Набор праймеров для обнаружения нуклеиновых кислот, набор зондов и набор для выявления нового типа коронавируса covid-19 и способ его выявления
Владельцы патента RU 2772130:
ХУЧЖОУ СЕНТРАЛ ХОСПИТЕЛ (CN)
ХУЧЖОУ СЕНТЕР ФОР ДИЗИЗ КОНТРОЛ ЭНД ПРИВЕНШН (CN)
Изобретение относится к области вирусологии. Описан набор праймеров для выявления нового типа коронавируса COVID-19, включающий две пары специфических праймеров, включающие нижеприведенные нуклеотидные последовательности: пару специфических праймеров для фрагмента гена ORF1ab вируса: ORF1ab-F: как показано в SEQ ID NO: 1, ORF1ab-R: как показано в SEQ ID NO: 2; пару специфических праймеров для сегмента гена N вируса: N-F: как показано в SEQ ID NO: 3, N-R: как показано в SEQ ID NO: 4. Также описан набор для выявления нового типа коронавируса COVID-19, включающий указанный набор праймеров для выявления нового типа коронавируса, а также пару праймеров внутреннего стандарта и зонд внутреннего стандарта, из них нуклеотидная последовательность пары праймеров внутреннего стандарта выглядит следующим образом: RNP-F: как показано в SEQ ID NO: 7, RNP-R: как показано в SEQ ID NO: 8; нуклеотидная последовательность зонда внутреннего стандарта выглядит следующим образом: RNP-P: как показано в SEQ ID NO: 9. Изобретение расширяет арсенал средств выявления SARS-CoV-2. 2 н. и 5 з.п. ф-лы, 4 ил., 1 табл., 1 пр.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
[0001] Настоящее изобретение относится к области техники выявления вируса и, в частности, к набору праймеров (реагентов) для обнаружения нуклеиновых кислот, набору зондов, набору для выявления нового типа коронавируса COVID-19 и к способу его выявления.
ПРЕДПОСЫЛКИ К СОЗДАНИЮ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0002] Новый тип коронавируса относится к роду β-коронавирусов, при этом он включает оболочки, частицы округлой или овальной, зачастую плеоморфной формы диаметром 60-140 нм, и его геномная последовательность представляет собой одноцепочечную РНК (29903bp), а его генетические характеристики безусловно отличаются от характеристик SARSr-CoV и MERSr-CoV. Результаты последних исследований продемонстрировали, что степень гомологии с SARS-подобным коронавирусом, который заражает летучих мышей (bat-SL-CoVZC45) составляет более 85%. На основе последних эпидемиологических исследований было установлено, что инкубационный период заболевания составляет 1-14 дней, в большинстве случаев 3-7 дней, сопровождаемый повышенной температурой, слабостью и сухим кашлем в качестве основных симптомов его проявления. У некоторых пациентов может отмечаться заложенность носа, боль в горле, диарея и т.д. У тяжёлых пациентов зачастую развивается одышка и (или) гипоксемия через одну неделю после проявления болезни. В тяжелых случаях проявление указанных симптомов сопровождается развитием острого респираторного дистресс-синдрома, септического шока, трудно устранимого метаболического ацидоза, нарушением свертываемости крови и т.д.
[0003] Новый тип коронавируса (COVID-19) вызывает острое респираторное инфекционное заболевание, при этом заболевание было отнесено к инфекционным заболеваниям Класса B, предусмотренным в «Законе Китайской Народной Республики о профилактике и борьбе с инфекционными заболеваниями», и лечение данного заболевания относится к инфекционным заболеваниям Класса B. Во всем мире складывается тяжелая ситуация, характеризующаяся прогрессированием пневмонии, вызываемой новым типом коронавируса, число подтвержденных и предполагаемых случаев заболевания постоянно растет, огромная нагрузка ложится на лечебно-диагностические учреждения, при этом новый тип коронавируса может представлять угрозу заражения в течение продолжительного периода времени. В этой связи разработка высокочувствительной системы для выявления нового типа коронавируса способствует принятию мер профилактики и контроля заболевания, вызываемого новым типом коронавируса, эффективной охраны здоровья и обеспечения безопасности людей, а также содействует общей экономической и социальной стабильности.
