Нейтрализация ингибиторных путей в лимфоцитах

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности предложено применение антитела, нейтрализующего активность NKG2A, для лечения рака у индивида-человека, плохо (слабо) реагирующего на лечение антителом, нейтрализующим PD-1, предложен способ идентификации индивида, имеющего высокую вероятность отсутствия реакции на лечение антителом, нейтрализующим PD-1, а также предложен способ лечения рака с помощью комбинации антител, нейтрализующих активность NKG2A и PD-1. 3 н. и 21 з.п. ф-лы, 8 ил., 3 табл., 8 пр.

 

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

В настоящей заявке заявляется приоритет по предварительной заявке США №62/281,217, поданной 21 января 2016 года, которая полностью включена в настоящий документ посредством ссылки, включая любые чертежи.

ССЫЛКА НА ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

Настоящая заявка подана вместе с перечнем последовательностей в электронном формате. Перечень последовательностей представлен в виде файла с названием "NKG2A-PD1b_ST25", созданного 19 января 2017 г., размером 38 кБ. Информация о перечне последовательностей в электронном формате полностью включена в настоящую заявку посредством ссылки.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

В настоящем изобретении предложено применение агентов, нейтрализующих NKG2A, для лечения рака, плохо (слабо) реагирующего на агенты, нейтрализующие PD-1, а также к комбинированному применению агентов, нейтрализующих NKG2A, и агентов, нейтрализующих PD-1, для лечения рака.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Активность NK-клеток регулирует сложный механизм, включающий как активирующие, так и ингибирующие сигналы. Выявлено несколько различных NK-специфических рецепторов, играющих важную роль в опосредованном NK-клетками распознавании и уничтожении клеток-мишеней, дефектных по HLA I класса. Рецепторы естественной цитотоксичности (NCR) относятся к классу активирующих рецепторных белков и генам, экспрессирующим их, специфически экспрессируемым в NK-клетках. Примеры NCR включают NKp30, NKp44 и NKp46 (см., например, Lanier (2001) Nat Immunol 2:23-27, Pende et al. (1999) J Exp Med. 190:1505-1516, Cantoni et al. (1999) J Exp Med. 189:787-796, Sivori et al (1997) J. Exp. Med. 186:1129-1136, Pessino et al. (1998) J Exp Med. 188(5):953-60; Mandelboim et al. (2001) Nature 409:1055-1060, полные описания которых включены в настоящий документ посредством ссылок). Эти рецепторы являются членами суперсемейства Ig, и их перекрестное связывание, индуцированное специфическими мАт, приводит к сильной активации NK-клеток, приводящей к повышению внутриклеточного уровня Ca⁺⁺, индукции цитотоксичности и высвобождению лимфокинов, а также активации NK-цитотоксичности против многих типов клеток-мишеней.

CD94/NKG2A представляет собой ингибиторный рецептор, встречающийся на субпопуляциях лимфоцитов. CD94/NKG2A ограничивает высвобождение цитокинов и цитотоксические реакции некоторых лимфоцитов по отношению к клеткам, экспрессирующим лиганд CD94/NKG2A HLA-E (см., например, WO 99/28748). Кроме того, обнаружено, что HLA-E секретируется в растворимой форме некоторыми опухолевыми клетками (Derre et al., J Immunol 2006; 177:3100-7) и активированными эндотелиальными клетками (Coupel et al., Blood 2007; 109:2806-14). Антитела, ингибирующие сигнальный путь CD94/NKG2A, могут усиливать высвобождение цитокинов и цитотоксическую активность лимфоцитов по отношению к HLA-E-положительным клеткам-мишеням, например, реакции CD94/NKG2A-положительных NK-клеток по отношению к HLA-E-экспрессирующим опухолевым клеткам или клеткам, инфицированным вирусами. Следовательно, терапевтические антитела, ингибирующие CD94/NKG2A, но не провоцирующие уничтожения CD94/NKG2A-экспрессирующих клеток (т.е. неистощающие антитела (non-depleting antibodies)), могут индуцировать контролирование опухолевого роста у онкологических пациентов.

PD-1 представляет собой член семейства рецепторов CD28 с ингибирующей активностью, также включающего CD28, CTLA-4, ICOS и BTLA. PD-1 экспрессируется на активированных В-клетках, Т-клетках и миелоидных клетках Okazaki et al. (2002) Curr. Opin. Immunol. 14: 391779-82; Bennett et al. (2003) J Immunol 170:711-8). Выявлены два лиганда PD-1-PD-L1 и PD-L2, и показано, что они подавляют активацию Т-клеток после связывания с PD-1 (Freeman et al. (2000) J Exp Med 192:1027-34; Latchman et al. (2001) Nat Immunol 2:261-8; Carter et al. (2002) Eur J Immunol 32:634-43). PD-L1 широко распространен в различных типах рака человека (Dong et al. (2002) Nat. Med. 8:787-9). Взаимодействие между PD-1 и PD-L1 приводит к снижению количества лимфоцитов, инфильтрирующих опухоль, снижению пролиферации, опосредованной Т-клеточным рецептором, и избеганию иммунной защиты раковыми клетками. Подавление иммунной системы можно купировать путем ингибирования локального взаимодействия PD-1 с PD-L1, и данный эффект является аддитивным при дополнительной блокаде взаимодействия PD-1 и PD-L2.

Блокада PD-1 приводила к выраженным противоопухолевым реакциям в различных клинических исследованиях. Однако при многих видах рака (например, раке легких) не у всех пациентов наблюдали эффект от противоопухолевого лечения, и, более того, у некоторых пациентов происходил рецидив рака после лечения. Следовательно, в данной области техники существует потребность в обеспечении улучшенного благоприятного эффекта для пациентов, получающих лечение с применением ингибиторов пути PD-1.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В одном из аспектов настоящего изобретения предложены усовершенствованные способы индукции противоопухолевого иммунного ответа у индивида, слабо реагирующего на лечение с применением PD1-нейтрализующего агента (например, антитела против PD-1 или против PD-L1), при этом индивид получает лечение с применением агента, нейтрализующего ингибиторный рецептор NKG2A. Лимфоциты, инфильтрирующие опухоль, у индивидов, слабо реагирующих на лечение по отношению к PD1, после лечения с применением PD1-нейтрализующего антитела могут экспрессировать ингибиторный рецептор NKG2A. У индивидов, слабо реагирующих на лечение, направленное на PD1, опухоли могут прогрессировать или уходить от иммунологического надзора, несмотря на лечение с применением PD-1-нейтрализующего агента, поскольку лимфоциты, инфильтрующие опухоль (TIL) ограничены ингибиторным рецептором NKG2A. На модели лимфомы, которая не реагирует на воздействие на PD-1, у мыши показано, что лечение с применением NKG2A-нейтрализующего агента индуцирует полную ремиссию у большинства индивидов.

Соответственно, в одном варианте реализации предложен способ лечения или профилактики рака, у индивида, который слабо реагирует на лечение, или у которого имеется рак, который слабо реагирует на лечение (например, согласно наблюдениям, указанный индивид слабо реагирует или указанный рак слабо реагирует, или согласно прогнозам, указанный индивид слабо реагирует или указанный рак слабо реагирует) по отношению к лечению с применением агента, нейтрализующего ингибиторную активность PD-1, причем данный способ включает введение индивиду терапевтически активного количества соединения, ингибирующего полипептид NKG2A человека. В одном варианте реализации соединение, ингибирующее полипептид NKG2A человека, вводят в комбинации с соединением, ингибирующим полипептид PD-1 человека. В еще одном варианте реализации соединение, ингибирующее полипептид NKG2A человека, вводят без комбинированного лечения с применением соединения, ингибирующего полипептид PD-1 человека. В одном варианте реализации соединение, ингибирующее полипептид NKG2A человека, вводят во время (в комбинации с) или после окончания (вслед за) курса лечения с применением соединения, ингибирующего полипептид PD-1 человека, причем индивид необязательно дополнительно характеризуется неполноценной реакцией (или отсутствием полноценной реакции), рецидивом рака или прогрессированием рака по время лечения или после лечения (например, после первого курса или цикла лечения) с применением соединения, ингибирующего полипептид PD-1 человека (например, в отсутствие лечения с применением соединения, ингибирующего полипептид NKG2A человека), причем у индивида необязательно присутствует (например, определяется присутствие) обнаружимое и/или повышенное количество NKG2A-экспрессирующих NK-и/или CD8 Т-клеток и/или повышенный уровень NKG2A на NK- и/или CD8 Т-клетках. В одном варианте реализации рак представляет собой гематологическую опухоль, необязательно, лимфому или лейкоз. В одном варианте реализации рак представляет собой карциному. В одном варианте реализации у индивида присутствует обнаружимое и/или повышенное количество NKG32А-экспрессирующих NK- и/или CD8 Т-клеток и/или повышенный уровень NKG2A на NK- и/или CD8 Т-клетках.

В одном варианте реализации предложен способ лечения или профилактики рака у индивида, включающий:

(a) введение индивиду агента, нейтрализующего ингибиторную активность PD-1 (например, введение цикла или курса лечения с применением этого агента); и

(b) если рак у индивида на стадии (а) определен как рак, который слабо реагирует на лечение агентом, нейтрализующим ингибиторную активность PD-1 (например, прогрессирует, характеризуется отсутствием полноценной реакции или регресса, не реагирует), - введение индивиду терапевтически активного количества соединения, ингибирующего полипептид NKG2A человека (необязательно в комбинации с агентом, нейтрализующим ингибиторную активность PD-1).

В одном варианте реализации соединение, ингибирующее полипептид NKG2A человека, представляет собой антитело, нейтрализующее ингибиторную активность NKG2A. В одном варианте реализации соединение, ингибирующее полипептид PD-1 человека, представляет собой антитело против PD-1 или против PDL-1, нейтрализующее ингибиторную активность PD-1. Согласно указаниям, индивид может являться человеком.

В одном варианте реализации предложен способ активации инфильтрирующей опухоль CD8+ Т-клетки у индивида, имеющего рак, слабо реагирующий на лечение с применением агента, нейтрализующего ингибиторную активность PD-1 (например, прогрессирующим, характеризующимся отсутствием полноценной реакции или регресса, не реагирующим), причем указанный способ включает введение индивиду терапевтически активного количества соединения, ингибирующего полипептид NKG2A человека.

В одном аспекте любого варианта реализации, описанного в настоящем документе, индивид, имеющий рак, слабо реагирующий на лечение с применением агента, нейтрализующего ингибиторную активность PD-1, является индивидом, у которого имеется высокая вероятность или, согласно прогнозам, который будет иметь высокую вероятность возникновения (например, на основании одного или более из прогностических факторов) неполноценной реакции, отсутствия терапевтической реакции, обнаружимого, рецидивирующего или остаточного рака и/или прогрессирующего заболевания с момента начала (во время или после лечения) лечения с применением агента, нейтрализующего ингибиторную активность PD-1. В одном варианте реализации рак, слабо реагирующий на лечение, представляет собой рак, не реагирующий, характеризующийся неполноценной реакцией, остающийся обнаружимым или остаточным, или рецидивирующий или прогрессирующий, несмотря на (например, во время или после) лечение с применением агента, нейтрализующего ингибиторную активность PD-1, или, согласно прогнозам (например, на основе одного или более из прогностических факторов), с высокой вероятностью характеризующийся отсутствием реакции, отсутствием полноценной реакции, остающийся обнаружимым или остаточным, или рецидивирующий или прогрессирующий, несмотря на лечение с применением агента, нейтрализующего ингибиторную активность PD-1. В одном варианте реализации индивид, слабо реагирующий на лечение или имеющий рак, который слабо реагирует на лечение, является индивидом, испытывающим неполноценную реакцию (например, не испытывающим полноценной реакции (a complete response; CR)) при (во время или после) лечении с применением агента, нейтрализующего ингибиторную активность PD-1. В одном варианте реализации индивид, слабо реагирующий или имеющий рак, который слабо отвечает на лечение, является индивидом, который испытывает по меньшей мере частичную реакцию (PR) при (во время или после) лечения с применением агента, нейтрализующего ингибиторную активность PD-1, однако у которого рак остается обнаружимым, рецидивирует или прогрессирует.

В одном варианте реализации индивид, слабо реагирующий или имеющий рак, характеризующийся слабой реакцией на лечение, является индивидом с плохим прогнозом заболевания при лечении с применением агента, нейтрализующего ингибиторную активность PD-1 (например, в отсутствие лечения с применением агента, нейтрализующего ингибиторную активность NKG2A; в качестве монотерапии). Индивид с плохим прогнозом заболевания может, например, согласно определению, характеризоваться высоким или повышенным риском прогрессирования рака (например, по сравнению с индивидами с хорошим прогнозом заболевания) на основании одного или более из прогностических факторов. В одном варианте реализации прогностический(е) фактор(ы) включает(ют) присутствие обнаружимого и/или повышенного количества NKG2A-экспрессирующих NK- и/или CD8 Т-клеток и/или повышенного уровня NKG2A на NK- и/или CD8 Т-клетках. В одном варианте реализации прогностический(е) фактор(ы) включает(ют) наличие или отсутствие мутации в одном или более генах. В одном варианте реализации мутация определяет неоэпитоп, распознаваемый Т-клеткой. В одном варианте реализации прогностический(е) фактор(ы) включает(ют) уровень (уровни) экспрессии одного или более генов или белков в опухолевых клетках, например, PD-L1, пониженный или повышенный уровень PD-L1 в опухолевых клетках. В одном варианте реализации прогностический(е) фактор(ы) включает(ют) уровень (уровни) экспрессии одного или более генов или белков в NK- или CD8 Т-клетках в кровотоке или опухолевом окружении, например, PD-1. В одном варианте реализации прогностический(е) фактор(ы) включает(ют) мутационную нагрузку в опухолевых клетках, например, количество несинонимичных мутаций на экзом.

В одном варианте реализации индивид, слабо реагирующий на лечение или имеющий рак, характеризующийся слабой реакцией на лечение, является индивидом, имеющим рак, заведомо слабо реагирующий на лечение с применением соединения, ингибирующего полипептид PD-1 человека, необязательно солидной опухолью, необязательно гематологическим злокачественным заболеванием, необязательно плоскоклеточной карциномой головы и шеи.

В одном из аспектов предложена композиция, содержащая антитело, ингибирующее полипептид NKG2A человека, для применения при лечении или профилактике рака, который слабо реагирует на лечение с применением соединения, ингибирующего полипептид PD-1 человека (например, прогрессирующего или, согласно прогнозам, прогрессирующего после лечения с применением соединения, ингибирующего полипептид PD-1 человека), причем рак необязательно представляет собой солидную карциному (например, рак легких), причем рак необязательно представляет собой плоскоклеточную карциному (например, HNSCC), причем рак необязательно представляет собой гематологическое злокачественное заболевание (например, лимфому).

В одном из аспектов предложен агент, нейтрализующий ингибиторную активность NKG2A человека, для применения в комбинации с агентом, нейтрализующим ингибиторную активность PD-1 человека, для лечения видов рака, который слабо реагирует на лечение с применением агента, нейтрализующего ингибиторную активность PD-1 человека. В одном из аспектов предложен агент, нейтрализующий ингибиторную активность NKG2A человека при лечении индивида, имеющего рак легких, меланому или плоскоклеточную карциному (например, HNSCC), причем лечение включает введение индивиду эффективного количества: (а) агента, необязательно антитела, нейтрализующего ингибиторную активность NKG2A человека, и (b) агента, необязательно антитела, нейтрализующего ингибиторную активность PD-1 человека.

В одном из аспектов предложена композиция, содержащая антитело, ингибирующее полипептид NKG2A человека, для применения при лечении или профилактике рака у индивида, получившего или подвергающегося лечению с применением соединения, ингибирующего полипептид PD-1 человека, причем индивид характеризуется наличием обнаружимого, увеличенного и/или повышенного количества NKG2A-экспрессирующих NK- и/или CD8 Т-клеток в опухолевом окружении, и/или повышенного уровня экспрессии NKG2A в NK- и/или CD8 Т-клеток в опухолевом окружении. В одном варианте реализации индивид характеризуется количеством NK-и/или CD8 Т-клеток в кровотоке или в опухолевом окружении, повышенным по сравнению с количеством, наблюдавшимся до лечения с применением соединения, ингибирующего полипептид PD-1 человека, и/или повышенным по сравнению с эталонным значением (например, количеством клеток, соответствующим значениям, наблюдаемым у пациентов со слабой реакцией на соединение, ингибирующее полипептид PD-1 человека). В одном варианте реализации индивид характеризуется повышенным уровнем экспрессии NKG2A на NK- и/или CD8 Т-клетках в опухолевом окружении по сравнению с количеством, наблюдавшимся до лечения с применением соединения, ингибирующего полипептид PD-1 человека, и/или по сравнению с эталонным значением (например, уровнем, соответствующим значениям, наблюдаемым у пациентов со слабой реакцией на соединение, ингибирующее полипептид PD-1 человека). В одном варианте реализации антитело против NKG2A вводят индивиду в количестве, приводящем к нейтрализации ингибиторной активности CD94/NKG2A человека у пациента-человека (in vivo), например, в количестве, приводящем к нейтрализации ингибиторной активности CD94/NKG2A человека на CD8 Т-клетках и NK-клетках у пациента-человека. В одном варианте реализации количество, приводящее к нейтрализации ингибиторной активности CD94/NKG2A человека у пациента-человека, является по меньшей мере 10-кратным (например, 10-20-кратным, 10-50-кратным, 10-100-кратным, 20-50-кратным, 20-100-кратным, 30-100-кратным, 50-100-кратным), необязательно по меньшей мере 50-, 60-, 80- или 100-кратным минимальной концентрации, требуемой для практического насыщения рецепторов NKG2A+-клеток (например, при анализе связывания, где антитело титруют по МПК). В одном варианте реализации антитело против NKG2A конкурирует с HLA-E за связывание с NKG2A человека.

В одном из аспектов настоящего изобретения показано, что комбинированное лечение с применением антител против NKGA и антител против PD-1, или антител против NKG2A и антител против PD-L1 является особенно эффективным при лечении рака. Кроме того, в настоящем документе показано, что лечение с применением антитела против PD1 могут стимулировать рецепторы NKG2A на лимфоцитах, инфильтрирующих опухоль, например, что NKG2A может ограничивать эффективность агентов, блокирующих ось (путь) PD1. Поскольку оба эти рецептора могут ограничивать цитотоксическую активность лимфоцитов, инфильтрирующих опухоль, нейтрализация ингибиторной активности обоих этих рецепторов антителами активирует эффективное уничтожение раковых клеток NKG2A+PD1+-лимфоцитами. В одном варианте реализации NKG2A+PD1+-лимфоциты являются цитотоксическими лимфоцитами, необязательно CD8+ Т-клетками или NK-клетками.

В одном из аспектов настоящего изобретения предложены усовершенствованные способы усиления противоопухолевого иммунного ответа за счет комбинированной нейтрализации ингибиторных рецепторов NKG2A и PD-1, например, за счет применения антител. Комбинированное лечение можно применять для лечения индивида, имеющего рак (например, рак, заведомо слабо реагирующий на агент, нейтрализующий PD-1, немелкоклеточный рак легких (НМРЛ), рак почек, рак желудочно-кишечного тракта, аденокарцинома поджелудочной железы или пищевода, рак молочной железы, почечноклеточный раком (RCC), меланома, рак ободочной и прямой кишки или рак яичников), независимо от того, слабо ли он реагирует на нейтрализацию ингибиторной активности PD-1, и, таким образом, включая индивидов, слабо реагирующих на лечение с применением агента, нейтрализующего ингибиторную активность PD-1, и индивидов, хорошо реагирующих на лечение с применением агента, нейтрализующего ингибиторную активность PD-1.

Соответственно, в одном варианте реализации предложен способ лечения или профилактики рака, который слабо реагирует на лечение с применением соединения, ингибирующего полипептид PD-1 человека, причем указанный способ включает введение индивиду, имеющему рак: (а) терапевтически активного количества соединения, ингибирующего полипептид NKG2A человека, и (b) терапевтически активного количества соединения, ингибирующего полипептид PD-1 человека. В одном варианте реализации рак представляет собой солидную опухоль, необязательно солидную опухоль, содержащую инфильтрирующие NK- и/или CD8 Т-клетки, причем NK- и/или CD8 Т-клетки необязательно экспрессируют NKG2A, причем по меньшей мере 10%, 20%, 30%, 40% или 50% NK-клеток необязательно экспрессируют NKG2A на своей поверхности. В одном варианте реализации соединение, ингибирующее полипептид NKG2A человека, представляет собой антитело, нейтрализующее ингибиторную активность NKG2A. В одном варианте реализации соединение, ингибирующее полипептид PD-1 человека, представляет собой антитело против PD-1 или против PDL-1, нейтрализующее ингибиторную активность PD-1. Согласно указаниям, индивид может являться человеком.

В одном варианте реализации предложен способ активации или стимуляции активности CD8+ Т-клеток, инфильтрирующих опухоль, у индивида, причем указанный способ включает введение индивиду: (а) терапевтически активного количества соединения, ингибирующего полипептид NKG2A человека, и (b) терапевтически активного количества соединения, ингибирующего полипептид PD-1 человека. В одном варианте реализации предложен способ активации или стимуляции активности NK-клеток, инфильтрирующих опухоль, у индивида, причем указанный способ включает введение индивиду: (а) терапевтически активного количества соединения, ингибирующего полипептид NKG2A человека, и (b) терапевтически активного количества соединения, ингибирующего полипептид PD-1 человека. В одном варианте реализации рак представляет собой солидную опухоль. В любом варианте реализации индивид необязательно имеет рак, который слабо отвечает на лечение с применением соединения, ингибирующего полипептид PD-1 человека.

В одном из аспектов настоящего изобретения предложено лечение, включающее введение комбинации антитела, нейтрализующего ингибиторную активность NKG2A, и антитела, нейтрализующего ингибиторную активность PD-1. В одном из аспектов любого варианта реализации, описанного в настоящем документе, предложена композиция, содержащая антитело, ингибирующее полипептид NKG2A человека, и антитело, связывающее PDL1 или PD1 и нейтрализующее ингибиторную активность полипептида PD-1 человека. В одном из аспектов указанную композицию применяют для лечения или профилактики рака.

