Способ диагностики колоректального рака

Изобретение относится к медицине и касается способа диагностики колоректального рака (КРР) путем количественной оценки концентрации внеклеточных нановезикул (ВНВ), секретируемых клетками эпителия толстой кишки и/или клетками аденокарциномы толстой кишки (кВНВ), в составе тотальной популяции ВНВ, заключающегося в том, что выделяют тотальную популяцию ВНВ плазмы, оценивают размер и концентрацию ВНВ с помощью анализа траекторий, формируют иммуно-сорбирующие комплексы, состоящие из суперпарамагнитных частиц (СПМЧ) со стрептавидином и 5 антител к маркерам дифференцировки кишечного эпителия CLRN3, GPA33, GCNT3, PIG-Y, Reg IV, комплексы СПМЧ-5АТ собирают на магнитном штативе, супернатант с несвязавшимися антителами отбирают и комплексы промывают два раза, отмытые комплексы СПМЧ-5АТ инкубируют с образцом тотальной фракции ВНВ, образовавшиеся комплексы СПМЧ-АТ-кВНВ собирают на магнитном штативе, супернатант с несвязавшимися кВНВ отбирают и комплексы промывают, кВНВ в составе комплекса СПМЧ-АТ-кВНВ метят антителами к общим экзосомальным маркерам CD63 или CD9, несущими флуоресцентную метку, выделяют кВНВ и оценивают их количественно в составе иммуно-сорбирующих комплексов АТ-кВНВ-флАТ методом проточной цитометрии, при этом у пациентов с КРР фракция кВНВ составляет более 5% от тотальной популяции ВНВ плазмы. Изобретение обеспечивает диагностирование КРР с чувствительностью 0,72 и специфичностью 0,76. 1 пр., 3 ил.

 

Изобретение относится к области биотехнологии и диагностической медицины и может быть использовано для диагностики, скрининга, контроля эффекта терапии колоректального рака (КРР).

КРР - это злокачественное образование, которое развивается из эпителия толстой кишки, включая ободочную кишку, ректосигмоидное соединение, прямую кишку и анус. Почти в 90% случаев КРР представляет собой аденокарциному - злокачественную опухоль, которая развивается из железистых эпителиальных клеток ободочной и прямой кишки, при этом клетки опухоли сохраняют признаки дифференцировки, характерные для клеток кишечного эпителия. Первые этапы развития заболевания происходят бессимптомно, поэтому в большинстве случаев диагноз КРР ставится на стадии метастатического распространения процесса, когда радикальное лечения затруднено или невозможно. Поэтому методы скрининга и ранней диагностики КРР активно разрабатываются, при этом практическое применение находят преимущественно различные варианты и сочетания эндоскопических технологий (колоноскопии) и методов детекции компонентов крови в каловых массах (2).

Технологии так называемой «жидкостной биопсии» имеют меньшее распространение в силу относительно низкой специфичности. Современные методы диагностики колоректального рака на основе анализа циркулирующих маркеров (жидкостная биопсия) включают технологии оценки концентрации молекулярных онкомаркеров белковой природы (РЭА, СА19.9, СА242, СК17, СК18), циркулирующих ДНК (соматические мутации в генах KRAS, ТР53, АРС, BRAF, PIK3CA, FBXW7, SMAD4 и других, характерные для клеток КРР), везикулярных компонентов (например, микроРНК) и циркулирующих опухолевых клеток (8).

Молекулярные маркеры КРР. Анализ молекулярных онкомаркеров белковой природы является единственным примером практического использования подхода «жидкостной биопсии» для диагностики КРР, хотя клиническая ценность этих методов не очевидна. Для оценки концентрации в плазме молекулярных онкомаркеров (РЭА, СА19.9, СА 242, СК17, СК18 и др.) используются технологии иммуноферментного (ИФА) или иммунохимического анализа. В настоящее время обе технологии успешно реализованы в ряде высокопродуктивных аппаратов и широко используются в лабораторной практике.

Недостатком этих методов в рамках диагностики КРР является низкая диагностическая специфичность. Это вытекает из природы онкомаркеров - все они являются протеинами или гликопротеинами, секретируемыми клетками различных тканей. Ни одна из этих молекул не является специфичной для клеток КРР или клеток кишечного эпителия, поэтому повышение уровня этих маркеров не является патогномоничным признаком КРР. Поэтому молекулярные онкомаркеры используются преимущественно для оценки эффекта терапии у пациентов с КРР, когда связь между фактом развития заболевания и повышением концентрации маркера в плазме установлена.

