Способ получения гкр-чипа для иммунохимического анализа

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к оборудованию, а именно созданию чипа для иммунохимического анализа (ИХА) с применением эффекта гигантского комбинационного рассеяния (ГКР). Способ получения ГКР-чипа включает обработку кремниевой подложки путем ее модифицирования веществом структуры:

при воздействии ультразвука и последующей мобилизации наночастиц серебра из концентрированного коллоидного раствора. Приготовление коллоидного раствора включает растворение 5,1 мг нитрата серебра в 30 мг деионизированной воды, растворение 9,8 мг цитрата натрия в 300 мкл деионизированной воды, доведение раствора нитрата серебра до кипения и добавление к нему по каплям раствора цитрата натрия, охлаждение полученного коллоидного раствора до комнатной температуры и последующее его концентрирование в 2-50 раз. Изобретение обеспечивает получение технического результата, заключающегося в повышении качества анализа за счет повышения точности определения искомого вещества, уменьшение времени, затрачиваемого на получение результатов, и повышение удобства пользования при одновременном увеличении срока хранения полученных результатов. 4 ил., 2 табл., 7 пр.

 

Изобретение относится к созданию чипа для иммунохимического анализа (ИХА) с применением эффекта гигантского комбинационного рассеяния (ГКР).

В настоящее время иммуночипы находят применение в скрининге антител, обнаружении наркотических веществ, диагностических системах для многих заболеваний (малярии, СПИДа, туберкулеза и т.д.) и многих других областях.

В настоящее время развитие ИХА направлено не только в сторону повышения точности определения искомого вещества, но и на уменьшение времени, затрачиваемого на получение результатов и возможность проведения анализа вне стен лаборатории. На практике уже нашли широкое применение системы для быстрого скрининга - тест-полоски (стрип-тесты) [М.-С. Hennion, D. Barcelo «Strengths and limitations of immunoassays for effective and effcient use for pesticide analysis in water samples: A review», Analytica Chimica Acta, 1998, 362, 3-34]. Но, несмотря на высокую скорость получения аналитического отклика, они имеют относительно невысокую чувствительность и служат лишь для качественного определения вещества в пробе. Ограничения мобильности многих методов ИХА из-за громоздкости оборудования, применяемого для детекции иммунных комплексов, дали стимул многим исследователям к разработке портативных оптических систем, интегрированных с иммуночипами (иммуносенсорами) [D. Sugumar, L. Kong «Lab-on-Chip Devices for Immunoassays)), In: Li D. (eds) Encyclopedia of Microfluidics and Nanofluidics, 2015, Springer, New York, NY. https://doi.org/10.1007/978-1-4614-5491-5_775].

Разработано большое количество различных ГКР-субстратов, предназначенных для решения разнообразных задач по идентификации веществ с применением ИХА. Например, в патентной заявке [GB 2439656 А, 2006 «Detection of enhanced multiplex signals by surface enhanced raman spectroscopy (sers)»] для таргетного захвата антигенов из аналита применяют чипы с иммобилизованными на их поверхностях меченными ГКР-репортерами антителами. Для получения сигнала используют детектирующие антитела, ковалентно связанные с наночастицами золота. Недостатком этого изобретения является трудновоспроизводимая методика синтеза конъюгатов антител и наночастиц серебра.

В качестве прототипа предлагаемого изобретения взят способ получения ГКР-чипа, описанный в патенте [0587008 А1, 1994 «Surface-enhaced raman spectroscopy immunoassay))]. На очищенную поверхность предметных стекол осаждались частицы серебра, полученные путем восстановления реагента Толленса D-глюкозой. Таким образом была сформирована наноостровковая пленка металла толщиной порядка 100 нм. Чипы показали хорошее усиление сигнала комбинационного рассеяния на примере динитробензола и его конъюгата с бычьим сывороточным альбумином. Была продемонстрирована принципиальная возможность определения соединений на примере изменения ГКР-спектров 2-[4-гидроксифенилазо]бензойной кислоты вследствие ее специфического взаимодействия с авидином. К недостаткам изобретения следует отнести:

• достаточно сложную и трудновоспроизводимую методику получения ГКР-поверхности;

• наноостровковая серебряная пленка, получаемая на предметных стеклах, обладает неоднородными свойствами, что может привести к невоспроизводимости результатов анализа;

• не приведены статистические данные о воспроизводимости сигнала с применением получаемых ГКР-чипов, что ставит под сомнение возможность их реализации в количественном ИХА;

• короткий срок хранения - 1 неделя.

Техническим результатом предложенного изобретения является совершенствование способа получения ГКР-чипа для ИХА, повышение стабильности и воспроизводимости получаемых результатов анализа, а также увеличение срока хранения.

Технический результат достигается путем получения ГКР-чипа для ИХА, представляющего собой кремниевую подложку, модифицированную веществами следующей структуры:

где Х=-Cl, -Br, -I, -F, -ОСН₃, -ОС₂Н₅; Y=-NH₂, -CN, -SH; n=3-10, с иммобилизованными на ее поверхности в двух зонах коллоидными частицами серебра. Коллоидный раствор серебра для иммобилизации получен путем восстановления нитрата серебра цитратом натрия и его последующим концентрированием. В качестве метки используют вещество, обладающее хорошо различимым ГКР-спектром и хорошо связывающееся с белковыми молекулами.