[0004] С начала 2020 года также публиковались материалы, содержащие информацию о наборах праймеров для выявления нового типа коронавируса (COVID-19). Например, в заявке № CN111057797A, поданной 19 января 2020 г. и опубликованной 24 апреля 2020 г., были раскрыты праймеры и зонды, наборы и способы количественной флуоресцентной ПЦР в реальном времени для выявления нового типа коронавируса 2019-nCoV; например, в заявке № CN111118228A, поданной 31 марта 2020 г. и опубликованной 8 мая 2020 г., раскрывался набор для обнаружения нуклеиновой кислоты нового типа коронавируса COVID-19 и способ его применения, а также были
2
опубликованы аналогичные заявки. Тем не менее, с точки зрения применения в клинической практике степень точности является низкой, и существует вероятность получения ложноположительных и ложноотрицательных результатов.
КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩЕСТВА ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0005] Цель настоящего изобретения заключается, по меньшей мере, в разрешении проблем предшествующего уровня техники, связанных с необходимостью повышения точности обнаружения и снижения вероятности получения ложноотрицательных и ложноположительных результатов тестов.
[0006] В той связи первая цель настоящего изобретения заключается в создании набора праймеров для обнаружения нуклеиновых кислот нового типа коронавируса COVID-19, содержащего две пары специфических праймеров, включающие нижеприведенные нуклеотидные последовательности:
[0007] пара специфических праймеров для фрагмента гена ORF1ab вируса:
[0008] ORF1ab-F: как показано в SEQ ID NO: 1,
[0009] 5′-TTTAGTTCCCTTCCATCATATGCA-3′;
[0010] ORF1ab-R: как показано в SEQ ID NO: 2;
[0011] 5′-ATTCAGATTTAGCCACATTCAAAGA-3′;
[0012] пара специфических праймеров для сегмента гена N вируса:
[0013] N-F: как показано в SEQ ID NO: 3,
[0014] 5′-ATTGCACAATTTGCCCCCAG-3′;
[0015] N-R: как показано в SEQ ID NO: 4.
[0016] 5′-CATCCAATTTGATGGCACCTG-3′.
[0017] Набор праймеров для выявления нового типа коронавируса COVID-19, предлагаемый настоящим изобретением, обладает, по меньшей мере, нижеприведенными преимуществами.
[0018] Две пары специфических праймеров соответственно нацелены на высококонсервативную область гена ORF1ab и гена N нового типа коронавируса. Обнаружение фрагментов гена ORF1ab и гена N может помочь в диагностировании инфекции, вызванной новым типом коронавируса. При этом путем оптимизации последовательности праймеров может быть повышена чувствительность выявления нового типа коронавируса, а также может быть предотвращена вероятность получения ложноотрицательных и ложноположительных результатов тестов. В соответствии со стандартной кривой могут быть обнаружены положительные пробы с минимальной концентрацией 15 копий/мл.
[0019] Вторая цель настоящего изобретения заключается в создании набора зондов, используемых в комбинации с набором праймеров для выявления нового типа коронавируса COVID-19, включающего следующие зонды:
[0020] зонд для фрагмента гена ORF1ab вируса:
[0021] ORF1ab-P: как показано в SEQ ID NO: 5,
[0022] 5′-TTTTGCTACTGCTCAAGAAGCTTATGAGC-3′;
[0023] зонд для фрагментов гена N вируса:
[0024] N-P: как показано в SEQ ID NO: 6,
[0025] 5′-TTCTTCGGAATGTCGCGCATTG-3′.
[0026] В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения каждый 5’-конец зонда мечен флуоресцентной репортерной группой, и каждый 3’-конец зонда мечен флуоресцентной тушащей группой.
