Устойчивая эмульсия пикеринга, стабилизированная нанокристаллами ацетилированной целлюлозы, способ её получения и применения

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к устойчивой эмульсии Пикеринга. Устойчивая эмульсия Пикеринга, представляющая собой гетерогенную систему, состоящую из двух несмешивающихся жидкостей, в которой одна жидкость равномерно распределена по всему объему другой жидкости в виде масляных капель, стабилизированных частицами нанокристаллической целлюлозы, отличающаяся тем, что первая жидкость в виде капель представляет собой вазелиновое или оливковое масло, а вторая - гидрозоль с содержанием ацитилированной нанокристаллической целлюлозы (АцНКЦ) в количестве 0,2-1,6 масс.% с дзета-потенциалом частиц минус 36-40 мВ, размером частиц по длине от 135 нм до 205 нм и по поперечному сечению - от 6 нм до 10 нм, при этом в эмульсии, состоящей из дисперсионной водной среды и капель масла, компоненты распределены при следующем объемном соотношении: гидрозоль - 70%; вазелиновое или оливковое масло - 30%, причем поверхности капель масла в эмульсии имеют отрицательный дзета-потенциал, дзета-потенциал капли для эмульсии с вазелиновым маслом минус 6,9, минус 7,5, минус 9,6, минус 10,3 или минус 12,5, для эмульсии с оливковым маслом - минус 10,9, минус 11,9, минус 14,0, минус 17,7, минус 18,5 или минус 19,9. Способ получения устойчивых эмульсий Пикеринга, включающий эмульгирование двух несмешивающихся жидкостей до равномерного распределения одной жидкости по всему объему другой жидкости с образованием масляных капель, стабилизированных в объеме, отличающийся тем, что эмульгирование проводят ультразвуком до равномерного распределения масла по всему объему гидрозоля в виде масленых капель с помощью ультразвукового генератора IL-10-0.1 в течение 180 секунд с частотой 22 кГц, стабилизацию поверхности масляных капель осуществляют частицами АцНКЦ с дзета-потенциалом частиц минус 36-40 мВ, размером по длине от 135 нм до 205 нм и по поперечному сечению - от 6 нм до 10 нм, при этом в процессе эмульгирования вазелинового или оливкового масла и гидрозоля, содержащего АцНКЦ в количестве 0,2-1,6 масс.%, получают устойчивую оболочку на поверхности капель с отрицательным дзета-потенциалом: для эмульсии с вазелиновым маслом минус 6,9, минус 7,5, минус 9,6, минус 10,3 или минус 12,5, для эмульсии с оливковым маслом - минус 10,9, минус 11,9, минус 14,0, минус 17,7, минус 18,5 или минус 19,9. Предлагается применение эмульсии, устойчивой в условиях желудка, в качестве системы целевой доставки липофильных лекарственных средств при пероральном введении. Вышеописанная эмульсия является устойчивой в условиях желудка системой доставки липофильных лекарственных средств, способ получения эмульсии является эффективным и простым, обеспечивает образование устойчивой оболочки эмульгированных капель. 3 н. и 1 з.п. ф-лы, 5 ил., 3 табл., 20 пр.

 

Изобретение относится к коллоидным эмульсиям, стабилизированным твёрдыми наночастицами для создания новых форм перорального транспорта лекарственных средств. В качестве твердофазных частиц для стабилизации капель масел использованы ацетилированные нанокристаллы целлюлозы (АцНКЦ).

Эмульсии представляют собой гетерогенные системы несмешивающихся жидкостей, в которых одна жидкость равномерно распределена в виде капель по всему объему другой. Системы, где капли стабилизированы твёрдыми частицами известны как эмульсии Пикеринга. При их формировании твердые частицы необратимо адсорбируются на границе раздела масло/вода и затем образуют устойчивую оболочку эмульгированных капель, препятствующую коалесценции [Capron I., Rojas O. J. b, Bordes R. Behavior of nanocelluloses at interfaces // Current Opinion in Colloid & Interface Science. 29 (2017) 83-95].

Проблемы стабилизации микроэмульсий твёрдыми наночастицами в последнее время вызывают интерес в связи с возросшими возможностями в области наносистем - получением новых типов и увеличением доступности ранее известных наночастиц-стабилизаторов, расширением спектра их использования.

Преимуществами применения эмульсий Пикеринга в сфере исследований и практических разработок материалов, контактирующих с живыми системами, является их стабильность, особенно при высоком внутреннем фазовом соотношении; отсутствие необходимости в использовании опасных поверхностно-активных веществ (ПАВ); способность в некоторых случаях сохранять или полностью восстанавливать структуру эмульсий после удаления дисперсионной среды [Aveyard R, Binks BP, Clint JH (2003) Emulsions stabilised solely by colloidal particles. Adv Colloid Interface Sci. https://doi.org/10.1016/S0001-8686(02)00069-6]. Подходящая для доставки жирорастворимых биологически активных соединений на основе эмульсии система должна соответствовать ряду требований. Во-первых, система доставки должна состоять только из компонентов, допустимых для употребления в пищевых целях с использованием экономически эффективных технологических операций. Во-вторых, она должна оставаться физически и химически стабильной на протяжении всего производства, хранения и использования. В-третьих, она не должна отрицательно влиять на желаемые физико-химические и органолептические свойства конечного продукта. В-четвёртых, она должна высвободить инкапсулированный компонент в соответствующей области человеческого тела после приема во внутрь.

Известны типы наночастиц, способных к стабилизации эмульсий, однако биосовместимыми признаны ограниченное их количество [Particle-Stabilized Emulsions and Colloids: Formation and Applications / Author(s): To Ngai, Stefan Bon, Hans-Jurgen Butt Series: RSC Soft Matter Publisher: Royal Society of Chemistry, Year: 2014 ISBN: 1849738815,978-1-84973-881-1,978-1-78262-014-3]. Особый интерес для перорального введения представляют полисахаридные наночастицы (нанововолокна, нанокристаллы) целлюлозы, хитина и крахмала [Albert C., Beladjine M., Tsapis N., Fattal E., Agnely F., Huang N. Pickering emulsions: Preparation processes, key parameters governing their properties and potential for pharmaceutical applications 2019 Journal of Controlled Release 309 DOI: 10.1016/j.jconrel.2019.07.003; Zhu F. Starch based Pickering emulsions: Fabrication, properties, and applications // Trends in Food Science & Technology].