Циркулирующая опухолевая ДНК. Оценка концентрации КРР-специфических фрагментов ДНК в плазме является развивающейся технологией, которая пока не вошла в широкую практику (9, 10). Анализ может быть проведен стандартными методами, включая секвенирование (NGS, next generation sequencing), ПЦР в режиме реального времени (qPCR, quantitative PCR), цифровую капельную ПЦР (ddPCR, droplet digital PCR) или с помощью менее известных технологий (11). Несмотря на многочисленные публикации, демонстрирующие перспективность анализа циркулирующих ДНК, метод имеет принципиальные ограничения. Во-первых, детекция мутантных ДНК фрагментов в плазме имеет смысл лишь при наличии соответствующих соматических мутаций в клетках опухоли. Но наиболее характерная для КРР мутация гена KRAS определяется лишь в 30-40% случаев, другие мутации встречаются еще реже. Даже при допущении, что мутантная ДНК из клеток опухоли обязательно попадает в циркулирующую плазму, а чувствительность используемых методов достаточна для ее детекции, данный метод не будет информативным в большой части случаев КРР, когда в клетках опухоли нет анализируемых генетических особенностей (мутаций).

Циркулирующие опухолевые клетки. Разработка методов детекции циркулирующих клеток опухоли и оценка этого параметра с диагностической целью также имеет относительно долгую историю. В ряде исследований было показано, что частота обнаружения циркулирующих опухолевых клеток коррелирует со стадией опухолевого процесса (12) и может быть использован как фактор прогноза течения заболевания (13). Использование этого подхода с целью ранней диагностики или скрининга КРР сомнительно. Во-первых, факт появления в циркулирующей крови клеток опухоли на начальных этапах ее формирования не доказан. Во-вторых, задача идентификации и детекции циркулирующих опухолевых клеток является весьма нетривиальной, и в настоящее время не имеет однозначного технического решения. В современной литературе представлены варианты различных технологий, например, специфическая адсорбция опухолевых клеток с помощью коллектора, который вводится в кровоток через внутривенный катетер (14), или чрезкожная детекция клеток, содержащих пигмент меланин, с помощью фотоакустической цитометрии (15). В настоящий момент трудно оценить перспективы широкого внедрения какой-либо технологии детекции циркулирующих опухолевых клеток как метода диагностики КРР по причинам как технологического, так и принципиального характера.

Внеклеточные нановезикулы (ВИВ) - мембранные нано-везикулы (80-130 нм), которые секретируются практически всеми клетками многоклеточных организмов во внеклеточное пространство. Биохимический состав ВИВ близок к составу клеток, которые их секретируют (3). Состав ВНВ циркулирующей плазмы пока изучен слабо. Предполагается, что мажорную фракцию ВНВ плазмы составляют везикулы, секретируемые клетками эндотелия и крови. Вероятно, количество везикул, секретируемых клетками других тканей, пропорционально массе ткани и секреторной активности клеток в ее составе. Это очевидное предположение пока не имеет четкого доказательства, но на его основании разрабатываются новые методы диагностики различных заболеваний, включая онкологические (4, 5). Например, предполагается, что некоторые белковые молекулы в составе везикулярной мембраны являются признаком того, что такие ВНВ секретируются опухолевыми клетками. Соответственно, такие ВНВ рассматриваются как потенциальные онкомаркеры, а их использование защищено патентами компаний Exosomics Siena SpA (US 20130196355 A1), Caris Life Sciences (US 7897356 B2).

ВНВ, секретируемые клетками опухоли, представляются наиболее перспективными диагностическими маркерами. ВНВ сохраняют биохимические признаки опухолевых клеток, ВНВ могут быть секретированы клетками опухоли минимального размера, секреция ВНВ клетками опухоли не связана с процессом диссеминации самих клеток. В настоящее время разработка методов диагностики онкологических заболеваний на основе детекции ВНВ или экзосом, секретируемых опухолевыми клетками является областью активных исследований (5).