В одном из аспектов антитело, нейтрализующее ингибиторную активность NKG2A, и антитело, нейтрализующее ингибиторную активность PD-1, применяют в комбинации для лечения или профилактики рака, который заведомо слабо реагирует на лечение с применением соединения, ингибирующего полипептид PD-1 человека, необязательно солидной опухоли, необязательно гематологического злокачественного заболевания. В одном варианте реализации рак, который заведомо слабо реагирует на лечение, представляет собой плоскоклеточную карциному, необязательно плоскоклеточную карциному головы и шеи.

В любых вариантах реализации, описанных в настоящем документе, соединение или агент, ингибирующий полипептид PD-1 человека, содержит полипептид (например, антитело, полипептид, объединенный с Fc-доменом, иммуноадгезин и т.д.), предотвращающий передачу сигнала PD-1, индуцированную PD-L1, например, путем блокирования взаимодействия между PD-1 и его природным лигандом PD-L1 (и, необязательно, дополнительного блокирования взаимодействия между PD-1 и PD-L2). В одном из аспектов полипептид представляет собой антитело, связывающее PD-1 (антитело против PD-1); такое антитело может блокировать взаимодействие между PD-1 и PD-L1 и/или между PD-1 и PD-L2. В еще одном из аспектов полипептид представляет собой антитело, связывающее PD-L1 (антитело против PD-L1) и блокирующее взаимодействие между PD-1 и PD-L1. В одном варианте реализации антитело, нейтрализующее полипептид PD-1 человека, вводят в количестве, приводящем к нейтрализации ингибиторной активности PD-1 человека у пациента-человека (in vivo), например, в количестве, приводящем к нейтрализации ингибиторной активности PD-1 человека на CD8 Т-клетках и NK-клетках у пациента-человека. В одном из аспектов антитело вводят (или предназначено для введения) в соответствии с конкретной клинической схемой применения, в частности, в конкретной количественной дозе и в соответствии с конкретным графиком применения.

В одном из аспектов любого варианта реализации, описанного в настоящем документе, соединение или агент, нейтрализующий ингибиторный рецептор NKG2A, представляет собой антитело. В одном из аспектов антитело, нейтрализующее NKG2A, представляет собой неистощающее антитело, например, антитело, не уничтожающее, не устраняющее, не лизирующее и не индуцирующее такое уничтожение, устранение или лизис, направленные на отрицательное влияние на количество NKG2A-экспрессирующих клеток в образце или у субъекта. В одном из аспектов антитело, нейтрализующее NKG2A, представляет собой неистощающее антитело. Неистощающее антитело может, например, не содержать Fc-домена или содержать Fc-домен, характеризующийся минимальным связыванием или отсутствием связывания с одним или более Fcγ-рецепторами (например, CD16). Пример включает антитела с константными областями IgC4-изотипических антител человека, антитела любого изотипа (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4) с константными областями, модифицированными с целью ослабления или устранения связывания с одним или более Fcγ-рецепторами (например, CD16, CD32A, CD32B и/или CD64).

В одном из аспектов любого варианта реализации, описанного в настоящем документе, антитело против NKG2A вводят в течение по меньшей мере одного цикла введения, причем цикл введения включает по меньшей мере первое и второе (и, необязательно, 3-е, 4-е, 5-е, 6-е, 7-е и/или 8-е или дальнейшие) введения антитела против NKG2A, причем антитело против NKG2A вводят в количестве, позволяющем эффективно достичь постоянной (минимальной) концентрации антитела против NKG2A в крови, равной по меньшей мере 10 мкг/мл (или, необязательно, по меньшей мере 20, 30, 40 или 50 мкг/мл), между первым и вторым (и, необязательно, дальнейшими) введениями. Достижение или поддержание указанной постоянной концентрации в крови означает, что концентрация в крови не снижается существенно ниже указанной концентрации в крови в течение указанного периода времени (например, между двумя введениями антитела, определенного количества недель), т.е. хотя концентрация в крови может меняться в течение указанного периода времени, указанная концентрация в крови представляет собой минимальную концентрацию.

В одном варианте реализации антитело против NKG2A вводят в количестве, позволяющем эффективно достичь максимальной концентрации в крови, составляющей приблизительно или по меньшей мере приблизительно 50, 60, 70 или 80 мкг/мл, необязательно по меньшей мере приблизительно 100 мкг/мл, после введения (например, в течение 1 или 2 дней после введения).

В одном варианте реализации антитело против NKG2A вводят в количестве, позволяющем эффективно достичь постоянной (минимальной) концентрации антитела против NKG2A в крови, составляющей приблизительно или по меньшей мере приблизительно 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70 или 80 мкг/мл, необязательно по меньшей мере приблизительно 100 мкг/мл, в течение по меньшей мере одной недели или по меньшей мере двух недель после введения антитела.

В одном варианте реализации антитело против NKG2A вводят в количестве, позволяющем эффективно достичь постоянной (минимальной) концентрации антитела против NKG2A в крови, составляющей приблизительно или по меньшей мере приблизительно 50, 60, 70 или 80 мкг/мл, необязательно по меньшей мере приблизительно 100 мкг/мл, между двумя последовательными введениями). В одном варианте реализации первое и второе введения разделены промежутком времени, составляющим приблизительно две недели, необязательно приблизительно одну неделю.

Антитело против NKG2A необязательно можно вводить в эффективном количестве и в соответствии с частотой, позволяющей достичь постоянной (минимальной) указанной концентрации в крови в течение всего цикла введения.

В одном варианте реализации антитело, ингибирующее полипептид NKG2A человека, вводят после курса лечения (курс лечения может быть полностью завершен или приостановлен до завершения, или после начала курса лечения (например, в случае неполноценной реакции, прогрессирования опухоли и т.д.) с применением антитела, нейтрализующего полипептид PD-1 человека, в ходе цикла введения, включающего по меньшей мере два введения антитела против NKG2A. В еще одном варианте реализации антитело, ингибирующее полипептид NKG2A человека, вводят в ходе цикла введения в комбинации с антителом, нейтрализующим полипептид PD-1 человека, причем цикл введения включает по меньшей мере два введения антитела против NKG2A. В одном варианте реализации антитело против NKG2A вводят в количестве, позволяющем эффективно достичь постоянной (минимальной) концентрации во внесосудистой ткани (например, опухолевом окружении), составляющей по меньшей мере 4 мкг/мл, необязательно по меньшей мере 10 мкг/мл, между двумя последовательными введениями. Антитело против NKG2A необязательно вводят в количестве, позволяющем эффективно достичь постоянной (минимальной) концентрации во внесосудистой ткани (например, опухолевом окружении), составляющей по меньшей мере 4 мкг/мл, необязательно по меньшей мере 10 мкг/мл, в течение всего цикла введения. В одном варианте реализации антитело против NKG2A вводят в количестве, позволяющем эффективно достичь постоянной (минимальной) концентрации антитела против NKG2A в крови, составляющей по меньшей мере 40 мкг/мл, необязательно по меньшей мере приблизительно 100 мкг/мл между двумя последовательными введениями или в течение цикла введения.

В одном варианте реализации указанный рак является гематологическим злокачественным заболеванием. В одном неограничивающем варианте реализации рак представляет собой лимфому или лейкоз. В одном варианте реализации рак представляет собой солидную опухоль на поздних стадиях и/или устойчивую к лечению солидную опухоль. В одном неограничивающем варианте реализации рак (например, устойчивую к лечению солидную опухоль на поздней стадии) выбирают из группы, состоящей из немелкоклеточного рака легких (НМРЛ), рака почек, рака желудочно-кишечного тракта, рака поджелудочной железы или аденокарциномы пищевода, рака молочной железы, почечноклеточной карциномы (RCC), меланомы, рака ободочной и прямой кишки и рака яичников.

Соединение, ингибирующее полипептид NKG2A (агент против NKG2A) представляет собой соединение, усиливающее способность NKG2A-экспрессирующих NK- и/или Т-клеток вызывать гибель HLA-E-экспрессирующих клеток. Соединение, ингибирующее полипептид NKG2A, необязательно представляет собой полипептид, необязательно антитело (например, моноклональное антитело), связывающее полипептид NKG2A.

В одном варианте реализации агент против NKG2A снижает ингибиторную активность NKG2A, блокируя связывание его лиганда HLA-E, т.е. агент против NKG2A мешает связыванию NKG2A HLA-E. Антитело, содержащее тяжелую цепь любой из последовательностей SEQ ID NO: 4-8 и легкую цепь SEQ ID NO: 9, является примером такого антитела. В одном варианте реализации агент против NKG2A снижает ингибиторную активность NKG2A без блокировки связывания его лиганда HLA-E, т.е. агент против NKG2A является неконкурентным антагонистом и не мешает связыванию NKG2A HLA-E. Антитело, содержащее вариабельные области тяжелой и легкой цепей SEQ ID NO: 10 и 11, соответственно, является примером такого антитела.

В одном варианте реализации агент против NKG2A представляет собой антитело, связывающееся с NKG2A со значительно более высоким сродством, чем с одним или более из активирующих рецепторов NKG2. Например, в одном варианте реализации агент представляет собой антитело, связывающееся с NKG2A со значительно более высоким сродством, чем с NKG2C. В дополнительном или альтернативном варианте реализации агент представляет собой антитело, связывающееся с NKG2A со значительно более высоким сродством, чем с NKG2E. В дополнительном или альтернативном варианте реализации агент представляет собой антитело, связывающееся с NKG2A со значительно более высоким сродством, чем с NKG2H.

В одном варианте реализации агент против NKG2A конкурирует при связывании с CD94/NKG2A с антителом, содержащим тяжелую и легкую цепи SEQ ID NO: 4-8 и 9, соответственно, или антителом, содержащим вариабельные области тяжелой и легкой цепи SEQ ID NO: 10 и 11, соответственно. Указанный агент может являться, например, антителом человека или гуманизированным антителом против NKG2A.

В одном варианте реализации антитело против NKG2A представляет собой гуманизированное антитело, содержащее CDR любой из тяжелых цепей согласно любой из последовательностей SEQ ID NO: 4-8, и CDR легкой цепи SEQ ID NO: 9, соответственно. В одном варианте реализации антитело против NKG2A представляет собой гуманизированное антитело, содержащее вариабельную область любой из тяжелых цепей согласно любой из последовательностей SEQ ID NO: 4-8, и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 9, соответственно. Предложены типичные остатки или последовательности области, определяющей комплементарность (CDR), и/или сайты аминокислотных замен в каркасной области (FR) таких гуманизированных антител с улучшенными свойствами, например, сниженной иммуногенностью, улучшенным связыванием антигена или другими функциональными свойствами и/или физико-свойствами, например, улучшенной стабильностью.

В некоторых необязательных аспектах предложен способ выявления индивида, имеющего рак и слабо реагирующего на лечение с применением агента, нейтрализующего ингибиторную активность PD-1 человека, причем указанный способ включает:

a) определение уровня экспрессии NKG2A (и, кроме того, необязательно PD-1) на NK- и/или CD8 Т-клетках и/или количества NKG2A⁺ (необязательно NKG2A⁺PD1⁺) NK- и/или CD8 Т-клеток у индивида, получавшего лечение с применением агента, нейтрализующего ингибиторную активность PD-1 человека (например, получившего по меньшей мере одно введение агента); и

b) после определения повышенного уровня экспрессии NKG2A на NK- и/или CD8 Т-клетках (необязательно на PD-1-экспрессирующих NK- или Т-клетках) и/или повышенного количества NKG2A⁺ (необязательно NKG2A⁺PD1⁺) NK- и/или CD8 Т-клеток у индивида (например, по сравнению с эталонным значением, повышенного по сравнению с эталонным значением, повышенного по сравнению со значением, наблюдавшимся до лечения с применением агента) - выявление того, что индивид характеризуется слабой реакцией на лечение с применением агента, нейтрализующего ингибиторную активность PD-1 человека.

В некоторых необязательных аспектах пациентов можно выявлять для лечения с применением агента против NKG2A, выполняя оценку наличия экспрессии NKG2A на NK-и/или CD8+ Т-клетках в образце опухоли (например, ткани опухоли и/или ткани, прилегающей к опухоли). В одном варианте реализации любого из терапевтических вариантов применения или способов лечения или профилактики рака, описанных в настоящем документе, лечение или профилактика рака у индивида включает:

a) определение уровня экспрессии NKG2A на NK- и/или CD8 Т-клетках и/или количества NKG2A-экспрессирующих NK- и/или CD8 Т-клеток у индивида, имеющего рак, получавшего или получающего лечение с применением агента, нейтрализующего ингибиторную активность PD-1, и

b) После определения повышенного уровня экспрессии NKG2A на NK- и/или CD8 Т-клетках и/или повышенного количества NKG2A-экспрессирующих NK- и/или CD8 Т-клеток у индивида - введение индивиду соединения, нейтрализующего ингибиторную активность полипептида NKG2A человека.

В одном варианте реализации любого из способов определение уровня экспрессии NKG2A на и/или количества NKG2A+ NK- и/или CD8 Т-клеток включает определение уровня экспрессии нуклеиновой кислоты или полипептида NKG2A на NK- и/или CD8 Т-клетках и/или определение количества NKG2A+ NK- и/или CD8 Т-клеток в биологическом образце и сравнение этого уровня с эталонным уровнем (например, значением, слабым или сильным окрашиванием поверхности клеток и т.д.). Эталонный уровень может, например, соответствовать здоровому индивиду, индивиду, реагирующему или слабо реагирующему на лечение с применением агента, ингибирующего полипептид PD-1 человека, или индивиду, у которого развивается слабый благоприятный клинический эффект/не развивается благоприятный клинический эффект от лечения с применением антитела против NKG2A (необязательно в комбинации с агентом, ингибирующим полипептид PD-1 человека). Определение того, что количество NKG2A-экспрессирующих NK- и/или CD8 Т-клеток в биологическом образце повышено (например, при количестве, соответствующем количеству у индивида, у которого не развивается достаточный благоприятный клинический эффект от лечения с применением агента, ингибирующего полипептид PD-1 человека, количестве, соответствующем количеству у индивида, у которого развивается достаточный благоприятный клинический эффект от лечения с применением антитела против NKG2A), указывает на то, что индивид имеет рак, который можно лечить с применением антитела против NKG2A, например, в соответствии со способами лечения, описанными в настоящем документе. Определение того, что уровень экспрессии нуклеиновой кислоты или полипептида NKG2A в биологическом образце повышен (например, высокого значения, сильного окрашивания поверхности, уровня, соответствующего уровню у индивида, у которого не развивается достаточный благоприятный клинический эффект от лечения с применением агента, ингибирующего полипептид PD-1 человека, уровня, соответствующего уровню у индивида, у которого развивается достаточный благоприятный клинический эффект от лечения с применением антитела против NKG2A, уровня, превышающего уровень, соответствующий индивиду, у которого развивается слабый благоприятный клинический эффект/не развивается благоприятный клинический эффект от лечения с применением антитела против NKG2A и т.д.), указывает на то, что индивид имеет рак, который можно лечить с применением антитела против NKG2A, например, в соответствии со способами лечения, описанными в настоящем документе.

В одном варианте реализации CD8 Т-клетки представляют собой CD8 Т-клетки, инфильтрирующие опухоль. В одном варианте реализации NK-клетки представляют собой NK-клетки, инфильтрирующие опухоль. В одном варианте реализации по меньшей мере 15%, 20%, 25% или 30% NK- и/или CD8 Т-клеток являются PD1⁺NKG2A⁺.

В одном варианте реализации индивид имеет рак, включающий злокачественные клетки, экспрессирующие полипептид HLA-E на своей поверхности. В одном варианте реализации способ лечения дополнительно включает определение состояния полипептида на HLA-E злокачественных клетках (например, опухолевых клетках) индивида, имеющего рак, причем определение того, что злокачественные клетки экспрессируют нуклеиновую кислоту или полипептид HLA-E, указывает на то, что пациент имеет рак, который можно лечить с применением агента, ингибирующего NKG2A.

В других вариантах реализации предложены фармацевтические композиции и наборы, а также способы их применения. В одном варианте реализации предложена фармацевтическая композиция, содержащая соединение, нейтрализующее ингибиторную активность полипептида NKG2A человека. В одном варианте реализации предложен набор, содержащий соединение, нейтрализующее ингибиторную активность полипептида NKG2A человека, и агент, способный обнаруживать экспрессию NKG2A на поверхности NK- и/или CD8 Т-клеток (например, антитело или другой NKG2A-связывающий агент, присоединенный к обнаружимой молекуле).

Эти аспекты подробнее описаны в описании изобретения, раскрытого в настоящем документе; кроме того, из него понятны дополнительные аспекты, особенности и преимущества.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На Фигурах 1А и 1В показана инфильтрация опухолевых клеток PD-L1+ Qa-1+ RMA-S Qa-1 Qdm B2m и A20 NK-клетками, экспрессирующими NKG2A, и CD8 Т-клетками, экспрессирующими NKG2A и/или PD-1. Мышей с опухолями RMA-S Qa-1 Qdm B2m (верхний ряд) и А20 (нижний ряд) умерщвляли при объеме опухоли приблизительно 500 мм³. Опухолевые клетки (Фигура 1А) и лимфоциты, инфильтрирующие опухоль (TIL) (Фигура 1В), анализировали проточной цитометрией, соответственно, на предмет экспрессии Qa-1 и PDL-1 для опухолевых клеток и NKG2A/C/E и PD-1 для TIL. MFI: медианная интенсивность флуоресценции.

На Фигуре 2 показано распределение NKG2A и PD-1 на субпопуляциях NK- и Т-клеток у мышей. Лимфоциты получали из селезенки, из дренирующих опухоль лимфатических узлов и из солидных опухолевых масс. Экспрессия PD-1 редко встречалась или отсутствовала среди всех субпопуляций клеток из селезенки и лимфатических узлов, однако во всех субпопуляциях лимфоцитов, инфильтрирующих опухоль (TIL), присутствовал относительно высокий процент клеток, экспрессирующих PD-1. С другой стороны, NKG2A обнаруживали на субпопуляциях NK-клеток, но не Т-клеток в селезенке и лимфатических узлах, хотя в опухолях обнаруживали значительный процент TIL, причем в среднем более 30% NK-клеток и более 19% CD8 Т-клеток являлись двойными положительными клетками по отношению к NKG2A и PD-1.

На Фигурах 3А и 3В показана экспрессия NKG2A и PD-1 у мышей с опухолями. Мышей с опухолями RMA Rae1 (верхняя строка), МС38 (средняя строка) и RMA (нижняя строка) умерщвляли по достижении опухолями объема 500, 2000 и 800 мм³, соответственно. NK-клетки (Фигура 3А) и CD8 Т-клетки (Фигура 3В) из селезенки, дренирующих опухоль лимфатических узлов (ЛУ) и опухоли анализировали проточной цитометрией на предмет экспрессии NKG2A/C/E и PD-1.

На Фигуре 4 показано, что лечение мышей мАт против PD-1 увеличивает частоту CD8 Т-клеток, экспрессирующих NKG2A, в опухолях МС38. Мышей с опухолями МС38 обрабатывали с использованием 200 мкг изотипического контрольного (IC) IgG2a крысы или антитела против PD-1 мыши на 11, 14 и 17 сутки после имплантации клеток. Мышей умерщвляли на 31 сутки, характеристики CD8 Т-клеток из селезенки, дренирующих опухоль лимфатических узлов (ЛУ) и опухоли исследовали с помощью проточной цитометрии.

На Фигуре 5 показан средний объем опухолей мышей, получавших изотипическое контрольное антитело, мАт против NKG2A мыши (200 мкг, в/в), мАт против PD-L1 мыши (200 мкг, в/б) или комбинацию антител против mNKG2A/mPDL-1 в зависимости от времени на 11, 14 и 18 сутки. В то время как антитело против NKG2A обеспечивало лишь скромный противоопухолевый эффект по сравнению с изотипическим контролем в данной модели, а антитело против PD-L1 обеспечивало существенный противоопухолевый эффект, однако объем опухоли рос до 28 суток, комбинированное лечение с использованием антитела против NKG2A и антитела против PD-L1 полностью прекращала опухолевый рост, и на 28 сутки значимого роста объема опухоли не наблюдали.

На Фигуре 6 показан медианный объем опухоли в зависимости от времени у мышей с PD-1/-L1-устойчивыми лимфомами А20 при лечении с применением изотипического контроля или нейтрализующего мАт против PD-L1 мыши или антитела против PD-1 мыши. Ни изотипический контроль, ни антитела против PD-1 или PD-L1 не были эффективны по отношению к контролю опухолевого роста.

На Фигуре 7 показан медианный объем опухоли в зависимости от времени у мышей с лимфомами А20 при лечении с применением изотипического контроля или нейтрализующего мАт против PD-1 мыши или антитела против PD-1 мыши в комбинации с нейтрализующим антителом против NKG2A мыши. Ни изотипический контроль, ни антитела против PD1 не были эффективны по отношению к контролю опухолевого роста, однако при добавлении лечения с применением антитела против NKG2A у большинства животных (7/10) наблюдался полный регресс опухоли.

На Фигуре 8 показан медианный объем опухоли в зависимости от времени у мышей с лимфомами А20 при лечении с применением изотипического контроля или нейтрализующего мАт против PD-L1 мыши или антитела против PD-L1 мыши в комбинации с нейтрализующим антителом против NKG2A мыши. При добавлении лечения с применением антитела NKG2A к лечению с применением антитела против PD-L1 у большинства животных (9/11) наблюдался полный регресс опухоли.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Определения

В настоящем описании формы единственного числа могут означать один или более определяемых объектов. Использование форм единственного числа в формуле изобретения в сочетании со словом «содержащий» может означать один или более одного определяемого объекта. В настоящем документе термин «еще один» может означать по меньшей второй или более отдаленный по порядку.

Термин «содержащий» необязательно можно заменять термином «состоящий главным образом из» или «состоящий из».

NKG2A (OMIM 161555, полное описание которого включено в настоящий документ посредством ссылки) является членом группы транскриптов NKG2 (Houchins, et al. (1991) J. Exp. Med. 173:1017-1020). NKG2A кодируют 7 экзонов, охватывающих 25 т.п.о. и демонстрирующих в некоторой степени дифференциальный сплайсинг. Вместе с CD94 NKG2A образует гетеродимерный ингибиторный рецептор CD94/NKG2A, присутствующий на поверхности субпопуляций NK-клеток, α/β Т-клеток, γ/δ Т-клеток и NKT-клеток. Аналогично ингибиторным рецепторам KIR, его цитоплазматический домен содержит ITIM. В настоящем документе «NKG2A» относится к любому варианту, производному или изоформе гена NKG2A или кодируемого им белка. NKG2A человека содержит 233 аминокислоты в 3 доменах, причем цитоплазматический домен содержит остатки 1-70, трансмембранная область содержит остатки 71-93, а внеклеточная область содержит остатки 94-233 следующей последовательности:

NKG2C (OMIM 602891, полное описание которого включено в настоящий документ посредством ссылки) и NKG2E (OMIM 602892, полное описание которого включено в настоящий документ посредством ссылки) представляют собой два других члена группы транскриптов NKG2 (Gilenke, et al. (1998) Immunogenetics 48:163-173). Рецепторы CD94/NKG2C и CD94/NKG2E являются активирующими рецепторами, присутствующими на поверхности таких субпопуляций лимфоцитов, как NK-клетки и Т-клетки.

