Способ дифференциальной диагностики лейкоплакии и плоскоклеточного рака слизистой полости рта на дооперационном этапе

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано для дифференциальной диагностики лейкоплакии и плоскоклеточного рака слизистой полости рта на дооперационном этапе. Сущность способа: проводят флюориметрическое определение химотрипсинподобной активности протеасом (ХТП) в сыворотке крови, для чего осуществляют забор крови из вены в две пробирки по 6 мл, через час после взятия крови ее центрифугируют в течение 15 минут при 3000 об/мин, полученную сыворотку предварительно активируют 10% SDS, далее ХТП определяют по гидролизу флуорогенного олигопептида Suc-LLVY-AMC (Sigma), утилизирующегося химотрипсинподобными центрами протеасом, для оценки активности примесных протеаз применяют специфический ингибитор протеасом - MG132 (Sigma), реакционная смесь для определения активности протеасом содержит 20 мМ Tris-HCl с рН 7,5, 1 мМ дитиотрейтола, 30 мкМ флуорогенного субстрата, 5 мМ MgCl₂ и 1 мМ АТФ, реакцию проводят при 37°С в течение 20 мин, образовавшийся продукт регистрируется на многорежимном микропланшетном ридере-имиджере «Cytationl» (BioTek, CIIIA) при Exi = 360 нм, Emi = 460 нм, удельную активность протеасом выражают в единицах активности на 1 мл сыворотки крови, ХТП оценивают по интенсивности флуоресценции гидролизованного субстрата в единицах показаний флуориметра Eg/мл. При достижении значения показателя ХТП в диапазоне от 30,9 до 69,9 диагностируют лейкоплакию, а при определении значения в диапазоне от 70,0 до 126,4 диагностируют плоскоклеточный рак слизистой полости рта. Использование изобретения обеспечивает снижение инвазивности, повышение точности ранней диагностики. 2 пр.

 

Изобретение относится к области медицины, конкретно к онкологии и, касается способов дифференциальной диагностики лейкоплакии и плоскоклеточного рака слизистой полости рта на дооперационном этапе.

Согласно классификации ВОЗ (2007) лейкоплакия слизистой оболочки полости рта (СОПР) относится к потенциально злокачественным заболеваниям (ПЗЗ) и представляет собой гиперкератоз, сопровождающийся воспалением стромы и возникающий, как правило, в ответ на хронические экзогенные и эндогенные раздражения. Данное заболевание является наиболее склонным к малигнизации предраковым заболеванием СОПР и красной каймы губ, риск малигнизации составляет 15,6-39,2% [1].

Экстенсивные показатели заболеваемости лейкоплакией в Российской Федерации, по данным официальной статистики, составляют 2,1% верифицированных случаев [2]. К преимущественной локализации лейкоплакии полости рта относят поражение слизистой оболочки щек (25%), языка (10%), губы (5-10%), твердого неба (10-20%), дна полости рта (10-25%) и десны (20%) [3].

В большинстве случаев лейкоплакия предшествует плоскоклеточному раку полости рта. По данным Brouns Е и др. от 16% до 62% плоскоклеточного рака полости рта связано с уже существующей лейкоплакией [4]. При этом заболеваемость плоскоклеточным раком полости рта во всем мире варьируется от 3 до 8 случаев на 100000 населения. Согласно статистике плоскоклеточный рак СОПР составляет 90-95% всех злокачественных новообразований данной области, а в 30-80% случаев на момент осмотра выявляются регионарные метастазы [5]. Заболевание чаще всего поражает людей среднего и пожилого возраста. Выживаемость пациентов очень сильно зависит от стадии заболевания и составляет около 60%.

В настоящее время основным методом дифференциальной диагностики лейкоплакии и плоскоклеточного рака слизистой полости рта является гистологическое исследование биоптата с очага поражения с последующим приготовление препаратов для морфологического анализа - стандартных гистологических срезов толщиной 5-6 мкм, их стандартную окраску для гистологического исследования и цитологическое исследование аномальных клеток СОПР. Однако, данный метод является достаточно инвазивным, болезненным для пациента, недостаточно точным, отсроченным по времени, неколичественным, субъективным и зависит от практического опыта врачей при визуальной оценке морфологии биоптата.

