SEQ ID NO: 10, 139 или 140), содержащаяся в вариабельной области легкой цепи (например, вариабельной области легкой цепи к) любого иммуноглобулина.

В определенных предпочтительных вариантах осуществления VH антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по изобретению содержит: CDR2 VH, как указано в SEQ ID NO: 7, CDR3 VH, как указано в SEQ ID NO: 8 и CDR1 VH, имеющую следующую аминокислотную последовательность: SEQ ID NO: 6, 137 или 138; и VL антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит: CDR1 VL, как указано в SEQ ID NO: 9, CDR3 VL, как указано в SEQ ID NO: 11, и CDR2 VL, имеющую аминокислотную последовательность: SEQ ID NO: 10, 139 или 140.

В определенных предпочтительных вариантах осуществления VH антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по настоящему изобретению содержит: CDR1 VH, как указано в SEQ ID NO: 6, CDR2 VH, как указано в SEQ ID NO: 7, и CDR3 VH, как указано в SEQ ID NO: 8; и VL антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит: CDR1 VL, как указано в SEQ ID NO: 9, CDR2 VL, как указано в SEQ ID NO: 10, и CDR3 VL, как указано в SEQ ID NO: 11.

В определенных предпочтительных вариантах осуществления VH антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по настоящему изобретению содержит: CDR1 VH, как указано в SEQ ID NO: 137, CDR2 VH, как указано в SEQ ID NO: 7, и CDR3 VH, как указано в SEQ ID NO: 8; и VL антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит: CDR1 VL, как указано в SEQ ID NO: 9, CDR2 VL, как указано в SEQ ID NO: 10, и CDR3 VL, как указано в SEQ ID NO: 11.

В определенных предпочтительных вариантах осуществления VH антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по настоящему изобретению содержит: CDR1 VH, как указано в SEQ ID NO: 138, CDR2 VH, как указано в SEQ ID NO: 7, и CDR3 VH, как указано в SEQ ID NO: 8; и VL антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит: CDR1 VL, как указано в SEQ ID NO: 9, CDR2 VL, как указано в SEQ ID NO: 10, и CDR3 VL, как указано в SEQ ID NO: 11.

В определенных предпочтительных вариантах осуществления VH антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по настоящему изобретению содержит: CDR1 VH, как указано в SEQ ID NO: 6, CDR2 VH, как указано в SEQ ID NO: 7, и CDR3 VH, как указано в SEQ ID NO: 8; и VL антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит: CDR1 VL, как указано в SEQ ID NO: 9, CDR2 VL, как указано в SEQ ID NO: 139, и CDR3 VL, как указано в SEQ ID NO: 11.

В определенных предпочтительных вариантах осуществления VH антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по настоящему изобретению содержит: CDR1 VH, как указано в SEQ ID NO: 6, CDR2 VH, как указано в SEQ ID NO: 7, и CDR3 VH, как указано в SEQ ID NO: 8; и VL антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит: CDR1 VL, как указано в SEQ ID NO: 9, CDR2 VL, как указано в SEQ ID NO: 140, и CDR3 VL, как указано в SEQ ID NO: 11.

(a) вариабельную область тяжелой цепи (VH), причем VH содержит:

и/или

(b) вариабельную область легкой цепи (VL), причем VL содержит:

В определенных предпочтительных вариантах осуществления CDR2 VL состоит из последовательности, выбранной из следующих: (a) SEQ ID NO: 16 или последовательность, которая отличается от SEQ ID NO: 16 одной или несколькими заменами, делециями или вставками аминокислот (например, 1, 2 или 3 заменами, делециями или вставками аминокислот); или (b) последовательность CDR2 VL. содержащаяся в аминокислотной последовательности, кодируемой геном легкой цепи эмбрионального типа человека. В определенных иллюстративных вариантах осуществления ген легкой цепи эмбрионального типа человека выбран из группы, состоящей из IGKV2–28*01 и IGKV3–15*01.