HLA-E (OMIM 143010, полное описание которого включено в настоящий документ посредством ссылки) представляет собой неклассическую MHC-молекулу, экспрессирующуюся на поверхности клеток и регулируемую за счет связывания пептидов, например, фрагментов сигнальных последовательностей других молекул МНС I класса. Кроме того, выявлены растворимые варианты HLA-E. В дополнение к связыванию Т-клеточного рецептора, HLA-E связывает субпопуляции естественных киллеров (NK-клеток), естественных Т-киллеров (NKT-клеток) и Т-клеток (α/β и γ/δ) посредством специфического связывания с CD94/NKG2A, CD94/NKG2B и CD94/NKG2C (см., например, Braud et al. (1998) Nature 391:795-799, полное описание которой включено в настоящий документ посредством ссылки). Поверхностная экспрессия HLA-E защищает клетки-мишени от лизиса клонами CD94/NKG2A+ NK-, Т- или NKT-клеток. В настоящем документе «HLA-Е» относится к любому варианту, производному или изоформе гена HLA-Е или кодируемого им белка.

В контексте настоящего изобретения термин «NKG2A» или «CD94/NKG2A-положительные лимфоциты» относится к клеткам лимфоидной линии дифференцировки (например, NK-, NKT- и Т-клеткам), экспрессирующим на своей поверхности CD94/NKG2A, который можно обнаружить, например, посредством проточной цитометрии с использованием антител, специфически распознающих комбинированный эпитоп на CD94 и NKG2A и/или только эпитоп на NKG2A. Термин «NKG2A-положительный лимфоцит» также включает иммортализованные линии клеток лимфоидного происхождения (например, NKL, NK-92).

В контексте настоящего изобретения выражения «снижает ингибиторную активность NKG2A», «нейтрализует NKG2A» или «нейтрализует ингибиторную активность NKG2A» относятся к процессу, в котором происходит ингибирование способности CD94/NKG2A оказывать негативное влияние на внутриклеточные процессы, приводящие к таким реакциям лимфоцитов, как высвобождение цитокинов и цитотоксические реакции. Это можно измерить, например, в ходе анализа цитотоксичности на основе NK- или Т-клеток, в котором измеряют способность терапевтического соединения стимулировать уничтожение HLA-E-положительных клеток CD94/NKG2A-положительными лимфоцитами. В одном варианте реализации препарат антител вызывает по меньшей мере 10% увеличение цитотоксичности CD94/NKG2A-ограниченных лимфоцитов, необязательно по меньшей мере 40% или 50% увеличение цитотоксичности лимфоцитов, необязательно по меньшей мере 70% увеличение NK-цитотоксичности» и относится к описанным анализам цитотоксичности. Если антитело против NKG2A ослабляет или блокирует взаимодействие CD94/NKG2A с HLA-Е, оно может увеличивать цитотоксичность CD94/NKG2A-ограниченных лимфоцитов. Оценку этого можно выполнить, например, в ходе стандартного 4-часового анализа цитотоксичности in vitro, с использованием, например, NK-клеток, экспрессирующих CD94/NKG2A, и клеток-мишеней, экспрессирующих HLA-E. Такие NK-клетки не способны эффективно уничтожать мишени, экспрессирующие HLA-E, поскольку CD94/NKG2A распознает HLA-Е, что приводит к инициации и распространению ингибиторного сигнального каскада, предотвращающего цитолиз, опосредованный лимфоцитами. Такой анализ цитотоксичности in vitro можно выполнять стандартными способами, хорошо известными в данной области техники, описанными, например, в Coligan et al., eds., Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience, N.Y., (1992, 1993). Высвобождение хрома и/или другие параметры для оценки способности антитела стимулировать уничтожение таких клеток-мишеней, как Р815, K562 или соответствующих опухолевых клеток лимфоцитами, также описаны в статьях Sivori et al., J. Exp. Med. 1997; 186:1129-1136; Vitale et al., J. Exp. Med. 1998; 187:2065-2072; Pessino et al. J. Exp. Med. 1998; 188:953-960; Neri et al. Clin. Diag. Lab. Immun. 2001; 8:1131-1135; Pende et al. J. Exp. Med. 1999; 190:1505-1516, полные описания которых включены в настоящий документ посредством ссылок. Клетки-мишени метят ⁵¹Cr перед добавлением NK-клеток, а затем оценивают уничтожение пропорционально высвобождению ⁵¹Cr из клеток в среду в результате уничтожения. Добавление антитела, предотвращающего связывание CD94/NKG2A с HLA-Е, приводит к предотвращению инициации и распространения ингибиторного сигнального каскада через CD94/NKG2A. Поэтому добавление таких агентов приводит к усилению уничтожения клеток-мишеней, опосредованного лимфоцитами. Тем самым, на данном этапе выявляют агенты, предотвращающие инициацию CD94/NKG2A-индуцированного негативного сигнального каскада путем, например, блокирования связывания лиганда. В конкретном анализе цитотоксичности на основе высвобождения ⁵¹Cr CD94/NKG2A-экспрессирующие эффекторные NK-клетки могут уничтожать HLA-E-отрицательные клетки-мишени LCL 721.221, но в меньшей степени, чем HLA-E-экспрессирующие контрольные клетки LCL 721.221-Cw3. В отличие от этого, эффекторные клетки YTS, не содержащие CD94/NKG2A, эффективно уничтожают клетки обеих линий. Таким образом, эффекторные NK-клетки менее эффективно уничтожают HLA-E⁺ клетки LCL 721.221-Cw3 вследствие HLA-E-индуцируемого ингибиторного сигнального каскада за счет CD94/NKG2A. При предварительном инкубировании NK-клеток с блокирующими антителами против CD94/NKG2A согласно настоящему изобретению в таком анализе цитотоксичности на основе высвобождения ⁵¹Cr происходит более эффективное уничтожение HLA-E-экспрессирующих клеток LCL 721.221-Cw3, зависящее от концентрации антител. Ингибиторную активность (т.е. способность усиливать цитотоксичность) антитела против NKG2A также можно оценить любым из ряда других способов, например, по влиянию на внутриклеточный уровень свободного кальция, как описано, например, в статье Sivori et al., J. Exp. Med. 1997; 186:1129-1136, описание которой включено в настоящий документ посредством ссылки.. Активацию цитотоксичности NK-клеток можно оценить, например, путем измерения увеличения продукции цитокина (например, продукции ИФН-γ) или маркеров цитотоксичности (например, мобилизации CD107 или CD137). В типичном протоколе оценивают продукцию ИФН-γ МПК путем окрашивания поверхности клетки и цитоплазмы и анализа с помощью проточной цитометрии после 4-дневного культивирования. Вкратце, в течение последних 4 часов культивирования добавляют брефелдин A (Sigma Aldrich) в конечной концентрации 5 мкг/мл. Затем клетки инкубируют с мАт против CD3 и против CD56 перед пермеабилизацией (IntraPrep™; Beckman Coulter) и окрашиванием с использованием РЕ-антитела против ИФН-γ или PE-IgG1 (Pharmingen). Продукцию ГМ-КСФ и ИФН-γ поликлональными активированными NK-клетками измеряют в супернатанте с помощью твердофазного ИФА (ГМ-КСФ: DuoSet Elisa, R&D Systems, Миннеаполис, штат Миннесота, ИФН-γ: OptEIA set, Pharmingen).

В настоящем документе термин «PD-1» относится к белку запрограммированной гибели-1 (PD-1) (также называемому «белком запрограммированной гибели клеток-1»), ингибиторному члену семейства рецепторов CD28, которая также включает CD28, CTLA-4, ICOS и BTLA. Полную последовательность PD-1 человека можно найти в GenBank под номером доступа U64863; она показана ниже:

«PD-1» также включает любой вариант, производное или изоформу гена PD-1 или кодируемого им белка. PD-1 экспрессируется на активированных В-клетках, Т-клетках и миелоидных клетках Okazaki et al. (2002) Curr. Opin. Immunol. 14: 391779-82; Bennett et al. (2003) J Immunol 170:711-8). Первоначальные члены семейства, CD28 и ICOS, были обнаружены по функциональному усилению пролиферации Т-клеток после добавления моноклональных антител (Hutloff et al. (1999) Nature 397:263-266; Hansen et al. (1980) Immunogenics 10:247-260). Выявлены два лиганда PD-1-PD-L1 и PD-L2, и показано, что они подавляют активацию Т-клеток после связывания с PD-1 (Freeman et al. (2000) J Exp Med 192:1027-34; Latchman et al. (2001) Nat Immunol 2:261-8; Carter et al. (2002) Eur J Immunol 32:634-43). Как PD-L1, так и PD-L2 являются гомологами В7, связывающимися с PD-1, но не связывающимися с другими членами семейства CD28.

Полную последовательность PD-L1 человека можно найти в UniProtKB/Swiss-Prot под идентификатором Q9NZQ7-1; она показана ниже:

PD-L1 широко распространен в различных типах рака человека (Dong et al. (2002) Nat. Med. 8:787-9). Взаимодействие между PD-1 и PD-L1 приводит к сокращению количества лимфоцитов, инфильтрирующих опухоль, снижению пролиферации, опосредованной Т-клеточным рецептором, и ускользанию раковых клеток от иммунологического надзора (Dong et al. (2003) J. Mol. Med. 81:281-7; Blank et al. (2005) Cancer Immunol. Immunother. 54:307-314; Konishi et al. (2004) Clin. Cancer Res. 10:5094-100). Иммунодепрессию можно купировать путем ингибирования локального взаимодействия PD-1 с PD-L1, и данный эффект является аддитивным при дополнительной блокаде взаимодействия PD-1 с PD-L2.

В контексте настоящего изобретения выражения «снижает ингибиторную активность PD-1 человека», «нейтрализует PD-1» или «нейтрализует ингибиторную активность PD-1 человека» относятся к процессу, в котором происходит ингибирование способности PD-1 передавать сигнал, возникающий при взаимодействии PD-1 с одним или более из его партнеров по связыванию, например, PD-L1 или PD-L2. Нейтрализатор ингибиторной активности PD-1 снижает, блокирует, ингибирует, останавливает или мешает передаче сигнала, возникающего в результате взаимодействия PD-1 с одним или несколькими из его партнеров по связыванию, например, PD-L1, PD-L2. Такой агент может тем самым ослабить негативный сигнал совместной стимуляции, опосредованный или осуществляемый через белки клеточной поверхности, экспрессирующиеся на Т-лимфоцитах, усиливая эффекторные функции Т-клеток, например, пролиферацию, продукцию цитокинов и/или цитотоксичность.

При упоминании термина «лечение рака» или аналогичных терминов по отношению к агенту, связывающему и нейтрализующему NKG2A (например, антителу), этот термин включает: (а) способ лечения рака, причем указанный способ включает этап введения (в течение по меньшей мере одного сеанса лечения) агента, связывающего NKG2A (например, вместе или раздельно с материалом фармацевтически приемлемого носителя), индивиду, млекопитающему, в особенности человеку, нуждающемуся в таком лечении, в дозе, обеспечивающей лечение рака (терапевтически эффективном количестве), необязательно в дозе (количестве), указанной в настоящем документе; (b) применение агента, связывающего и нейтрализующего NKG2A, для лечения рака, или агент, связывающий и нейтрализующий NKG2A, предназначенный для применения при таком лечении (в особенности у человека); (с) применение агента, связывающего и нейтрализующего NKG2A, для производства фармацевтического препарата для лечения рака, способ применения агента, связывающего и нейтрализующего NKG2A, для производства фармацевтического препарата для лечения рака, включающий смешивание агента, связывающего и нейтрализующего NKG2A, с фармацевтически приемлемым носителем, или фармацевтический препарат, содержащий эффективную дозу агента, связывающего и нейтрализующего NKG2A, подходящую для лечения рака; или (d) любую комбинацию пунктов а), b) и c) в соответствии с объектом изобретения, которую можно запатентовать в стране, где подана данная заявка.

В настоящем документе термин «биопсия» определяется как удаление ткани для целей обследования, например, установления диагноза. Примеры различных видов биопсии включают биопсию путем всасывания, например, через иглу, присоединенную к шприцу; путем инструментального удаления фрагмента ткани; путем удаления с помощью соответствующих инструментов через эндоскоп; путем хирургического иссечения, например, всего очага; и т.п.

В настоящем описании термин «антитело» относится к поликлональным и моноклональным антителам. В зависимости от типа константного домена тяжелых цепей антитела относятся к одному из пяти основных классов: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM. Некоторые из указанных классов, кроме того, подразделяются на подклассы или изотипы, например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 и т.п. Типичная структурная единица иммуноглобулина (антитела) включает тетрамер. Каждый тетрамер состоит из двух идентичных пар полипептидных цепей, причем каждая пара содержит одну «легкую» (приблизительно 25 кДа) и одну «тяжелую» цепь (приблизительно 50-70 кДа). N-концевой фрагмент каждой цепи содержит вариабельную область из приблизительно 100-110 аминокислот, главным образом отвечающих за распознавание антигена. Термины «вариабельная область легкой цепи» (V_L) и «вариабельная область тяжелой цепи» (V_H) относятся к указанным легкой и тяжелой цепям, соответственно. Константные домены тяжелой цепи, соответствующие различным классам иммуноглобулинов, называются «альфа», «дельта», «эпсилон», «гамма» и «мю», соответственно. Хорошо известны субъединичная структура и трехмерная конфигурация различных классов иммуноглобулинов. IgG представляют собой типичные классы антител, используемых в настоящем изобретении, поскольку они являются наиболее распространенными антителами в физиологических условиях, и их проще всего получить в лабораторных условиях. Антитело необязательно является моноклональным антителом. Конкретными примерами антител являются гуманизированные, химерные антитела, антитела человека или антитела, подходящие для человека по иным причинам. Термин «антитело» также включает любой фрагмент или производное любого из антител, описанных в настоящем документе.

Термин «специфически связывается с» означает, что антитело может предпочтительно связываться при анализе конкурентного связывания с партнером по связыванию, например, NKG2A, PD-1, PD-L1, согласно оценке с использованием рекомбинантных форм белков, их эпитопов или нативных белков, присутствующих на поверхности выделенных клеток-мишеней. Анализ конкурентного связывания и другие способы определения специфического связывания хорошо известны в данной области техники. Например, связывание можно обнаружить с помощью радиоактивных меток, физическими способами, например, масс-спектрометрией, или с использованием прямых или непрямых флуоресцентных меток, обнаруживаемых с использованием, например, цитофлуориметрического анализа (например, FACScan). Связывание в количестве, превышающем количество, наблюдаемое для контрольного, неспецифического агента указывает на связывание агента с мишенью. Агент, специфически связывающий NKG2A, может связывать только NKG2A или NKG2A в виде димера с CD94.

Когда говорят, что антитело «конкурирует с» конкретным моноклональным антителом, это означает, что антитело конкурирует с указанным моноклональным антителом при анализе связывания с использованием рекомбинантных молекул (например, NKG2A, PD-1, PD-L1) или молекул, экспрессируемых на поверхности клеток (например, NKG2A, PD-1, PD-L1). Например, если тестируемое антитело снижает связывание антитела, содержащего тяжелую цепь согласно любой из SEQ ID NO: 4-8 и легкую цепь согласно SEQ ID NO: 9 с полипептидом NKG2A или клеткой, экспрессирующей NKG2A, при анализе связывания, то говорят, что антитело «конкурирует» с таким антителом, соответственно.

В настоящем описании термин «сродство» означает силу связывания антитела с эпитопом. Сродство антитела задается константой диссоциации Kd, определяемой как [Ab]×[Ag]/[Ab-Ag], где [Ab-Ag] - молярная концентрация комплекса антитело-антиген, [Ab] - молярная концентрация свободного антитела и [Ag] - молярная концентрация свободного антигена. Константа сродства K_a определяется как 1/Kd. Способы определения сродства мАт можно найти в Harlow, et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988), Coligan et al., eds., Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience, N.Y., (1992, 1993), и Muller, Meth. Enzymol. 92:589-601 (1983), включенных в настоящий документ посредством ссылок. Один стандартный способ определения сродства мАт, хорошо известный в данной области техники, представляет собой использование скрининга на основе поверхностного плазмонного резонанса (ППР) (например, посредством анализа с помощью аналитического ППР-устройства BIAcore™).

В контексте настоящего документа термин «детерминанта» означает сайт взаимодействия или связывания в составе полипептида.

Термин «эпитоп» относится к антигенной детерминанте и представляет собой область или регион антигена, с которым связывается антитело. Эпитоп белка может содержать аминокислотные остатки, непосредственно участвующие в связывании, а также аминокислотные остатки, эффективно блокируемые специфическим антигенсвязывающим антителом или пептидом, т.е. аминокислотные остатки в области распознавания антитела. Это - простейшая форма или наименьшая структурная область сложной молекулы антигена, которая может взаимодействовать с, например, антителом или рецептором. Эпитопы могут быть линейными или конформационными/структурными. Термин «линейный эпитоп» определяется как эпитоп, состоящий из аминокислотных остатков, которые находятся рядом друг с другом на линейной последовательности аминокислот (первичной структуре). Термин «конформационный или структурный эпитоп» определяется как эпитоп, состоящий из аминокислотных остатков, не все из которых расположены рядом друг с другом и, таким образом, представляют собой отдельные части линейной последовательности аминокислот, которые сближаются друг с другом за счет фолдинга молекулы (вторичной, третичной и/или четвертичной структуры). Конформационный эпитоп зависит от 3-мерной структуры. Поэтому термин «конформационный» часто используется на равных основаниях с термином «структурный».

В настоящем документе термин «агент» используется для обозначения химического соединения, смеси химических соединений, биологической макромолекулы или экстракта биологических материалов. Термин «терапевтический агент» относится к агенту, обладающему биологической активностью.

Для целей настоящего изобретения термины «гуманизированное» антитело или антитело «человека» относятся к антителу, в котором константная и вариабельная каркасная области одного или более иммуноглобулинов человека объединены со связывающей областью, например, CDR, иммуноглобулина животного. Такие антитела сконструированы с целью поддержания специфичности связывания нечеловеческого антитела, производными которого являются связывающие области, при избегании иммунного ответа против нечеловеческого антитела. Такие антитела можно получить о трансгенных мышей или других животных, «сконструированных» с целью продукции специфических антител человека в ответ на антигенную стимуляцию (см., например, Green et al. (1994) Nature Genet 7:13; Lonberg et al. (1994) Nature 368:856; Taylor et al. (1994) Int Immun 6:579, информация из которых полностью включена в настоящий документ посредством ссылки). Кроме того, полностью человеческое антитело можно сконструировать с использованием способов трансфекции генов или хромосом, а также технологии фагового дисплея, которые известны в данной области техники (see, e.g., McCafferty et al. (1990) Nature 348:552-553). Кроме того, антитела человека можно получить in vitro с применением активированных В-клеток (см., например, патенты США №5567610 и 5229275, полностью включенные в настоящий документ посредством ссылок).

«Химерное антитело» представляет собой молекулу антитела, в которой (а) константная область или ее фрагмент модифицированы, замещены или заменены таким образом, что антигенсвязывающий сайт (вариабельная область) связан с константной областью, относящейся к другому или измененному классу, обладающей другой эффекторной функцией и/или характерной для другого вида, или с совершенно другой молекулой, придающей химерному антителу новые свойства, например, ферментом, токсином, гормоном, фактором роста, лекарственным веществом и т.д.; либо (b) вариабельная область или ее фрагмент модифицированы, замещены или заменены вариабельной областью, обладающей специфичностью по отношению к другому или модифицированному антигену.

Термины «Fc-домен», «Fc-фрагмент» и «Fc-область» относятся к C-концевому фрагменту тяжелой цепи антитела, например, от приблизительно 230 до приблизительно 450 аминокислоты (АК) тяжелой γ (гамма) цепи человека, или аналогичной ему последовательности в тяжелых цепях антител других типов (например, α, δ, ε и μ для антител человека), либо их аллотипу, встречающемуся в природе. Если не указано иное, в настоящем изобретении используют общепринятую нумерацию аминокислот в иммуноглобулинах по Кабату (см. Kabat et al. (1991) Sequences of Protein of Immunological Interest, 5th ed., United States Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda, MD).

Термины «выделенный», «очищенный» или «биологически чистый» относятся к материалу, в основном или практически не содержащему компонентов, обычно сопутствующих ему в нативном состоянии. Чистоту и однородность обычно определяют с помощью методик аналитической химии, например, электрофореза в полиакриламидном геле или высокоэффективной жидкостной хроматографии. Белок, являющийся преобладающим в препарате соединением, является в основном очищенным.

Термины «полипептид», «пептид» и «белок» используются в настоящем документе на равных основаниях для обозначения полимера, состоящего из аминокислотных остатков. Эти термины относятся к аминокислотным полимерам, в которых один или более из аминокислотных остатков является искусственным соединением, имитирующим соответствующую природную аминокислоту, а также природным аминокислотным полимерам и аминокислотным полимерам, не встречающимся в природе.

Термин «рекомбинантный», используемый по отношению к, например, клетке, нуклеиновой кислоте, белку или вектору, означает, что указанная клетка, нуклеиновая кислота, белок или вектор модифицированы путем внедрения гетерологичной нуклеиновой кислоты или белка или изменения нативной нуклеиновой кислоты или белка, или что клетка происходит от клетки, модифицированной таким образом Так, например, рекомбинантные клетки экспрессируют гены, не встречающиеся в нативной (не рекомбинантной) форме данной клетки, или экспрессируют нативные гены, в противном случае экспрессирующиеся аномальным образом, в недостаточном количестве или вообще не экспрессирующиеся.

В контексте настоящего описании термин «антитело, связывающее» полипептид или эпитоп, означает антитело, связывающее указанную детерминанту с определенной специфичностью и/или сродством.