[0027] В процессе амплификации в ПЦР, если зонд является интактным, ввиду того, что флуоресцентная тушащая группа расположена в
непосредственной близости от флуоресцентной репортерной группы, флуоресценция, излучаемая флуоресцентным репортерным геном, поглощается тушащей группой, в результате чего флуоресцентный сигнал не излучается. При удлинении праймера зонд, связанный с матрицей, обрезается ферментом Taq (5'→3' экзонуклеазная активность), флуоресцентная репортерная группа отделяется от флуоресцентной тушащей группы, в результате чего генерируется флуоресцентный сигнал. Прибор для проведения количественной ПЦР с флуоресцентной детекцией автоматически вычерчивает кривую амплификации в реальном времени на основе детектированного флуоресцентного сигнала, с целью выявления нового типа коронавируса на уровне нуклеиновых кислот. Результаты теста могут быть качественными или количественными, и качественное выявление нового типа коронавируса может быть осуществлено путем непосредственного определения наличия или отсутствия соответствующей кривой амплификации. Соответствующая стандартная кривая может быть вычерчена в соответствии с значением порогового цикла различных стандартных градиентов концентрация, в то время как количественные результаты могут быть получены путем вычисления значения порогового цикла пробы. Кроме того, основываясь на общем понимании в данной области техники, флуоресцентные репортерные группы различных зондов могут различаться таким образом, чтобы амплификация различных фрагментов генов в одной реакционной пробирке обеспечивала генерирование флуоресцентных сигналов различных диапазонов длин волн для упрощения процесса выявления нового типа коронавируса.
[0028] В более предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения 5’-конец зонда для фрагмента гена ORF1ab-P вируса мечен флуоресцентной репортерной группой FAM, и 3’-конец мечен флуоресцентной тушащей группой BHQ1; 5’-конец зонда для фрагмента гена NP мечен флуоресцентной репортерной группой HEX, и 3’-конец мечен флуоресцентной тушащей группой BHQ1.
[0029] Третья цель настоящего изобретения заключается в создании набора для выявления нового типа коронавируса COVID-19, при этом набор для выявления нового типа коронавируса включает вышеупомянутый набор праймеров и вышеупомянутый набор зондов.
[0030] В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения набор для выявления нового типа коронавируса дополнительно включает пару праймеров внутреннего стандарта и зонд внутреннего стандарта;
[0031] из них, нуклеотидная последовательность пары праймеров внутреннего стандарта выглядит следующим образом:
[0032] RNP-F: как показано в SEQ ID NO: 7,
[0033] 5′- AGATTTGGACCTGCGAGCG-3′;
[0034] RNP-R: как показано в SEQ ID NO: 8,
[0035] 5′-GAGCGGCTGTCTCCACAAGT-3′;
[0036] нуклеотидная последовательность зонда внутреннего стандарта выглядит следующим образом:
[0037] RNP-P: как показано в SEQ ID NO: 9,
[0038] 5′-TTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG-3′.
[0039] Внутренним стандартом, используемым в наборе, является рибонуклеотид человека P (РНаза P, рибонуклеопротеин (RNP)). Внутренний стандарт используют для определения того, получена ли ткань подходящего пациента или проба секреции. Весь экспериментальный процесс сбора, транспортировки и экстракции тестируемых проб находится
под полным контролем во избежание получения ложноотрицательных результатов теста.
[0040] В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения 5’-конец RNP-P мечен флуоресцентной репортерной группой, и 3’-конец мечен флуоресцентной тушащей группой.
[0041] Флуоресцентная репортерная группа зонда внутреннего стандарта также может быть группой, отличающейся от флуоресцентной репортерной группы вышеупомянутого зонда выявления нового типа коронавируса, например, TEXAS RED, и BHQ2 выбран для флуоресцентной тушащей группы. Таким образом, обеспечивается детектирование флуоресценции в канале (красителе) TEXAS RED/ROX.
[0042] В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения набор для выявления нового типа коронавируса, предлагаемый настоящим изобретением, дополнительно включает смесь фермента ОT-ПЦР и буфера для ОТ-ПЦР.