Наиболее близким к предлагаемому является способ дифференциальной диагностики лейкоплакии и плоскоклеточного рака слизистой полости рта с помощью цитологического исследование морфологии клеток [6]. Метод заключается в получении соскоба - скарификата острым скальпелем с поверхности очага и дальнейшее фиксацию на предметном стекле с последующим изучением препаратов под микроскопом. Недостатками данного метода являются субъективность и значительный процент диагностических ошибок. По данным различных авторов, цитологические ошибки и неудачи могут достигать 20%.

Новый технический результат - снижение инвазивности, повышение точности ранней диагностики.

Для достижения нового технического результата в способе дифференциальной диагностики лейкоплакии и плоскоклеточного рака слизистой полости рта на дооперационном этапе, путем исследования биологического материала пациента, причем проводят флюориметрическое определение химотрипсинподобной активности протеасом (ХТП) в сыворотке крови, для чего, осуществляют забор крови из вены в две пробирки по 6 мл, через час после взятия крови ее центрифугируют в течение 15 минут при 3000 об./мин, полученную сыворотку предварительно активируют 10% SDS, далее ХТП определяют по гидролизу флуорогенного олигопептида Suc-LLVY-AMC (Sigma), утилизирующегося химотрипсинподобными центрами протеасом, для оценки активности примесных протеаз применяют специфический ингибитор протеасом - MG132 (Sigma), реакционная смесь для определения активности протеасом содержит 20 мМ Tris-HCl с pH 7,5, 1 мМ дитиотрейтола, 30 мкМ флуорогенного субстрата, 5 мМ MgCl₂ и 1 мМ АТФ, реакцию проводят при 37 °С в течение 20 мин, образовавшийся продукт регистрируется на многорежимном микропланшетном ридере-имиджере «Cytationl» (BioTek,CLLIA) при Exi=360 нм, Emi=460 нм, удельную активность протеасом выражают в единицах активности на 1 мл сыворотки крови, ХТП оценивают по интенсивности флуоресценции гидролизованного субстрата в единицах показаний флуориметра Eg/мл и при достижении значении показателя ХТП в диапазоне от 30,9 до 69.9 диагностируют лейкоплакию, а при определении значения в диапазоне от 70,0 до 126,4 диагностируют плоскоклеточный рак слизистой полости рта.

Способ осуществляют следующим образом

На дооперационном этапе проводят флюориметрическое определение химотрипсинподобной активности протеасом (ХТП) в сыворотке крови, для чего, проводят забор крови из вены в две пробирки по 6 мл, спустя час после взятие крови ее центрифугируют в течение 15 минут при 3000 об/мин, полученную сыворотку предварительно активируют 10% SDS согласно методике, далее ХТП определяют по гидролизу флуорогенного олигопептида Suc-LLVY-AMC (Sigma), утилизирующегося химотрипсинподобными центрами протеасом, для оценки активности примесных протеаз применяют специфический ингибитор протеасом - MG132 (Sigma), реакционная смесь для определения активности протеасом содержит 20 мМ Tris-HCl с pH 7,5, 1 мМ дитиотрейтола, 30 мкМ флуорогенного субстрата, 5 мМ MgCl₂ и 1 мМ АТФ, реакцию проводят при 37 °С в течение 20 мин, образовавшийся продукт регистрируется на многорежимном микропланшетном ридере-имиджере «Cytationl» (BioTek, CIIIA) при Exi=360 нм, Emi=460 нм, удельную активность протеасом выражают в единицах активности на 1 мл сыворотки крови, ХТП оценивают по интенсивности флуоресценции гидролизованного субстрата в единицах показаний флуориметра Eg/мл и при достижении значении показателя ХТП в диапазоне от 30,9 до 69.9 диагностируют лейкоплакию, а при определении значения в диапазоне от 70,0 до 126,4 диагностируют плоскоклеточный рак слизистой полости рта.

Такой подход к дифференциальной диагностике лейкоплакии и плоскоклеточного рака полости рта обусловлен рядом предпосылок:

- одним из основных путей регуляции уровня и активности рецепторов, компонентов сигнальных путей, факторов транскрипции, участвующих в формировании плоскоклеточного рака полости рта является протеолиз, опосредуемый через убиквитин-протеасомную систему [7];