Изобретение характеризуется следующими графическими материалами:

• Фиг. 1 - Поверхность кремниевой подложки после иммобилизации на нее частиц серебра из коллоидного раствора;

• Фиг. 2 - ГКР-спектр тетраметилродаминизотиоцианата (ТРИТЦ), полученного на изготовленных ГКР-субстратах;

• Фиг. 3 - Распределение величины относительной интенсивности сигнала первой и второй зон внутри партии ГКР-подложек. Интенсивность спектров оценена по величине пика спектра ТРИТЦ 1641 см^-1. По оси абсцисс отложены отношения интенсивностей сигнала первой и второй зон, по оси ординат - количество подложек, соответствующих этим отношениям;

• Фиг. 4 - График зависимости интенсивности ГКР-сигнала от концентрации конъюгата иммуноглобулина кролика с ТРИТЦ (IgG_кр-ТРИТЦ) в координатах lgI (-lgC).

Пример 1.

Приготовление коллоидного раствора нитрата серебра

5,1 мг нитрата серебра марки х.ч. растворяют в 30 мл деионизированной воды. 9,8 мг цитрата натрия растворяют в 300 мкл деионизированной воды. Раствор нитрата серебра доводят до кипения при интенсивном перемешивании и к нему по каплям добавляют раствор цитрата натрия. Реакцию проводят в течение 60 минут. После этого полученный коллоидный раствор охлаждают до комнатной температуры и концентрируют в 2-50 раз в ячейке на мембране с размером пор 4 нм.

Пример 2

Модифицирование кремниевых подложек

Кремниевые подложки обрабатывают ультразвуком в аммиачной смеси в течение 30 минут, затем тщательно промывают деионизированной водой.

Промытые подложки обрабатывают ультразвуком в 0,1-15% водном растворе вещества структуры:

где Х=-Cl, -Br, -I, -F, -ОСН₃, -ОС₂Н₅; Y=-NH₂, -CN, -SH; n=3-10, после чего тщательно промывают деионизированной водой.

Пример 3

Иммобилизация частиц серебра на модифицированную кремниевую поверхность

На каждую кремниевую подложку из примера 2 наносят по 2 одинаковые капли коллоидного раствора серебра из примера 1. Иммобилизацию частиц серебра проводят в течение 2 часов в закрытой чашке Петри, после чего подложки высушивают и промывают водой. Поверхность полученных ГКР-субстратов охарактеризована при помощи двухлучевого просвечивающего электронного микроскопа (Фиг. 1).

Пример 4

Получение сигнала на ГКР-субстратах

Полученные ГКР-субстраты погружают в 0,02% водный раствор ТРИТЦ на 5 минут, после чего ополаскивают в воде, высушивают на воздухе и проводят измерение сигнала при длине волны возбуждающего лазера 523 нм (Фиг. 2).

Пример 5

Характеристика воспроизводимости сигнала

Проводят статистическую обработку относительной интенсивности сигнала первой и второй зоны для 100 ГКР-подложек по величине пика 1641 см^-1 с применением методики, описанной в примере 4 (Фиг. 3). Из рисунка видно, что для ГКР-субстратов, полученных заявляемым способом, отклонение отношения интенсивностей сигналов двух зон не превышает 20% для каждой из подложек.

Пример 6

Приготовление конъюгата IgG_кр-ТРИТЦ

IgG_кр был выбран в качестве модели из-за того, что антитела, применяемые во всех известных схемах ИХА, относятся к этой фракции белков.

1 rp IgG_кр растворяют в 5 мл физиологического раствора и доводят рН до 9,0, затем при интенсивном перемешивании к нему добавляют по каплям 6 мл свежеприготовленного раствора ТРИТЦ в ДМСО (с=2,5 мг/мл). Реакцию проводят 3 часа при рН 9,0. Реакционную смесь отделяют от непрореагировавшего ТРИТЦ диализом против PBS. В результате получается раствор меченого IgG_кр-ТРИТЦ в PBS с концентрацией белка 1 мг/мл и соотношением белок/краситель - 1/4.

Пример 7

Определение зависимости интенсивности ГКР-сигнала от концентрации конъюгата IgG-ТРИТЦ

Делают серию кратных разведений раствора IgG_кр-ТРИТЦ из примера 6 путем его разбавления PBS в 2 раза. Таким образом получают растворы меченого белка с концентрациями от 1 до 2,0×10^-3 мг/мл. В эти растворы погружают подложки аналогично примеру 4. На основании полученных данных построен график зависимости интенсивности ГКР-сигнала от концентрации конъюгата IgG_кр-ТРИТЦ в логарифмических координатах (Фиг. 4). Из рисунка видно, что график имеет прямолинейный участок при значениях -lgC от 0 до 2, что соответствует диапазону концентраций белка от 1 до 8,0×10^-3 мг/мл. Это говорит о том, что применение при таких условиях меченых иммунореагентов делает возможным реализацию различных схем твердофазного ИХА (прямой, сэндвич, конкурентный) в количественном анализе. В конкретном случае предел обнаружения белкового соединения будет составлять 8,0×10^-3 мг/мл, так как после этой точки график выходит на плато. Этот предел можно будет впоследствии снизить путем подбора другого более чувствительного красителя или методики мечения иммунореагентов.

Способ получения ГКР–чипа для иммунохимического анализа путем обработки кремниевой подложки, отличающийся тем, что ее модифицируют веществом структуры:

при воздействии ультразвука и последующей иммобилизации наночастиц серебра из концентрированного коллоидного раствора, приготовление которого включает растворение 5,1 мг нитрата серебра в 30 мл деионизированной воды, растворение 9,8 мг цитрата натрия в 300 мкл деионизированной воды, доведение раствора нитрата серебра до кипения и добавление к нему по каплям раствора цитрата натрия, охлаждение полученного коллоидного раствора до комнатной температуры и его концентрирование в 2-50 раз.