[0043] В предпочтительном варианте осуществления набор для выявления нового типа коронавируса, предлагаемый настоящим изобретением, дополнительно включает пробу положительного контроля и пробу отрицательного контроля. Проба положительного контроля способна полностью амплифицировать фрагмент гена-мишени, соответствующий праймеру, в процессе амплификация, такой как стандартный штамм инактивированного вируса, плазмиды, содержащие соответствующей фрагмент гена-мишени (фрагмент гена ORFlab, фрагмент гена N, фрагмент гена RNP) и т.д. Проба отрицательного контроля представляет собой воду, используемую для растворения матричной РНК, например, воду, обработанную диэтилпилокарбонатом.
[0044] В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения набор для выявления нового типа коронавируса, предлагаемого настоящим изобретением, дополнительно включает реагент для экстракции нуклеиновых кислот. Экстракция вирусных нуклеиновых кислот в пробе осуществляется с помощью соответствующего реагента для экстракции нуклеиновых кислот с целью обеспечения проведения последующих процессов амплификации и обнаружения.
[0045] Четвертая цель настоящего изобретения заключается в создании способа выявления нового типа коронавируса с использованием вышеупомянутого набора для выявления указанного вируса.
[0046] Способ выявления нового типа коронавируса включает следующие этапы:
[0047] выделение тотальной РНК из тестируемых проб;
[0048] использование тестируемых проб тотальной РНК в качестве матрицы; использование вышеупомянутого набора праймеров для амплификации и для выявления набора зондов в ПЦР после обратной транскрипции;
[0049] проведение анализа продуктов амплификации и определение того, содержат ли тестируемые пробы новый тип коронавируса в зависимости от появления кривой амплификации.
[0050] В соответствии со способом выявления нового типа коронавируса в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения программа реакции амплификации в ПЦР составляет 50°С, 5 мин; 95°С, 10 сек; 95°С, 5 сек; 60°С, 30 сек; с 40 циклами.
[0051] Способ ОТ-ПЦР в реальном времени с флуоресцентной детекцией занимает только 1 час и 10 минут, начиная от экстракции нуклеиновых кислот до завершения выявления нового типа коронавируса. Способ является легким в использовании, характеризуется высокой
чувствительностью и представляет собой оперативный и эффективный лабораторный способ выявления нового типа коронавируса для диагностики инфекционного заболевания.
[0052] Две пары специфических праймеров соответственно нацелены на высококонсервативную область гена ORF1ab и гена N нового типа коронавируса. Выявление фрагментов гена ORF1ab и гена N позволяет диагностировать инфекцию, вызываемую новым типом коронавируса. При этом путем оптимизации последовательности праймеров может быть повышена чувствительность обнаружения нового типа коронавируса, снижена вероятность получения ложноотрицательных и ложноположительных результатов тестов и вероятность необнаружения нового типа коронавируса.
[0053] Вышеупомянутые способы выявления нового типа коронавируса с использованием вышеупомянутых наборов могут найти применение для дополнительной диагностики нового типа коронавируса, в результате чего может быть обеспечено оперативное получение информации о вспышках эпидемии, вызываемой новым типом коронавируса, и оказано надежное техническое содействие, направленное на проведение профилактических мер и мер по борьбе с эпидемией, вызываемой новым типом коронавируса. Этот фактор имеет первостепенное значение для предотвращения будущих вспышек заболевания, вызываемых неизвестными новыми типами коронавируса.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
[0054] На Фиг. 1 проиллюстрированы результаты амплификации с использованием набора мультиплексного ПЦР-анализа (Multiplex PCR Kit) для выявления нового типа коронавируса в соответствии с примером настоящего изобретения.
[0055] На Фиг. 2 проиллюстрирована стандартная кривая и кривая амплификации одной и той же пробы при различных концентрациях разведения. На Фиг. 2-1 представлена стандартная кривая, основанная на кривой амплификации Фиг. 2-2, при этом концентрация положительных плазмид составляет 4 мкг\мл, и соответствующее количество копий составляет 1* 1010 копий/мл, C1~C7 соответствует 1*102~8 копий/мл после многократного разведения; взяв значение порогового цикла (Ct)<40 в качестве отрицательного критерия, предел выявления нового типа коронавируса с использованием разработанного набора составляет 15 копий/мл.