В определенных предпочтительных вариантах осуществления VH антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по настоящему изобретению содержит: CDR1 VH, как указано в SEQ ID NO: 12, CDR3 VH, как указано в SEQ ID NO: 14, и CDR2 VH, которая состоит из последовательности, выбранной из следующих: последовательность CDR2 VH, содержащаяся в вариабельной области тяжелой цепи любого иммуноглобулина (например, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 141, или SEQ ID NO: 142);

и VL антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит: CDR1 VL, как указано в SEQ ID NO: 15, CDR3 VL, как указано в SEQ ID NO: 17, и CDR2 VL, как указано в SEQ ID NO: 16.

и VL антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит: CDR1 VL, как указано в SEQ ID NO: 15, CDR3 VL, как указано в SEQ ID NO: 17, и CDR2 VL, которая состоит из последовательности, выбранной из следующих: последовательность CDR2 VL, содержащаяся в вариабельной области легкой цепи (например, вариабельная область легкой цепи каппа) любого иммуноглобулина (например, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 143 или SEQ ID NO: 144).

В определенных предпочтительных вариантах осуществления VH антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по настоящему изобретению содержит: CDR1 VH, как указано в SEQ ID NO: 12, CDR3 VH, как указано в SEQ ID NO: 14, и CDR2 VH, имеющую последовательность, выбранную из группы, состоящей из: SEQ ID NO: 13, 141 или 142; и VL антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит: CDR1 VL, как указано в SEQ ID NO: 15, CDR3 VL, как указано в SEQ ID NO: 17, и CDR2 VL, имеющую последовательность, выбранную из группы, состоящей из: SEQ ID NO: 16, 143 или 144.

В определенных предпочтительных вариантах осуществления VH антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по настоящему изобретению содержит: CDR1 VH, как указано в SEQ ID NO: 12, CDR2 VH, как указано в SEQ ID NO: 13, и CDR3 VH, как указано в SEQ ID NO: 14; и VL антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит: CDR1 VL, как указано в SEQ ID NO: 15, CDR2 VL, как указано в SEQ ID NO: 16, и CDR3 VL, как указано в SEQ ID NO: 17.

В определенных предпочтительных вариантах осуществления VH антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по настоящему изобретению содержит: CDR1 VH, как указано в SEQ ID NO: 12, CDR2 VH, как указано в SEQ ID NO: 141, и CDR3 VH, как указано в SEQ ID NO: 14; и VL антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит: CDR1 VL, как указано в SEQ ID NO: 15, CDR2 VL, как указано в SEQ ID NO: 16, и CDR3 VL, как указано в SEQ ID NO: 17.

В определенных предпочтительных вариантах осуществления VH антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по настоящему изобретению содержит: CDR1 VH, как указано в SEQ ID NO: 12, CDR2 VH, как указано в SEQ ID NO: 142, и CDR3 VH, как указано в SEQ ID NO: 14; и VL антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит: CDR1 VL, как указано в SEQ ID NO: 15, CDR2 VL, как указано в SEQ ID NO: 16, и CDR3 VL, как указано в SEQ ID NO: 17.

В определенных предпочтительных вариантах осуществления VH антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по настоящему изобретению содержит: CDR1 VH, как указано в SEQ ID NO: 12, CDR2 VH, как указано в SEQ ID NO: 13, и CDR3 VH, как указано в SEQ ID NO: 14; и VL антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит: CDR1 VL, как указано в SEQ ID NO: 15, CDR2 VL, как указано в SEQ ID NO: 143, и CDR3 VL, как указано в SEQ ID NO: 17.

В определенных предпочтительных вариантах осуществления VH антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по настоящему изобретению содержит: CDR1 VH, как указано в SEQ ID NO: 12, CDR2 VH, как указано в SEQ ID NO: 13, и CDR3 VH, как указано в SEQ ID NO: 14; и VL антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит: CDR1 VL, как указано в SEQ ID NO: 15, CDR2 VL, как указано в SEQ ID NO: 144, и CDR3 VL, как указано в SEQ ID NO: 17.