Термин «идентичность» или «идентичный» при использовании по отношению к связи между последовательностями двух или более полипептидов относится к степени родства последовательностей полипептидов, определенной по количеству совпадений между двумя или более цепями аминокислотных остатков. «Идентичность» измеряет процент идентичных совпадений между меньшей из двух последовательностей при выравнивании промежутков (при их наличии), рассчитываемый определенной математической моделью или компьютерной программой (т.е. «алгоритмами»). Идентичность родственных полипептидов легко рассчитать известными способами. Такие способы включают способы, описанные в Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York, 1991; и Carillo et al., SIAM J. Applied Math. 48, 1073 (1988), но не ограничиваются ими.

Способы определения идентичности выдают степень максимального совпадения между тестируемыми последовательностями. Способы определения идентичности описаны в общедоступных компьютерных программах. Программные способы определения идентичности между двумя последовательностями включают программный пакет GCG, включающий GAP (Devereux et al., Nucl. Acid. Res. 12, 387 (1984); Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.), BLASTP, BLASTN, и FASTA (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215, 403-410 (1990)). Программа BLASTX общедоступна в Национальном центре биотехнологической информации США (NCBI) и других источниках (BLAST Manual, Altschul et al. NCB/NLM/NIH Bethesda, Md. 20894; Altschul et al., supra). Кроме того, для определения идентичности можно использовать хорошо известный алгоритм Смита-Уотермана.

NKG2A-нейтрализующие терапевтические агенты

Агент-антагонист NKG2A связывается с внеклеточным фрагментом рецептора CD94/NKG2A человека и снижает ингибиторную активность рецептора CD94/NKG2A человека, экспрессируемого на поверхности CD94/NKG2A-положительных лимфоцитов. В одном варианте реализации данный агент конкурирует с HLA-Е за связывание с CD94/NKG2A, т.е. блокирует взаимодействие между CD94/NKG2A и его лигандом HLA-E. В другом варианте реализации данный агент не конкурирует с HLA-Е за связывание с CD94/NKG2A; т.е. способен связывать CD94/NKG2A одновременно с HLA-Е. Антитело может связываться с комбинированным эпитопом на CD94 и NKG2A и/или только с эпитопом на NKG2A.

В одном аспекте агент-антагонист NKG2A представляет собой антитело, выбранное из полностью человеческого антитела, гуманизированного антитела и химерного антитела. В одном из аспектов агент содержит константный домен, происходящий от антитела IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 человека. В одном из аспектов агент представляет собой фрагмент антитела, выбранного из антител IgA, IgD, IgG, IgE и IgM. В одном из аспектов агент представляет собой фрагмент антитела, выбранный из Fab-фрагмента, Fab'-фрагмента, Fab'-SH-фрагмента, F(ab)2-фрагмента, F(ab')2-фрагмента, Fv-фрагмента, тяжелой цепи Ig (Ig ламы или верблюда), V_HH-фрагмента, однодоменного FV и фрагмента одноцепочечного антитела. В одном из аспектов агент представляет собой синтетическую или полусинтетическую молекулу, происходящую от антитела, выбранную из scFV, dsFV, миниантитела, диатела, триатела, каппа-тела, IgNAR и полиспецифического антитела.

Антитела против NKG2A необязательно не демонстрируют существенного специфического связывания с Fcv-рецепторами человека, например, CD16. Антитела против NKG2A необязательно не характеризуются существенным специфическим связыванием или характеризуются низким или пониженным специфическим связыванием с одним или более или всеми CD16, CD32A, CD32B или CD64 человека. Типичные антитела могут содержать константные области различных тяжелых цепей, заведомо не связывающиеся или характеризующиеся низким связыванием с Fcγ-рецепторами. Одним из таких примеров является константная область IgG4 человека. В одном варианте реализации IgG4-антитело содержит модификацию с целью предотвращения образования полуантител (обмена плеч fab) in vivo, например, антитело содержит тяжелую цепь IgG4, содержащую мутацию замены серина на пролин в остатке 241, соответствующем положению 228 согласно ЕС-индексу (Kabat et al., "Sequences of proteins of immunological interest", 5^th ed., NIH, Bethesda, ML, 1991). Такие модифицированные IgG4-антитела остаются интактными in vivo и поддерживают двухвалентное связывание (с высоким сродством) с NKG2A, в отличие от нативного IgG4, которое должно подвергаться обмену плеч fab in vivo таким образом, что они связываются с NKG2A моновалентным образом, что может влиять на сродство связывания. В качестве альтернативы, во избежание связывания с Fc-рецептором можно использовать фрагменты антител, не содержащие константных областей, например, Fab-или F(ab')2-фрагменты. Связывание с Fc-рецептором можно оценить в соответствии со способами, известными в данной области техники, в том числе, например, тестированием связывания антитела с Fc-рецепторным белком при анализе BIACORE. Кроме того, можно использовать антитело человека любого типа (например, IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4), в котором Fc-фрагмент модифицирован с целью минимизации или устранения связывания с Fc-рецепторами (см., например, WO 03101485, описание которого включено в настоящий документ посредством ссылки). Такие анализы для оценки связывания с Fc-рецептором, как, например, анализы на основе клеток, хорошо известны в данной области техники и описаны, например, в WO 03101485.

Таким образом, настоящее изобретение относится к антителам или другим агентам, связывающимся с NKG2A. В одном аспекте антитело связывается с NKG2A с по меньшей мере 100-кратно более низкой KD, чем при связывании с NKG2C и/или NKG2E человека.

В одном аспекте изобретения агент уменьшает CD94/NKG2A-опосредованное ингибирование CD94/NKG2A-экспрессирующего лимфоцита, создавая помехи для сигнального пути CD94/NKG2A, например, мешая связыванию HLA-E NKG2A, предотвращая или индуцируя конформационные изменения рецептора CD94/NKG2A и/или влияя на димеризацию и/или кластеризацию рецептора CD94/NKG2A.

В одном аспекте изобретения агент связывается с внеклеточным фрагментом NKG2A с по меньшей мере 100-кратно более низкой KD, чем при связывании с NKG2C. В дополнительном предпочтительном аспекте агент связывается с внеклеточным фрагментом NKG2A с по меньшей мере 150-, 200-, 300, 400- или 10000-кратно более низкой KD, чем при связывании с NKG2C. В еще одном аспекте изобретения агент связывается с внеклеточным фрагментом NKG2A с по меньшей мере 100-кратно более низкой KD, чем при связывании с молекулами NKG2C, NKG2E и/или NKG2H. В дополнительном предпочтительном аспекте агент связывается с внеклеточным фрагментом NKG2A с по меньшей мере 150-, 200-, 300, 400- или 10000-кратно более низкой KD, чем при связывании с молекулами NKG2C, NKG2C и/или NKG2H. Это можно измерить, например, в экспериментах на BiaCore, где измеряют способность агентов связывать внеклеточный фрагмент иммобилизованного CD94/NKG2A (например, выделенного из CD94/NKG2-экспрессирующих клеток или продуцированного в биосистеме) и сравнивают ее со связыванием агентов с аналогично продуцированным CD94/NKG2C и/или другими вариантами CD94/NKG2 в аналогичном анализе. В качестве альтернативы, связывание агентов с клетками, естественным образом экспрессирующими или сверхэкспрессирующими (например, после временной или стабильной трансфекции) CD94/NKG2A можно измерить и сравнить со связыванием клеток, экспрессирующих CD94/NKG2C и/или другие варианты CD94/NKG2. Антитела против NKG2A необязательно могут связывать NKG2B, который является сплайс-вариантом NKG2A, образующим ингибиторный рецептор вместе с CD94. В одном варианте реализации сродство можно измерить с помощью способов, описанных в патенте США №8206709, например, путем оценки связывания с ковалентно иммобилизованным гибридным белком NKG2A-CD94-Fc с помощью Biacore, как показано в примере 8 патента США №8206709, описание которого включено в настоящий документ посредством ссылки.

Антитело против NKG2A может являться гуманизированным антителом, например, содержащим акцепторный каркас VH человека из акцепторной последовательности человека, выбранный из, например, VH1_18, VH5_a, VH5_51, VH1_f и VH1_46 и JH6 J-сегмента, или другие каркасные последовательности VH эмбриональных линий человека, известные в данной области техники. Акцепторная последовательность VL-области человека может представлять собой, например, VKI_O2/JK4.

В некоторых вариантах реализации антитело является гуманизированным антителом на основе антитела Z270. Различные гуманизированные Z270VH-цепи показаны в SEQ ID NO: 4-8 (аминокислоты домена вариабельной области подчеркнуты). HumZ270VH6 (SEQ ID NO: 4) основана на VH5_51; HumZ270VH1 (SEQ ID NO: 5) основана на VH1_18; humZ270VH5 (SEQ ID NO: 6) основана на VH5_a; humZ270VH7 (SEQ ID NO: 7) основана на VH1_f; a humZ270VH8 (SEQ ID NO: 8) основана на VH1_46; все они содержат J-сегмент JH6. Каждое из этих антител сохраняет высокое сродство связывания с NKG2A при низкой вероятности иммунного ответа хозяина против антитела, поскольку 6 C-концевых аминокислотных остатков CDR-H2 по Кабату каждого из этих гуманизированных конструктов идентичны акцепторному каркасу человека. С помощью программы выравнивания VectorNTI получили следующие значения идентичности последовательностей humZ270VH1 и humZ270VH5, -6, -7 и -8: 78,2% (VH1 по сравнению с VH5), 79,0% (VH1 по сравнению с VH6), 88,7% (VH1 по сравнению с VH7) и 96,0% (VH1 по сравнению с VH8).

В одном аспекте агент содержит (i) вариабельную область тяжелой цепи согласно любой из SEQ ID NO: 4-8 или аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% или 99% идентичную ей, и (ii) вариабельную область легкой цепи согласно SEQ ID NO: 9 или аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% или 99% идентичную ей. В одном аспекте агент содержит (i) тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность согласно любой из SEQ ID NO: 4-8 или аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% или 99% идентичную ей, и (ii) легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO: 9 или аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% или 99% идентичную ей. Антитело, содержащее тяжелую цепь согласно любой из SEQ ID NO: 4-8 и легкую цепь согласно SEQ ID NO: 9, нейтрализует ингибиторную активность NKG2A, однако не связывает активирующие рецепторы NKG2C, NKGE или NKG2H в существенной степени. Кроме того, это антитело конкурирует с HLA-Е за связывание с NKG2A на поверхности клетки. В одном аспекте агент содержит последовательности HCDR1, HCDR2 и/или HCDR3, происходящие от тяжелой цепи, содержащей аминокислотную последовательность согласно любой из SEQ ID NO: 4-8. В одном аспекте настоящего изобретения агент содержит последовательности LCDR1, LCDR2 и/или LCDR3, происходящие от легкой цепи, содержащей аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO: 9.

Тяжелые цепи VH6:

VH1:

VH5:

VH7:

VH8:

Легкая цепь

В одном аспекте антитело против NKG2A представляет собой антитело, содержащее CDR-H1, соответствующую остаткам 31-35 SEQ ID NO: 4-8, CDR-H2, соответствующую остаткам 50-60 (необязательно 50-66 при включении аминокислот человеческого происхождения) SEQ ID NO: 4-8 и CDR-H3, соответствующую остаткам 99-114 (95-102 по Кабату) SEQ ID NO: 4-8. В одном варианте реализации CDR-H2 соответствует остаткам 50-66 SEQ ID NO: 4-8. CDR необязательно может содержать одну, две, три, четыре или более аминокислотные замены.

В одном аспекте антитело против NKG2A представляет собой антитело, содержащее CDR-L1, соответствующую остаткам 24-34 SEQ ID NO: 9, CDR-L2 соответствует остаткам 50-56 SEQ ID NO: 9, a CDR-L3 соответствует остаткам 89-97 SEQ ID NO: 9. CDR необязательно может содержать одну, две, три, четыре или более аминокислотные замены.

В одном аспекте антитело против NKG2A представляет собой антитело, содержащее CDR-H1, соответствующую остаткам 31-35 SEQ ID NO: 4-8, CDR-H2 соответствует остаткам 50-60 (необязательно 50-66) SEQ ID NO: 4-8 и CDR-H3, соответствующую остаткам 99-114 (95-102 по Кабату) SEQ ID NO: 4-8, CDR-L1 соответствует остаткам 24-34 SEQ ID NO: 9, CDR-L2 соответствует остаткам 50-56 SEQ ID NO: 9, a CDR-L3 соответствует остаткам 89-97 SEQ ID NO: 9.

В одном аспекте агент содержит последовательности HCDR1, HCDR2 и/или HCDR3, происходящие от VH, содержащей аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO: 10. В одном аспекте настоящего изобретения агент содержит последовательности LCDR1, LCDR2 и/или LCDR3, происходящие от VL, содержащей аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO: 11. В одном аспекте агент содержит последовательности HCDR1, HCDR2 и/или HCDR3, происходящие от VH, содержащей аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO: 10, и LCDR1, LCDR2 и/или LCDR3, происходящие от VL, содержащей аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO: 11. Антитело, содержащее тяжелую цепь согласно SEQ ID NO: 10 и легкую цепь согласно SEQ ID NO: 11, нейтрализует ингибиторную активность NKG2A, а также связывает активирующие рецепторы NKG2C, NKGE или NKG2H. Указанное антитело не конкурирует с HLA-Е за связывание с NKG2A на поверхности клетки (т.е. представляет собой неконкурентный антагонист NKG2A).

В одном аспекте агент содержит аминокислотные остатки 31-35, 50-60, 62, 64, 66 и 99-108 вариабельного домена тяжелой цепи (V_H) (SEQ ID NO: 10) и аминокислотные остатки 24-33, 49-55 и 88-96 вариабельного домена легкой цепи (V_L) (SEQ ID NO: 11), необязательно с одной, двумя, тремя, четырьмя или более аминокислотными заменами.

В одном аспекте агент является полностью человеческим антителом, полученное против эпитопа CD94/NKG2A, с которым связывается любое из вышеупомянутых антител.

Следует принимать во внимание, что несмотря на возможность применения вышеупомянутых антител, другие антитела могут распознавать и быть получены против любой части полипептида NKG2A при условии, что данное антитело нейтрализует ингибиторную активность NKG2A. Например, любой фрагмент NKG2A, предпочтительно, но не исключительно представляющий собой NKG2A человека, или любую комбинацию фрагментов NKG2A можно применять в качестве иммуногенов для получения антител, и указанные антитела могут распознавать эпитопы в любом положении в пределах полипептида NKG2A, при условии, что они могут делать это на NK-клетках, экспрессирующих NKG2A, как описано в настоящем документе. Указанный эпитоп необязательно представляет собой эпитоп, специфически распознаваемый антителом, содержащим тяжелую цепь согласно SEQ ID NO: 4-8, и легкую цепь согласно SEQ ID NO: 9.

В одном аспекте агент конкурирует с антителом humZ270, описанным в патенте США №8206709 (описание которого включено в настоящий документ посредством ссылки), за связывание с внеклеточным фрагментом рецептора CD94/NKG2A человека. Конкурентное связывание можно измерить, например, в экспериментах на BiaCore, где измеряют способность агентов связывать внеклеточный фрагмент иммобилизованного рецептора CD94/NKG2A (например, выделенного из CD94/NKG2-экспрессирующих клеток или продуцированного в биосистеме), насыщенный humZ270. В качестве альтернативы, измеряют связывание агентов с клетками, естественным образом экспрессирующими или сверхэкспрессирующими (например, после временной или стабильной трансфекции) рецептор CD94/NKG2A, предварительно инкубированными с насыщающими дозами Z270. В одном варианте реализации конкурентное связывание можно измерить с помощью способов, описанных в патенте США №8206709, например, путем оценки связывания с клетками Ba/F3-CD94-NKG2A с помощью проточной цитометрии, как показано в примере 15 патента США №8206709, описание которого включено в настоящий документ посредством ссылки.

Терапевтические агенты, нейтрализующие PD-1

В настоящее время существуют по меньшей мере шесть агентов, блокирующих путь PD-1/PD-L1, которые выпущены на рынок или находятся на стадии клинической оценки. Один агент представляет собой BMS-936558 (ниволумаб/ONO-4538, Bristol-Myers Squibb; прежнее название MDX-1106). Ниволумаб (торговое название Opdivo®) представляет собой утвержденное FDA полностью человеческое IgG4-мАт против PD-L1, ингибирующее связывание лиганда PD-L1 с PD-1 и CD80 и описанное как антитело 5С4 в заявке WO 2006/121168, описание которой включено в настоящий документ посредством ссылки. Для пациентов с меланомой наиболее значимый OR наблюдали при дозе 3 мг/кг, в то время как для других видов рака он присутствовал при дозе 10 мг/кг. Ниволумаб обычно применяют в дозировке 10 мг/кг каждые 3 недели до прогрессирования рака.

MK-3475 (IgG4-мАт против PD1 человека производства Merck), также известное под названием ламбролизумаб или пембролизумаб (торговое название Keytruda®) одобрено FDA для лечения меланомы и проходит испытания при других видах рака. Пембролизумаб испытывали при дозировке 2 мг/кг или 10 мг/кг каждые 2-3 недели до прогрессирования заболевания. ДНК-конструкты, кодирующие вариабельные области тяжелых и легких цепей гуманизированных антител h409AlI, депонированы в патентном депозитарии Американской коллекции типовых культур (10801 University Blvd., Манассас, штат Виргиния, США). Плазмида, содержащая ДНК, кодирующую тяжелую цепь h409A-I 1, депонирована 9 июня 2008 г. с присвоением идентификатора 081469_SPD-H, а плазмида, содержащая ДНК, кодирующую легкую цепь h409Al 1, депонирована 9 июня 2008 г. с присвоением идентификатора 0801470_SPD-L-I 1. MK-3475, также известное как Merck 3745 или SCH-900475, также описано в WO 2009/114335.

MPDL3280A/RG7446 (антитело против PD-L1 производства Roche/Genentech) представляет собой мАт человека против PD-L1, содержащее рекомбинантный Fc-домен, сконструированный с целью оптимизации эффективности и безопасности за счет минимизации связывания FcγR и последующей антитело-зависимой клеточной цитотоксичности (ADCC). Дозы ≤1, 10, 15 и 25 мг/кг MPDL3280A вводили каждые 3 недели в течение периода продолжительностью до 1 года. В исследовании 3 фазы MPDL3280A вводили в дозе 1200 мг путем внутривенного вливания каждые три недели пациентам с НМРЛ.

АМР-224 (Amplimmune и GSK) представляет собой иммуноадгезин, содержащий внеклеточный домен PD-L2, объединенный с Fc-доменом. Другие примеры агентов, нейтрализующих PD-1, могут включать антитело, связывающее PD-L2 (антитело против PD-L2) и блокирующее взаимодействие между PD-1 и PD-L2.

Пидлизумаб (СТ-011; CureTech) (гуманизированное IgG1-мАт против PD1 производства CureTech/Teva), пидлизумаб (СТ-011; CureTech) (см., например, WO 2009/101611). Тридцать пациентов с рецидивирующей FL, чувствительной к ритуксимабу, лечили путем внутривенного введения 3 мг/кг СТ-011 каждые 4 недели в составе курса из 4 вливаний в комбинации с ритуксимабом в дозировке 375 мг/м2 каждую неделю в течение 4 недель, начиная со 2 недели после первого вливания СТ-011.

Дополнительные известные антитела против PD-1 и другие ингибиторы PD-1 включают АМР-224 (гибридный белок B7-DC/IgG1, лицензированный GSK), АМР-514, описанное в WO 2012/145493, антитело MEDI-4736 (антитело против PD-L1, разработанное AstraZeneca/Medimmune), описанное в WO 2011/066389 и US 2013/034559, антитело YW243.55.S70 (антитело против PD-L1), описанное в WO 2010/077634, MDX-1105, также известное как BMS-936559, которое представляет собой антитело против PD-L1, разработанное Bristol-Myers Squibb, описанное в WO 2007/005874, и антитела и ингибиторы, описанные в WO 2006/121168, WO 2009/014708, WO 2009/114335 и WO 2013/019906, описание которых включено в настоящий документ посредством ссылок. Дополнительные примеры антител против PD1 описаны в WO 2015/085847 (Shanghai Hengrui Pharmaceutical Co. Ltd.), например, антитела, содержащие CDR1, 2 и 3 вариабельного домена легкой цепи SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 и/или SEQ ID NO: 8, соответственно, и CDR1, 2 и 3 вариабельного домена тяжелой цепи антитела согласно SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 5, соответственно, причем ссылки на SEQ ID NO пронумерованы согласно WO 2015/085847, описание которой включено в настоящий документ посредством ссылки. Кроме того, можно использовать антитела, конкурирующие с любым из этих антител за связывание с PD-1 или PD-L1.

Типичным антителом против PD-1 является пембролизумаб (см., например, WO 2009/114335, описание которой включено в настоящий документ посредством ссылки). Антитело против PD-1 может представлять собой антитело h409Al 1 из заявки WO 2008/156712, содержащее вариабельные области тяжелой цепи, кодируемые ДНК, депонированной в АТСС как 081469_SPD-H, и вариабельные области легкой цепи, кодируемые ДНК, депонированной в АТСС как 0801470_SPD-L-I 1. В других вариантах реализации антитело содержит CDR или вариабельные области тяжелой и легкой цепи пембролизумаба. Соответственно, в одном варианте реализации, антитело содержит CDR1-, CDR2- и CDR3-домены VH пембролизумаба, кодируемые ДНК, депонированной в АТСС как 081469_SPD-H, и CDR1-, CDR2- и CDR3-домены VL пембролизумаба, кодируемые ДНК, депонированной в АТСС как 0801470_SPD-L-I 1.

В некоторых вариантах реализации изобретения агент, нейтрализующий PD-L1, представляет собой мАт против PD-L1, ингибирующее связывание PD-L1 с PD-1. В некоторых вариантах реализации изобретения агент, нейтрализующий PD1, представляет собой мАт против PD-1, ингибирующее связывание PD-1 с PD-L1. В некоторых вариантах реализации агент, нейтрализующий PD-1, является иммуноадгезином (например, иммуноадгезином, содержащим внеклеточный или PD-1-связывающий фрагмент PD-L1 или PD-L2, объединенный с константной областью (например, Fc-областью последовательности иммуноглобулина).

Еще одним типичным антителом против PD-1 является ниволумаб, содержащий тяжелые и легкие цепи, обладающие соответствующими последовательностями, показанными в SEQ ID NO: 12 и 13 или соответствующую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% или 99% идентичную им, или их антиген-связывающие фрагменты и варианты В других вариантах реализации антитело содержит CDR или вариабельные области тяжелой и легкой цепи ниволумаба. Соответственно, в одном варианте реализации антитело содержит CDR1-, CDR2- и CDR3-домены тяжелой цепи ниволумаба, обладающей последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 12, и CDR1-, CDR2- и CDR3-домены легкой цепи ниволумаба, обладающие последовательностями, приведенными в SEQ ID NO: 13.