В ряде работ [Kalashnikova I, Bizot H, Bertoncini P, et al (2013) Cellulosic nanorods of various aspect ratios for oil in water Pickering emulsions. Soft Matter 9:952-959. https://doi.org/10.1039/C2SM26472B; Bai L, Greca LG, Xiang W, et al (2018) Adsorption and assembly of cellulosic and lignin colloids at oil/water interfaces. Langmuir 35:571-588. https://doi.org/https://doi.org/10.1021/acs.langmuir.8b01288; Li X, Li J, Gong J, et al (2018) Cellulose nanocrystals (CNCs) with different crystalline allomorph for oil in water Pickering emulsions. Carbohydr Polym 183:303-310. https://doi.org/10.1016/j.carbpol.2017.12.085] показано, что для формирования стабильных эмульсий Пикеринга типа масло-в-воде, необходимо контролировать следующие свойства наночастиц целлюлозы: геометрию, химическую природу поверхности и ее заряд. На формирование и устойчивость капель влияют следующие свойства дисперсных сред: ионная сила и тип противоиона, рН дисперсионной среды и тип гидрофобной жидкости. Анизотропная форма наночастиц приводит к лучшей способности капиллярных взаимодействий, а увеличенное отношение длины частиц к диаметру вместе с ростом их концентрации вызывает дополнительный эффект взаимосвязанных капель. Стержнеобразная морфология частиц НКЦ является наиболее распространенной, также целесообразно контролировать коллоидно-химические свойства частиц путем регулирования плотности активных центров на поверхности, выступающих в качестве ориентантов диполей дисперсионной среды. С точки зрения применения, предпочтительно, чтобы поверхность частиц нанокристалов целлюлозы не содержала сульфатных, карбоксильных и других отрицательно заряженных групп, увеличивающих поверхностный заряд и, следовательно, взаимное отталкивание частиц.

В работах [Zhou Y, Sun S, Bei W, et al (2018) Preparation and antimicrobial activity of oregano essential oil Pickering emulsion stabilized by cellulose nanocrystals. Int J Biol Macromol. https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2018.01.102; Kalashnikova I, Bizot H, Cathala B, Capron I (2012) Modulation of Cellulose Nanocrystals Amphiphilic Properties to Stabilize Oil/Water Interface. Biomacromolecules 13:267-275. https://doi.org/10.1021/bm201599j; Li W, Ju B, Zhang S (2020) Novel amphiphilic cellulose nanocrystals for pH-responsive Pickering emulsions. Carbohydr Polym 229:115401. https://doi.org/10.1016/j.carbpol.2019.115401] исследователи получали стабильные эмульсии с размером капель от 0.1 до 3 мкм для биомедицинского назначения. Нанокристаллы были получены из бактериальной и микрокристаллической целлюлозы, но чтобы нейтрализовать эффект, производимый отрицательно заряженными группами, десульфатация полисахаридов выполнялась путем добавления электролита или дополнительной гидрофобизации их поверхности аминными и бензильными группами. Подобная модификация наночастиц полисахарида позволяет получать эмульсии, но для улучшения стабилизации дополнительно использовались традиционные ПАВ. Кроме использования ПАВ есть и существенный недостаток в выше указанных работах - нет исследований токсичности капель эмульсий, а также используемых наночастиц целлюлозы.

Наиболее близкими работами, рассматривающими получение эмульсий Пикеринга с использованием ацетилированных НКЦ являются статьи [Sèbe G, Ham-Pichavant F, Pecastaings G (2013) Dispersibility and Emulsion-Stabilizing Effect of Cellulose Nanowhiskers Esterified by Vinyl Acetate and Vinyl Cinnamate. Biomacromolecules 14:2937-2944. https://doi.org/10.1021/bm400854n; Espino-Pérez E, Domenek S, Belgacem N, et al (2014) Green Process for Chemical Functionalization of Nanocellulose with Carboxylic Acids. Biomacromolecules 15:4551-4560. https://doi.org/10.1021/bm5013458; Wang H, Xie H, Du H, et al (2020) Highly Efficient Preparation of Functional and Thermostable Cellulose Nanocrystals via H2SO4 Intensified Acetic Acid Hydrolysis. Carbohydr Polym 239:116233. https://doi.org/https://doi.org/10.1016/j.carbpol.2020.116233], в которых обсуждается стабилизация ацетилированными нанокристаллами целлюлозы эмульсий Пикеринга типа масло-в-воде на основе этилацетата, толуола и циклогексана. Ацетилированные производные НКЦ показали более высокие эмульгирующие свойства по сравнению с другими типами НКЦ и, в частности, наиболее распространённой сульфатированной НКЦ. К сожалению, в публикациях, описывающих получение и исследование эмульсий Пикеринга, стабилизированных АцНКЦ, отсутствуют очень важные данные об эмульгирующей способности этих частиц с маслами, пригодными для перорального введения, а также данные о реологии, строении поверхности капель и токсичности получаемых эмульсий.

Техническим результатом настоящего изобретения является расширение арсенала устойчивых стабильных эмульсий типа «масло-в-воде» на основе оливкового или вазелинового масел, пригодных для перорального введения, состоящих из дисперсионной водной среды и капель масла, стабилизированных частицами ацетилированной нанокристаллической целлюлозы (АцНКЦ) со стержневидной морфологией. Полученные эмульсии могут быть реализованы в качестве устойчивых в условиях желудка систем целевой доставки липофильных лекарственных средств. Способ получения эмульсии является эффективным и простым, обеспечивает образование устойчивой оболочки эмульгированных капель.