(a) вариабельную область тяжелой цепи (VH), причем VH содержит:

и/или

(b) вариабельную область легкой цепи (VL), причем VL содержит:

В определенных предпочтительных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению дополнительно содержит каркасную область.

В определенных предпочтительных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению содержит:

(iv) FR4 VH, которая состоит из последовательности, выбранной из следующих: SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 53 или последовательность, которая отличается от этих последовательностей одной или несколькими заменами, делециями или вставками аминокислот (например, 1, 2, 3 или 4 заменами, делециями или вставками аминокислот);

и/или

(b) одну или несколько (например, 1, 2, 3 или 4) каркасных областей (FR) вариабельной области легкой цепи (VL), выбранных из следующих:

В определенных предпочтительных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению содержит FR1 VH, FR2 VH, FR3 VH и FR4 VH, как определено выше. В определенных предпочтительных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению содержит FR1 VL, FR2 VL, FR3 VL и FR4 VL, как определено выше. В определенных предпочтительных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению содержит FR1 VH, FR2 VH, FR3 VH, FR4 VH, FR1 VL, FR2 VL, FR3 VL и FR4 VL, как определено выше.

(a) FR1 VH, как указано в SEQ ID NO: 21, FR2 VH, как указано в SEQ ID NO: 22, FR3 VH, как указано в SEQ ID NO: 23, и FR4 VH, как указано в SEQ ID NO: 24;

(b) FR1 VH, как указано в SEQ ID NO: 29, FR2 VH, как указано в SEQ ID NO: 30, FR3 VH, как указано в SEQ ID NO: 31, и FR4 VH, как указано в SEQ ID NO: 32; или

(c) FR1 VH, как указано в SEQ ID NO: 37, FR2 VH, как указано в SEQ ID NO: 38, FR3 VH, как указано в SEQ ID NO: 39, и FR4 VH, как указано в SEQ ID NO: 32.

В определенных предпочтительных вариантах осуществления VL антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит:

(a) FR1 VL, как указано в SEQ ID NO: 25, FR2 VL, как указано в SEQ ID NO: 26, FR3 VL, как указано в SEQ ID NO: 27, и FR4 VL, как указано в SEQ ID NO: 28; или

(b) FR1 VL, как указано в SEQ ID NO: 33, FR2 VL, как указано в SEQ ID NO: 34, FR3 VL, как указано в SEQ ID NO: 35, и FR4 VL, как указано в SEQ ID NO: 36.

(a) FR1 VH, как указано в SEQ ID NO: 21, FR2 VH, как указано в SEQ ID NO: 22, FR3 VH, как указано в SEQ ID NO: 23, и FR4 VH, как указано в SEQ ID NO: 24; и FR1 VL, как указано в SEQ ID NO: 25, FR2 VL, как указано в SEQ ID NO: 26, FR3 VL, как указано в SEQ ID NO: 27, и FR4 VL, как указано в SEQ ID NO: 28;

(b) FR1 VH, как указано в SEQ ID NO: 29, FR2 VH, как указано в SEQ ID NO: 30, FR3 VH, как указано в SEQ ID NO: 31, и FR4 VH, как указано в SEQ ID NO: 32; и FR1 VL, как указано в SEQ ID NO: 33, FR2 VL, как указано в SEQ ID NO: 34, FR3 VL, как указано в SEQ ID NO: 35, и FR4 VL, как указано в SEQ ID NO: 36; или

(c) FR1 VH, как указано в SEQ ID NO: 37, FR2 VH, как указано в SEQ ID NO: 38, FR3 VH, как указано в SEQ ID NO: 39, и FR4 VH, как указано в SEQ ID NO: 32; и FR1 VL, как указано в SEQ ID NO: 33, FR2 VL, как указано в SEQ ID NO: 34, FR3 VL, как указано в SEQ ID NO: 35, и FR4 VL, как указано в SEQ ID NO: 36.