- в ряде исследований продемонстрировано участие убиквитин-протеасомной системы в развитии опухолей различных локализаций, причем эти изменения разнонаправленные. В частности, развитие рака эндометрия связано с повышением химотрипсинподобной активности протеасом, увеличением содержания LMP2, LMP7, РА28 субъединиц и снижением экспрессии суммы а1а2а3а5а6а7 субъединиц протеасом [8]. При распространении на регионарные лимфоузлы рака щитовидной железы, а также при раке толстой кишки с наличием лимфогенных и гематогенных метастазов, выявлено увеличение химотрипсинподобной активности протеасом [9, 10]. В то же время, при плоскоклеточном раке головы и шеи высокая химотрипсинподобная активность протеасом является благоприятным прогностическим признаком и ассоциируется с более высокими показателями 2-летней общей выживаемости [11]. У больных эпителиальным раком яичников III стадии со сниженной активностью внутриклеточных протеаз обнаружено прогрессирование заболевания после проведенного лечения и достигнутой стабилизации [12]. У больных раком почки отмечается изменение активности кальпаинов и протеасом в опухоли после проводимого лечения эверолимусом и ингибиторами тирозинкиназ [13, 14].

Предлагаемый критерий подобран на основании анализа данных проведенных экспериментальных и клинических исследований, в ходе которых выявлены связи ХТП активности циркулирующих протеасом. Исследование проводили у 12 пациентов с лейкоплакией и 15 пациентов с плоскоклеточным раком СОПР, проходивших лечение в отделении общей онкологии НИИ онкологии ТНИМЦ с 2019 по 2020 год. У всех пациентов диагноз был морфологически верифицирован, лечение пациентов по поводу заболеваний СОПР не проводилось. Согласно полученным данным, удельная ХТП активность протеасом при лейкоплакии и плоскоклеточном раке СОПР составила 50,4 (30,9-69.9) и 95,1 (70,0-126,4) (р=0.018) соответственно.

Клинические примеры

Пример 1. Пациентка М. 68 лет. В апреле 2020 года обратилась в НИИ онкологии СО РАМН, где по результатам гистологического исследования и визуального осмотра врачом онкологом был поставлен диагноз: лейкоплакия боковой поверхности языка справа. Были проведены исследования согласно предлагаемому способу. При исследовании удельная ХТП активности циркулирующих протеасом составила 33,7, что подтвердило диагноз лейкоплакии.

Пример 2. Пациент К. 64 года. В июле 2020 года обратилась в НИИ онкологии СО РАМН, где по результатам гистологического исследования и визуального осмотра врачом онкологом был поставлен диагноз: высоко дифференцированный плоскоклеточный рак боковой поверхности языка слева, II стадия T2N0M0. Дополнительно было проведено исследование согласно предлагаемому способу. При исследовании удельная ХТП активности циркулирующих протеасом составила 126,4 что подтвердило первоначальный диагноз - плоскоклеточный рак слизистой полости рта.

Таким образом, применение предлагаемого способа совместно с определением основных клинико-морфологических параметров позволяет с большей степенью вероятности поставить верный диагноз, снизить частоту диагностических ошибок. Предлагаемый способ является малоинвазивным, также повышает объективность диагностики за счет устранения ее зависимости от недостаточной квалификации специалиста, что особенно важно в сложных случаях, т.к. способ сводит к минимуму возможность диагностической ошибки из-за субъективной оценки специалистом того или иного качественного морфологического признака. Предложенный способ дифференциальной диагностики лейкоплакии и плоскоклеточного рака слизистой оболочки рта может быть широко использоваться в онкологических клиниках.

Источники информации, принятые во внимание при составлении описания:

1. Mortazavi, Н., Baharvand, М., Mehdipour, М. Oral potentially malignant disorders: an overview of more than 20 entities. Journal of dental research, dental clinics, dental prospects. 2014; 8(1) 6-14. https://doi.org/10.5681/ioddd.2014.002

2. Гилева О.С, Либик Т.В., Позднякова А.А., Сатюкова Л.Я. Предраковые заболевания в структуре патологии слизистой оболочки полости рта. Вестник стоматологии. 2012;(2):3-9.

3. Рабинович О.Ф., Абрамова Е.С., Тогонидзе А.А. Клиника, диагностика и лечение различных форм лейкоплакии. Стоматология. 2014;93(5):75-81.