В рамках разработки способов диагностики КРР, например, был предложен способ оценки общей концентрации всех циркулирующих нановезикул эндосомального происхождения (16). Несмотря на очевидно низкую диагностическую специфичность такого подхода, авторы исследования рекомендовали количественный анализ циркулирующих экзосом в качестве метода скрининга. Анализ концентрации КРР-ассоциированных компонентов ВНВ плазмы, таких как микроРНК (17), РНК (18), или протеазы (19), может иметь более высокую диагностическую специфичность, чем просто подсчет везикул. Важной положительной особенностью везикулярных онкомаркеров является потенциальная возможность анализа двух и более молекулярных маркеров в составе отдельных везикул, что повышает диагностическую специфичность метода.

К основным недостаткам везикулярных онкомаркеров можно отнести, во-первых, недостаток информации о молекулярных особенностях или специфических компонентах ВНВ, секретируемых опухолевыми клетками и, во-вторых, необходимость детекции опухоль-ассоциированных компонентов в составе тотальной популяции ВНВ плазмы, где опухолевые ВНВ составляют лишь минорную фракцию. Эта особенность ограничивает диагностическую чувствительность способа.

Известен способ диагностики и мониторинга течения плоскоклеточной карциномы головы и шеи, в котором применяется технология выделения и последующая количественная оценка отдельных фракций ВНВ, предположительно секретируемых клетками опухоли. Рабочая гипотеза этого исследования предполагала, что экспрессия молекулы CD44v3(+) активирована в клетках опухоли, а количество CD44v3(+) ВНВ повышено в плазме пациентов. ВНВ были выделены из плазмы с помощью эксклюзионной хроматографии, затем фракция CD44v3(+) была выделена путем иммуносорбции на суперпарамагнитных частицах и относительное количество таких везикул было оценено методом проточной цитометрии ("on-bead") в образцах, полученных от пациентов и от здоровых доноров (20). В работе было показано, что количество CD44v3(+) ВНВ у пациентов коррелирует со стадией заболевания, а фракция CD44v3(+) ВНВ, выделенная из плазмы пациентов, содержит большее количество иммуносупрессивных компонентов, чем CD44v3(+) ВНВ в плазме доноров.

Способ не позволяет использовать его для диагностики КРР.

Известен способ диагностики меланомы, в основе которого лежало предположение о том, что мембрана клеток меланомы и, соответственно, ВНВ, секретируемых этими клетками, содержат специфический маркер CSPG4 (tumor antigen chondroitin sulfate proteoglycan 4) (21). Авторы использовали аналогичную технологию иммуносорбции ВНВ на поверхности суперпарамагнитных частиц, мечение и анализ методом проточной цитометрии. Авторами показан диагностический потенциал анализа CSPG4 маркера, который может быть использован для «отделения» ВНВ, секретируемых клетками меланомы от общей популяции ВНВ.

Способ не может использоваться для диагностики КРР, может рассматриваться как аналог по технологии исследования.

Задачей изобретения являлась разработка способа диагностики КРР путем иммуносорбции и количественной оценки ВНВ, секретируемых не исключительно клетками карциномы, а также клетками эпителия толстой кишки, который является источником опухоли. В основе способа лежит предположение о том, что развитие опухоли, клетки которой сохраняют признаки клеток кишечного эпителия, сопровождается повышением в крови содержания ВНВ, секретируемых такими клетками. Для выделения и количественной оценки таких везикул, была адаптирована технология иммуносорбции, но в качестве сорбирующих ВНВ антител были использованы антитела к мембранным белкам, которые экспрессируются исключительно или преимущественно клетками нормального кишечного эпителия. Для решения поставленной задачи были использованы антитела к белкам CLRN3, GPA33, GCNT3, PIG-Y и Reg IV.

Технический результат изобретения заключается в количественной оценке ВНВ, несущих маркеры клеток кишечного эпителия, путем иммуносорбции ВНВ с помощью супер-парамагнитных частиц (СПМЧ) и антител к белкам CLRN3, GPA33, GCNT3, PIG-Y и Reg IV, флуоресцентного мечения сорбированных ВНВ и анализа эффективности сорбции методом проточной цитометрии. Предложенная технология позволяет диагностировать КРР с чувствительностью 0,72 и специфичностью 0,76.