В определенных предпочтительных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению является гуманизированным. В определенных предпочтительных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению обладает степенью гуманизации по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 86%, по меньшей мере 87%, по меньшей мере 88%, по меньшей мере 89%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100%. В определенных предпочтительных вариантах осуществления области не CDR антитела или его антигенсвязывающих фрагментов по изобретению содержат не более 19, не более 15, не более 14, не более 13, не более 12, не более 11, не более 10, не более 9, не более 8, не более 7, не более 6, не более 5, не более 4, не более 3, не более 2 или не более 1 не являющегося человеческим аминокислотного остатка (например, яванского макака), или области не CDR не содержат не являющихся человеческими аминокислотных остатков (например, яванского макака). В определенных предпочтительных вариантах осуществления область FR антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по изобретению содержит не более 19, не более 15, не более 14, не более 13, не более 12, не более 11, не более 10, не более 9, не более 8, не более 7, не более 6, не более 5, не более 4, не более 3, не более 2 или не более 1 не являющегося человеческим аминокислотного остатка (например, яванского макака), или область FR не содержит не являющихся человеческими аминокислотных остатков (например, яванского макака).

В определенных предпочтительных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению содержит: каркасную область иммуноглобулина человека, например, каркасную область, содержащуюся в аминокислотной последовательности, кодируемой геном антитела эмбрионального типа человека. В определенных предпочтительных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит: каркасную область тяжелой цепи, содержащуюся в аминокислотной последовательности, кодируемой геном тяжелой цепи эмбрионального типа человека, и/или каркасную область легкой цепи, содержащуюся в аминокислотной последовательности, кодируемой геном легкой цепи эмбрионального типа человека.

В таких вариантах осуществления каркасная область тяжелой цепи и/или каркасная область легкой цепи антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по изобретению может содержать один или несколько не являющихся человеческими аминокислотных остатков (например, яванского макака). В определенных предпочтительных вариантах осуществления каркасная область тяжелой цепи и/или каркасная область легкой цепи содержит один или несколько аминокислотных остатков, подвергнутых обратной мутации на соответствующие остатки яванского макака или консервативным заменам соответствующих остатков (такие мутации называют обратными мутациями).

В определенных предпочтительных вариантах осуществления VH антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит: каркасную область тяжелой цепи, содержащуюся в аминокислотной последовательности, кодируемой геном тяжелой цепи эмбрионального типа человека IGHV 4–4*08, и каркасная область тяжелой цепи необязательно содержит одну или несколько обратных мутаций с остатков человека на остатки яванского макака. В определенных предпочтительных вариантах осуществления IGHV 4–4*08 кодирует аминокислотную последовательность, как указано в SEQ ID NO: 40.

(i) FR1 VH, которая представляет собой SEQ ID NO: 21 или отличается от SEQ ID NO: 21 одной или несколькими аминокислотными заменами (например, 1, 2 или 3 аминокислотными заменами), выбранными из группы, состоящей из:

(01) T в H17;

(02) L в H20; и

(03) T в H23;

(ii) FR2 VH, которая представляет собой SEQ ID NO: 22;

(iii) FR3 VH, которая представляет собой SEQ ID NO: 23 или отличается от SEQ ID NO: 23 одной или несколькими аминокислотными заменами (например, 1, 2 или 3 аминокислотными заменами), выбранными из группы, состоящей из:

(01) K в H64;

(02) I в H69; и

(03) F в H78;

(iv) FR4 VH, которая представляет собой SEQ ID NO: 24 или отличается от SEQ ID NO: 24 одной или несколькими аминокислотными заменами (например, 1 или 2 аминокислотными заменами), выбранными из группы, состоящей из:

(01) T в H107; и

(02) T в H108;

где все положения аминокислот, упомянутые выше, пронумерованы в соответствии с системой нумерации Kabat.