Типичное антитело против PD-L1 содержит вариабельные области тяжелой и легкой цепи, обладающие соответствующими последовательностями, показанными в SEQ ID NO: 14 и 15 или аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% или 99% идентичную им, или их антиген-связывающие фрагменты и варианты В других вариантах реализации антитело содержит CDR или вариабельные области тяжелой и легкой цепи MPDL3280A. Соответственно, в одном варианте реализации антитело содержит CDR1-, CDR2- и CDR3-домены тяжелой цепи, обладающей последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 14, и CDR1-, CDR2- и CDR3-домены легкой цепи, обладающие последовательностями, приведенными в SEQ ID NO: 15.

Антитело против PD-1 или против PD-L1 можно выбрать из полностью человеческого антитела, гуманизированного антитела и химерного антитела. В одном аспекте настоящего изобретения агент содержит константный домен, происходящий от IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4-антитела человека. В одном аспекте настоящего изобретения указанный агент представляет собой фрагмент антитела, выбранного из IgA, IgD, IgG, IgE и IgM-антитела. В одном аспекте настоящего изобретения агент представляет собой фрагмент антитела, выбранный из Fab-фрагмента, Fab'-фрагмента, Fab'-SH-фрагмента, F(ab)2-фрагмент, F(ab')2-фрагмент, Fv-фрагмент, тяжелую цепь Ig (Ig ламы или верблюда), V_HH-фрагмент, однодоменный FV и фрагмент одноцепочечного антитела. В одном аспекте настоящего изобретения указанный агент представляет собой синтетическое или полусинтетическое производное антитела, выбранное из scFV, dsFV, миниантитела, диатела, триатела, каппа-тела, IgNAR; и полиспецифического антитела.

Антитело против PD-1 или против PD-L1 может не обладать существенной способностью к специфическому связыванию с Fcγ-рецепторами, например, CD16. Такие антитела могут содержать константные области различных тяжелых цепей, заведомо не связывающих Fc-рецепторы. Одним из таких примеров является константная область IgG4. В качестве альтернативы, во избежание связывания с Fc-рецептором можно использовать фрагменты антител, не содержащие константных областей, например, Fab-или F(ab')2-фрагменты. Связывание с Fc-рецептором можно оценить в соответствии со способами, известными в данной области техники, в том числе, например, тестированием связывания антитела с Fc-рецепторным белком при анализе BIACORE. Кроме того, можно использовать антитело человека любого типа (например, IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4), в котором Fc-фрагмент модифицирован с целью минимизации или устранения связывания с Fcγ-рецепторами. Такое антитело против PD-1 или против PD-L1 обычно обладает сниженными или минимальными эффекторными функциями. В одном аспекте минимальная эффекторная функция является результатом продукции в прокариотических клетках. В одном аспекте минимальная эффекторная функция является результатом «безэффекторной мутации Fc» или агликозилирования. В дополнительно варианте реализации безэффекторная мутация Fc представляет собой замену N297A или D265A/N297A в константной области.

Агент против NKG2A или против PD-1 или против PD-L1, например, антитело, можно включить в фармацевтический состав в концентрации от 1 мг/мл до 500 мг/мл, причем рН указанного состава находится в диапазоне от 2,0 до 10,0. Состав может также содержать буферную систему, консервант(ы), регулятор(ы) тоничности, хелатирующий(е) агент(ы), стабилизаторы и поверхностно-активные вещества. В одном варианте реализации фармацевтический состав является водным составом, например, составом, содержащим воду. Такой состав обычно представляет собой раствор или суспензию. В дополнительном варианте реализации фармацевтический состав представляет собой водный раствор. Термин «водный состав» означает состав, содержащий по меньшей мере 50 масс. % воды. Аналогичным образом, термин «водный раствор» означает раствор, содержащий по меньшей мере 50 масс. % воды, а термин «водная суспензия» означает суспензию, содержащую по меньшей мере 50 масс. % воды.

В еще одном варианте реализации фармацевтический состав представляет собой лиофилизированный состав, к которому врач или пациент добавляет растворители и/или разбавители перед применением.

В еще одном варианте реализации фармацевтический состав представляет собой высушенный состав (например, лиофилизированный или высушенный посредством распылительной сушки), готовый к применению без предварительного растворения.

В другом аспекте фармацевтический состав содержит водный раствор такого антитела и буфер, причем антитело присутствует в концентрации от 1 мг/мл и выше, а рН указанного состава составляет от 2,0 до 10,0.

В еще одном варианте реализации рН состава находится в диапазоне, выбранном из списка, состоящего из диапазонов от приблизительно 2,0 до приблизительно 10,0, от приблизительно 3,0 до приблизительно 9,0, от приблизительно 4,0 до приблизительно 8,5, от приблизительно 5,0 до приблизительно 8,0, и от приблизительно 5,5 до приблизительно 7,5.

В дополнительном варианте реализации буфер выбирают из группы, состоящей из ацетата натрия, карбонат натрия, цитрата, глицилглицина, гистидина, глицина, лизина, аргинина, дигидрофосфата натрия, гидрофосфата натрия, фосфата натрия и трис(гидроксиметил)аминометана, бицина, трицина, яблочной кислоты, сукцината, малеиновой кислоты, фумаровой кислоты, винной кислоты, аспарагиновой кислоты или их смесей. Каждый из этих конкретных буферов представляет собой альтернативный вариант реализации изобретения.

В дополнительном варианте реализации состав дополнительно содержит фармацевтически приемлемый консервант. В дополнительном варианте реализации состав дополнительно содержит изотонический агент. В дополнительном варианте реализации состав также содержит хелатирующий агент. В дополнительном варианте реализации настоящего изобретения состав дополнительно содержит стабилизатор. В дополнительном варианте реализации состав дополнительно содержит поверхностно-активное вещество. Для удобства приведена ссылка на Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19^th edition, 1995.

В пептидном фармацевтическом составе согласно настоящему изобретению могут присутствовать другие ингредиенты. Такие дополнительные ингредиенты могут включать увлажнители, эмульгаторы, антиоксиданты, наполнители, модификаторы тоничности, хелатирующие агенты, ионы металлов, масляные носители, белки (например, человеческий сывороточный альбумин, желатин или белки) и цвиттерион (например, такую аминокислоту, как бетаин, таурин, аргинин, глицин, лизин и гистидин). Такие дополнительные ингредиенты, разумеется, не должно оказывать нежелательного влияния на общую стабильность фармацевтического состава согласно настоящему изобретению.

Введение фармацевтических композиций согласно настоящему изобретению можно осуществлять несколькими путями, например, внутривенно. Подходящие составы антител также можно определить путем изучения опыта применения других уже разработанных терапевтических моноклональных антител. Несколько моноклональных антител, например, Rituxan (Rituximab), герцептин (трастузумаб), Xolair (омализумаб), Bexxar (тозитумомаб), Campath (алемтузумаб), зевалин, Oncolym продемонстрировали свою эффективность в клинических ситуациях, и можно использовать аналогичные составы, содержащие антитела согласно настоящему изобретению. Например, моноклональное антитело можно поставлять в концентрации 10 мг/мл в 100-мг (10-мл) или 500-мг (50-мл) одноразовых флаконах в составе для в/в введения, содержащем 9,0 мг/мл хлорида натрия, 7,35 мг/мл дигидрата цитрата натрия, 0,7 мг/мл полисорбата 80 и стерильную воду для инъекций. рН доводят до 6,5. В еще одном варианте реализации антитело поставляют в составе, содержащем приблизительно 20 мМ цитрата Na, приблизительно 150 мМ NaCl при рН приблизительно 6,0.

Кроме того, предложены наборы, содержащие фармацевтическую композицию, содержащую антитело против NKG2A, и, необязательно, также антитело против PD-1 или против PD-L1 и фармацевтически приемлемый носитель в терапевтически эффективном количестве, приспособленном для применения в предшествующих способах. Указанные наборы также могут необязательно содержать инструкции, например, график введения, позволяющий практикующему специалисту (например, врачу, медсестре или пациенту) вводить состав, содержащийся в нем, с целью введения композиции пациенту, имеющему рак (например, солидную опухоль). Кроме того, набор может содержать шприц.

Наборы необязательно содержат несколько упаковок, содержащих разовые дозы фармацевтических композиций, каждая из которых содержит эффективное количество антитела против NKG2A и, необязательно, также антитело против PD-1 или против PD-L1, для разового введения в соответствии со способами, предложенными выше. В наборы также могут входить инструменты или изделия, необходимые для введения фармацевтической(их) композиции(й). Например, набор может содержать один или более предварительно заполненных шприцов, содержащих некоторое количество антитела против NKG2A, против PD-1 или против PD-L1.

В одном варианте реализации настоящего изобретения предложен набор для лечения рака, устойчивого к антителу против PD-1/PD-L1, у пациента-человека, причем указанный набор содержит:

(a) дозу антитела против NKG2A, содержащего CDR1-, CDR2- и CDR3-домены тяжелой цепи, обладающей последовательностью, приведенной в любой из SEQ ID NO: 4-8, и домены CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи, обладающей последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 9;

(b) необязательно, дозу антитела против PD-1 или антитела против PD-L1; и

(c) необязательно, инструкции по применению антитела против NKG2A (и, необязательно, антитело против PD-1 или PD-L1) в любом из способов, описанных в настоящем документе.

Диагностика, прогнозирование и лечение злокачественных новообразований

Описаны способы, которые можно применять при диагностике, прогнозировании, мониторинге, лечении и профилактике рака у индивида с применением агента, нейтрализующего активность NKG2A, необязательно в комбинации с агентом, нейтрализующим активность PD-1, например, антителом против PD-1 или антителом против PD-L1. Индивид необязательно может слабо реагировать на лечение с применением агента, нейтрализующего ингибиторную активность PD-1, например, являться индивидом, испытывающим или, согласно прогнозам, с высокой вероятностью характеризующимся (например, на основании одного или более из прогностических факторов) неполноценной реакцией, отсутствием терапевтической реакции, обнаружимым или остаточным раком и/или прогрессирующим заболеванием при (во время или после) лечении с применением агента, нейтрализующего ингибиторную активность PD-1. В одном варианте реализации рак индивида характеризуется отсутствием полноценной реакции, или, согласно прогнозам, характеризуется вероятностью (например, высокой вероятностью) отсутствия полноценной реакции при (во время или после) лечения с применением агента, нейтрализующего ингибиторную активность PD-1. В одном варианте реализации рак индивида прогрессирует (например, прогрессирующее заболевание) при (во время или после) лечения с применением агента, нейтрализующего ингибиторную активность PD-1. В одном варианте реализации рак индивида характеризуется частичной реакцией или стабилизацией (частичная реакция или стабильное заболевание), однако, согласно прогнозам, характеризуется вероятностью прогрессирования при (во время или после) лечения с применением агента, нейтрализующего ингибиторную активность PD-1.

В одном примере индивид имеет рак, который заведомо слабо реагирует на лечение с применением агента, нейтрализующего ингибиторную активность PD-1 (например, при монотерапии). В одном примере индивид имеет рак, заведомо характеризующийся инфильтрацией опухоли NKG2A-экспрессирующими CD8+- или NK-клетками при лечении с применением агента, нейтрализующего ингибиторную активность PD-1 (например, при монотерапии). В одном примере индивид имеет рак, заведомо характеризующийся экспрессией (или повышенной экспрессией) HLA-Е на раковых клетках при лечении с применением агента, нейтрализующего ингибиторную активность PD-1 (например, при монотерапии). Рак необязательно представляет собой плоскоклеточную карциному головы и шеи, немелкоклеточный рак легких (НМРЛ), рак почек, рак желудочно-кишечного тракта, рак поджелудочной железы или аденокарциному пищевода, рак молочной железы, почечноклеточную карциному (RCC), меланому, рак ободочной и прямой кишки или рак яичников. Такого индивида можно успешно лечить с применением агента, нейтрализующего ингибиторную активность NKG2A, в комбинации с агентом, нейтрализующим ингибиторную активность PD-1.

Например, индивид может иметь рак, слабо реагирующий (или устойчивым, или не реагирующим) на лечение, например, рак, рецидивирующий или прогрессирующий, несмотря на (например, во время или после) лечение с применением агента, нейтрализующего ингибиторную активность PD-1. В одном варианте реализации индивид, получавший лечение с применением агента против NKG2A, испытывал неполноценную реакцию (не испытывал полноценной реакции (CR)) при (во время или после) лечении с применением агента, нейтрализующего ингибиторную активность PD-1 (например, в качестве монотерапии или комбинированной терапии с агентом, не являющимся агентом, нейтрализующим NKG2A), или испытывал по меньшей мере частичную реакцию (PR) при (во время или после) лечении с применением агента, нейтрализующего ингибиторную активность PD-1, однако его рак рецидивировал или прогрессировал. В любых вариантах реализации, приведенных в настоящем документе, реакцию на лечение можно определит и/или оценивать в соответствии с общеизвестными критериями, например, критериями оценки реакции в солидных опухолях (Response Evaluation Criteria In Solid Tumors, RECIST), например, версии 1.1, см. Eisenhauer et al. (2009) Eur. J. Cancer 45:228-247, или критериями реакции, связанными с иммунной системой (Immune-Related Response Criteria, irRC), см. Wolchock et al. (2009) Clinical Cancer Research 15:7412-7420.

В одном варианте реализации индивид, слабо реагирующий или имеющий рак, который слабо реагирует на лечение, является индивидом с плохим прогнозом заболевания при лечении с применением агента, нейтрализующего ингибиторную активность PD-1. Индивид с плохим прогнозом заболевания может, например, согласно определению, характеризоваться высоким или повышенным риском прогрессирования рака (например, по сравнению с индивидами с хорошим прогнозом заболевания) на основании одного или более из прогностических факторов. В одном варианте реализации прогностический(е) фактор(ы) включает(ют) присутствие повышенного количества NKG2A-экспрессирующих NK- и/или CD8 Т-клеток и/или повышенного уровня NKG2A на NK- и/или CD8 Т-клетках, что может указывать на плохой прогноз для индивида по отношению к реакции на лечение с применением антитела, нейтрализующего PD-1. В одном варианте реализации прогностический(е) фактор(ы) включает(ют) наличие или отсутствие мутации в одном или более генах. В одном варианте реализации мутация определяет неоэпитоп, распознаваемый Т-клеткой. В одном варианте реализации прогностический(е) фактор(ы) включает(ют) уровень (уровни) экспрессии одного или более генов или белков в опухолевых клетках, например, PD-L1, пониженный или повышенный уровень PD-L1 в опухолевых клетках. В одном варианте реализации прогностический(е) фактор(ы) включает(ют) уровень (уровни) экспрессии одного или более генов или белков в NK- или CD8 Т-клетках в кровотоке или опухолевом окружении, например, PD-1. В одном варианте реализации прогностический(е) фактор(ы) включает(ют) мутационную нагрузку в раковых клетках, например, количество несинонимичных мутаций на экзом.

Схемы и способы лечения, описанные в настоящем документе, можно применять с предварительным этапом обнаружения экспрессии PD-L1 в клетках биологического образца, полученного от индивида (например, биологического образца, содержащего раковые клетки, раковую ткань или ткань, прилегающую к раку), или без такого этапа. В еще одном варианте реализации настоящего изобретения предложен способ лечения или профилактики рака у индивида, нуждающегося в этом, причем указанный способ включает:

a) обнаружение клеток (например, опухолевых клеток, иммунных клеток, инфильтрирующих опухоль, макрофагов, инфильтрирующих опухоль), экспрессирующих PD-L1, в образце, полученном от индивида, и

b) после определения наличия в образце клеток, экспрессирующих PD-L1, необязательно при эталонном уровне, соответствующем индивиду, слабо реагирующему и/или не получающему значительного благоприятного эффекта от агента, нейтрализующего ингибиторную активность PD-1, - введение индивиду агента, нейтрализующего ингибиторную активность NKG2A, необязательно в комбинации с агентом, нейтрализующим ингибиторную активность PD-1. Эталонный уровень PD-L1 может характеризоваться любым подходящим традиционно используемым эталонным уровнем. Например, если 1% или менее, необязательно 5% или менее, необязательно 10% или менее, необязательно 50% или менее опухолевых клеток или клеток из образца опухолевой ткани экспрессируют PD-L1 (например, при использовании анализа на основе иммуногистохимии), можно определить, что данный образец соответствует индивиду, слабо реагирующему и/или не получающему значительного благоприятного эффекта от применения агента, нейтрализующего ингибиторную активность PD-1. Примеры таких анализов включают анализ PD-L1 IHC 22С3 из pharmDx от Dako Denmark A/S. При таком анализе уровень экспрессии PD-L1 измеряют с использованием балльной оценки доли опухоли (TPS) - процентной доли окрашивания опухолевых клеток на предмет PD-L1 (от 0% до 100%). Эталонный уровень необязательно представляет собой невысокий уровень экспрессии PD-L1, при котором необязательно менее 50% опухолевых клеток экспрессируют PD-L1 (например, TPS у пациента составляет менее 50%).

Схемы и способы лечения, описанные в настоящем документе, могут быть полезны при лечении солидных опухолей и гематологических злокачественных заболеваний. Способы и композиции согласно настоящему изобретению применяют, например, для лечения различных раковых заболеваний и других пролиферативных заболеваний, включая: плоскоклеточные раковые опухоли, карциномы, в том числе карциномы мочевого пузыря, молочной железы, толстой кишки, почки, печени, легкого, яичника, головы и шеи, предстательной железы, поджелудочной железы, желудка, шейки матки, щитовидной железы и кожи; гемопоэтические опухоли лимфоидного ростка, в том числе лейкоз, острый лимфоцитарный лейкоз, хронический лимфоцитарный лейкоз, острый лимфобластный лейкоз, В-клеточную лимфому, Т-клеточную лимфому, лимфому Ходжкина, неходжкинскую лимфому, волосатоклеточную лимфому и лимфому Беркитта, а также множественную миелому; гемопоэтические опухоли миелоидного ростка, в том числе острые и хронические миелогенные лейкозы, промиелоцитарный лейкоз и миелодиспластический синдром; опухоли мезенхимального происхождения, в том числе фибросаркому и рабдомиосаркому; другие опухоли, в том числе меланому, семиному, тератокарциному, нейробластому и глиому; опухоли центральной и периферической нервной системы, в том числе астроцитому, нейробластому, глиому и шванномы; опухоли мезенхимального происхождения, в том числе фибросаркому, рабдомиосаркому и остеосаркому; и другие опухоли, в том числе меланому, пигментную ксеродерму, кератоакантому, семиному и фолликулярный рак щитовидной железы.

В одном варианте реализации рак представляет собой плоскоклеточную карциному головы и шеи (HNSCC). В одном варианте реализации HNSCC представляет собой опухоль ротоглотки, опухоль гортани, опухоль ротовой полости или опухоль гортаноглотки. В одном варианте реализации HNSCC представляет собой SCC ротовой полости (OCSCC). OCSCC включает плоскоклеточную карциному губы, передних 2/3 языка, дна ротовой полости, слизистой щеки, десны, твердого неба и ретромолярного треугольника. В одном варианте реализации HNSCC представляет собой метастатический рак.

При лечении индивида с солидной опухолью соединение (например, антитело), нейтрализующее ингибиторную активность полипептида NKG2A человека, можно успешно вводить в соответствии со схемой лечения, описанной в настоящем документе, индивиду, имеющему рак и не подвергавшемуся хирургической операции по удалению раковых клеток или не подвергающемуся такой операции в настоящее время. В то же время следует принимать во внимание, что указанное соединение также можно успешно вводить пациенту, подвергавшемуся или подвергающемуся хирургической операции с целью удаления раковых клеток. При введении соединения против NKG2A индивиду, не подвергавшемуся хирургическому вмешательству по удалению раковых клеток (например, удалению клеток HNSCC), соединение, связывающее NKG2A, можно вводить, например, приблизительно за 1-8 недель до операции. В одном варианте реализации до операции вводят по меньшей мере один (например, один, два, три или более) полный цикл лечения с применением соединения против NKG2A. В одном варианте реализации продолжительность цикла введения составляет от 2 до 8 недель.

Лекарственные средства для лечения рака, слабо реагирующего на лечение PD-1/PD-L1, предложенные в настоящем документе, включают введение нейтрализующего антитела против NKG2A, необязательно в отсутствие или необязательно в комбинации с агентом, нейтрализующим PD-1, например, нейтрализующего антитела против PD-1 или против PD-L1, для лечения субъектов, имеющих рак (например, устойчивые или прогрессирующие солидные или гематологические опухоли на поздней стадии). В одном варианте реализации настоящего изобретения предложено антитело против NKG2A и, необязательно, в комбинации также с антителом против PD-1 для лечения субъектов с солидной опухолью (например, солидной опухолью, устойчивой солидной опухолью на поздней стадии) или субъектов с гематологическим злокачественным заболеванием. В конкретном варианте реализации антитело против NKG2A содержит тяжелую цепь согласно любой из SEQ ID NO: 4-8 и легкую цепь согласно SEQ ID NO: 9. В одном варианте реализации антитело, нейтрализующее ингибиторную активность PD-1, выбрано из группы, состоящей из пембролизумаба, ниволумаба, АМР-514, MEDI-4736, СТ-011 и MPDL3280A.

В настоящем документе дополнительное или комбинированное введение (совместное введение) включает одновременное введение соединений в одинаковой или разной лекарственной форме, или раздельное введение соединений (например, последовательное введение). Так, антитела против NKG2A и антитела против PD-1 или против PD-L1 можно одновременно вводить в едином составе. В качестве альтернативы, антитела против NKG2A и антитела против PD-1 или против PD-L1 могут содержаться в составах для раздельного введения, и их можно вводить одновременно или последовательно.

В одном варианте реализации рак, который лечат способами, описанными в настоящем документе, представляет собой рак, характеризующийся инфильтрацией NK-клетками и/или CD8 Т-клетками, экспрессирующими NKG2A на своей поверхности. В одном варианте реализации рак, который лечат способами, описанными в настоящем документе, представляет собой рак, характеризующийся инфильтрацией NK-клетками, причем по меньшей мере 20%, 30%, 40% или 50% NK-клеток экспрессируют NKG2A на своей поверхности.