Указанный технический результат достигается в способе диагностики колоректального рака (КРР) путем количественной оценки концентрации внеклеточных нано-везикул (ВНВ), секретируемых клетками эпителия толстой кишки и/или клетками аденокарциномы толстой кишки (кВНВ), в составе тотальной популяции внеклеточных нано-везикул (ВНВ), в котором выделяют тотальную популяцию ВНВ плазмы, оценивают размер и концентрацию ВНВ с помощью анализа траекторий, при этом концентрация везикул должна быть в диапазоне 2x10¹¹/мл - 8x10¹¹/мл, мажорная фракция суспензии ВНВ - не менее 85%, размер везикул мажорной фракции - 80-110 нм, формируют иммуно-сорбирующие комплексы, состоящие из суперпарамагнитных частиц (СПМЧ) со стрептавидином и 5 антител к маркерам дифференцировки кишечного эпителия CLRN3, GPA33, GCNT3, PIG-Y, Reg IV, меченых биотином - СПМЧ-5АТ, комплексы СПМЧ-5АТ собирают на магнитном штативе, супернатант с несвязавшимися антителами отбирают и комплексы промывают два раза фосфатно-солевым буфером, отмытые комплексы СПМЧ-5АТ инкубируют с образцом тотальной фракции ВНВ в фосфатно-солевом буфере на вортексе при температуре +4°С, образовавшиеся комплексы СПМЧ-АТ-кВНВ собирают на магнитном штативе, супернатант с несвязавшимися кВНВ отбирают и комплексы промывают два раза фосфатно-солевым буфером на магнитном штативе, кВНВ в составе комплекса СПМЧ-АТ-кВНВ метят антителами к общим экзосомальным маркерам CD63 или CD9, несущими флуоресцентную метку FITC или PerCP, выделяют кВНВ и оценивают их количественно в составе иммуно-сорбирующих комплексов АТ-кВНВ-флАТ методом проточной цитометрии, при этом у пациентов с КРР фракция кВНВ составляет более 5% от тотальной популяции ВНВ плазмы.

Сущность способа иллюстрируется фиг. 1-3, где:

на фиг. 1 - интенсивность окрашивания, отражающая количество фиксированных кВНВ, оценивается с помощью проточной цитометрии;

на фиг. 2 - репрезентативные примеры анализа комплексов, приготовленных без инкубации с ВНВ плазмы (негативный контроль), и комплексов, содержащих кВНВ здорового донора и пациента с КРР;

на фиг. 3 - результаты анализа всех 40 образцов плазмы: пациентов с КРР (n=20) и здоровых доноров (n=20).

Клетки нормального эпителия толстой кишки имеют особый состав белков поверхностной мембраны: в ее состав входят так называемые маркеры дифференцировки кишечного эпителия. Как все остальные клетки организма, клетки кишечного эпителия секретируют ВНВ (кВНВ). В состав мембраны таких кВНВ также входят маркеры дифференцировки кишечного эпителия. Попадая из межклеточного пространства в другие физиологические жидкости, кВНВ составляют минорную фракцию ВНВ циркулирующей плазмы.

Таким образом, заявляемый способ основан на предположении, что развитие дифференцированной опухоли из клеток эпителия толстой кишки сопровождается секрецией клетками опухоли кВНВ, и, соответственно, повышением их концентрации в циркулирующей плазме. Маркеры дифференцировки кишечного эпителия в составе кВНВ не являются «онкомаркерами» в традиционном понимании, так как они характерны для везикул, секретируемых как нормальными клетками эпителия толстой кишки, так и клетками дифференцированной КРР (аденокарциномы). Но повышение концентрации кВНВ в плазме может служить диагностическим критерием КРР.

Технология количественной оценки кВНВ предполагает предварительное выделение тотальной популяции ВНВ плазмы любым доступным методом, например, с помощью двух-фазной полимерной системы (6) или ультра-центрифугирования (7). Затем, фракция кВНВ выделяется из тотальной популяции ВНВ плазмы с помощью супер-парамагнитных СПМЧ (10 мкм) на поверхности которых фиксированы антитела к маркерам дифференцировки кишечного эпителия: CLRN3, GPA33, GCNT3, PIG-Y, Reg IV (СПМЧ-5АТ). Такая комбинация антител обеспечивает эффективное выделения кВНВ. Фиксация антител к поверхности супер-парамагнитных частиц (СПМЧ) осуществляется любым доступным методом, например, через связь биотин-стрептавидин. После инкубации СПМЧ-5АТ с суспензией ВНВ плазмы и формирования связей между антителами на поверхности СПМЧ и маркерами (CLRN3, GPA33, GCNT3, PIG-Y, Reg IV) на мембране кВНВ, комплексы СПМЧ-5АТ-кВНВ отделяются с помощью магнитного штатива, фиксированные везикулы окрашиваются путем мечения (антителами CD9-FITC или CD63-FITC). Интенсивность окрашивания, отражающая количество фиксированных кВНВ, оценивается с помощью проточной цитометрии (Фиг. 1). Результаты анализа позволяют диагностировать КРР и/или проводить оценку эффекта системных методов противоопухолевой терапии пациентов с КРР.

Способ осуществляют, например, следующим образом.

1. Подготовка плазмы.

Плазму отделяют от форменных элементов крови путем центрифугирования в течение 15 минут при 1000xG. Затем верхнюю часть (плазму) отделяют от форменных элементов крови путем переноса в отдельную пробирку и снова подвергают центрифугированию в течение 15 минут 10000G для осаждения клеточного детрита и крупных мембранных везикул.

2. Выделение тотальной популяции ВНВ.

Из подготовленной таким образом плазмы (1,5 мл) выделяют тотальную популяцию ВНВ с помощью двухфазной полимерной системы (патент №2741776 от 28.01.2021), (6). Тотальная популяция везикул может быть выделена любым другим способом, например, традиционным методом ультрацентрифугирования. Для выделения кВНВ необходимо выделить ВНВ из 1,5 мл плазмы и ресуспендировать их в 100 мкл фосфатно-солевого буфера.

3. Оценка качества выделенных ВНВ.

После этапа выделения тотальной фракции ВНВ необходимо оценить их размер и концентрацию с помощью анализа траекторий наночастиц - АТН (nanoparticles tracking analysis, NTA). Допустимы колебания концентрации везикул в диапазоне 2х10¹¹/мл - 8x10¹¹/мл. Мажорная фракция суспензии ВНВ должна составлять не менее 85%, медиана размера везикул мажорной фракции может колебаться в диапазоне 80-110 нм.

4. Формирование иммуно-сорбирующих комплексов, СПМЧ-5АТ.

Супер-парамагнитные частицы (СПМЧ) размером 1-4 мкм, в концентрации 1 мг/мл, покрытые стрептавидином, СПМЧ (например, частицы производства ООО «Селекс», Москва) и моноклональные антитела (AT) к белкам интереса CLRN3, GPA33, GCNT3, PIG-Y и Reg IV (например AT к белку CLRN3: CSB-PA818764LD01HU; AT к белку GPA33: CSB-PA857459ED01HU; AT к белку GCNT3: CSB-PA009329LD01HU от «Cusabio», China; AT к белку PIG-Y: АВР56795; AT к белку Reg IV: АВР56724 от «Abbkine», China) в равном соотношении и суммарной концентрации 10 нг/мл смешивают в соотношении 1:10 в фосфатно-молевом буфере (100 мкл) и инкубируют в течение 1 часа при постоянном помешивании на вортексе при температуре +4°С. В ходе этой инкубации в результате образования биотин-стрептавидиновой связи формируются комплексы СПМЧ-5АТ. Комплексы СПМЧ-5АТ собирают на магнитном штативе, супернатант с несвязавшимися антителами отбирают и комплексы промывают два раза фосфатно-солевым буфером.

5. Формирование комплексов СПМЧ-5АТ-кВНВ (или выделение кВНВ).

Для выделения ВНВ, секретируемых клетками кишечного эпителия (кВНВ), отмытые комплексы СПМЧ-5АТ инкубируют с образцом тотальной фракции ВНВ в 100 мкл фосфатно-солевого буфера в течение ночи при постоянном помешивании на вортексе при температуре +4°С. Образовавшиеся комплексы СПМЧ-АТ-кВНВ собирают на магнитном штативе, супернатант с несвязавшимися ВНВ отбирают и комплексы промывают два раза фосфатно-солевым буфером на магнитном штативе.

6. Мечение и количественный анализ кВНВ.

ВНВ, в составе комплекса СПМЧ-АТ-кВНВ, метят антителами к общим экзосомальным маркерам CD63 или CD9, несущими флуоресцентную метку (FITC или PerCP). Разведения флуоресцентно меченных антител готовят согласно инструкциям производителей, инкубация в течение 2-6 часов в темноте при постоянном помешивании на вортексе при температуре +4°С. После инкубации связавшиеся комплексы СПМЧ-АТ-кВНВ-флАТ собирают на магнитном штативе, супернатант с несвязавшимися антителами отбирают и комплексы промывают два раза фосфатно-солевым буфером на магнитном штативе. Полученные комплексы ресуспендируют в 100 мкл фосфатно-солевого буфера. Количественную оценку везикул в составе комплексов СПМЧ-АТ-кВНВ-флАТ, проводят методом проточной цитометрии. В качестве негативного контроля используют СПМЧ-АТ, которые не инкубировали с ВНВ, но инкубировали с флуоресцентно меченными антителами, флАТ.

С целью оценки диагностической ценности способа образцы плазмы были получены от 20 пациентов с гистологически верифицированным диагнозом КРР (аденокарциномы) II-IIIa стадии и 20 здоровых доноров без жалоб или объективных признаков кишечной патологии.

Тотальная популяция ВНВ плазмы была выделена из 1,5 мл плазмы каждого образца с помощью двух-фазной полимерной системы (6). Размер и концентрация выделенных ВНВ была оценена путем анализа траекторий наночастиц, оба параметра соответствовали требованиям, изложенным выше. Иммуно-сорбирующие комплексы были сформированы в соответствии с протоколом в течение 1 часа, промыты дважды фосфатно-солевым буфером. Инкубация комплексов СПМЧ-5АТ с ВНВ плазмы проводилась в 100 мкл фосфатно-солевого буфера в течение ночи при постоянном помешивании на вортексе при температуре +4°С. Комплексы СПМЧ-5АТ-кВНВ были отмыты дважды фосфатно-солевым буфером от везикул плазмы. Везикулы в составе комплексов (кВНВ) были помечены антителами к CD63-FITC в соответствии с стандартным протоколом (концентрация антител 5 нг/мл, время инкубации 4 часа, в темноте при постоянном помешивании на вортексе при температуре +4°С. Полученные комплексы были дважды отмыты фосфатно-солевым буфером. Анализ проведен с помощью проточного цитометра CytoFLEX (Beckman Coulter, США).

На Фиг. 2 представлены репрезентативные примеры анализа комплексов, приготовленных без инкубации с ВНВ плазмы (негативный контроль), и комплексов, содержащих кВНВ здорового донора и пациента с КРР. Количество позитивных (флуоресцентных) комплексов составило 0,78%; 1,33% и 6,24%, соответственно. Две последние цифры отражают количество кВНВ в составе циркулирующей плазмы донора и пациента с КРР. Результаты анализа всех 40 образцов представлены на Фиг. 3. Статистическая значимость сравнения двух групп проведена методом Манн-Уитней (р<0,005). Диагностическая значимость разработанного метода оценена с помощью ROC (receiver operation curve) анализа: AUC=0,82; чувствительность - 0,72; специфичность - 0,76.

Способ подтверждается клиническими примерами получения количественной оценки кВНВ в плазме пациентов с КРР (n=20) и у здоровых доноров (n=20).

С целью оценки диагностической ценности метода, образцы плазмы были получены от 20 пациентов с гистологически верифицированным диагнозом колоректального рака (аденокарциномы) II-IIIa стадии и 20 здоровых доноров без жалоб или объективных признаков кишечной патологии. Тотальная популяция ВНВ плазмы была выделена из 1,5 мл плазмы каждого образца с помощью двух-фазной полимерной системы (6). Размер и концентрация выделенных ВНВ была оценена путем анализа траекторий наночастиц, оба параметра соответствовали требованиям, изложенным выше. Иммуно-сорбирующие комплексы были сформированы в соответствии с протоколом в течение 1 часа, промыты дважды фосфатно-солевым буфером. Инкубация комплексов СПМЧ-5АТ с ВНВ плазмы проводилась в 100 мкл фосфатно-солевого буфера в течение ночи при постоянном помешивании на вортексе при температуре +4°С. Комплексы СПМЧ-5АТ-кВНВ были отмыты дважды фосфатно-солевым буфером от везикул плазмы. Везикулы в составе комплексов (кВНВ) были помечены антителами к CD63-FITC в соответствии с стандартным протоколом (концентрация антител 5 нг/мл, время инкубации 4 часа, в темноте при постоянном помешивании на вортексе при температуре +4°С. Полученные комплексы были дважды отмыты фосфатно-солевым буфером. Анализ проведен с помощью проточного цитометра CytoFLEX (Beckman Coulter, США). На Фиг. 2 представлены репрезентативные примеры анализа комплексов, приготовленных без инкубации с ВНВ плазмы (негативный контроль), и комплексов, содержащих кВНВ здорового донора и пациента с КРР. Количество позитивных (флуоресцентных) комплексов составило 0,78%; 1,33% и 6,24%, соответственно. Две последние цифры отражают количество кВНВ в составе циркулирующей плазмы донора и пациента с КРР. Результаты анализа всех 40 образцов представлены на Фиг. 3. Статистическая значимость сравнения двух групп проведена методом Манн-Уитней (р<0,005). Диагностическая значимость разработанного метода оценена с помощью ROC (receiver operation curve) анализа: AUC=0,82; чувствительность - 0,72; специфичность - 0,76.

Заявляемый способ позволяет осуществить количественную оценку ВНВ, несущих маркеры клеток кишечного эпителия, и диагностировать КРР с чувствительностью 0,72 и специфичностью 0,76.

Заявляемый способ позволяет диагностировать КРР путем количественной оценки популяции внеклеточных нано-везикул, секретируемых клетками эпителия толстой кишки и/или клетками аденокарциномы толстой кишки (кВНВ) в составе тотальной популяции внеклеточных нано-везикул плазмы (ВНВ).

Источники информации:

1. А.Д. Каприн, В.В. Старинский ГВП. Злокачественные Новообразования В России 2018 (Заболеваемость И Смертность). Федеральная Служба Государственной Статистики. 2019.

2. Пузанов ДП, Половинкин ВВ, Пузанова И.А. Скрининг колоректального рака. Обзор существующих меодов и рекомендаций. Инновационная медицина Кубани. 2018;1(9):58-64.

3. Colombo М, Raposo G, Thery С. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annual review of cell and developmental biology. 2014.

4. Малек AB, Самсонов РБ, Кьези А. Перспективы разработки методов диагностики и мониторинга онкологических заболеваний на основе анализа экзосом, секретируемых опухолевыми клетками. Российский биотерапевтический журнал. 2015;4(14):9-18.

5. Whiteside TL. The potential of tumor-derived exosomes for noninvasive cancer monitoring: an update. Expert Rev Mol Diagn [Internet]. 2018 Dec 2;18(12):102SM0. Available from: https://www.tandfonline.com/doi/full/10.1080/14737159.2018.1544494.

6. Slyusarenko M, Nikiforova N, Sidina E, Nazarova I, Egorov V, Garmay Y, et al. Formation and Evaluation of a Two-Phase Polymer System in Human Plasma as a Method for Extracellular Nanovesicle Isolation. Polymers (Basel) [Internet]. 2021 Jan 31;13(3):458. Available from: https://www.mdpi.com/2073-4360/13/3/458.

7. Thery C, Amigorena S, Raposo G, Clayton A. Isolation and Characterization of Exosomes from Cell Culture Supernatants and Biological Fluids. Curr Protoc Cell Biol. 2006.

8. Rodriguez-Casanova A, Costa-Fraga N, Bao-Caamano A, Lopez-Lopez R, Muinelo-Romay L, Diaz-Lagares A. Epigenetic Landscape of Liquid Biopsy in Colorectal Cancer. Front Cell Dev Biol. 2021.

9. Федянин МЮ, Полянская EM, Тюляндин CA. Роль циркулирующей в крови опухолевой ДНК при раке толстой кишки. Онкологическая колопроктология. 2016;3(6):43-52.

10. Petit J, Carroll G, Gould T, Pockney P, Dun M, Scott RJ. Cell-Free DNA as a Diagnostic Blood-Based Biomarker for Colorectal Cancer: A Systematic Review. J Surg Res [Internet]. 2019 Apr;236:184-97. Available from: https://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0022480418308205.

11. Li M, Diehl F, Dressman D, Vogelstein B, Kinzler KW. BEAMing up for detection and quantification of rare sequence variants. Nat Methods. 2006.

12. Ogata-Kawata H, Izumiya M, Kurioka D, Honma Y, Yamada Y, Furuta K, et al. Circulating Exosomal microRNAs as Biomarkers of Colon Cancer. Akagi T, editor. PLoS One [Internet]. 2014 Apr 4;9(4):e92921. Available from: https://dx.plos.org/10.1371/journal.pone.0092921.

13. Tan Y, Wu H. The significant prognostic value of circulating tumor cells in colorectal cancer: A systematic review and meta-analysis. Current Problems in Cancer. 2018.

14. Dizdar L, Fluegen G, Dalum G, Honisch E, Neves RP, Niederacher D, et al. Detection of circulating tumor cells in colorectal cancer patients using the GILUPI CellCollector: results from a prospective, single□ center study. Mol Oncol [Internet]. 2019 Jul 17;13(7):1548-58. Available from: https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/1878-0261.12507.

15. Galanzha EI, Menyaev YA, Yadem AC, Sarimollaoglu M, Juratli MA, Nedosekin DA, et al. In vivo liquid biopsy using Cytophone platform for photoacoustic detection of circulating tumor cells in patients with melanoma. Sci TranslMed. 2019.

16. Kobayashi M, Kawachi H, Hurtado C, Wielandt AM, Ponce A, Karelovic S, et al. A Pilot Trial to Quantify Plasma Exosomes in Colorectal Cancer Screening from the International Collaborative Study between Chile and Japan. Digestion [Internet]. 2018;98(4):270-4. Available from: https://www.karger.com/Article/FullText/490559.

17. Ogata-Kawata H, Izumiya M, Kurioka D, Honma Y, Yamada Y, Furuta K, et al. Circulating Exosomal microRNAs as Biomarkers of Colon Cancer. Akagi T, editor. PLoS One [Internet]. 2014 Apr 4;9(4):e92921. Available from: https://dx.plos.org/10.1371/journal.pone.0092921.

18. Wang L, Duan W, Yan S, Xie Y, Wang C. Circulating long non-coding RNA colon cancer-associated transcript 2 protected by exosome as a potential biomarker for colorectal cancer. Biomed Pharmacother [Internet]. 2019 May; 113:108758. Available from: https://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0753332218382969.

19. Замбалова EA, Патышева MP, Димча AA, Тамкович CH, Григорьева AE, Колегова EC, et al. Экзосомальные протеиназы при колоректальном раке. Успехи молекулярной онкологии. 2018;5(4):117-26.

20. Theodoraki MN, Matsumoto A, Beccard I, Hoffmann TK, Whiteside TL. CD44v3 protein-carrying tumor-derived exosomes in HNSCC patients' plasma as potential noninvasive biomarkers of disease activity. Oncoimmunology. 2020.

21. Ferrone S, Whiteside TL. Targeting CSPG4 for isolation of melanoma cell-derived exosomes from body fluids. HNO [Internet]. 2020 Feb;68(2): 100-5. Available from: http://link.springer.com/10.1007/s00106-019-00811-1.

Способ диагностики колоректального рака (КРР) путем количественной оценки концентрации внеклеточных нановезикул (ВНВ), секретируемых клетками эпителия толстой кишки и/или клетками аденокарциномы толстой кишки (кВНВ), в составе тотальной популяции ВНВ, заключающийся в том, что выделяют тотальную популяцию ВНВ плазмы, оценивают размер и концентрацию ВНВ с помощью анализа траекторий, при этом концентрация везикул должна быть в диапазоне 2×10¹¹/мл - 8×10¹¹/мл, мажорная фракция суспензии ВНВ - не менее 85%, размер везикул мажорной фракции - 80-110 нм, формируют иммуно-сорбирующие комплексы, состоящие из суперпарамагнитных частиц (СПМЧ) со стрептавидином и 5 антител к маркерам дифференцировки кишечного эпителия CLRN3, GPA33, GCNT3, PIG-Y, Reg IV, меченых биотином - СПМЧ-5АТ, комплексы СПМЧ-5АТ собирают на магнитном штативе, супернатант с несвязавшимися антителами отбирают и комплексы промывают два раза фосфатно-солевым буфером, отмытые комплексы СПМЧ-5АТ инкубируют с образцом тотальной фракции ВНВ в фосфатно-солевом буфере на вортексе при температуре +4°С, образовавшиеся комплексы СПМЧ-АТ-кВНВ собирают на магнитном штативе, супернатант с несвязавшимися кВНВ отбирают и комплексы промывают два раза фосфатно-солевым буфером на магнитном штативе, кВНВ в составе комплекса СПМЧ-АТ-кВНВ метят антителами к общим экзосомальным маркерам CD63 или CD9, несущими флуоресцентную метку FITC или PerCP, выделяют кВНВ и оценивают их количественно в составе иммуно-сорбирующих комплексов АТ-кВНВ-флАТ методом проточной цитометрии, при этом у пациентов с КРР фракция кВНВ составляет более 5% от тотальной популяции ВНВ плазмы.