В определенных иллюстративных вариантах осуществления VH антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит: FR1 VH, как указано в SEQ ID NO: 44, FR2 VH, как указано в SEQ ID NO: 22, FR3 VH, как указано в SEQ ID NO: 45, и FR4 VH, как указано в SEQ ID NO: 46.

В определенных предпочтительных вариантах осуществления VH антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит: каркасную область тяжелой цепи, содержащуюся в аминокислотной последовательности, кодируемой геном тяжелой цепи эмбрионального типа человека IGHV 4–4*02, и каркасная область тяжелой цепи необязательно содержит одну или несколько обратных мутаций с остатков человека на остатки яванского макака. В определенных предпочтительных вариантах осуществления аминокислотная последовательность, кодируемая IGHV 4–4*02, указана в SEQ ID NO: 42.

(i) FR1 VH, которая представляет собой SEQ ID NO: 29 или отличается от SEQ ID NO: 29 одной или несколькими аминокислотными заменами (например, 1 или 2), выбранными из группы, состоящей из:

(01) V в H2; и

(02) G в H16;

(ii) FR2 VH, которая представляет собой SEQ ID NO: 30 или отличается от SEQ ID NO: 30 следующей аминокислотной заменой: V в H37;

(iii) FR3 VH, которая представляет собой SEQ ID NO: 31 или отличается от SEQ ID NO: 31 одной или несколькими аминокислотными заменами (например, 1, 2, 3 или 4 аминокислотными заменами), выбранными из группы, состоящей из:

(01) S в H65;

(02) V в H71;

(03) K в H73; и

(04) K в H81;

(iv) FR4 VH, которая представляет собой SEQ ID NO: 32 или отличается от SEQ ID NO: 32 следующей аминокислотной заменой: T в H107;

где все положения аминокислот, упомянутые выше, пронумерованы в соответствии с системой нумерации Kabat.

В определенных иллюстративных вариантах осуществления VH антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит: FR1 VH, как указано в SEQ ID NO: 50, FR2 VH, как указано в SEQ ID NO: 51, FR3 VH, как указано в SEQ ID NO: 52, и FR4 VH, как указано в SEQ ID NO: 53.

В определенных предпочтительных вариантах осуществления VL антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит: каркасную область легкой цепи, содержащуюся в аминокислотной последовательности, кодируемой геном легкой цепи эмбрионального типа человека IGKV1–39*01, где каркасная область легкой цепи необязательно содержит одну или несколько обратных мутаций с остатков человека на остатки яванского макака. В определенных предпочтительных вариантах осуществления аминокислотная последовательность, кодируемая IGKV1–39*01, указана в SEQ ID NO: 41.

(i) FR1 VL, которая представляет собой SEQ ID NO: 25 или отличается от SEQ ID NO: 25 одной или несколькими аминокислотными заменами (например, одной или двумя аминокислотными заменами), выбранными из группы, состоящей из:

(01) D в L1; и

(02) Q в L3;

(ii) FR2 VL, которая представляет собой SEQ ID NO: 26 или отличается от SEQ ID NO: 26 следующей аминокислотной заменой: K в L45;

(iii) FR3 VL, которая представляет собой SEQ ID NO: 27 или отличается от SEQ ID NO: 27 одной или несколькими аминокислотными заменами (например, 1, 2, 3 или 4 аминокислотными заменами), выбранными из группы, состоящей из:

(01) Q в L55;

(02) S в L63;

(03) D в L70; и

(04) A в L84;

(iv) FR4 VL, которая представляет собой SEQ ID NO: 28;

где все положения аминокислот, упоминаемые выше, пронумерованы в соответствии с системой нумерации Kabat.