[0056] На Фиг. 3 проиллюстрировано, что для экстракции РНК использовали исходный раствор положительной пробы D с применение соответственно разработанных наборов, набора A (Фиг. 3-1), набора B (Фиг. 3-2) и набора C (Фиг. 3-3), произвольно выбранных на рынке. Условия амплификации соответственно амплифицировали согласно инструкциям к наборам A, B и C. Пробу D протестировали как положительную для всех наборов. Значение порогового цикла набора настоящего изобретения ниже по сравнению с произвольно выбранными наборами, и при этом его чувствительность выше.
[0057] На Фиг. 4-1 проиллюстрировано, что исходный раствор положительной пробы D разводили 8 раз для экстрагирования РНК в качестве матрицы и использовали разработанный набор и набор A, произвольно выбранный на рынке. Реакционная система ПЦР и условия амплификации представляли собой условия протекания реакции, предусмотренные инструкцией к набору A; разработанный набор отличался максимальным значением порогового цикла чувствительности (Ct), составлявшим 36,2, что рассматривалось как положительная проба.
Значение порогового цикла набора A достигало 38,3, и это определялось как сомнительная проба в соответствии с инструкциями к набору.
[0058] На Фиг. 4-2 проиллюстрировано, что положительную пробу D разбавляли для экстрагирования РНК в качестве матрицы, и соответственно использовали разработанный набор (набор настоящего изобретения) и набор B, произвольно выбранный на рынке (Фиг. 4-2). Система ПЦР и условия амплификации представляли собой условия протекания реакции, предусмотренные инструкцией к набору B, максимальное значение порогового цикла чувствительности разработанного набора составляло 36,4, что рассматривалось как положительная проба. Значение порогового цикла набора B превысило 40, и это определялось как отрицательная проба в соответствии с инструкциями к набору, что приводило к ложноотрицательным результатам.
[0059] На Фиг. 4-3 проиллюстрировано, что исходный раствор положительной пробы D разводили 8 раз для экстрагирования РНК в качестве матрицы. Соответственно использовали разработанный набор и набор C, произвольно выбранный на рынке (Фиг. 4-3). Система ПЦР и условия амплификации представляли собой условия протекания реакции, предусмотренные инструкцией к набору C. Максимальное значение пороговое цикла чувствительности разработанного набора составляло 38,2, и это определялось как сомнительная проба. Значение порогового цикла чувствительности набора C превысило 40, и это определялось как отрицательная проба в соответствии с инструкциями к набору, что приводило к ложноотрицательным результатам.
ОПИСАНИЕ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0060] Ниже приведено ясное и полное описание идеи настоящего изобретения и достигаемые технические эффекты со ссылкой на варианты осуществления для полного понимания целей, характерных особенностей и эффектов настоящего изобретения. Безусловно, описанные варианты осуществления настоящего изобретения являются лишь частью вариантов осуществления настоящего изобретения, а не всеми из них. Исходя из вариантов осуществления настоящего изобретения, другие варианты осуществления настоящего изобретения, созданные специалистами в данной области техники без осуществления изобретательской деятельности, относятся к объему правовой охраны настоящего изобретения.