В одном варианте реализации рак, который лечат способами, описанными в настоящем документе, представляет собой рак, характеризующийся высоким уровнем HLA-Е. В одном варианте реализации рак выбирают из группы, состоящей из рака легких (например, немелкоклеточного рака легких (НМРЛ)), почечноклеточной карциномы (RCC), меланомы, плоскоклеточной карциномы головы и шеи (HNSCC), рака ободочной и прямой кишки и рака яичников. Следует принимать во внимание, что пациента, имеющего рак, можно лечить с применением агента против NKG2A с предварительным этапом обнаружения в целях оценки экспрессии HLA-Е на поверхности опухолевых клеток или без такого этапа. Преимущество состоит в том, что способы лечения могут включать этап обнаружения нуклеиновой кислоты или полипептида HLA-Е в биологическом образце опухоли (например, опухолевой клетке) индивида. Пример биологических образцов включают любые подходящие биологические жидкости (например, сыворотку крови, лимфу, кровь), образец клеток или образец ткани. Например, образец ткани может представлять собой образец опухолевой ткани или ткани, прилегающей к опухоли. Полипептид HLA-Е необязательно обнаруживают на поверхности злокачественной клетки. Определение наличия экспрессии HLA-Е (например, выраженной экспрессии; высокого уровня экспрессии HLA-Е, высокой интенсивности окрашивания антителом против HLA-Е по сравнению с эталоном) в биологическом образце указывает на наличие у индивида рака, при котором лечение с применением ингибитора NKG2A может обеспечить сильное благоприятное действие. В одном варианте реализации способ включает определение уровня экспрессии нуклеиновой кислоты или полипептида HLA-Е в биологическом образце и сравнение этого уровня с эталонным уровнем (например, значением, слабым окрашиванием поверхности клеток и т.д.), соответствующим здоровому индивиду. Определение того, что биологический образец экспрессирует нуклеиновую кислоту или полипептид HLA-Е на повышенном уровне по сравнению с эталонным уровнем, может указывать на то, что индивид имеет рак, который можно лечить с применением агента, ингибирующего NKG2A.

В одном варианте реализации определение выраженной экспрессии нуклеиновой кислоты или полипептида HLA-Е в биологическом образце (например, образце, содержащем опухолевые клетки, опухолевую ткань и/или ткань, прилегающую к опухоли) указывает на наличие у индивида рака, который можно лечить с применением ингибитора NKG2A. «Выраженная экспрессия» по отношению к полипептиду HLA-Е означает, что полипептид HLA-E экспрессируется в значительном количестве опухолевых клеток, полученных от данного индивида. Хотя определение термина «выраженная экспрессия» не связано с точным процентным значением, в некоторых примерах рецептор, о котором говорят, что он «выраженно экспрессируется», должен присутствовать на по меньшей мере 30%, 40%, 50°%, 60%, 70%, 80%, или более опухолевых клетках, полученных от пациента (в образце).

Определение наличия у индивида раковых клеток, экспрессирующих полипептид HLA-Е может включать, например, получение биологического образца (например, путем выполнения биопсии) от индивида, содержащего раковые клетки, приведение указанных клеток в контакт с антителом, связывающим полипептид HLA-Е, и обнаружение наличия экспрессии HLA-Е на поверхности указанных клеток. Определение наличия раковых клеток, экспрессирующих HLA-Е, у индивида необязательно включает проведение иммуногистохимического анализа. Определение наличия раковых клеток, экспрессирующих HLA-Е, у индивида необязательно включает проведение анализа посредством проточной цитометрии.

В способах лечения при введении антитела против NKG2A в комбинации с антителом против PD-1 или антителом против PD-L1 антитело против NKG2A и антитело против PD-1 или антитело против PD-L1 можно вводить раздельно, вместе или последовательно, или в виде смеси. В некоторых вариантах реализации антитело против NKG2A вводят до введения антител против PD-1 или против PD-L1. Например, антитело против NKG2A можно вводить приблизительно за 0-30 дней до введения антител против PD-1 или против PD-L1. В некоторых вариантах реализации антитело против NKG2A вводят в диапазоне от приблизительно 30 минут до приблизительно 2 недель, от приблизительно 30 минут до приблизительно 1 недели, от приблизительно 1 часа до приблизительно 2 часов, от приблизительно 2 часов до приблизительно 4 часов, от приблизительно 4 часов до приблизительно 6 часов, от приблизительно 6 часов до приблизительно 8 часов, от приблизительно 8 часов до 1 дня, или от приблизительно 1 до 5 дней до введения антител против PD-1 или против PD-L1. В некоторых вариантах реализации антитело против NKG2A вводят одновременно с введением антител против PD-1 или против PD-L1. В некоторых вариантах реализации антитело против NKG2A вводят после введения антител против PD-1 или против PD-L1. Например, антитело против NKG2A можно вводить приблизительно через 0-30 дней после введения антител против PD-1 или против PD-L1. В некоторых вариантах реализации антитело против NKG2A вводят в диапазоне от приблизительно 30 минут до приблизительно 2 недель, от приблизительно 30 минут до приблизительно 1 недели, от приблизительно 1 часа до приблизительно 2 часов, от приблизительно 2 часов до приблизительно 4 часов, от приблизительно 4 часов до приблизительно 6 часов, от приблизительно 6 часов до приблизительно 8 часов, от приблизительно 8 часов до 1 дня, или от приблизительно 1 до 5 дней после введения антител против PD-1 или против PD-L1.

Типичные протоколы лечения человека с применением антитела против NKG2A включают, например, введение пациенту эффективного количества антитела, ингибирующего NKG2A, причем указанный способ включает по меньшей мере один цикл введения, в котором вводят по меньшей мере одну дозу антитела против NKG2A в дозировке 1-10 мг/кг массы тела. В одном варианте реализации продолжительность цикла введения составляет от 2 до 8 недель.

Типичные протоколы лечения человека с применением антитела против NKG2A включают, например, введение пациенту эффективного количества как антитела, ингибирующего NKG2A, так и антитела, нейтрализующего ингибиторную активность PD-1 человека, причем указанный способ включает по меньшей мере один цикл введения, в котором вводят по меньшей мере одну дозу антитела против NKG2A в дозировке 1-10 мг/кг массы тела и по меньшей мере одну дозу антитела против PD-1 или против PD-L1 в дозировке 1-20 мг/кг массы тела. В одном варианте реализации продолжительность цикла введения составляет от 2 до 8 недель.

В одном варианте реализации указанный способ включает по меньшей мере один цикл введения, причем указанный цикл представляет собой период продолжительностью восемь недель или менее, причем в каждом из по меньшей мере одного цикла две, три или четыре дозы антитела против NKG2A вводят в дозировке 1-10 мг/кг массы тела. В одном варианте реализации каждый цикл дополнительно включает введение двух, трех или четырех доз антитела против PD-1 или против PD-L1 в дозировке 1-20 мг/кг массы тела.

Антитело против NKG2A можно предпочтительно вводить в количестве, позволяющем достичь концентрации в кровотоке, по меньшей мере в 10, 20 или 30 раз превышающей концентрацию, необходимую для практически полного (например, 90%, 95%) насыщения рецепторов (например, согласно оценке путем титрования антитела против NKG2A на NKG2A-экспрессирующих клетках, например, МПК), или, необязательно, в количестве, позволяющем достичь концентрации в внесосудистой ткани (например, опухолевой ткани или окружении опухоли), по меньшей мере в 10, 20, или 30 раз превышающей концентрацию, необходимую для практически полного насыщения рецепторов (например, согласно оценке путем титрования антител против NKG2A на NKG2A-экспрессирующих клетках, например, МПК).

Ответ NKG2A+ NK-клеток можно оценить с помощью подходящего анализа цитотоксической активности NKG2A-экспрессирующих NK-клеток по отношению к клеткам-мишеням, экспрессирующим HLA-Е. Примеры включают анализы на основе маркеров активации NK-клеток, например, экспрессии CD107 или CD137. По отношению к ответу NKG2A+ NK-клеток (например, согласно оценке с помощью анализа мобилизации CD107) ЕС₅₀ блокирующего антитела humZ270 против NKG2A, используемого в примерах в настоящем документе (например, содержащего тяжелую цепь согласно любой из SEQ ID NO: 4-8 и легкую цепь согласно SEQ ID NO: 9) составляет приблизительно 4 мкг/мл, а ЕС₁₀₀ - приблизительно 10 мкг/мл. Таким образом, вводимое количество антитела против NKG2A позволяет поддерживать постоянную (минимальную) концентрацию в крови, составляющую по меньшей мере 4 мкг/мл. Предпочтительно, можно ввести такое количество антитела против NKG2A, которое позволяет достичь и/или поддерживать постоянную (минимальную) концентрацию в крови, составляющую по меньшей мере 10 мкг/мл. Например, достигаемая и/или поддерживаемая концентрация в крови может составлять 10-12 мкг/мл, 10-15 мкг/мл, 10-20 мкг/мл, 10-30 мкг/мл, 10-40 мкг/мл, 10-50 мкг/мл, 10-70 мкг/мл, 10-100 мкг/мл, 10-150 мкг/мл или 10-200 мкг/мл. Если мишенями являются внесосудистые ткани (например, при лечении солидных опухолей), вводят количество антитела против NKG2A, позволяющее достичь и/или поддерживать концентрацию в тканях, составляющую по меньшей мере 10 мкг/мл; например, ожидается, что введения количества антитела против NKG2A, позволяющего достичь концентрации в крови, составляющей по меньшей мере 100 мкг/мл, позволит достичь концентрации в ткани, равной по меньшей мере 10 мкг/мл. Например, концентрация в крови, достигаемая и/или поддерживаемая с целью достижения/поддержания концентрации в ткани, составляющей 10 мкг/мл, может составлять 100-110 мкг/мл, 100-120 мкг/мл, 100-130 мкг/мл, 100-140 мкг/мл, 100-150 мкг/мл, 100-200 мкг/мл, 100-250 мкг/мл или 100-300 мкг/мл.

В некоторых вариантах реализации вводят количество антитела против NKG2A, позволяющее получить концентрацию в крови (например, сыворотке), соответствующую по меньшей мере EC₅₀ для ответа NKG2A+ лимфоцитов (например, ответа NKG2A+ NK-клеток), необязательно приблизительно или по меньшей мере приблизительно ЕС₁₀₀. «EC₅₀» (или «ЕС₁₀₀») по отношению к ответу NKG2A+ клеток (например, ответу NK-клеток) относится к эффективной концентрации антитела против NKG2A, обеспечивающей 50% (или 100%, когда речь идет о ЕС₁₀₀) от его максимальной реакции или действия по отношению к такому ответу NKG2A+ клеток (например, ответу NK-клеток). В некоторых вариантах реализации, особенно для лечения солидных опухолей, достигаемая концентрация должна обеспечить концентрацию в тканях (за пределами сосудистого русла, например, в окружении опухоли), соответствующую по меньшей мере EC₅₀ по отношению к ответу NKG2A+ NK-клеток, необязательно приблизительно или по меньшей мере приблизительно ЕС₁₀₀ по отношению к ответу NKG2A+ NK-клеток.

Типичные протоколы лечения с применением антитела против NKG2A, например, humZ270, использованного в разделе «Примеры» настоящего документа и обладающего ЕС₁₀₀ для ответа NKG2A+ NK-клеток, равной приблизительно 10 мкг/мл, включают по меньшей мере один цикл введения, в котором вводят по меньшей мере одну дозу антитела против NKG2A в дозировке 2-10 мг/кг, необязательно 4-10 мг/кг, необязательно 6-10 мг/кг, необязательно 2-6 мг/кг, необязательно 2-8 мг/кг, или необязательно 2-4 мг/кг массы тела. Необязательно вводят по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 доз антитела против NKG2A. В одном варианте реализации продолжительность цикла введения составляет от 2 до 8 недель. В одном варианте реализации продолжительность цикла введения составляет 8 недель. В одном варианте реализации продолжительность цикла введения составляет 8 недель, и он включает введение одной дозы антитела против NKG2A каждые две недели (т.е. в общей сложности четырех доз).

В одном из аспектов любого из вариантов реализации, приведенных в настоящем документе, антитело против NKG2A вводят приблизительно раз в две недели.

Типичные протоколы лечения с применением антитела против NKG2A, в частности, для лечения гемопоэтического злокачественного заболевания, включают, например, введение пациенту антитела против NKG2A два раза в месяц в количестве, обеспечивающем эффективное поддержание постоянной концентрации антитела против NKG2A в крови, равной по меньшей мере 10 мкг/мл, между по меньшей мере двумя последовательными введениями антитела против NKG2A в дозировке 2-10 мг/кг, необязательно 2-6 мг/кг, необязательно 2-8 мг/кг, необязательно 2-4 мг/кг, необязательно 2-6 мг/кг, необязательно 2-4 мг/кг, необязательно приблизительно 4 мг/кг массы тела. Эти дозы при необходимости можно вводить, обеспечивая постоянную концентрацию антитела против NKG2A в крови, составляющую по меньшей мере 10 мкг/мл, на протяжении всего цикла лечения. Достижение концентрации антитела против NKG2A в крови, равной 10 мкг/мл, соответствует ЕС₁₀₀ для такого антитела, как гуманизированное антитело Z270.

Типичные протоколы лечения с применением антитела против NKG2A, в частности, для лечения солидной опухоли, когда желательная концентрация антитела против NKG2A во внесосудистой ткани (например, в опухоли или опухолевом окружении) составляет EC₅₀, включают, например, введение пациенту антитела против NKG2A два раза в месяц в количестве, обеспечивающем эффективное поддержание постоянной концентрации антитела против NKG2A в крови, равной по меньшей мере 40 мкг/мл, между по меньшей мере двумя последовательными введениями антитела против NKG2A в дозировке 2-10 мг/кг, необязательно 2-6 мг/кг, необязательно 2-4 мг/кг, необязательно приблизительно 4 мг/кг массы тела. Эти дозы при необходимости можно вводить, обеспечивая постоянную концентрацию антитела против NKG2A в крови, составляющую по меньшей мере 40 мкг/мл, на протяжении всего цикла лечения. Ожидается, что достижение концентрации антитела против NKG2A в крови, равной 40 мкг/мл, обеспечит концентрацию в ткани (например, внесосудистой ткани, окружении опухоли), составляющей приблизительно 4 мкг/мл, что, в свою очередь, соответствует EC₅₀ для такого антитела, как гуманизированное антитело Z270.

Типичные протоколы лечения с применением антитела против NKG2A, в частности, для лечения солидной опухоли, когда желательная концентрация антитела против NKG2A во внесосудистой ткани (например, в опухоли или опухолевом окружении) составляет EC₅₀, включают, например, введение пациенту эффективного количества антитела против NKG2A, причем антитело вводят 2 раза в месяц в количестве, обеспечивающем эффективное поддержание постоянной концентрации антитела против NKG2A в крови, равной по меньшей мере 100 мкг/мл, между по меньшей мере двумя последовательными введениями антитела против NKG2A в дозировке 4-10 мг/кг, необязательно 4-6 мг/кг, необязательно 4-8 мг/кг, необязательно приблизительно 4 мг/кг, необязательно приблизительно 6 мг/кг, необязательно приблизительно 8 мг/кг или необязательно приблизительно 10 мг/кг. Эти дозы при необходимости можно вводить, обеспечивая постоянную концентрацию антитела против NKG2A в крови, составляющую по меньшей мере 100 мкг/мл, на протяжении всего цикла лечения. Ожидается, что достижение концентрации антитела против NKG2A в крови, равной 100 мкг/мл, обеспечит концентрацию в ткани (например, внесосудистой ткани, окружении опухоли), составляющей приблизительно 10 мкг/мл, что, в свою очередь, соответствует ЕС₁₀₀ для такого антитела, как гуманизированное антитело Z270.

Дополнительные типичные протоколы лечения для применения с антителом против NKG2A включают схемы, использующие нагрузочный период с применением повышенной дозы с последующим поддерживающим периодом. Например, нагрузочный период может включать введение пациенту эффективного количества антитела против NKG2A, причем указанное антитело вводят один или более раз в количестве, позволяющем поддерживать постоянную концентрацию антитела против NKG2A в крови, составляющую по меньшей мере 100 мкг/мл до первого введения антитела против NKG2A в рамках поддерживающей схемы. Например, при однократном приеме можно ввести нагрузочную дозу 10 мг/кг антитела против NKG2A, причем первое введение антитела против NKG2A в период поддерживающей схемы происходит приблизительно через две недели (или менее) после нагрузочной дозы. Затем в рамках поддерживающей схемы можно использовать более низкую дозу или пониженную частоту введения для поддержания непрерывной концентрации антитела против NKG2A в крови, составляющей по меньшей мере 100 мкг/мл, между последовательными введениями в рамках поддерживающей схемы. Например, поддерживающая схема может включать введение антитела против NKG2A каждые две недели в дозе между 2-10 мг/кг, необязательно 4-10 мг/кг, необязательно 2-4 мг/кг, необязательно 4-6 мг/кг, необязательно 4-8 мг/кг, необязательно приблизительно 4 мг/кг, необязательно приблизительно 6 мг/кг, необязательно приблизительно 8 мг/кг.

В некоторых вариантах реализации дозу (например, каждую дозу) антитела против NKG2A вводят в дозировке 4, 6, 8 или 10 мг/кг. В некоторых вариантах реализации дозу (например, каждую дозу) антитела против PD-1 вводят в дозировке 1-20 мг/кг, необязательно 10 мг/кг. В некоторых вариантах реализации дозу (например, каждую дозу) антитела против PD-L1 вводят в дозировке 10, 15, 20 или 25 мг/кг, необязательно в общей дозе 1200 мг/кг. В некоторых вариантах реализации комбинированная терапия позволяет вводить антитело против PD-1 или PD-L1 в пониженной дозе; в одном варианте реализации каждую дозу антитела против PD-1 вводят в дозировке 2 или 3 мг/кг.

В одном варианте реализации антитело против NKG2A и антитело против PD-1 или против PD-L1 вводят в следующих дозах:

(a) 1-10 мг/кг антитела против NKG2A и (i) 1-10 мг/кг антитела против PD-1 или (ii) 1-20 мг/кг антитела против PD-L1;

(b) 4, 6, 8 или 10 мг/кг антитела против NKG2A и 10 мг/кг антитела против PD-1 или против PD-L1;

(c) 4, 6, 8 или 10 мг/кг антитела против NKG2A и 3 мг/кг антитела против PD-1; или (а) 4, 6, 8 или 10 мг/кг антитела против NKG2A и 2 мг/кг антитела против PD-1.

В одном из аспектов любого из вариантов реализации, приведенных в настоящем документе, антитело против NKG2A вводят приблизительно раз в две недели. В одном из аспектов любого из вариантов реализации, приведенных в настоящем документе, антитело против PD-1 или против PD-L1 вводят приблизительно раз в три недели. В одном из аспектов любого из вариантов реализации, приведенных в настоящем документе, антитело против PD-1 или против PD-L1 вводят приблизительно раз в две недели. В одном из аспектов любого из вариантов реализации, приведенных в настоящем документе, антитело против PD-1 или против PD-L1 вводят приблизительно раз в четыре недели.

В одном варианте реализации антитело против PD-1 или против PD-L1 и/ил антитело против NKG2A вводят в/в. В одном варианте реализации антитело против PD-1 или против PD-L1 и/ил антитело против NKG2A вводят в один и тот же день, необязательно в дальнейшем раз в две недели, необязательно в дальнейшем в/в.

В других аспектах предложены способы выявления NKG2A+ PD1+ NK-клеток и/или Т-клеток. Оценку совместной экспрессии NKG2A и PD-1 на NK-клетках и/или Т-клетках можно применять в способах диагностики и прогнозирования. Например, можно получить биологический образец от индивида (например, из рака или ткани, прилегающей к раку, полученной от пациента с раком) и проанализировать его на наличие NKG2A+ PD1+ NK- и/или Т-клеток. Экспрессию как NKG2A, так и PD-1 на таких клетках можно, например, применять для выявления индивидов с NK- и/или Т-клетками, инфильтрирующими опухоль и ингибируемыми полипептидами NKG2A (и, необязательно, также полипептидами PD1). Указанный способ, например, можно применять для прогнозирования реакции на лечение с применением агента, нейтрализующего NKG2A, прогнозирования реакции на лечение с применением агента, нейтрализующего PD1, или прогнозирования реакции на комбинированное лечение с применением агента, нейтрализующего NKG2A, и агента, нейтрализующего PD1.

В одном варианте реализации предложен способ оценки, в котором индивид подходит для лечения с применением агента, ингибирующего NKG2A, и агента, нейтрализующего ингибиторную активность PD-1 человека, причем указанный способ включает обнаружение популяции лимфоцитов (например, CD8+ Т-клеток, NK-клеток), экспрессирующих как нуклеиновую кислоту или полипептид NKG2A, так и нуклеиновую кислоту или полипептид PD-1, в биологическом образце индивида. Определение наличия у индивида популяции лимфоцитов, экспрессирующих как нуклеиновую кислоту или полипептид NKG2A, так и нуклеиновую кислоту или полипептид PD-1, указывает на наличие у индивида рака, который можно лечить с применением ингибитора NKG2A в комбинации с агентом, нейтрализующим ингибиторную активность PD-1 человека.

В других аспектах предложены способы выявления NKG2A+ PD1+ NK-клеток и/или Т-клеток. Данные о том, что эффекторные лимфоциты, инфильтрирующие опухоль, могут экспрессировать оба ингибиторных рецептора NKG2A и PD-1, приводят к появлению усовершенствованных способов лечения, а также способов обнаружения таких дважды ограниченных/ингибированных эффекторных клеток, которые можно применять в диагностических и прогностических целях.

Например, можно получить биологический образец от индивида (например, из рака или ткани, прилегающей к раку, полученной от пациента с раком) и проанализировать его на наличие NKG2A+ PD1+ NK- и/или Т-клеток. Экспрессию NKG2A и PD-1 на таких клетках можно, например, применять для выявления индивидов с NK-и/или Т-клетками, инфильтрирующими опухоль и ингибируемыми полипептидами NKG2A и PD1. Указанный способ, например, можно применять для прогнозирования реакции на лечение с применением агента, нейтрализующего NKG2A, прогнозирования реакции на лечение с применением агента, нейтрализующего PD1, или прогнозирования реакции на комбинированное лечение с применением агента, нейтрализующего NKG2A, и агента, нейтрализующего PD1.