4. Brouns Е., Baart J.A., Bloemena Е, Karagozoglu Н., van der Waal I. The relevance of uniform reporting in oral leukoplakia: Definition, certainty factor and staging based on experience with 275 patients. Medicina oral, patologia oral у cirugia bucal. 2012:18756-18756

5. Anis R., Gaballah K. Oral cancer in the UAE: a multicenter, retrospective study. Libyan Journal of Medicine. 2013; 27;8:21782

6. Verma R., Singh A., Badni M., Chandra A., Gupta, S., Verma, R. (2015). Evaluation of exfoliative cytology in the diagnosis of oral premalignant and malignant lesions: A cytomorphometric analysis. Dental research journal. 2015 12(1), 83-88. https://doi.ora/10.4103/1735-3327.150339

7. Voutsadakis I. A. Ubiquitination and the Ubiquitin - Proteasome System in the Pathogenesis and Treatment of Squamous Head and Neck Carcinoma. Anticancer Research. 2013;33 (9) 3527-3541;

8. Спирина Л.В., Кондакова И.В., Коломиец Л.А., Чернышева А.Л., Асадчикова О.Н., Шарова Н.П., Коваль В.Д. Активность протеасом и их субъединичный состав при гиперпластических процессах и раке эндометрия. Опухоли женской репродуктивной системы. 2011; 4:64-68.

9. Иванова Э.В., Кондакова И.В., Спирина Л.В., Афанасьев С.Г., Августинович А.В., Черемисина О.В. Химотрипсинподобная активность протеасом и общая активность кальпаинов при раке желудка и толстой кишки. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2014; 157(6):753-756.

10. Шашова Е.Е., Астахова Т.М., Плеханова А.С., Богомягкова Ю.В., Люпина Ю.В., Сумели И.Р., Слонимская Е.М., Ерохов П.А., Абрамова Е.Б., Родоман Г.В., Кузнецов Н.А., Кондакова И.В., Шарова Н.П., Чойнзонов Е.Л. Изменение химотрипсинподобной активности протеасом в развитии карцином молочной и щитовидной желез человека. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2013; 156(8):209-211

11. Чойнзонов Е.Л., Спирина Л.В., Кондакова И.В., Чижевская С.Ю., Шишкин Д.А., Кульбакин Д.Е. Прогностическая значимость определения активности протеасом в тканях плоскоклеточных карцином головы и шеи. Сибирский научный медицинский журнал. 2014; 34(4): 103-108

12. Юнусова Н.В., Спирина Л.В., Кондакова И.В., Коломиец Л.А., Виллерт А.Б., Шпилева О.В. Экспрессия и активность протеаз при метастазировании рака яичников. Известия Российской академии наук. Серия биологическая. 2014; 5: 448-455.

13. Спирина Л.В., Усынин Е.А., Кондакова И.В., Юрмазов З.А., Слонимская Е.М. Влияние таргетной терапии на содержание транскрипционных, ростовых факторов, протеинкиназы mTOR и активности внутриклеточных протеиназ у больных диссеменированным раком почки. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2015; 160(12):768-772

14. Юрмазов З.А., Спирина Л.В., Усынин Е.А., Кондакова И.В., Слонимская Е.М. Молекулярные показатели, связанные с эффективностью терапии эверолимусом у больных диссеменированным раком почки. Сибирский онкологический журнал. 2016; 15(2):42-47

Способ дифференциальной диагностики лейкоплакии и плоскоклеточного рака слизистой полости рта на дооперационном этапе путем исследования биологического материала пациента, характеризующийся тем, что проводят флюориметрическое определение химотрипсинподобной активности протеасом (ХТП) в сыворотке крови, для чего осуществляют забор крови из вены в две пробирки по 6 мл, через час после взятия крови ее центрифугируют в течение 15 минут при 3000 об/мин, полученную сыворотку предварительно активируют 10% SDS, далее ХТП определяют по гидролизу флуорогенного олигопептида Suc-LLVY-AMC (Sigma), утилизирующегося химотрипсинподобными центрами протеасом, для оценки активности примесных протеаз применяют специфический ингибитор протеасом - MG132 (Sigma), реакционная смесь для определения активности протеасом содержит 20 мМ Tris-HCl с рН 7,5, 1 мМ дитиотрейтола, 30 мкМ флуорогенного субстрата, 5 мМ MgCl₂ и 1 мМ АТФ, реакцию проводят при 37°С в течение 20 мин, образовавшийся продукт регистрируется на многорежимном микропланшетном ридере-имиджере «Cytationl» (BioTek, CIIIA) при Exi = 360 нм, Emi = 460 нм, удельную активность протеасом выражают в единицах активности на 1 мл сыворотки крови, ХТП оценивают по интенсивности флуоресценции гидролизованного субстрата в единицах показаний флуориметра Eg/мл и при достижении значении показателя ХТП в диапазоне от 30,9 до 69.9 диагностируют лейкоплакию, а при определении значения в диапазоне от 70,0 до 126,4 диагностируют плоскоклеточный рак слизистой полости рта.