[0061] Пример 1
[0062] В примере предлагается набор праймеров и зондов для выявления нового типа коронавируса. На основе технологии TaqMan с использованием флуоресцентных зондов, соответствующие специфические праймеры для выявления нового типа коронавируса и зонды Taqman могут быть разработаны на основе высококонсервативных областей гена ORF1ab и гена N нового типа коронавируса. При этом, при использовании РНП человека в качестве внутреннего стандарта могут быть разработаны соответствующие пары праймеров и зонды внутреннего стандарта. Детальная информация приведена в Таблице 1 ниже:
[0063] Таблица 1: Информация о праймерах и зондах
| Наименование последовательности | Последовательность |
| ORF1ab-F | 5′-TTTAGTTCCCTTCCATCATATGCA-3′ |
| ORF1ab-R | 5′-ATTCAGATTTAGCCACATTCAAAGA-3′ |
| ORF1ab-P | 5′FAM-TTTTGCTACTGCTCAAGAAGCTTATGAGC-3′BHQ1 |
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> ХУЧЖОУ СЕНТРAЛ ХОСПИТЕЛ
ХУЧЖОУ СЕНТЕР ФОР ДИЗИЗ КОНТРОЛ ЭНД ПРИВЕНШН
<120> НАБОР ПРАЙМЕРОВ ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ,
НАБОР ЗОНДОВ И НАБОР ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ НОВОГО ТИПА КОРОНАВИРУСА COVID-19
И СПОСОБ ЕГО ВЫЯВЛЕНИЯ
<141> 2020-12-02
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> искусственная последовательность
<220>
<222> (1)..(24)
<223> ORF1ab-F
<400> 1
tttagttccc ttccatcata tgca 24
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> искусственная последовательность
<220>
<222> (1)..(25)
<223> ORF1ab-R
<400> 2
attcagattt agccacattc aaaga 25
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> искусственная последовательность
<220>
<222> (1)..(20)
<223> N-F
<400> 3
attgcacaat ttgcccccag 20
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> искусственная последовательность
<220>
<222> (1)..(21)
<223> N-R
<400> 4
catccaattt gatggcacct g 21
<210> 5
<211> 29
<212> DNA
<213> искусственная последовательность
<220>
<222> (1)..(29)
<223> ORF1ab-P
<400> 5
ttttgctact gctcaagaag cttatgagc 29
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> искусственная последовательность
<220>
<222> (1)..(22)
<223> N-P
<400> 6
ttcttcggaa tgtcgcgcat tg 22
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> искусственная последовательность
<220>
<222> (1)..(19)
<223> RNP-F
<400> 7
agatttggac ctgcgagcg 19
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> искусственная последовательность
<220>
<222> (1)..(20)
<223> RNP-R
<400> 8
gagcggctgt ctccacaagt 20
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> искусственная последовательность
<220>
<222> (1)..(23)
<223> RNP-P
<400> 9
ttctgacctg aaggctctgc gcg 23
<---
1. Набор праймеров для выявления нового типа коронавируса COVID-19, отличающийся тем, что он включает две пары специфических праймеров, включающие нижеприведенные нуклеотидные последовательности:
пару специфических праймеров для фрагмента гена ORF1ab вируса:
ORF1ab-F: как показано в SEQ ID NO: 1,
ORF1ab-R: как показано в SEQ ID NO: 2;
пару специфических праймеров для сегмента гена N вируса:
N-F: как показано в SEQ ID NO: 3,
N-R: как показано в SEQ ID NO: 4.
2. Набор для выявления нового типа коронавируса COVID-19, отличающийся тем, что набор включает набор праймеров по п. 1 для выявления нового типа коронавируса, пару праймеров внутреннего стандарта и зонд внутреннего стандарта,
из них нуклеотидная последовательность пары праймеров внутреннего стандарта выглядит следующим образом:
RNP-F: как показано в SEQ ID NO: 7,
RNP-R: как показано в SEQ ID NO: 8;
нуклеотидная последовательность зонда внутреннего стандарта выглядит следующим образом:
RNP-P: как показано в SEQ ID NO: 9.
3. Набор для выявления нового типа коронавируса COVID-19 по п. 2, отличающийся тем, что набор дополнительно включает два зонда, включающие нижеприведенные нуклеотидные последовательности:
зонд для фрагмента гена ORF1ab вируса:
ORF1ab-P: как показано в SEQ ID NO: 5;
зонд для фрагментов гена N вируса:
N-P: как показано в SEQ ID NO: 6.
4. Набор по п. 2, отличающийся тем, что 5’-конец RNP-P мечен флуоресцентной репортерной группой, и 3’-конец мечен флуоресцентной тушащей группой.
5. Набор по п. 4, отличающийся тем, что 5’-конец RNP-P мечен флуоресцентной репортерной группой TEXAS RED, и 3’-конец мечен флуоресцентной тушащей группой BHQ2.
6. Набор по п. 5, дополнительно включающий смесь ферментов ОТ-ПЦР и буфера для ОТ-ПЦР.
7. Набор по п. 6, дополнительно включающий положительную контрольную пробу и отрицательную контрольную пробу.