Обнаружение NKG2A- и PD-1-ограниченных NK- и/или CD8 Т-клеток в биологических образцах в более общем случае может обладать преимуществами при применении в целях исследования, оценки, диагностики, прогноза и/или предсказания патологий, где важное значение имеет оценка характеристик NK- и/или CD8 Т-клеток. Например, можно сделать благоприятный или неблагоприятный прогноз рака путем оценки того, характеризуется ли опухоль или ткани, прилегающие к опухоли, проникновением NK- и/или CD8 Т-клеток, экспрессирующих как NKG2A, так и PD-1.

Например, можно исследовать или оценивать рак у пациентов с помощью антител против NKG2A и против PD1 с целью оценки того, являются ли NK- и/или CD8 Т-клетки, инфильтрирующие опухоль, NKG2A+ PD1+, и в том числе, присутствуют ли такие NK- и/или CD8 Т-клетки на периферии опухоли (в ткани, прилегающей к раку). Эти способы можно применять для определения наличия у пациента патологии, характеризующейся NK- и/или CD8 Т-клетками, которые можно было бы модулировать с использованием терапевтических агентов, непосредственно действующих на такие NK- и/или CD8 Т-клетки (например, путем связывания с NKG2A и/или PD-1, и/или их соответствующим лигандам HLA-Е или PD-L1), или косвенно действующих на такие NK- и/или CD8 Т-клетки (например, путем продукции цитокинов или других сигнальных молекул, которые могут модулировать активность NK- или CD8 Т-клеток). В любом варианте реализации пациента необязательно лечат агентом, нейтрализующим PD-1. Способы, описанные в настоящем документе, необязательно могут дополнительно включать введение индивиду такого терапевтического агента, если установлено, что у индивида есть патология, которую можно было бы модулировать с использованием терапевтических агентов, действующих на NK- и/или CD8 Т-клетки, инфильтрирующие опухоль.

В одном аспекте авторы изобретения предлагают способ обнаружения in vitro NKG2A+ PD-1+ лимфоцита, необязательно NK- или CD8+ Т-клетки, причем указанный способ включает получение биологического образца, содержащего лимфоциты, инфильтрирующие опухоль, и определение наличия экспрессии NKG2A и PD-1 лимфоцитами.

В одном варианте реализации предложен способ оценки, в котором индивид подходит для лечения с применением агента, ингибирующего NKG2A (и, необязательно, также агента, нейтрализующего ингибиторную активность PD-1 человека), причем указанный способ включает обнаружение популяции лимфоцитов (например, CD8+ Т-клеток), экспрессирующих как нуклеиновую кислоту или полипептид NKG2A, так и нуклеиновую кислоту или полипептид PD-1, в биологическом образце индивида. Определение наличия у индивида популяции лимфоцитов, экспрессирующих как нуклеиновую кислоту или полипептид NKG2A, так и нуклеиновую кислоту или полипептид PD-1, может указывать на то, что пациент имеет рак, который можно лечить с применением агента, ингибирующего NKG2A, в комбинации с агентом, нейтрализующим ингибиторную активность PD-1 человека.

В других аспектах предложены способы оценки того, характеризуется ли пациент, имеющий рак, слабой реакцией на лечение с применением агента, нейтрализующего PD-1, причем выполняют оценку наличия и/или количества NKG2A+ и/или NKG2A+PD1+ NK-клеток и/или Т-клеток. Оценка экспрессии NKG2A (и/или совместной экспрессии NKG2A и PD-1) может включать, например, получение биологического образца от индивида (например, раковой опухоли или ткани, окружающей раковую опухоль, полученного от пациента, имеющего рак) и анализ образца на предмет наличия NKG2A+ NK- и/или CD8 Т-клеток. Повышенная экспрессия NKG2A (и, необязательно, также PD-1) и/или количества NKG2A+ и/или NKG2A⁺PD-1⁺ клеток может позволить выявить индивидов с NK- и/или Т-клетками, инфильтрирующими опухоль и ингибируемыми как полипептидом NKG2A, так и полипептидом PD1. Повышение экспрессии NKG2A (и, необязательно, также PD-1) и количества таких NKG2A+ и/или NKG2A⁺PD-1⁺-клеток необязательно обнаруживают после введения индивиду агента, нейтрализующего PD-1 (по сравнению, например, с эталонным значением или со значением до лечения с применением агента, нейтрализующего PD-1). Можно определить, что индивид с усиленной или повышенной экспрессией NKG2A (и, необязательно, также PD-1) и/или количества NKG2A+ и/или NKG2A⁺PD-1⁺ клеток характеризуется слабой реакцией на применение агента, нейтрализующего активность PD-1. Указанный способ, например, можно применять для прогнозирования реакции на лечение с применением агента, нейтрализующего NKG2A, прогнозирования реакции на лечение с применением агента, нейтрализующего PD1, или прогнозирования реакции на комбинированное лечение с применением агента, нейтрализующего NKG2A, и агента, нейтрализующего PD1.

В любом из способов, описанных в настоящем документе, обнаружение NKG2A и/или PD1 на Т- и/или NK-клетках может включать обнаружение экспрессии NKG2A и/или PD1 на CD8 Т-клетках и/или NK-клетках человека, инфильтрирующих ткани, причем указанный способ включает получение образца опухоли у индивида (например, образца опухолевой ткани или ткани, прилегающей к опухоли), и обнаружение CD8 Т-клеток и/или NK-клеток, инфильтрирующих ткань, в указанном образце с использованием моноклонального антитела, специфически связывающегося с полипептидом NKG2A человека, и моноклонального антитела, специфически связывающегося с полипептидом PD-1 человека в образцах. В любом варианте реализации пациента необязательно лечат агентом, нейтрализующим PD-1. В одном варианте реализации образец содержит опухолевые клетки, опухолевую ткань или ткань, прилегающую к опухоли. В одном варианте реализации CD8 Т-клетки и/или NK-клетки выявляют с помощью иммуногистохимических способов. В одном варианте реализации образец является образцом, залитым парафином; образец, залитый парафином, необязательно фиксируют, заливают парафином, нарезают, удаляют парафин и переносят на предметное стекло перед введением в контакт с моноклональным антителом. В одном варианте реализации CD8 Т-клетки и/или NK-клетки выявляют с помощью проточно-цитометрических способов.

Примеры

Пример 1 - NK-клетки, экспрессирующие NKG2A, и CD8 Т-клетки, экспрессирующие NKG2A и/или PD-1, инфильтрируют опухолевые клетки RMA-S и А20

Лимфоциты, как правило, не характеризуются совместной экспрессией NKG2A и PD-1. Для изучения экспрессии этих рецепторов на лимфоцитах, инфильтрирующих опухоль, исследовали распределение NKG2A и PD-1 на субпопуляциях NK- и Т-клеток в опухоли мыши. Лимфоциты получали из селезенки, из дренирующих опухоль лимфатических узлов, а также из солидных опухолей.

Мышам C57/BL6 имплантировали (п/к) PDL-1+ Qa-1+ RMA-S-клетки (Qa-1, Qdm, B2m) или опухолевые клетки А20. Мышей с опухолями RMA-S Qa-1 Qdm B2m (верхняя строка) и А20 (нижняя строка) умерщвляли при размере опухолей, составлявшем приблизительно 500 мм³.

Результаты показаны на Фигурах 1А и 1В. Опухолевые клетки (Фигура 1А) и лимфоциты, инфильтрирующие опухоль (TIL) (Фигура 1В), анализировали проточной цитометрией, соответственно, на предмет экспрессии Qa-1 и PDL-1 для опухолевых клеток и NKG2A и PD-1 для TIL. Показана одна из 3 типичных мышей. MFI: медианная интенсивность флуоресценции.

Более половины NK-клеток, инфильтрирующих опухоли обоих типов, экспрессировали NKG2A, что указывает на ингибирование NK-клеток, инфильтрирующих опухоль, за счет NKG2A. NKG2A+ NK-клетки обычно не экспрессируют PD-1 в значительном количестве. Несмотря на это, были обнаружены CD8 Т-клетки, положительные как по отношению к NKG2A, так и к PD-1, что указывает на ограничение CD8 Т-клеток обоими ингибиторными рецепторами NKG2A и PD-1.

Пример 2 - субпопуляции NK- и Т-клеток мышей с опухолями rma-rae1 способны совместно экспрессировать NKG2A и PD-1

Для дальнейшего изучения экспрессии рецепторов NKG2A и PD-1 исследовали распределение NKG2A и PD-1 на субпопуляциях NK- и Т-клеток у мышей. Лимфоциты получали из селезенки, из дренирующих опухоль лимфатических узлов, а также из солидных опухолей.

Мышам C57/BL6 имплантировали (п/к) клон 6 RMA-Rae (2 миллиона клеток). Эти опухолевые клетки экспрессируют лиганд CD94/NKG2A-Qa-1. Мышей умерщвляли на 12 день при среднем объеме опухоли: 723 мм³, СО: 161 мм³, n=4. После получения суспензии клеток селезенки, ЛУ и опухоли клетки окрашивали следующим образом: CD3e PerCP Cy5.5, NKP46 Alexa 647, NKG2A/C/E FITC, PD1 РЕ, CD8 Pacific Blue.

Результаты показаны на Фигуре 2 и в таблицах 1-3.

В субпопуляции NK-клеток клетки в дренирующих лимфатических узлах и селезенке были приблизительно наполовину NKG2A-положительными и наполовину NKG2A-положительным, однако в обоих случаях отсутствовала значимая экспрессия PD1. NK-клетки из лимфатических узлов являлись NKG2A⁺PD-1^- (49,2%) и NKG2A^- PD-1^- (49,5%), и менее 1% (среднее значение) NK-клеток являлись NKG2A⁺ PD-1⁺. NK-клетки из селезенки являлись NKG2A⁺ PD-1⁺ (44,1%) и NKG2A^- PD-1^- (55,7%), и в среднем 0,1% (среднее значение) NK-клеток являлись NKG2A⁺ PD-1⁺.

В субпопуляции Т-клеток большинство клеток являлись NKG2A-отрицательными (лишь 1,1% клеток в лимфатических узлах и 4,7% в селезенке являлись NKG2A⁺), и небольшая фракция клеток являлась PD-1⁺ (3,5% в лимфатических узлах и 10% в селезенке являлись PD-1⁺ NKG2A^-), а количество двойных положительных NKG2A PD-1 клеток было незначительным. Лишь 0,1% (среднее значение) Т-клеток в лимфатических узлах являлись NKG2A⁺ PD-1⁺, и лишь 0,4% (среднее значение) Т-клеток в селезенке являлись NKG2A⁺ PD-1⁺. 95,1% Т-клеток в лимфатических узлах представляли собой двойные отрицательные клетки, и 85,6% Т-клеток в селезенке представляли собой двойные отрицательные клетки.

В субпопуляции CD8 Т-клеток большинство клеток также являлись NKG2A-отрицательными (лишь 1,6% клеток в лимфатических узлах и 3,9% в селезенке являлись NKG2A⁺), и небольшая фракция клеток являлась PD-1⁺ (1,1% в лимфатических узлах и 2,5% в селезенке являлись PD-1⁺ NKG2A^-), а значимое количество двойных положительных NKG2A PD-1 клеток отсутствовало. Лишь 0,2% (среднее значение) Т-клеток в лимфатических узлах являлись NKG2A⁺ PD-1⁺, и лишь 0,3% (среднее значение) Т-клеток в селезенке являлись NKG2A⁺ PD-1⁺. 97,3% Т-клеток в лимфатических узлах представляли собой двойные отрицательные клетки, и 93,6% Т-клеток в селезенке представляли собой двойные отрицательные клетки.

Вместе с тем, во всех субпопуляциях лимфоцитов, инфильтрирующих опухоль (TIL), были клетки, экспрессирующие PD-1. Обнаружено, что NK-клетки, которые ранее не экспрессировали PD-1 на значительном количестве клеток, в опухоли являлись PD-1-положительными, включая субпопуляцию NKG2A⁺, причем 31,8% (среднее значение) NK-клеток являлись NKG2A⁺PD-1⁺. Хотя CD8 Т-клетки с экспрессией NKG2A практически отсутствовали за пределами опухоли, CD8 Т-клетки, экспрессирующие PD-1, часто встречались в опухоли (в субпопуляции CD8 Т-клеток, инфильтрирующих опухоль, в среднем 26,3% клеток являлись NKG2A+ положительными клетками). Кроме того, большинство клеток этой субпопуляции NKG2A-положительных CD8 Т-клеток являлись NKG2A⁺PD-1⁺ (19,4% (среднее значение). Тем не менее, среди субпопуляции CD8^- Т-клеток существовало небольшое различие в экспрессии NKG2A между TIL и клетками селезенки и лимфатических узлов, поскольку лишь 5,1% Т-клеток в опухоли экспрессировали NKG2A, и лишь 3,6% Т-клеток являлись двойными положительными по NKG2A и PD-1.

Пример 3 - экспрессия NKG2A и PD-1 у мышей с опухолями.

Для дальнейшего изучения экспрессии NKG2A и PD-1 у мышей с опухолями мышам C57/BL6 имплантировали (п/к) различные опухолевые клетки линий RMA-Rae1, МС38 или RMA. Для оценки влияния объема опухоли мышей умерщвляли по достижении опухолями объема 500, 2000 и 800 мм³, соответственно.

Результаты показаны на Фигурах 3А и 3В для опухолей RMA Rae1 (верхняя строка), МС38 (средняя строка) и RMA (нижняя строка). NK-клетки (Фигура 3А) и CD8 Т-клетки (Фигура 3В) селезенки, дренирующих опухоль лимфатических узлов (ЛУ) и опухоли анализировали проточной цитометрией на предмет экспрессии NKG2A и PD-1. Показана одна из 2-4 типичных мышей.

В субпопуляции NK-клеток клетки в опухоли, лимфатических узлах и селезенке были приблизительно наполовину NKG2A-положительными и наполовину NKG2A-отрицательными. NK-клетки (независимо от экспрессии ими NKG2A) из дренирующих лимфатических узлов или селезенки не демонстрировали значимой экспрессии PD1. Однако NK-клетки, инфильтрирующие опухоли RMA-Rae1 и RMA, экспрессировали NKG2A и PD1 на значимых уровнях. NK клетки, инфильтрирующие опухоль линии МС38 у мышей, умерщвленных при особенно большом объеме опухоли (2000 мм³), экспрессировали NKG2A (50%), но не экспрессировали PD1 в значимой степени (3%).

В отличие от NK-клеток, приблизительно половина популяции которых экспрессировала NKG2A, CD8 Т-клетки селезенки и лимфатических узлов обычно не экспрессировали ни NKG2A, ни PD1. Однако в опухолях значительная доля CD8 Т-клеток экспрессировала NKG2A и PD1 (28% в RMA-Rae1, 43% в МС38 и 40% в RMA являлись дважды положительными). Эти результаты повторно указывают, что CD8 Т-клетки, так же как и NK-клетки, инфильтрирующие опухоли, могут быть ограничены как ингибиторным рецептором NKG2A, так и PD1 в опухолевых клетках различного типа.

Пример 4 - Повышенное количество NKG2A-экспрессирующих CD8 Т-клеток, инфильтрующих опухоль, у мышей, устойчивых к лечению с применением PD-1

Для оценки воздействия лечения антителом против PD-1 на CD8 Т-клетки мышей с опухолями МС38 обрабатывали с использованием 200 мкг изотипического контрольного (IC) IgG2a крысы или нейтрализующего моноклонального антитела против PD-1 мыши на 11, 14 и 17 сутки после имплантации клеток. Мышей (n=3/группу) умерщвляли на 31 сутки, характеристики CD8 Т-клеток из селезенки, дренирующих опухоль лимфатических узлов (ЛУ) и опухоли исследовали с помощью проточной цитометрии. Представлены средние значения +/- SD (n=3) доли CD8 NKG2A+ среди CD8 Т-клеток. Р<0,005 (***), Р<0,0005 (****), статистический анализ выполняли с использованием двухфакторного дисперсионного анализа, а затем - критерия множественных сравнений Тьюки.

Результаты показаны на Фигуре 4. Аналогично результатам, наблюдавшимся в других экспериментах, CD8 Т-клетки из селезенки и лимфатических узлов не экспрессировали NKG2A в значимой степени. Введение антитела против PD1 не вызвало изменений уровня экспрессии NKG2A в Т-клетках из селезенки или лимфатических узлов. Однако в популяции CD8 Т-клеток, инфильтрирующих опухоли, введение антитела против PD1 вызвало более чем 50% увеличение NKG2A-экспрессирующих CD8 Т-клеток. Эти результаты указывают, что у мышей, не реагирующих на лечение, имело место значительное увеличение количества CD8 Т-клеток, экспрессирующих NKG2A, по сравнению с мышами, получавшими изотипическое контрольное мАт. Следовательно, рецептор NKG2A может вносить повышенный вклад в ингибирование CD8 Т-клеточного ответа по отношению к опухолям у индивидов, характеризующихся слабой реакцией на антитело против PD1. Поэтому нейтрализацию NKG2A можно использовать для купирования ингибирования NKG2A-ограниченных Т-клеток у индивидов, получавших агент, нейтрализующий путь PD-1, например, антитело против PD1 или PDL1.

Пример 5 - комбинированная блокада с использованием антитела против NKG2A/антитела против PD1 ингибирует опухолевый рост

Для оценки эффекта комбинированного лечения нейтрализующим антителом против PD1 и нейтрализующим антителом против NKG2A мышам C57BL/6 имплантировали (п/к) опухолевые клетки RMA-S Qa-1 Qdm B2m и вводили нейтрализующий антагонист PD1 (нейтрализующее антитело против PD-L1) и нейтрализующее антитело против NKG2A.

Вкратце, мышей C57BL/6 рандомизировали на 11 сутки по достижении опухолями RMA-S Qa-1 Qdm B2m объема приблизительно 85 мм³ (n=8 мышей/группу) и лечили изотипическим контрольным антителом, мАт против NKG2A мыши (200 мкг, в/в), мАт против PD-L1 мыши (200 мкг, в/б) или комбинацией антител против mNKG2A/mPDL-1 на 11, 14 и 18 сутки. Объем опухоли измеряли два раза в неделю, мышей умерщвляли по достижении опухолями большого размера (объема >2000 мм³), изъязвлении или некрозе опухолей, и выполняли оценку характеристик NK- и CD8 Т-клеток проточной цитометрией.

Рост медианного объема опухоли со временем показан на Фигуре 5. В то время как антитело против NKG2A обеспечивало лишь скромный противоопухолевый эффект по сравнению с изотипическим контролем в данной модели, а антитело против PD-L1 обеспечивало существенный противоопухолевый эффект, однако объем опухоли рос до 28 суток, комбинированное лечение с использованием антитела против NKG2A и антитела против PD-L1 полностью прекращала опухолевый рост, и на 28 сутки значимого роста объема опухоли не наблюдали.

Пример 6 - Модель PD-1/-L1-устойчивого рака in vivo

Линия клеток А20 представляет собой линию В-клеточной лимфомы, экспрессирующую PD-L1, но не Qa-1^b. При подкожной инъекции мышам Balb/c А20 образовывали солидные опухоли, в которых сохранялась экспрессия PD-L1 и в которых индуцировали экспрессию Qa-1^b. Рост опухолей А20 контролировался NK- и CD8 Т-клетками.

Для оценки влияния комбинированного лечения с применением нейтрализующего антитела против PD1 или нейтрализующего антитела против PDL1, мышам Balb/c (самкам в возрасте 8-10 недель) имплантировали (п/к) клетки опухоли А20 (1×10⁶ клеток), и лечили мышей с применением изотипического контроля (IC) или нейтрализующего антитела против PD-1 мыши или нейтрализующего антитела против PD-L1 мыши (200 мкг антитела против PD1 или антитела против PD-L1, в/б, в 13, 17 и 20 дни). Объем опухоли измеряли два раза в неделю, мышей умерщвляли по достижении опухолями большого размера (объема >2000 мм³), изъязвлении или некрозе опухолей, и выполняли оценку характеристик NK- и CD8 Т-клеток проточной цитометрией.

Изменение объема отдельных опухолей со временем показан на Фигуре 6. Ни антитела против PD-L1, ни антитела против PD-1 не позволили получить значимого противоопухолевого эффекта. Среди 9 мышей, получавших изотипический контроль (IC), не наблюдали ни частичного регресса, ни временного полного регресса, ни полного регресса. Ни у одной из 9 мышей, получавших антитело против PD-1, не наблюдали ни частичного регресса, ни временного полного регресса, и у 2 мышей имел место полный регресс. Среди 10 мышей, получавших антитело против PD-L1, не наблюдали ни частичного регресса, ни временного полного регресса, и у 2 мышей имел место полный регресс.

Несмотря на высокий уровень экспрессии PD-1 на многих инфильтрирующих иммунных клетках и высокий уровень экспрессии PD-L1 на опухолевых клетках, монотерапия с применением мАт против PD-1 или против PD-L1 приводила к лишь умеренному снижению опухолевого роста. Примечательно, что более 50% NK-клеток и приблизительно 10% CD8 Т-клеток, инфильтрирующих опухоль А20, экспрессировали CD94/NKG2A. Популяция NKG2A⁺ CD8 Т-клеток также совместно экспрессировала PD-1. Экспрессию Qa-1^b индуцировали не только на поверхности опухолевых клеток, но и на иммунных клетках, осуществляющих инфильтрацию in vivo.

Пример 7 - Антитело против NKG2A и антитело против PD1 приводили к полному регрессу опухолей в PD-1/-L1-устойчивых опухолях А20

Поскольку клетки опухоли А20 совместно экспрессировали как PD-L1, так и Qa-1^b, мышей с опухолями А20, получавших нейтрализующее антитело против PD-1 (см. пример 6), дополнительно лечили с применением нейтрализующего антитела против NKG2A.

Мышам Balb/c (самкам в возрасте 8-10 недель) имплантировали (п/к) клетки опухоли А20 (1×10⁶ клеток) и лечили мышей с применением изотипического контроля (IC), нейтрализующего антитела против PD-1 мыши или антитела против PD-1 и нейтрализующего антитела против NKG2A (200 мкг, в/б, в 10, 13 и 17 дни). Объем опухоли измеряли два раза в неделю с помощью штангенциркуля. Животных умерщвляли при достижении опухолями значительного размера (объем >2000 мм³), изъязвлении или некрозе опухоли. Данные представляли собой объем отдельных опухолей на эксперимент.