В определенных иллюстративных вариантах осуществления VL антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит: FR1 VL, как указано в SEQ ID NO: 47, FR2 VL, как указано в SEQ ID NO: 48, FR3 VL, как указано в SEQ ID NO: 49, и FR4 VL, как указано в SEQ ID NO: 28.

В определенных предпочтительных вариантах осуществления VL антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит: каркасную область легкой цепи, содержащуюся в аминокислотной последовательности, кодируемой геном легкой цепи эмбрионального типа человека IGKV4–1*01, где каркасная область легкой цепи необязательно содержит одну или несколько обратных мутаций с остатков человека на остатки яванского макака. В определенных предпочтительных вариантах осуществления аминокислотная последовательность, кодируемая IGKV4–1*01, указана в SEQ ID NO: 43.

(i) FR1 VL, которая представляет собой SEQ ID NO: 33 или отличается от SEQ ID NO: 33 одной или несколькими аминокислотными заменами (например, 1, 2 или 3 аминокислотных замены), выбранными из группы, состоящей из:

(01) V в L3;

(02) T в L5; и

(03) A в L19;

(ii) FR2 VL, которая представляет собой SEQ ID NO: 34 или которая отличается от SEQ ID NO: 34 следующей аминокислотной заменой: V в L43;

(iii) FR3 VL, которая представляет собой SEQ ID NO: 35 или которая отличается от SEQ ID NO: 35 одной или несколькими аминокислотными заменами (например, 1, 2 или 3 аминокислотными заменами), выбранными из группы, состоящей из:

(01) D в L60;

(02) S в L76; и

(03) S в L77;

(iv) FR4 VL, которая представляет собой SEQ ID NO: 36;

где положения аминокислоты, упоминаемые выше, пронумерованы в соответствии с системой нумерации Kabat.

В определенных иллюстративных вариантах осуществления VL антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит: FR1 VL, как указано в SEQ ID NO: 54, FR2 VL, как указано в SEQ ID NO: 55, FR3 VL, как указано в SEQ ID NO: 56, и FR4 VL, как указано в SEQ ID NO: 36.

(a) каркасную область тяжелой цепи, содержащуюся в аминокислотной последовательности, кодируемой IGHV4–4*08, и каркасную область легкой цепи, содержащуюся в аминокислотной последовательности, кодируемой IGKV1–39*01; или

(b) каркасную область тяжелой цепи, содержащуюся в аминокислотной последовательности, кодируемой IGHV4–4*02, и каркасную область легкой цепи, содержащуюся в аминокислотной последовательности, кодируемой IGKV4–1*01.

(a) FR1 VH, как указано в SEQ ID NO: 44, FR2 VH, как указано в SEQ ID NO: 22, FR3 VH, как указано в SEQ ID NO: 45, FR4 VH, как указано в SEQ ID NO: 46; и FR1 VL, как указано в SEQ ID NO: 47, FR2 VL, как указано в SEQ ID NO: 48, FR3 VL, как указано в SEQ ID NO: 49, и FR4 VL, как указано в SEQ ID NO: 28; или

(b) FR1 VH, как указано в SEQ ID NO: 50, FR2 VH, как указано в SEQ ID NO: 51, FR3 VH, как указано в SEQ ID NO: 52, и FR4 VH, как указано в SEQ ID NO: 53; и FR1 VL, как указано в SEQ ID NO: 54, FR2 VL, как указано в SEQ ID NO: 55, FR3 VL, как указано в SEQ ID NO: 56, и FR4 VL, как указано в SEQ ID NO: 36.