Технический результат достигается тем, что устойчивая эмульсия Пикеринга, представляющая собой гетерогенную систему, состоящую из двух несмешивающихся жидкостей, в которой одна жидкость равномерно распределена по всему объему другой жидкости в виде масляных капель, стабилизированных по поверхности твёрдыми частицами, согласно изобретения, первая жидкость в виде капель представляет собой вазелиновое или оливковое масло, а вторая - гидрозоль с содержанием АцНКЦ в количестве 0.2 - 1.6 масс. % с дзета-потенциалом минус 36-40 мВ, размером частиц по длине от 135 нм до 205 нм и по поперечному сечению - от 6 нм до 10 нм, при этом в эмульсии, состоящий из дисперсной водной среды и капель масла компоненты распределены при следующем объемном соотношении:

- гидрозоль - 70 %;

- вазелиновое или оливковое масло - 30 %

В частном случае, эмульсия дополнительно содержит фоновый электролит (NaCl) в количестве 60 - 120 мМ.

Технический результат способа достигается тем, что способ получения устойчивых эмульсий Пикеринга, включающий эмульгирование двух несмешивающихся жидкостей до равномерного распределения одной жидкости по всему объему другой жидкости с образованием масляных капель, стабилизированных в объеме, согласно изобретения, эмульгирование проводят ультразвуком, стабилизацию поверхности масляных капель осуществляют частицами ацитилированной нанокристаллической целлюлозой (АцНКЦ) в процессе эмульгирования вазелинового или оливкового масла и гидрозоля, содержащего АцНКЦ в количестве 0.2 - 1.6 масс. % путем адсорбирования частиц на границе раздела масло/вода с образованием устойчивой оболочки эмульгированных капель.

Полученная эмульсия устойчива в условиях желудка и применима в качестве системы целевой доставки липофильных лекарственных средств при пероральном введении. Для обоснования проведен скрининг in vivo токсичности полученных эмульсий и исходных наночастиц с использованием лабораторных мышей и in vitro поведения эмульсий в желудочно-кишечном тракте.

Изобретение поясняется чертежами и фотографиями.

На фигуре 1 представлены фотографии (визуальные наблюдения) эмульсий с вазелиновым маслом с различной концентрацией АцНКЦ и NaCl; свежеприготовленные (а, с, е) и после месяца хранения (b, d, f). На фигуре 2 - фотографии (визуальные наблюдения) эмульсий с оливковым маслом с различной концентрацией АцСНЦ и NaCl; свежеприготовленные (а, с, е) и после месяца хранения (b, d, f). На фиг. 3 представлена гистограмма и микрофотографии эмульсий после месяца хранения. На фиг. 4 представлены кривые вязкости эмульсий масло/вода, стабилизированных АцНКЦ (1.6 масс.%): вазелиновое масло (а) и оливковое масло (б) (при 25°C, с различными концентрациями NaCl). На фиг. 5 представлены оптические микрофотографии эмульсий, стабилизированные АцНКЦ до и после нахождения в модельных условиях желудочно-кишечного тракта, где: (a) - исходная эмульсия; (б) - эмульсия после выдерживания в условиях ротовой полости (модель); (с) - эмульсия после выдерживания в условиях желудка (модель); (д) - эмульсия после выдерживания в условиях тонкого кишечника (модель).

Полученные стабильные эмульсии относятся к 5-му классу токсичности (не токсичные вещества), и согласно изобретению могут быть использованы в качестве липофильных систем доставки лекарственных средств методом перорального введения, устойчивых в условиях желудка с полным разрушением в кишечнике млекопитающих.

Эмульсии типа масло-в-воде были сформированы с использованием наночастиц АцНКЦ, полученной из целлюлозы по методике, описанной в работе [Torlopov M. A., Mikhaylov V. I., Udoratina E. V., Aleshina L. A., Prusskii A. I., Tsvetkov N. V., Krivoshapkin P. V. Cellulose nanocrystals with different length-to-diameter ratios extracted from various plants using novel system acetic acid/phosphotungstic acid/octanol-1 // Cellulose, 2018. Volume 25, Issue 2, pp 1031-1046 Doi. 10.1007/s10570-017-1624-z].

Средний размер использованных частиц АцНКЦ составил по длине от 135 нм до 205 нм и от 6 нм до 10 нм по поперечному сечению, индекс кристалличности = 0.88; дзета-потенциал гидрозоля = -38 ± 2 мВ, содержание ацетатных групп 13.5 на 100 целлюлозных звеньев. Для формирования устойчивых эмульсий с размером капель основной фракции до 2 мкм, достаточно исходного гидрозоля с концентрацией наноцеллюлозных частиц 0.2 - 1.6 масс. %.

Указанная стержнеобразная морфология нанокристаллов целлюлозы, наличие липофильных ацетатных групп и отрицательный поверхностный заряд определяют образование двойного электрического слоя (ДЭС) на поверхности капли, что приводит к формированию устойчивых капель масла в воде.

Исходный гидрозоль может содержать наночастицы АцНКЦ в количестве 0.2 - 1.6 масс. % и при необходимости фоновый электролит (NaCl) в количестве 0 - 120 мМ. Для получения эмульсии к гидрозолю добавляли гидрофобную жидкость, нетоксичную и пригодную для перорального введения (вазелиновое масло или оливковое масло) при объемном соотношении масло/гидрозоль 30/70. Плотность исследуемых органических жидкостей была меньше плотности воды, поэтому их постепенное расслоение приводило к формированию двух слоев. Образующийся при стоянии верхний органический слой (крем) и есть эмульсия, что хорошо просматривается визуально (фиг. 1 и фиг. 2). На фигуре 1 представлены фотографии (визуальные наблюдения) эмульсий с вазелиновым маслом с различной концентрацией АцНКЦ и NaCl; свежеприготовленные (а, с, е) и после месяца хранения (b, d, f), на фигуре 2 - фотографии (визуальные наблюдения) эмульсий с оливковым маслом с различной концентрацией АцСНЦ и NaCl; свежеприготовленные (а, с, е) и после месяца хранения (b, d, f).

Полученные эмульсии Пикеринга стабилизированные АцНКЦ были исследованы с помощью оптического микроскопа Olympus BX53 и лазерного анализатора Malvern ZetaSizer Nano ZS. Все стабилизированные капли в свежеприготовленных разбавленных эмульсиях отображаются в виде сферических объектов с размерами от 1.6 до 8.2 мкм с вазелиновым маслом и от 1.2 до 9.2 мкм с оливковым маслом (таблица 1). Диаметр капель основных фракций эмульсий с добавлением электролита не превышал 2 мкм, что установлено по микрофотографиям. Для сравнения в работе [Kalashnikova I, Bizot H, Cathala B, Capron I (2012) Modulation of Cellulose Nanocrystals Amphiphilic Properties to Stabilize Oil/Water Interface. Biomacromolecules 13:267-275. https://doi.org/10.1021/bm201599j] частицы нанокристаллов целлюлозы в форме стержней вместе с гидрофобными жидкостями образуют капли эмульсий диаметром от 4.0 мкм и более.

Оптические микрофотографии свежеприготовленных и после месяца хранения стабилизированных АцНКЦ эмульсий оливкового масла при концентрации частиц АцНКЦ 1.6 масс.%, C(NaCl) = 60 мM представлены на фиг. 3, как показали исследования после хранения в течение месяца морфология капель не изменилась; средний диаметр капель основных фракций изменился не более чем на 0,5 мкм (фиг. 3, гистограмма). На микрофотографиях эмульсий после месяца хранения следов разрушения капель и свободного масла не обнаружено.

Дзета-потенциалы капель эмульсии были экспериментально определены методом лазерного доплеровского электрофореза (Malvern ZetaSizer Nano ZS, 4 мВт He / Ne-лазер, 633 нм) при 25°C.

Наблюдаемая стабильность капель эмульсии обеспечивается формированием слоя частиц АцНКЦ на поверхности раздела фаз масло-вода, что создает механический барьер и обеспечивает взаимное отталкивание одноимённо заряженных капель, препятствующих коалесценции.

В таблице 1 показано, что капли эмульсий во всех изученных системах имели отрицательный дзета-потенциал, поскольку поверхностный заряд капель был вызван адсорбцией нанокристаллических частиц целлюлозы на границе раздела. В связи с этим дзета-потенциал капель эмульсии, как и у исходного АцНКЦ [Mikhailov VI, Torlopov MA, Martakov IS, Krivoshapkin PV (2017) Stability of nanocrystalline cellulose in aqueous KCl solutions. Colloid J 79:. https://doi.org/10.1134/S1061933X17020065], уменьшался с увеличением концентрации электролита. Однако изменение концентрации АцНКЦ в эмульсиях обычно приводило к незначительным изменениям значений дзета-потенциала. Наиболее резкое изменение дзета-потенциала в зависимости от концентрации NaCl наблюдалось в эмульсиях на основе вазелинового масла при самых высоких концентрациях АцНКЦ, что сопоставимо с изменениями в водных дисперсиях АцНКЦ. Эмульсии на основе оливкового масла показали несколько иную картину. При концентрациях электролита 60 мМ значения дзета-потенциала оставались высокими, т.е. не снижались ниже -14 мВ. Этот факт косвенно указывает на участие молекул жирных кислот, которые среди исследованных масел содержатся только в оливковом масле, в формировании приповерхностного слоя, выстраиваясь в границу раздела и способствуя увеличению дзета-потенциала.

Реологические эксперименты проводили с использованием реометра Brookfield DV-III Ultra (Brookfield Engineering Laboratories Inc., США). На фиг. 4 показаны кривые вязкости эмульсий масло/вода, стабилизированных АцНКЦ (1.6 масс.%): вазелиновое масло (а) и оливковое масло (б) (при 25°C, с различными концентрациями NaCl). Вязкость эмульсий имеет первостепенное значение для их применения. Все рассматриваемые эмульсий масло/вода - неньютоновские жидкости с псевдопластическим поведением (фиг. 4). Особенно это касается эмульсий с фоновым электролитом. Кроме того, добавление электролита значительно изменило вязкость эмульсий, стабилизированных АцНКЦ. При увеличении концентрации NaCl в эмульсиях наблюдалось увеличение вязкости. Для эмульсии с вазелиновым маслом наибольшее увеличение динамической вязкости наблюдалось при увеличении концентрации NaCl от 60 до 120 мМ в системе. Кривые вязкости эмульсий с фоновым электролитом, особенно на основе оливкового масла, были близкими, что указывало на меньшие различия в этих системах по сравнению с системами без NaCl.

На основании приведенных выше данных можно сделать вывод, что сжатие двойного электрического слоя в присутствии NaCl и падение дзета-потенциала капель эмульсии привело к уменьшению эффекта взаимного отталкивания капель. В результате для рассматриваемых эмульсий увеличивается вероятность образования слабосвязанных агрегатов - сетки капель матричной фазы в высококонцентрированной эмульсионной системе. Именно этот эффект, по-видимому, определяет повышенную динамическую вязкость АцНКЦ в присутствии определенных количеств электролита.

Изобретение подробно описано и проиллюстрировано с конкретной ссылкой на определенные варианты его осуществления согласно следующими примерами.

Пример 1. К гидрозолю АцНКЦ с концентрацией наночастиц 0.2 масс.% добавляли вазелиновое масло при объемном соотношении гидрозоль/масло - 70/30. Полученную смесь помещали в ледяную баню (в частности, емкость, заполненную льдом) и эмульгировали ультразвуком до состояния равномерного распределения масла по всему объему гидрозоля в виде масляных капель (оптимальным режим - в течение 180 с., УЗ генератор IL-10-0.1, Россия. Частота 22 кГц, титановый зонд). Размеры полученных капель эмульсии определяли на оптическом микроскопе с помощью микроскопа Olympus BX53 и на лазерном анализаторе Malvern ZetaSizer Nano ZS. Для эмульсий вазелинового масла средний размер капель составлял 1.6 мкм (см. таблица 1). Полученные капли эмульсий были стабильны не менее одного месяца, что подтверждалось исследованиями размеров капель и их морфологии с использованием оптической микроскопии, визуальным наблюдением, которые не изменялись. Полученные эмульсии типа масло-в-воде представляют собой неньютоновские жидкости с псевдопластическим поведением.

Пример 2. К гидрозолю АцНКЦ с концентрацией наночастиц 0.2 масс.% добавляли оливковое масло при объемном соотношении гидрозоль/масло - 70/30. Процесс эмульгирования вели аналогично примеру 1. Для эмульсий оливкового масла средний размер капель 1.2 мкм (см. таблица 1). Полученные капли эмульсий были стабильны не менее чем в течение месяца, что подтверждалось исследованиями размеров капель и их морфологии с использованием оптической микроскопии, визуальным наблюдением, которые не изменялись. Полученные эмульсии типа масло-в-воде представляют собой неньютоновские жидкости с псевдопластическим поведением.

Пример 3. К гидрозолю АцНКЦ с концентрацией наночастиц 0.9 масс.% добавляли вазелиновое масло при объемном соотношении гидрозоль/масло - 70/30. Полученную смесь помещали в ледяную баню и обрабатывали ультразвуком до состояния равномерного распределения масла по всему объему гидрозоля в виде масляных капель в течение 180 секунд (УЗ генератор IL-10-0.1, Россия. Частота 22 кГц, титановый зонд). Размеры полученных капель эмульсии, а также дзета-потенциал и вязкость измеряли как в примере 1.

Пример 4. К гидрозолю АцНКЦ с концентрацией наночастиц 0.9 масс.% добавляли оливковое масло при объемном соотношении гидрозоль /масло - 70/30. Полученную смесь помещали в ледяную баню и обрабатывали ультразвуком до состояния равномерного распределения масла по всему объему гидрозоля в виде масляных капель в течение 180 секунд (УЗ генератор IL-10-0.1, Россия. Частота 22 кГц, титановый зонд). Размеры полученных капель эмульсии, дзета-потенциал и вязкость измеряли как в примере 1.

Пример 5. К гидрозолю АцНКЦ с концентрацией наночастиц 1.6 масс.% добавляли вазелиновое масло при объемном соотношении гидрозоль/масло - 70/30. Полученную смесь помещали в ледяную баню и обрабатывали ультразвуком до состояния равномерного распределения масла по всему объему гидрозоля в виде масляных капель в течение 180 секунд (УЗ генератор IL-10-0.1, Россия. Частота 22 кГц, титановый зонд). Размеры полученных капель эмульсии, а также дзета-потенциал и вязкость измеряли как в примере 1.

Пример 6. К гидрозолю АцНКЦ с концентрацией наночастиц 1.6 масс.% добавляли оливковое масло при объемном соотношении гидрозоль/масло - 70/30. Полученную смесь помещали в ледяную баню и обрабатывали ультразвуком до состояния равномерного распределения масла по всему объему гидрозоля в виде масляных капель в течение 180 секунд (УЗ генератор IL-10-0.1, Россия. Частота 22 кГц, титановый зонд). Размеры полученных капель эмульсии, дзета-потенциал и вязкость измеряли как в примере 1.

Пример 7. К гидрозолю АцНКЦ с концентрацией наночастиц 0.2 масс.% добавляли фоновый электролит (NaCl) в количестве 60 мМ и вазелиновое масло при объемном соотношении гидрозоль/масло - 70/30. Полученную смесь помещали в ледяную баню и эмульгировали ультразвуком до состояния равномерного распределения масла по всему объему гидрозоля в виде масляных капель (оптимальным режим - в течение 180 с., УЗ генератор IL-10-0.1, Россия. Частота 22 кГц, титановый зонд). Размеры полученных капель эмульсии определяли на оптическом микроскопе с помощью микроскопа Olympus BX53 и на лазерном анализаторе Malvern ZetaSizer Nano ZS. Для эмульсий вазелинового масла средний размер составлял 2,9 мкм (таблица 1). Полученные капли эмульсий были стабильны не менее чем в течение месяца, что подтверждалось исследованиями размеров капель и их морфологии с использованием оптической микроскопии, визуальным наблюдением, которые не изменялись. Полученные эмульсии типа масло-в-воде представляют собой неньютоновские жидкости с псевдопластическим поведением. Добавление электролита значительно увеличивало вязкость эмульсий.

Пример 8. К гидрозолю АцНКЦ с концентрацией наночастиц 0.2 масс.% добавляли фоновый электролит (NaCl) в количестве 60 мМ и оливковое масло при объемном соотношении гидрозоль/масло - 70/30. Полученную смесь помещали в ледяную баню и эмульгировали ультразвуком до состояния равномерного распределения масла по всему объему гидрозоля в виде масляных капель (оптимальным режим - в течение 180 с., УЗ генератор IL-10-0.1, Россия. Частота 22 кГц, титановый зонд). Размеры полученных капель эмульсии определяли на оптическом микроскопе с помощью микроскопа Olympus BX53 и на лазерном анализаторе Malvern ZetaSizer Nano ZS. Для эмульсий оливкового масла средний размер капель составлял 4,8 мкм (таблица 1). Полученные капли эмульсий были стабильны не менее чем в течение месяца, что подтверждалось исследованиями размеров капель и их морфологии с использованием оптической микроскопии, визуальным наблюдением, которые не изменялись. Полученные эмульсии типа масло-в-воде представляют собой неньютоновские жидкости с псевдопластическим поведением. Добавление электролита значительно увеличивало вязкость эмульсий.

Пример 9. К гидрозолю АцНКЦ с концентрацией наночастиц 0.2 масс.% добавляли фоновый электролит (NaCl) в количестве 120 мМ и вазелиновое масло при объемном соотношении гидрозоль/масло - 70/30. Полученную смесь помещали в ледяную баню и эмульгировали ультразвуком до состояния равномерного распределения масла по всему объему гидрозоля в виде масляных капель (оптимальным режим - в течение 180 с., УЗ генератор IL-10-0.1, Россия. Частота 22 кГц, титановый зонд). Размеры полученных капель эмульсии, а также дзета-потенциал приведены в таблице 1, вязкость измеряли как в примере 7.

Пример 10. К гидрозолю АцНКЦ с концентрацией наночастиц 0.2 масс.% добавляли фоновый электролит (NaCl) в количестве 120 мМ и оливковое масло при объемном соотношении гидрозоль /масло - 70/30. Полученную смесь помещали в ледяную баню и эмульгировали ультразвуком до состояния равномерного распределения масла по всему объему гидрозоля в виде масляных капель (оптимальным режим - в течение 180 с., УЗ генератор IL-10-0.1, Россия. Частота 22 кГц, титановый зонд). Размеры полученных капель эмульсии, а также дзета-потенциал приведены в таблице 1, вязкость измеряли как в примере 7.

Пример 11. К гидрозолю АцНКЦ с концентрацией наночастиц 0.9 масс.% добавляли фоновый электролит (NaCl) в количестве 60 мМ и вазелиновое масло при объемном соотношении гидрозоль /масло - 70/30. Полученную смесь помещали в ледяную баню и эмульгировали ультразвуком до состояния равномерного распределения масла по всему объему гидрозоля в виде масляных капель (оптимальным режим - в течение 180 с., УЗ генератор IL-10-0.1, Россия. Частота 22 кГц, титановый зонд). Размеры полученных капель эмульсии, а также дзета-потенциал приведены в таблице 1, вязкость измеряли как в примере 7.

Пример 12. К гидрозолю АцНКЦ с концентрацией наночастиц 0.9 масс.% добавляли фоновый электролит (NaCl) в количестве 60 мМ и оливковое масло при объемном соотношении гидрозоль /масло - 70/30. Полученную смесь помещали в ледяную баню и эмульгировали ультразвуком до состояния равномерного распределения масла по всему объему гидрозоля в виде масляных капель (оптимальным режим - в течение 180 с., УЗ генератор IL-10-0.1, Россия. Частота 22 кГц, титановый зонд). Размеры полученных капель эмульсии, а также дзета-потенциал приведены в таблице 1, вязкость измеряли как в примере 7.

Пример 13. К гидрозолю АцНКЦ с концентрацией наночастиц 0.9 масс.% добавляли фоновый электролит (NaCl) в количестве 120 мМ и вазелиновое масло при объемном соотношении гидрозоль/масло - 70/30. Полученную смесь помещали в ледяную баню и эмульгировали ультразвуком до состояния равномерного распределения масла по всему объему гидрозоля в виде масляных капель (оптимальным режим - в течение 180 с., УЗ генератор IL-10-0.1, Россия. Частота 22 кГц, титановый зонд). Размеры полученных капель эмульсии, а также дзета-потенциал приведены в таблице 1, вязкость измеряли как в примере 7.

Пример 14. К гидрозолю АцНКЦ с концентрацией наночастиц 0.9 масс.% добавляли фоновый электролит (NaCl) в количестве 120 мМ и оливковое масло при объемном соотношении гидрозоль/масло - 70/30. Полученную смесь помещали в ледяную баню и эмульгировали ультразвуком до состояния равномерного распределения масла по всему объему гидрозоля в виде масляных капель (оптимальным режим - в течение 180 с., УЗ генератор IL-10-0.1, Россия. Частота 22 кГц, титановый зонд). Размеры полученных капель эмульсии, а также дзета-потенциал приведены в таблице 1, вязкость измеряли как в примере 7.

Пример 15. К гидрозолю АцНКЦ с концентрацией наночастиц 1.6 масс.% добавляли фоновый электролит (NaCl) в количестве 60 мМ и вазелиновое масло при объемном соотношении гидрозоль /масло - 70/30. Полученную смесь помещали в ледяную баню и эмульгировали ультразвуком до состояния равномерного распределения масла по всему объему гидрозоля в виде масляных капель (оптимальным режим - в течение 180 с., УЗ генератор IL-10-0.1, Россия. Частота 22 кГц, титановый зонд). Размеры полученных капель эмульсии, а также дзета-потенциал приведены в таблице 1, вязкость измеряли как в примере 7.

Пример 16. К гидрозолю АцНКЦ с концентрацией наночастиц 1.6 масс.% добавляли фоновый электролит (NaCl) в количестве 60 мМ и оливковое масло при объемном соотношении гидрозоль /масло - 70/30. Полученную смесь помещали в ледяную баню и эмульгировали ультразвуком до состояния равномерного распределения масла по всему объему гидрозоля в виде масляных капель (оптимальным режим - в течение 180 с., УЗ генератор IL-10-0.1, Россия. Частота 22 кГц, титановый зонд). Размеры полученных капель эмульсии, а также дзета-потенциал приведены в таблице 1, вязкость измеряли как в примере 7.

Пример 17. К гидрозолю АцНКЦ с концентрацией наночастиц 1.6 масс.% добавляли фоновый электролит (NaCl) в количестве 120 мМ и вазелиновое масло при объемном соотношении гидрозоль /масло - 70/30. Полученную смесь помещали в ледяную баню и эмульгировали ультразвуком до состояния равномерного распределения масла по всему объему гидрозоля в виде масляных капель (оптимальным режим - в течение 180 с., УЗ генератор IL-10-0.1, Россия. Частота 22 кГц, титановый зонд). Размеры полученных капель эмульсии, а также дзета-потенциал приведены в таблице 1, вязкость измеряли как в примере 7.

Пример 18. К гидрозолю АцНКЦ с концентрацией наночастиц 1.6 масс.% добавляли фоновый электролит (NaCl) в количестве 120 мМ и оливковое масло при объемном соотношении гидрозоль /масло - 70/30. Полученную смесь помещали в ледяную баню и эмульгировали ультразвуком до состояния равномерного распределения масла по всему объему гидрозоля в виде масляных капель (оптимальным режим - в течение 180 с., УЗ генератор IL-10-0.1, Россия. Частота 22 кГц, титановый зонд). Размеры полученных капель эмульсии, а также дзета-потенциал приведены в таблице 1, вязкость измеряли как в примере 7.

Таблица 1
Стабилизаторы эмульсий	Эмульсии с вазелиновым маслом	Эмульсии с оливковым маслом
Средний гидродинамический диаметр капель, мкм	Дзета- потенциал капель, мВ	Средний гидродинамический диаметр капель, мкм	Дзета- потенциал капель, мВ
По примеру 1 и 2 АцНКЦ 0.2 масс.%	1.6	-60.2	1.2	-51.5
По примеру 3 и 4 АцНКЦ 0.9 масс.%	4.7	-53.5	1.2	-49.7
По примеру 5 и 6 АцНКЦ 1.6 масс.%	5.3	-46.6	1.2	-46.6
По примеру 7 и 8 АцНКЦ 0.2 масс.% C (NaCl)=60 мМ	2.9	-12.5	4.8	-19.9
По примеру 9 и 10 АцНКЦ 0.2 масс.% C (NaCl)=120 мМ	5.7	-7.5	4.9	-17.7
По примеру 11 и 12 АцНКЦ 0.9 масс.% C (NaCl)=60 мМ	4.2	-10.3	6.4	-18.5
По примеру 13 и 14 АцНКЦ 0.9 масс.% C (NaCl)=120 мМ	6.2	-6.9	6.5	-10.9
По примеру 15 и 16 АцНКЦ 1.6 масс.% C (NaCl)=60 мМ	5.4	-9.6	7.1	-14.0
По примеру 17 и 18 АцНКЦ 1.6 масс.% C (NaCl)=120 мМ	8.2	-6.9	9.2	-11.9

Пример 19. Анализ на острую оральную токсичность с использованием лабораторных мышей.

Анализ острой токсичности проводился в соответствии с руководством 425

Организации экономического сотрудничества и развития (ОЭСР) (от 2001 г.). По методике общее количество 50 шт. мышей весом от 21 до 38 г.разделили случайным образом на пять экспериментальных групп по 10 мышей в каждой (5 самцов и 5 самок в группе). Каждой группе вводили гидрозоль АцНКЦ (для контроля влияния наночастиц), а также эмульсии согласно примеру 10 в разовых дозах 2000 мг/кг, соответственно, через желудочный зонд. Контрольным группам вводили такой же объем дистиллированной воды или раствор NaCl с концентрацией 0,12 М, что соответствует количеству NaCl 120 мМ в растворе. После введения доз за животными наблюдали индивидуально на предмет смертности и изменений общего поведения в течение первых 30 минут, а затем через 2, 4, 6, 10 и 24 часа. Симптомы токсичности, такие как гипоактивность, пилоэрекция, затрудненное дыхание, тремор и судороги, оценивались после введения доз препаратов и выражалось в значении LD₅₀ (см. таблицу 2).

Таблица 2 Токсикометрия эмульсий, стабилизированных гидрозолем АцНКЦ
Препарат	Пол мышей	LD50 (мг/кг)	Умерло/всего	Класс токсичности (OECD)
Гидрозоль АцНКЦ	самцы	2000	0/5	Не токсично (Класс V)
самки	2000	0/5	Не токсично (Класс V)
Эмульсия вазелинового масла по примеру 7	самцы	2000	0/5	Не токсично (Класс V)
самки	2000	0/5	Не токсично (Класс V)
Эмульсия оливкового масла по примеру 7	самцы	2000	0/5	Не токсично (Класс V)
самки	2000	0/5	Не токсично (Класс V)

В течение оставшегося экспериментального периода наблюдение за животными проводили не реже одного раза в день в течение 14 суток после введения доз исследуемых препаратов. Вес тела измеряли сразу после введения препарата на 4, 7, 11 и 14 сутки после введения доз препаратов. На 14-й день мышей умерщвляли под анестезией и жизненно важные органы (сердце, почки, селезенка и печень) удаляли для макроскопического исследования.

В таблице 3 приведены данные выраженные как среднее значение веса испытуемых мышей. Статистическая значимость определялась односторонним дисперсионным анализом (ANOVA) с последующим тестом Dennett’s и U-test Mann-Whitney. Анализ данных у самцов и самок проводился отдельно, и различия считались статистически значимыми при p <0,05.

Таблица 3 Вес мышей, получавших исследуемые препараты
Пол мышей	Время после инъекции, сутки	Контроль 1 (вода)	Контроль 2 (раствор NaCl)	Гидрозоль АцНКЦ	Эмульсия вазелинового масла по примеру 7	Эмульсия оливкового масла по примеру 7
самцы	0	27.4±0.2	29.0±0.4	27.0±0.7	30.0±0.6	28.6±1.3
	4	26.8±0.4	30.2±0.6	27.0±0.9	27.7±1.3	27.8±1.1
	7	27.0±0.0	27.8±0.7	27.2±0.9	28.7±0.3	27.4±1.0
	11	26.6±0.4	29.2±0.5	28.6±0.7	27.3±0.9	28.6±0.9
14	26.4±0.5	28.0±0.5	27.0±0.7	28.3±0.3	27.8±1.1
самки	0	25.6±1.2	26.8±2.0	23.2±1.0	24.8±0.4	24.8±1.1
	4	24.8±1.2	27.2±1.5	23.2±1.0	24.8±0.6	24.2±1.0
	7	25.2±1.2	27.4±1.5	23.6±0.8	25.6±0.9	24.6±1.1
	11	24.8±1.4	27.2±1.6	22.8±1.0	24.6±0.7	23.2±1.2
14	24.8±1.4	26.8±1.4	22.2±1.2	24.8±0.9	22.6±1.4

Пример 20. Анализ сохранности эмульсий в условиях, моделирующих желудочно-кишечный тракт млекопитающих.

Раствор, имитирующий слюну, готовили растворением 0,6 г муцина в 20 мл деионизированной воды. Затем к полученному раствору добавили 20 мл эмульсии оливкового масла по примеру 10, разбавленную из расчета получения 2 масс.% масла, и непрерывно перемешивали при 100 об./мин в шейкере-инкубаторе (37°C в течение 5 минут). Полученный раствор в неразбавленном виде исследовали методом оптической микроскопии. Из анализа размера и морфологии капель (фиг. 5) видно, что эмульсии благополучно сохраняются в условиях ротовой полости in vitro.

Модельную желудочную среду готовили растворением 2 г NaCl и 7 мл соляной кислоты (37,6%) в деионизированной воде с доведением объема до 1 л. Далее в 20 мл полученной смеси растворяли 64 мг пепсина (pH=1.68). К полученному раствору добавляли 20 мл эмульсии, прошедшей стадию ротовой полости, и непрерывно перемешивали при 100 об./мин в шейкере-инкубаторе (37°C в течение 2 часов) для имитации условий в желудке. Полученный раствор в неразбавленном виде исследовали методом оптической микроскопии. Из анализа размера и морфологии капель (фиг. 5) видно, что эмульсии сохраняются в условиях желудка in vitro.

Образец эмульсии, прошедший стадию желудка (20 мл), постепенно доводили до pH=7.0 с использованием 0.1 M раствора NaOH при перемешивании в шейкере- инкубаторе со скоростью 100 об./мин при температуре 37°C в течение 5 минут.Затем в полученный раствор при непрерывном перемешивании добавляли симулированные кишечные жидкости: 1.5 мл раствора, содержащего 0.25 М CaCl2 и 3.75 М NaCl, и 3.5 мл раствора желчи (5 мг/мл). После добавления реагентов pH системы снова доводили до значения 7.0. После этого в систему в носили 2.5 мл свежеприготовленного раствора липазы (1.6 мг/мл). Смесь непрерывно перемешивали со скоростью 100 об./мин в шейкере-инкубаторе (37°C в течение двух часов) для имитации условий в тонком кишечнике. Полученный раствор в неразбавленном виде исследовали методом оптической микроскопии. Из анализа (фиг. 5) видно, что эмульсия полностью разрушается за время нахождения в среде, симулирующей кишечные жидкости (два часа).

Таким образом, пероральное введение разовой дозы заявленных в изобретении гидрозоля и эмульсий не приводили к гибели мышей в течение 14-дневного периода наблюдения, что соответствует классу токсичности V, т.е. вводимые препараты не токсичны. Также заявленные в изобретении эмульсии могут быть использованы в качестве липофильных систем доставки лекарственных средств методом перорального введения, устойчивых в условиях желудка и с полным разрушением в кишечнике млекопитающих.

1. Устойчивая эмульсия Пикеринга, представляющая собой гетерогенную систему, состоящую из двух несмешивающихся жидкостей, в которой одна жидкость равномерно распределена по всему объему другой жидкости в виде масляных капель, стабилизированных частицами нанокристаллической целлюлозы, отличающаяся тем, что первая жидкость в виде капель представляет собой вазелиновое или оливковое масло, а вторая - гидрозоль с содержанием ацитилированной нанокристаллической целлюлозой (АцНКЦ) в количестве 0,2-1,6 масс.% с дзета-потенциалом частиц минус 36-40 мВ, размером частиц по длине от 135 нм до 205 нм и по поперечному сечению - от 6 нм до 10 нм, при этом в эмульсии, состоящей из дисперсионной водной среды и капель масла компоненты распределены при следующем объемном соотношении:

- гидрозоль - 70%;

- вазелиновое или оливковое масло - 30%,

причем поверхности капель масла в эмульсии имеют отрицательный дзета-потенциал, дзета-потенциал капли для эмульсии с вазелиновым маслом - минус 6,9, минус 7,5, минус 9,6, минус 10,3 или минус 12,5, для эмульсии с оливковым маслом - минус 10,9, минус 11,9, минус 14,0, минус 17,7, минус 18,5 или минус 19,9.

2. Эмульсия по п. 1, отличающаяся тем, что дополнительно содержит фоновый электролит (NaCl) в количестве 60-120 мМ.

3. Способ получения устойчивых эмульсий Пикеринга по п.1, включающий эмульгирование двух несмешивающихся жидкостей до равномерного распределения одной жидкости по всему объему другой жидкости с образованием масляных капель, стабилизированных в объеме, отличающийся тем, что эмульгирование проводят ультразвуком до равномерного распределения масла по всему объему гидрозоля в виде масленых капель с помощью ультразвукового генератора IL-10-0.1 в течение 180 секунд с частотой 22 кГц, стабилизацию поверхности масляных капель осуществляют частицами АцНКЦ с дзета-потенциалом частиц минус 36-40 мВ, размером по длине от 135 нм до 205 нм и по поперечному сечению - от 6 нм до 10 нм, при этом в процессе эмульгирования вазелинового или оливкового масла и гидрозоля, содержащего АцНКЦ в количестве 0,2-1,6 масс.%, получают устойчивую оболочку на поверхности капель с отрицательным дзета-потенциалом: для эмульсии с вазелиновым маслом минус 6,9, минус 7,5, минус 9,6, минус 10,3 или минус 12,5, для эмульсии с оливковым маслом - минус 10,9, минус 11,9, минус 14,0, минус 17,7, минус 18,5 или минус 19,9.

4. Применение эмульсии по п. 1, устойчивой в условиях желудка, в качестве системы целевой доставки липофильных лекарственных средств при пероральном введении.