Изменение объема отдельных опухолей со временем показан на Фигуре 7. Аналогично данным, наблюдавшимся в примере 6, опухоли были устойчивы к антителам против PD-1 или изотипическому контролю (IC). Среди 10 мышей, получавших изотипический контроль (IC), не наблюдали частичного регресса, наблюдали один случай временного полного регресса и один случай полного регресса, в то время как при применении только антитела против NKG2A наблюдали один случай частичного регресса, один случай полного регресса и не наблюдали временного полного регресса. Ни у одной из 9 мышей, получавших антитело против PD-1, не наблюдали частичного регресса, наблюдали 1 случай временного полного регресса и 3 случая полного регресса. Однако среди 10 мышей, получавших лечение с добавлением антитела против NKG2A (отмеченного как «Комбинация» на Фигуре 7), наблюдали 7 случаев полного регресса (при отсутствии частичного регресса или временного полного регресса). Следовательно, антитело против NKG2A обладает перспективным терапевтическим потенциалом при лечении видов рака, устойчивых к лечению с применением антител против PD-1 или против PD-L1.

Пример 8 - Антитело против NKG2A и антитело против PD-L1 приводили к полному регрессу опухолей в опухолях А20, устойчивых к антителам против PD1/-L1

Мышам Balb/c (самкам, в возрасте 8 недель, n=11/группу) подкожно имплантировали клетки опухоли А20 (5×10⁶ клеток), и в 11 день (объем опухоли приблизительно 50 мм³) мышей рандомизировали и лечили с применением изотипического контроля (IC), нейтрализующего антитела против PD-L1 (50 мкг, в/б, в 11, 14, 18, 21, 25, 28 дни), блокирующего мАт против NKG2A (200 мкг, в/в, в 11, 14 и 18 дни) или комбинации обоих мАт. Объем опухоли измеряли два раза в неделю с помощью штангенциркуля. Эвтаназию животных выполняли по достижении опухолями объема более 2000 мм3, изъязвлении или некрозе опухолей. Данные представляли собой кривую отдельной опухоли. PR: частичный регресс, CR: полный регресс

Изменение объема отдельных опухолей со временем показан на Фигуре 8. Аналогично данным, наблюдавшимся в примере 6, опухоли были устойчивы к антителам против PD-L1 или изотипическому контролю (IC). Среди 11 мышей, получавших изотипический контроль (IC), не наблюдали частичного регресса и наблюдали два случая полного регресса (18%), в то время как при применении только антитела против NKG2A наблюдали четыре случая полного регресса. Ни у одной из 11 мышей, получавших антитело против PD-L1, не наблюдали частичного регресса, но наблюдали 6 случаев полного регресса. Однако среди 11 мышей, получавших лечение с добавлением антитела против NKG2A, наблюдали 9 случаев полного регресса. Эти результаты показывают, что антитело против NKG2A обладает перспективным терапевтическим потенциалом при лечении видов рака, устойчивых к лечению с применением антител против PD-L1.

Все источники, включая публикации, патентные заявки и патенты, приведенные в настоящем документе, полностью включены в настоящий документ посредством ссылок в той же степени, как если каждый источник был отдельно и конкретно указан для включения посредством ссылки и был изложен в полном объеме в настоящем документе (в максимальной степени, разрешенной законом), независимо от любого отдельно взятого включения в настоящий документ конкретных документов, независимо от места их подготовки.

Термины, относящиеся к единственному числу, и аналогичные термины, используемые в контексте описания настоящего изобретения, должны толковаться как охватывающие как единственное, так и множественное число, если в настоящем документе не указано иное, или если это не противоречит контексту явным образом.

Если не указано иное, все точные значения, представленные в настоящем документе, являются типичными примерами соответствующих приближенных значений (например, все точные типичные значения конкретного фактора или измерения можно считать также относящимися к соответствующему приблизительному измерению при добавлении слова «приблизительно» в соответствующих случаях). Там, где термин «приблизительно» используется в связи с численным значением, можно указать, что этот термин включает значения, соответствующие ±10% от указанного числа.

Приведенное в настоящем документе описание любого аспекта или варианта реализации настоящего изобретения с использованием таких терминов, как «содержащий», «обладающий», «включающий» по отношению к элементу или элементом, предназначено для подтверждения подобного аспекта или варианта реализации изобретения, который «состоит из», «главным образом состоит из» или «главным образом содержит» данный конкретный элемент или элементы, если не указано иное или иное не противоречит контексту явным образом (например, если в настоящем документе описано, что композиция содержит определенный элемент, следует понимать, что это также относится к композиции, состоящей из этого элемента, если не указано иное или иное не противоречит контексту явным образом).

Использование всевозможных примеров или типичных выражений (например, выражения «такой как») в настоящем документе предназначено только для лучшего освещения изобретения и не накладывает ограничений на область изобретения, если в формуле изобретения не указано иное. Ни одно выражение в описании не следует рассматривать в качестве обозначения элемента, не предусмотренного формулой изобретения и необходимого для осуществления изобретения.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> INNATE PHARMA

<120> НЕЙТРАЛИЗАЦИЯ ИНГИБИТОРНЫХ ПУТЕЙ В ЛИМФОЦИТАХ

<130> NKG2A-PD1b

<150> US 62/281,217

<151> 21.01.2016

<160> 15

<170> Версия PatentIn 3.5

<210> 1

<211> 233

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 1

Met Asp Asn Gln Gly Val Ile Tyr Ser Asp Leu Asn Leu Pro Pro Asn

1 5 10 15

Pro Lys Arg Gln Gln Arg Lys Pro Lys Gly Asn Lys Ser Ser Ile Leu

20 25 30

Ala Thr Glu Gln Glu Ile Thr Tyr Ala Glu Leu Asn Leu Gln Lys Ala

35 40 45

Ser Gln Asp Phe Gln Gly Asn Asp Lys Thr Tyr His Cys Lys Asp Leu

50 55 60

Pro Ser Ala Pro Glu Lys Leu Ile Val Gly Ile Leu Gly Ile Ile Cys

65 70 75 80

Leu Ile Leu Met Ala Ser Val Val Thr Ile Val Val Ile Pro Ser Thr

85 90 95

Leu Ile Gln Arg His Asn Asn Ser Ser Leu Asn Thr Arg Thr Gln Lys

100 105 110

Ala Arg His Cys Gly His Cys Pro Glu Glu Trp Ile Thr Tyr Ser Asn

115 120 125

Ser Cys Tyr Tyr Ile Gly Lys Glu Arg Arg Thr Trp Glu Glu Ser Leu

130 135 140

Leu Ala Cys Thr Ser Lys Asn Ser Ser Leu Leu Ser Ile Asp Asn Glu

145 150 155 160

Glu Glu Met Lys Phe Leu Ser Ile Ile Ser Pro Ser Ser Trp Ile Gly

165 170 175

Val Phe Arg Asn Ser Ser His His Pro Trp Val Thr Met Asn Gly Leu

180 185 190

Ala Phe Lys His Glu Ile Lys Asp Ser Asp Asn Ala Glu Leu Asn Cys

195 200 205

Ala Val Leu Gln Val Asn Arg Leu Lys Ser Ala Gln Cys Gly Ser Ser

210 215 220

Ile Ile Tyr His Cys Lys His Lys Leu

225 230

<210> 2

<211> 288

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 2

Met Gln Ile Pro Gln Ala Pro Trp Pro Val Val Trp Ala Val Leu Gln

1 5 10 15

Leu Gly Trp Arg Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp

20 25 30

Asn Pro Pro Thr Phe Phe Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp

35 40 45

Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val

50 55 60

Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala

65 70 75 80

Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg

85 90 95

Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg

100 105 110

Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu

115 120 125

Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val

130 135 140

Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro

145 150 155 160

Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln Thr Leu Val Val Gly Val Val Gly Gly

165 170 175

Leu Leu Gly Ser Leu Val Leu Leu Val Trp Val Leu Ala Val Ile Cys

180 185 190

Ser Arg Ala Ala Arg Gly Thr Ile Gly Ala Arg Arg Thr Gly Gln Pro

195 200 205

Leu Lys Glu Asp Pro Ser Ala Val Pro Val Phe Ser Val Asp Tyr Gly

210 215 220

Glu Leu Asp Phe Gln Trp Arg Glu Lys Thr Pro Glu Pro Pro Val Pro

225 230 235 240

Cys Val Pro Glu Gln Thr Glu Tyr Ala Thr Ile Val Phe Pro Ser Gly

245 250 255

Met Gly Thr Ser Ser Pro Ala Arg Arg Gly Ser Ala Asp Gly Pro Arg

260 265 270

Ser Ala Gln Pro Leu Arg Pro Glu Asp Gly His Cys Ser Trp Pro Leu

275 280 285

<210> 3

<211> 290

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 3

Met Arg Ile Phe Ala Val Phe Ile Phe Met Thr Tyr Trp His Leu Leu

1 5 10 15

Asn Ala Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr

20 25 30

Gly Ser Asn Met Thr Ile Glu Cys Lys Phe Pro Val Glu Lys Gln Leu

35 40 45

Asp Leu Ala Ala Leu Ile Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp Lys Asn Ile

50 55 60

Ile Gln Phe Val His Gly Glu Glu Asp Leu Lys Val Gln His Ser Ser

65 70 75 80

Tyr Arg Gln Arg Ala Arg Leu Leu Lys Asp Gln Leu Ser Leu Gly Asn

85 90 95

Ala Ala Leu Gln Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr

100 105 110

Arg Cys Met Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile Thr Val

115 120 125

Lys Val Asn Ala Pro Tyr Asn Lys Ile Asn Gln Arg Ile Leu Val Val

130 135 140

Asp Pro Val Thr Ser Glu His Glu Leu Thr Cys Gln Ala Glu Gly Tyr

145 150 155 160

Pro Lys Ala Glu Val Ile Trp Thr Ser Ser Asp His Gln Val Leu Ser

165 170 175

Gly Lys Thr Thr Thr Thr Asn Ser Lys Arg Glu Glu Lys Leu Phe Asn

180 185 190

Val Thr Ser Thr Leu Arg Ile Asn Thr Thr Thr Asn Glu Ile Phe Tyr

195 200 205

Cys Thr Phe Arg Arg Leu Asp Pro Glu Glu Asn His Thr Ala Glu Leu

210 215 220

Val Ile Pro Glu Leu Pro Leu Ala His Pro Pro Asn Glu Arg Thr His

225 230 235 240

Leu Val Ile Leu Gly Ala Ile Leu Leu Cys Leu Gly Val Ala Leu Thr

245 250 255

Phe Ile Phe Arg Leu Arg Lys Gly Arg Met Met Asp Val Lys Lys Cys

260 265 270

Gly Ile Gln Asp Thr Asn Ser Lys Lys Gln Ser Asp Thr His Leu Glu

275 280 285

Glu Thr

290

<210> 4

<211> 452

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Химерная последовательность человек/мышь

<400> 4

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Ser Pro Ser Phe

50 55 60

Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Tyr Asp Phe Asp Val Gly Thr Leu Tyr Trp Phe Phe

100 105 110

Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr

115 120 125

Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser

130 135 140

Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu

145 150 155 160

Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His

165 170 175

Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser

180 185 190

Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys

195 200 205

Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu

210 215 220

Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu

225 230 235 240

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

245 250 255

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

260 265 270

Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

275 280 285

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr

290 295 300

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

305 310 315 320

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser

325 330 335

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

340 345 350

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val

355 360 365

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

370 375 380

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

385 390 395 400

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr

405 410 415

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

420 425 430

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

435 440 445

Ser Leu Gly Lys

450

<210> 5

<211> 452

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Химерная последовательность человек/мышь

<400> 5

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Ala Gln Lys Leu

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Tyr Asp Phe Asp Val Gly Thr Leu Tyr Trp Phe Phe

100 105 110

Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr

115 120 125

Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser

130 135 140

Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu

145 150 155 160

Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His

165 170 175

Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser

180 185 190

Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys

195 200 205

Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu

210 215 220

Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu

225 230 235 240

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

245 250 255

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

260 265 270

Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

275 280 285

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr

290 295 300

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

305 310 315 320

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser

325 330 335

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

340 345 350

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val

355 360 365

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

370 375 380

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

385 390 395 400

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr

405 410 415

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

420 425 430

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

435 440 445

Ser Leu Gly Lys

450

<210> 6

<211> 452

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Химерная последовательность человек/мышь

<400> 6

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Ser Pro Ser Phe

50 55 60

Gln Gly His Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Tyr Asp Phe Asp Val Gly Thr Leu Tyr Trp Phe Phe

100 105 110

Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr

115 120 125

Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser

130 135 140

Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu

145 150 155 160

Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His

165 170 175

Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser

180 185 190

Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys

195 200 205

Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu

210 215 220

Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu

225 230 235 240

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

245 250 255

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

260 265 270

Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

275 280 285

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr

290 295 300

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

305 310 315 320

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser

325 330 335

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

340 345 350

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val

355 360 365

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

370 375 380

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

385 390 395 400

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr

405 410 415

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

420 425 430

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

435 440 445

Ser Leu Gly Lys

450

<210> 7

<211> 452

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Химерная последовательность человек/мышь

<400> 7

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Gln Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Ala Glu Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Thr Gly Gly Tyr Asp Phe Asp Val Gly Thr Leu Tyr Trp Phe Phe

100 105 110

Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr

115 120 125

Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser

130 135 140

Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu

145 150 155 160

Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His

165 170 175

Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser

180 185 190

Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys

195 200 205

Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu

210 215 220

Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu

225 230 235 240

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

245 250 255

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

260 265 270

Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

275 280 285

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr

290 295 300

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

305 310 315 320

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser

325 330 335

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

340 345 350

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val

355 360 365

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

370 375 380

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

385 390 395 400

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr

405 410 415

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

420 425 430

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

435 440 445

Ser Leu Gly Lys

450

<210> 8

<211> 452

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Химерная последовательность человек/мышь

<400> 8

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Tyr Asp Phe Asp Val Gly Thr Leu Tyr Trp Phe Phe

100 105 110

Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr

115 120 125

Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser

130 135 140

Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu

145 150 155 160

Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His

165 170 175

Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser

180 185 190

Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys

195 200 205

Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu

210 215 220

Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu

225 230 235 240

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

245 250 255

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

260 265 270

Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

275 280 285

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr

290 295 300

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

305 310 315 320

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser

325 330 335

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

340 345 350

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val

355 360 365

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

370 375 380

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

385 390 395 400

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr

405 410 415

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

420 425 430

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

435 440 445

Ser Leu Gly Lys

450

<210> 9

<211> 214

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Химерная последовательность человек/мышь

<400> 9

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Gly Thr Pro Arg

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 10

<211> 119

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Химерная последовательность человек/мышь

<400> 10

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Glu Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val

50 55 60

Thr Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Glu Ile Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg His Gly Asp Tyr Pro Arg Phe Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly

100 105 110

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 11

<211> 107

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Химерная последовательность человек/мышь

<400> 11

Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Leu Met Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile

20 25 30

Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Arg Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr

35 40 45

Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Gly Asn Pro Tyr Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 12

<211> 432

<212> БЕЛОК

<213> homo sapiens

<400> 12

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Trp Gln Pro Gly Arg Ser

1 5 10 15

Leu Arg Leu Asp Cys Lys Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Asn Ser Gly

20 25 30

Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala

35 40 45

Val Arg Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

100 105 110

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

115 120 125

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Asp Tyr Phe

130 135 140

Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly

145 150 155 160

Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu

165 170 175

Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Thr Tyr Thr

180 185 190

Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Arg Val Glu

195 200 205

Ser Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly

210 215 220

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

225 230 235 240

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Trp Val Asp Val Ser Gln Glu

245 250 255

Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Tyr Asp Gly Val Glu Val His

260 265 270

Asn Ala Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val

275 280 285

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

290 295 300

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys

305 310 315 320

Thr Ile Ser Lys Ala Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

325 330 335

Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

340 345 350

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

355 360 365

Asn Gly Gln Pro Glu Lys Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

370 375 380

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser

385 390 395 400

Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

405 410 415

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

420 425 430

<210> 13

<211> 207

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 13

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr

35 40 45

Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu

65 70 75 80

Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ser Asn Trp Pro Arg Thr

85 90 95

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser

100 105 110

Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Ser Gly Thr Ala Ser

115 120 125

Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Val Gln Trp

130 135 140

Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr

145 150 155 160

Glu Gln Asp Ser Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Leu Ser

165 170 175

Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His

180 185 190

Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

195 200 205

<210> 14

<211> 117

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 14

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser

20 25 30

Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 15

<211> 107

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 15

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr

35 40 45

Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu

65 70 75 80

Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala Thr

85 90 95

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105

<---

1. Применение антитела, нейтрализующего ингибиторную активность NKG2A человека, содержащего CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи, имеющие последовательности, заданные в любой из последовательностей SEQ ID NO: 4-8, и CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи, имеющие последовательности, заданные в последовательности SEQ ID NO: 9, при лечении рака, экспрессирующего PD-L1, у индивида-человека, испытывающего или, согласно прогнозам, имеющего высокую вероятность неполноценной реакции, отсутствия терапевтической реакции, обнаружимого или остаточного рака и/или прогрессирующего заболевания при (во время или после) лечении антителом, которое нейтрализует ингибиторную активность PD-1 человека.

2. Применение по п.1, отличающееся тем, что у указанного индивида повышено количество NKG2A-экспрессирующих NK- и/или CD8 T-клеток.

3. Применение по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что у указанного индивида повышен уровень экспрессии полипептида NKG2A в NK- и/или CD8 T-клетках.

4. Применение по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что указанное антитело, которое нейтрализует ингибиторную активность NKG2A человека, представляет собой антитело, связывающее NKG2A и препятствующее связыванию NKG2A HLA-E.

5. Применение по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что указанное антитело, которое нейтрализует ингибиторную активность NKG2A человека, вводят в комбинации с антителом, которое нейтрализует ингибиторную активность PD-1.

6. Применение по п. 5, отличающееся тем, что указанное антитело, которое нейтрализует ингибиторную активность NKG2A человека, и указанное антитело, которое нейтрализует ингибиторную активность PD-1, представлены в форме для раздельного введения и указанные антитела вводят одновременно или последовательно.

7. Применение по п. 5, отличающееся тем, что указанное антитело, которое нейтрализует ингибиторную активность NKG2A человека, и указанное антитело, которое нейтрализует ингибиторную активность PD-1, представлены в форме для одновременного введения в виде единого состава.

8. Применение по любому из пп. 4-7, отличающееся тем, что указанное антитело, которое нейтрализует ингибиторную активность NKG2A человека, вводят после по меньшей мере одного введения антитела, которое нейтрализует ингибиторную активность PD-1, необязательно после по меньшей мере одного цикла лечения антителом, которое нейтрализует ингибиторную активность PD-1.

9. Применение по любому из предшествующих пунктов, при котором определяют, что у указанного индивида повышено количество NKG2A-экспрессирующих NK- и/или CD8 Т-клеток после по меньшей мере одного введения антитела, которое нейтрализует ингибиторную активность PD-1, необязательно после по меньшей мере одного цикла лечения антителом, которое нейтрализует ингибиторную активность PD-1.

10. Применение по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что указанный рак представляет собой солидную опухоль.

11. Применение по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что указанный рак выбран из группы, состоящей из рака легкого, почечноклеточной карциномы (RCC), меланомы, рака ободочной и прямой кишки и рака яичника.

12. Применение по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что указанный рак представляет собой плоскоклеточную карциному головы и шеи.

13. Применение по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что антитело, которое нейтрализует ингибиторную активность PD-1, представляет собой антитело, связывающее полипептид PD-1.

14. Применение по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что антитело, которое нейтрализует ингибиторную активность PD-1, представляет собой антитело, связывающее полипептид PD-L1.

15. Применение по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что указанное антитело представляет собой химерное антитело, антитело человека или гуманизированное антитело.

16. Применение по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что указанное антитело, которое нейтрализует ингибиторную активность NKG2A, представляет собой неистощающее антитело.

17. Применение по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что указанное антитело, которое нейтрализует ингибиторную активность PD-1, представляет собой неистощающее антитело.

18. Применение по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что указанное антитело представляет собой антитело типа IgG4.

19. Применение по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что указанное антитело не содержит Fc-домен или содержит Fc-домен, модифицированный для ослабления связывания между Fc-доменом и Fcγ-рецептором.

20. Применение по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что указанное антитело представляет собой фрагмент антитела.

21. Применение по п. 20, отличающееся тем, что указанный фрагмент антитела выбран из Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab') 2, Fv, диатела, фрагмента одноцепочечного антитела или полиспецифического антитела, содержащего несколько различных фрагментов антител.

22. Применение по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что указанное антитело, которое нейтрализует ингибиторную активность NKG2A, вводят указанному индивиду в количестве, которое эффективно нейтрализует ингибиторную активность NKG2A в NK- и/или CD8 Т-клетках.

23. Способ идентификации индивида, испытывающего или, согласно прогнозам, имеющего высокую вероятность неполноценной реакции, отсутствия терапевтической реакции, обнаружимого или остаточного рака и/или прогрессирующего заболевания при (во время или после) лечении антителом, нейтрализующим ингибиторную активность PD-1 человека, при этом указанный способ включает:

a) определение уровня экспрессии NKG2A на NK- и/или CD8 T-клетках и/или количества NKG2A-экспрессирующих NK- и/или CD8 T-клеток у указанного индивида, получавшего лечение антителом, которое нейтрализует ингибиторную активность PD-1 человека; и

b) после определения наличия у индивида повышенного уровня экспрессии NKG2A на NK- и/или CD8 T-клетках и/или повышенного количества NKG2A-экспрессирующих NK- и/или CD8 T-клеток указанного индивида идентифицируют как испытывающего или, согласно прогнозам, имеющего высокую вероятность неполноценной реакции, отсутствия терапевтической реакции, обнаружимого или остаточного рака и/или прогрессирующего заболевания при (во время или после) лечении антителом, которое нейтрализует ингибиторную активность PD-1 человека.

24. Способ лечения рака, экспрессирующего PD-L1, у индивида-человека, испытывающего или, согласно прогнозам, имеющего высокую вероятность неполноценной реакции, отсутствия терапевтической реакции, обнаружимого или остаточного рака и/или прогрессирующего заболевания при (во время или после) лечении антителом, нейтрализующим ингибиторную активность PD-1, причем указанный способ включает:

a) определение уровня экспрессии NKG2A в NK- и/или CD8 T-клетках и/или количества NKG2A-экспрессирующих NK- и/или CD8 T-клеток у указанного индивида; и

b) после определения наличия повышенного уровня экспрессии NKG2A в NK- и/или CD8 T-клетках и/или повышенного количества NKG2A-экспрессирующих NK- и/или CD8 T-клеток у указанного индивида введение указанному индивиду антитела, которое нейтрализует ингибиторную активность полипептида NKG2A человека.