В определенных предпочтительных вариантах осуществления VH антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по настоящему изобретению содержит:

(a) FR1 VH, как указано в SEQ ID NO: 21, FR2 VH, как указано в SEQ ID NO: 22, FR3 VH, как указано в SEQ ID NO: 23, и FR4 VH, как указано в SEQ ID NO: 24;

(b) FR1 VH, как указано в SEQ ID NO: 29, FR2 VH, как указано в SEQ ID NO: 30, FR3 VH, как указано в SEQ ID NO: 31, и FR4 VH, как указано в SEQ ID NO: 32;

(c) FR1 VH, как указано в SEQ ID NO: 37, FR2 VH, как указано в SEQ ID NO: 38, FR3 VH, как указано в SEQ ID NO: 39, и FR4 VH, как указано в SEQ ID NO: 32;

(e) FR1 VH, как указано в SEQ ID NO: 50, FR2 VH, как указано в SEQ ID NO: 51, FR3 VH, как указано в SEQ ID NO: 52, и FR4 VH, как указано в SEQ ID NO: 53.

В определенных предпочтительных вариантах осуществления VL антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по настоящему изобретению содержит:

(a) FR1 VL, как указано в SEQ ID NO: 25, FR2 VL, как указано в SEQ ID NO: 26, FR3 VL, как указано в SEQ ID NO: 27, и FR4 VL, как указано в SEQ ID NO: 28;

(b) FR1 VL, как указано в SEQ ID NO: 33, FR2 VL, как указано в SEQ ID NO: 34, FR3 VL, как указано в SEQ ID NO: 35, и FR4 VL, как указано в SEQ ID NO: 36;

(d) FR1 VL, как указано в SEQ ID NO: 54, FR2 VL, как указано в SEQ ID NO: 55, FR3 VL, как указано в SEQ ID NO: 56, и FR4 VL, как указано в SEQ ID NO: 36.

В определенных предпочтительных вариантах осуществления вариабельная область тяжелой цепи антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по изобретению содержит FR1 VH, CDR1 VH, FR2 VH, CDR2 VH, FR3 VH, CDR3 VH и FR4 VH, как определено выше. В определенных предпочтительных вариантах осуществления вариабельная область легкой цепи антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по изобретению содержит FR1 VL, CDR1 VL, FR2 VL, CDR2 VL, FR3 VL, CDR3 VL и FR4 VL, как определено выше. В определенных предпочтительных вариантах осуществления вариабельная область тяжелой цепи антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по изобретению содержит FR1 VH, CDR1 VH, FR2 VH, CDR2 VH, FR3 VH, CDR3 VH и FR4 VH, как определено выше; и вариабельная область легкой цепи содержит FR1 VL, CDR1 VL, FR2 VL, CDR2 VL, FR3 VL, CDR3 VL и FR4 VL, как определено выше.

В определенных предпочтительных вариантах осуществления аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по изобретению обладает по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99 или 100% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью вариабельной области тяжелой цепи, выбранной из группы, состоящей из: вариабельных областей тяжелой цепи, как указано в любой из SEQ ID NO: 1, 3, 5, 57, 59, 157, 158, 163 и 164.

В определенных предпочтительных вариантах осуществления аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи антитела или антигенсвязывающего фрагмента по изобретению обладает по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью вариабельной области легкой цепи, выбранной из группы, состоящей из вариабельных областей легкой цепи, как указано в любой из SEQ ID NO: 2, 4, 58, 60, 159, 160, 165 и 166.

В определенных предпочтительных вариантах осуществления вариабельная область легкой цепи антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по изобретению представляет собой вариабельную область легкой цепи, как указано в любой из SEQ ID NO: 2, 4, 58, 60, 159, 160, 165 и 166.

В определенных предпочтительных вариантах осуществления антитело по изобретению содержит вариабельную область тяжелой цепи, как определено выше, и вариабельную область легкой цепи, как определено выше.

В определенных предпочтительных вариантах осуществления вариабельная область тяжелой цепи антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по изобретению представляет собой вариабельную область тяжелой цепи, как указано в любой из SEQ ID NO: 3, 59, 163 и 164; и вариабельная область легкой цепи антитела или его антигенсвязывающего фрагмента представляет собой вариабельную область легкой цепи, как указано в любой из SEQ ID NO: 4, 60, 165 и 166.

В определенных предпочтительных вариантах осуществления антитела по изобретению содержат: