Индуцибельные гены rep aav

Авторы патента:

ВИССИНГ, Зильке (DE)

ФАУСТ, Николь (DE)

ХАЙН, Керстин (DE)

C12N7/04 - инактивация или истощение; получение субъединиц вирусов

C12N2750/14122 - Микроорганизмы или ферменты; их композиции (биоциды, репелленты или аттрактанты или регуляторы роста растений, содержащие микроорганизмы, вирусы, микробные грибки, ферменты, агенты брожения или вещества, получаемые или экстрагируемые из микроорганизмов или из материала животного происхождения A01N 63/00; пищевые составы A21,A23; лекарственные препараты A61K; химические аспекты или использование материалов для бандажей, перевязочных средств, впитывающих подкладок или хирургических приспособлений A61L; удобрения C05); размножение, консервирование или сохранение микроорганизмов (консервирование живых тканей или органов людей или животных A01N 1/02); мутации или генная инженерия; питательные среды (среды для микробиологических испытаний C12Q)

C12N15/8645 - Получение мутаций или генная инженерия; ДНК или РНК, связанные с генной инженерией, векторы, например плазмиды или их выделение, получение или очистка; использование их хозяев (мутанты или микроорганизмы, полученные генной инженерией C12N 1/00,C12N 5/00,C12N 7/00; новые виды растений A01H; разведение растений из тканевых культур A01H 4/00; новые виды животных A01K 67/00; использование лекарственных препаратов, содержащих генетический материал, который включен в клетки живого организма, для лечения генетических заболеваний, для генной терапии A61K 48/00 пептиды вообще C07K)

C12N15/86 - вирусные векторы

C12N15/63 - введение чужеродного генетического материала с использованием векторов; векторы; использование их хозяев; регулирование экспрессии

C07K14/005 - из вирусов

Владельцы патента RU 2772989:

СИВЕК ФАРМАСЬЮТИКАЛЗ ГМБХ (DE)

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, в частности к клеткам-хозяевам, предназначенным для получения белков Rep аденоассоциированного вируса (AAV) Rep78 и Rep68; к нуклеиновой кислоте, кодирующей белки Rep аденоассоциированного вируса (AAV) Rep78 и Rep68, и экспрессионному вектору, содержащему вышеупомянутую нуклеиновую кислоту, а также к способу продуцирования аденоассоциированного вируса (AAV). Изобретение обеспечивает стабильное получение векторов AAV, которое не требует временной трансфекции или вируса-помощника. 5 н. и 8 з.п. ф-лы, 9 ил., 5 табл., 4 пр.

Настоящее изобретение относится к клеткам-хозяевам, содержащим нуклеиновую кислоту, кодирующую белки Rep аденоассоциированного вируса (AAV) Rep78 и Rep68, где внутренний промотор p19 AAV инактивирован посредством одной или нескольких мутаций, которые сохраняют функциональность указанных белков Rep78 и Rep68. Кроме того, настоящее изобретение относится к соответствующим нуклеиновым кислотам и векторам, содержащим их, а также к соответствующим способам получения AAV.

Недавно произошел быстрый рост количества испытаний генной терапии и продуктов на основе векторов, происходящих из аденоассоциированного вируса (AAV). Преимуществами векторов AAV в генной терапии являются хороший профиль безопасности, тот факт, что такие векторы не являются патогенными, т.е. не ассоциированы с каким-либо заболеванием, стабильная экспрессия трансгенов и возможность трансдукции делящихся, а также не делящихся клеток.

Продуцирование рекомбинантного AAV требует, среди прочего, экспрессии белков Rep и Cap AAV, обычно кодируемых геномом AAV, для продуцирования рекомбинантного вируса, обеспечиваемого in trans. Кроме того, необходимо использовать гены-помощники, которые могут происходить из отличающихся вирусов-помощников, причем наиболее часто используемыми являются гены вирусов-помощников, взятые из аденовируса (AV), такие как РНК E1A, E1B, E2A, E4orf6 или VA. Более того, необходим вектор для переноса, содержащий представляющий интерес ген (GOI).

Современные системы, продуцирующие AAV, основаны по большей части на следующих технологиях, которые, однако, имеют несколько недостатков. Временная трансфекция генов rep AAV, например, с использованием системы из трех плазмид, содержащей вектор для переноса, содержащий представляющий интерес ген, плазмиду с функциями помощника аденовируса и плазмиду, обеспечивающую функции капсида и репликазы, лишена масштабируемости, надежности, воспроизводимости и вовлекает высокие затраты на ДНК категории GMP. Продуцирующие клеточные линии, которые по большей части основаны на клетках HeLa, все еще нуждаются в инфицировании вирусом-помощником, таким образом, требуя тщательной очистки и дорогостоящего подтверждения отсутствия вирусов-помощников. Индуцибельная экспрессия генов rep AAV посредством встраивания стоп-кассеты в локус rep ниже промотора p19 требует встраивания искусственного интрона, который содержит стоп-сигнал (например, поли(A) SV40), фланкированный двумя участками loxP. Кроме того, клеткам требуется рекомбиназа Cre, которая распознает участки loxP и вырезает стоп-кассету. Она должна быть либо предоставлена в индуцибельной форме, либо посредством модифицированного аденоассоциированного вектора, требующего дорогостоящего подтверждения отсутствия вируса-помощника. Кроме того, опосредуемая Cre рекомбинация часто демонстрирует только низкую эффективность.

Таким образом, современные системы, продуцирующие AAV, ограничены в отношении масштабируемости, надежности, воспроизводимости, простоты применения и стоимости. Таким образом, является в высокой степени желательным стабильное получение векторов AAV, которые не требуют временной трансфекции или вируса-помощника.

Таким образом, технической проблемой, лежащей в основе настоящего изобретения, является предоставление соответствующих клеток-хозяев, нуклеиновых кислот, векторов и способов, обеспечивающих такую систему.

Решение описанной выше технической проблемы достигается посредством вариантов осуществления, охарактеризованных в формуле изобретения.

В частности, в первом аспекте настоящее изобретение относится к клетке-хозяину, содержащей нуклеиновую кислоту, кодирующую белки Rep аденоассоциированного вируса (AAV) Rep78 и Rep68, где внутренний промотор p19 AAV инактивирован посредством одной или нескольких мутаций, которые сохраняют функциональность указанных белков Rep78 и Rep68.

В этом контексте стабильные продуцирующие клеточные линии для продуцирования AAV трудно получать, поскольку белки Rep являются токсичными для клеток. Экспрессия белков Rep регулируется E1A, который также необходим для продуцирования AAV. В клеточных линиях, таких как клетки CAP, клетки HEK293 или клетки Per.C6, E1A уже конститутивно экспрессируется. Всего существует четыре белка Rep: два длинных (Rep78, Rep68), которые экспрессируются с промотора p5, и два коротких (Rep52, Rep40), которые экспрессируются с внутреннего промотора p19, расположенного в кодирующей области длинных белков Rep (для схематического изображения см. фиг.1).

Промотор p5 может быть заменен индуцибельным промотором, но не внутренним промотором p19, который является частью кодирующей области Rep78 и Rep68. Таким образом, получение упаковывающих/продуцирующих клеточных линий, основанное на клетках, конститутивно экспрессирующих E1A, является невозможным, поскольку это привело бы к конститутивной экспрессии токсических уровней Rep52 и Rep40. Другим клеточным линиям, не экспрессирующим конститутивно EA1, необходим индуцибельный E1A или предоставление E1A, например, путем инфицирования аденовирусом, что несет в себе недостатки, описанные выше.

Эта проблема преимущественно решается настоящим изобретением, которое основано на инактивации внутреннего промотора p19 AAV посредством мутаций, которые препятствуют конститутивной экспрессии Rep52 и Rep40, одновременно сохраняя функциональность указанных белков Rep78 и Rep68.

Термины "Аденоассоциированный вирус" и "AAV", как используют в рамках изобретения, не ограничиваются конкретными серотипами AAV. В этом контексте следует отметить, что белки Rep AAV являются в высокой степени консервативными среди различных серотипов AAV. В конкретных вариантах осуществления описанные выше термины относятся к аденоассоциированному вирусу серотипа 2 (AAV2).

Термин "сохранять функциональность указанных белков Rep78 и Rep68", как используют в рамках изобретения, относится к тому факту, что мутации в соответствии с настоящим изобретением не снижают функциональную активность указанных белков или снижают указанную активность не более чем на 30%, предпочтительно не более чем на 25%, не более чем на 20%, не более чем на 15%, не более чем на 12,5%, не более чем на 10%, не более чем на 7,5%, не более чем на 5%, не более чем на 4%, не более чем на 3%, не более чем на 2% или не более чем на 1%.

В предпочтительных вариантах осуществления одна или несколько мутаций в соответствии с настоящим изобретением находятся по меньшей мере в одном из регуляторных участков промотора p19, предпочтительно в области SP1 -50 (нуклеотиды 817-829), области TATA -20 (нуклеотиды 843-849) или области TATA -35 (нуклеотиды 830-835). В частности, указанные одна или несколько мутаций могут быть в области SP1 -50, в области TATA -20, в области TATA -35, как в области SP1 -50, так и в области TATA -20, как в области SP1 -50, так и в области TATA -35, как в области TATA -20, так и в области TATA -35, или во всех трех областях, т.е. в области SP1 -50, области TATA -20 и области TATA -35. В частности, в рамках настоящего изобретения было показано, что даже мутация одного нуклеотида в одной из указанных областей преимущественно приводит к значительному снижению экспрессии Rep52 и Rep40.

В этом контексте все положения нуклеотидов, как указано в настоящем описании, относятся к полной геномной последовательности AAV2, доступной под номером доступа GenBank AF043303. Указанное применимо к всем положениям аминокислот. Кроме того, в таблице 1 ниже представлен перечень однонуклеотидной номенклатуры в соответствии с IUPAC.

Таблица 1: Однобуквенная номенклатура нуклеотидов в соответствии с IUPAC.

Буква	Нуклеотиды
W	A; T
S	C; G
M	A; C
K	G; T
R	A; G
Y	C; T
B	C; G; T
D	A; G; T
H	A; C; T
V	A; C; G

В предпочтительных вариантах осуществления одна или несколько мутаций в соответствии с настоящим изобретением, которые инактивируют внутренний промотор p19, представляют собой молчащие мутации, т.е. мутации, которые не изменяют кодируемую аминокислоту.

Предпочтительно, указанные одна или несколько мутаций включают по меньшей мере одну мутацию, выбранную из группы, состоящей из мутаций 731C>D, 732A>C, 734A>B, 737T>C, 746A>G, 749C>D, 752G>H, 758G>A, 761G>H, 764G>H, 818G>A, 824G>H, 830T>V, 833T>C, 845T>C, 846T>C, 848A>B или 848A>G, 849A>T, 850G>C и 851C>D.

В случаях, когда указанные одна или несколько мутаций находятся в области SP1 -50 промотора p19, указанные мутации включают по меньшей мере одну мутацию, выбранную из группы, состоящей из мутаций 818G>A и 824G>H. В случаях, когда одна или несколько мутаций находятся в области TATA -20 промотора p19, указанные мутации включают по меньшей мере одну мутацию, выбранную из группы, состоящей из мутаций 845T>C, 846T>C, 848A>B или 848A>G и 849A>T. В случаях когда указанные одна или несколько мутаций находятся в области TATA -35 промотора p19, указанные мутации включают по меньшей мере одну мутацию, выбранную из группы, состоящей из мутаций 830T>V и 833T>C.

В предпочтительных вариантах осуществления указанные одна или несколько мутаций включают 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или все 20 из указанных выше мутаций. Таким образом, клетки-хозяева по настоящему изобретению могут содержать нуклеиновую кислоту, содержащую любую одну, любые две и три, любые четыре, любые пять, любые шесть, любые семь, любые восемь, любые девять, любые десять, любые одиннадцать, любые двенадцать, любые 13, любые 14, любые 15, любые 16, любые 17, любые 18, любые 19 или все 20 из мутаций 731C>D, 732A>C, 734A>B, 737T>C, 746A>G, 749C>D, 752G>H, 758G>A, 761G>H, 764G>H, 818G>A, 824G>H, 830T>V, 833T>C, 845T>C, 846T>C, 848A>B или 848A>G, 849A>T, 850G>C и 851C>D.

Нуклеиновая кислота, используемая в рамках настоящего изобретения, кодирующая белки Rep аденоассоциированного вируса (AAV) Rep78 и Rep68, где внутренний промотор p19 AAV инактивирован молчащими мутациями, предпочтительно представляет собой нуклеиновую кислоту, содержащую по меньшей мере одну нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из нуклеотидных последовательностей согласно SEQ ID NO: 1-8, 11-14 и 34-42. В особенно предпочтительных вариантах осуществления указанная нуклеиновая кислота содержит нуклеотидную последовательность согласно SEQ ID NO: 1, 6, 8, 13, 14, 34-39, 41 и 42.

В этом контексте "внутренний промотор", как используют в рамках изобретения, указывает на тот факт, что промотор p19 AAV находится в кодирующей последовательности Rep78 и Rep68 и формирует часть указанной кодирующей последовательности. Кроме того, термин "инактивированный" в отношении промотора p19 AAV указывает на тот факт, что посредством внесения молчащих мутаций в промоторную область p19 AAV указанный промотор имеет устраненную или по меньшей мере значительно сниженную (например, сниженную по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере 99%) активность промотора.

Нуклеотидные последовательности согласно SEQ ID NO: 1-8, 11-14 и 34-42 соответствуют промоторной области p19 AAV (нуклеотиды 651-1053 генома AAV2), где присутствуют паттерны мутаций, указанные в таблице 2 ниже.

В предпочтительных вариантах осуществления нуклеиновая кислота, используемая в рамках настоящего изобретения, кодирующая белки Rep аденоассоциированного вируса (AAV) Rep78 и Rep68, где внутренний промотор p19 AAV инактивирован посредством молчащих мутаций, предпочтительно представляет собой нуклеиновую кислоту, содержащую нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из нуклеотидных последовательностей согласно SEQ ID NO: 15-22, 25-28 и 43-51. В особенно предпочтительных вариантах осуществления указанная нуклеиновая кислота содержит нуклеотидную последовательность согласно SEQ ID NO: 15, 20, 22, 27, 28, 43-48, 50 и 51.

Нуклеотидные последовательности согласно SEQ ID NO: 15-22, 25-28 и 43-51 соответствуют кодирующей области AAV для белков Rep: Rep78, Rep68, Rep52 и Rep40 (нуклеотиды 321-2252 генома AAV2), где промоторная область p19 (нуклеотиды 651-1053 генома AAV2) заменена мутантной промоторной областью p19, содержащей мутации, указанные в таблице 2 ниже.

Таблица 2: Предпочтительные паттерны мутаций промоторной области p19

SEQ ID NO:	Паттерн мутации	Мутации
1/15	mut19	731C>D; 732A>C; 734A>B; 737T>C; 746A>G; 749C>D; 752G>H; 758G>A; 761G>H; 764G>H; 818G>A; 824G>H; 830T>V; 833T>C; 845T>C; 848A>G; 849A>T; 850G>C; 851C>D
2/16	mut5	845T>C; 848A>G; 849A>T; 850G>C; 851C>D
3/17	mut1	848A>G
4/18	mut2	849A>T; 850G>C
5/19	mut1-2	845T>C
6/20	mut14	731C>D; 732A>C; 734A>B; 737T>C, 746A>G; 749C>D; 752G>H, 758G>A; 761G>H; 764G>H, 818G>A; 824G>H, 830T>V; 833T>C
7/21	mut10	731C>D; 732A>C; 734A>B; 737T>C, 746A>G; 749C>D; 752G>H; 758G>A; 761G>H; 764G>H
8/22	mut10-2	818G>A; 824G>H, 830T>V; 833T>C, 845T>C; 846T>C; 848A>B; 849A>T; 850G>C; 851C>D
11/25	mut2-3	846T>C; 848A>B
12/26	mut1-3	846T>C
13/27	mut5-2	845T>C, 846T>C; 848A>B, 849A>T, 850G>C
14/28	mut20	731C>D; 732A>C; 734A>B; 737T>C, 746A>G; 749C>D; 752G>H, 758G>A; 761G>H; 764G>H, 818G>A; 824G>H, 830T>V; 833T>C, 845T>C, 846T>C; 848A>B, 849A>T, 850G>C, 851C>D
34/43	L (SP1 -50)	818G>A; 824G>H
35/44	M (TATA -20)	830T>V; 833T>C
36/45	N (SP1 -50 1)	818G>A
37/46	O (SP1 -50 2)	824G>H
38/47	P (TATA -20 1)	830T>V
39/48	Q (TATA -20 2)	833T>C
40/49	R (SP1 -50 и TATA -35)	818G>A; 824G>H; 830T>V; 833T>C
41/50	S (SP1 -50 и TATA -20)	818G>A; 824G>H; 845T>C, 846T>C; 848A>B, 849A>T, 850G>C
42/51	T (TATA -20 и TATA -35)	830T>V; 833T>C; 845T>C, 846T>C; 848A>B, 849A>T, 850G>C

В других предпочтительных вариантах осуществления одна или несколько мутаций в соответствии с настоящим изобретением, которые инактивируют внутренний промотор p19, представляют собой мутации, которые приводят к одной или нескольким консервативным заменам аминокислот, т.е. заменам аминокислоты на отличающуюся аминокислоту со сходными биохимическими свойствами (например, в отношении заряда, гидрофобности или размера). Предпочтительно, указанные одна или несколько аминокислотных замен представляют собой аминокислотные замены, происходящие в пределах класса алифатических аминокислот (Gly, Ala, Val, Leu, Ile), в пределах класса гидроксил- или сера/селен-содержащих аминокислот (Ser, Cys, Sec, Thr, Met), в пределах класса основных аминокислот (His, Lys, Arg) или в пределах класса кислотных аминокислот (Asp, Glu, Asn, Gln).

В конкретных вариантах осуществления указанные одна или несколько аминокислотных замен включают аминокислотные замены Leu176>Ala и/или Ala168>Gly.

В этом отношении нуклеиновая кислота, используемая в рамках настоящего изобретения, кодирующая белки Rep аденоассоциированного вируса (AAV) Rep78 и Rep68, где внутренний промотор p19 AAV инактивирован посредством мутаций, приводящих к консервативным аминокислотным заменам, предпочтительно представляет собой нуклеиновую кислоту, содержащую по меньшей мере одну нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из нуклеотидных последовательностей согласно SEQ ID NO: 9 и 10.

В этом контексте термин "инактивированный" в отношении промотора p19 AAV указывает на тот факт, что посредством внесения мутаций, приводящих к консервативным аминокислотным заменам, в промоторную область p19 AAV указанный промотор имеет устраненную или по меньшей мере значительно сниженную (например, сниженную по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99%) промоторную активность.

Нуклеотидные последовательности согласно SEQ ID NO: 9 и 10 соответствуют промоторной области p19 AAV (нуклеотиды 651-1053 генома AAV2), где присутствуют паттерны мутаций, указанные в таблице 3 ниже.

В предпочтительных вариантах осуществления нуклеиновая кислота, используемая в рамках настоящего изобретения, кодирующая белки Rep аденоассоциированного вируса (AAV) Rep78 и Rep68, где внутренний промотор p19 AAV инактивирован посредством мутаций, приводящих к консервативным аминокислотным заменам, представляет собой нуклеиновую кислоту, содержащую по меньшей мере одну нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из нуклеотидных последовательностей согласно SEQ ID NO: 23 и 24.

Нуклеотидные последовательности согласно SEQ ID NO: 23 и 24 соответствуют кодирующей области AAV для белков Rep: Rep78, Rep68, Rep52 и Rep40 (нуклеотиды 321-2252 генома AAV2), где промоторная область p19 (нуклеотиды 651-1053 генома AAV2) заменена мутантной промоторной областью p19, содержащей мутации, указанные в таблице 3 ниже.

Таблица 3: Предпочтительные паттерны мутаций промоторной области p19.

SEQ ID NO:	Паттерн мутаций	Мутации	Конечная аминокислотная замена
9/23	mut3	846T>G, 847T>C, 848A>B	Leu176>Ala
10/24	mut2-2	823C>G, 824G>H	Ala168>Gly

Нуклеиновая кислота, находящаяся в клетке-хозяине по настоящему изобретению, кроме того, может содержать по меньшей мере один элемент, выбранный из группы, состоящей из индуцибельных промоторов, областей поли(A), селективных маркеров, последовательностей IRES и энхансерных элементов. Подходящие индуцибельные промоторы конкретно не ограничены и известны в данной области, например, Tet-индуцибельные промоторы, такие как промотор TRE3G третьего поколения. Подходящие области поли(A) конкретно не ограничены и известны в данной области, например, область поли(A) SV40. Подходящие селективные маркеры конкретно не ограничены и известны в данной области, например, кассеты устойчивости к антибиотикам, такие как кассеты устойчивости к бластицидину или ампициллину.

Настоящее изобретение также относится к клеткам-хозяевам, содержащим нуклеиновую кислоту, обладающую по меньшей мере 70% идентичностью последовательности с нуклеиновой кислотой, как определено выше, при условии, что присутствуют конкретные мутации, определенные выше. В этом контексте термин "при условии, что присутствуют конкретные мутации, определенные выше" относится к следующим ситуациям (i)-(xxiii):

(i) в нуклеотидных последовательностях, происходящих из нуклеотидных последовательностей согласно SEQ ID NO: 1 или 15, присутствуют мутации 731C>D; 732A>C; 734A>B; 737T>C; 746A>G; 749C>D; 752G>H; 758G>A; 761G>H; 764G>H; 818G>A; 824G>H; 830T>V; 833T>C; 845T>C; 848A>G; 849A>T; 850G>C и 851C>D;

(ii) в нуклеотидных последовательностях, происходящих из нуклеотидных последовательностей согласно SEQ ID NO: 2 или 16, присутствуют мутации 845T>C; 848A>G; 849A>T; 850G>C; и 851C>D;

(iii) в нуклеотидных последовательностях, происходящих из нуклеотидных последовательностей согласно SEQ ID NO: 3 или 17, присутствует 848A>G;

(iv) в нуклеотидных последовательностях, происходящих из нуклеотидных последовательностей согласно SEQ ID NO: 4 или 18, присутствуют мутации 849A>T и 850G>C;

(v) в нуклеотидных последовательностях, происходящих из нуклеотидных последовательностей согласно SEQ ID NO: 5 или 19 присутствует мутация 845T>C;

(vi) в нуклеотидных последовательностях, происходящих из нуклеотидных последовательностей согласно SEQ ID NO: 6 или 20, присутствуют мутации 731C>D; 732A>C; 734A>B; 737T>C, 746A>G; 749C>D; 752G>H, 758G>A; 761G>H; 764G>H, 818G>A; 824G>H, 830T>V и 833T>C;

(vii) в нуклеотидных последовательностях, происходящих из нуклеотидных последовательностей согласно SEQ ID NO: 7 или 21, присутствуют мутации 731C>D; 732A>C; 734A>B; 737T>C, 746A>G; 749C>D; 752G>H; 758G>A; 761G>H и 764G>H;

(viii) в нуклеотидных последовательностях, происходящих из нуклеотидных последовательностей согласно SEQ ID NO: 8 или 22, присутствуют мутации 818G>A; 824G>H, 830T>V; 833T>C, 845T>C; 846T>C; 848A>B; 849A>T; 850G>C и 851C>D;

(ix) в нуклеотидных последовательностях, происходящих из нуклеотидных последовательностей согласно SEQ ID NO: 9 или 23, присутствуют мутации 846T>G, 847T>C и 848A>B;

(x) в нуклеотидных последовательностях, происходящих из нуклеотидных последовательностей согласно SEQ ID NO: 10 или 24, присутствуют мутации 823C>G и 824G>H;

(xi) в нуклеотидных последовательностях, происходящих из нуклеотидных последовательностей согласно SEQ ID NO: 11 или 25, присутствуют мутации 846T>C и 848A>B;

(xii) в нуклеотидных последовательностях, происходящих из нуклеотидных последовательностей согласно SEQ ID NO: 12 или 26, присутствует мутация 846T>C;

(xiii) в нуклеотидных последовательностях, происходящих из нуклеотидных последовательностей согласно SEQ ID NO: 13 или 27, присутствуют мутации 845T>C, 846T>C; 848A>B, 849A>T, и 850G>C;

(xiv) в нуклеотидных последовательностях, происходящих из нуклеотидных последовательностей согласно SEQ ID NO: 14 или 28, присутствуют мутации 731C>D; 732A>C; 734A>B; 737T>C, 746A>G; 749C>D; 752G>H, 758G>A; 761G>H; 764G>H, 818G>A; 824G>H, 830T>V; 833T>C, 845T>C, 846T>C; 848A>B, 849A>T, 850G>C и 851C>D;

(xv) в нуклеотидных последовательностях, происходящих из нуклеотидных последовательностей согласно SEQ ID NO: 34 или 43, присутствуют мутации 818G>A и 824G>H;

(xvi) в нуклеотидных последовательностях, происходящих из нуклеотидных последовательностей согласно SEQ ID NO: 35 или 44, присутствуют мутации 830T>V и 833T>C;

(xvii) в нуклеотидных последовательностях, происходящих из нуклеотидных последовательностей согласно SEQ ID NO: 36 или 45, присутствует мутация 818G>A;

(xviii) в нуклеотидных последовательностях, происходящих из нуклеотидных последовательностей согласно SEQ ID NO: 37 или 46, присутствует мутация 824G>H;

(xix) в нуклеотидных последовательностях, происходящих из нуклеотидных последовательностей согласно SEQ ID NO: 38 или 47, присутствует мутация 830T>V;

(xx) в нуклеотидных последовательностях, происходящих из нуклеотидных последовательностей согласно SEQ ID NO: 39 или 48, присутствует мутация 833T>C;

(xxi) в нуклеотидных последовательностях, происходящих из нуклеотидных последовательностей согласно SEQ ID NO: 40 или 49, присутствуют мутации 818G>A; 824G>H; 830T>V и 833T>C;

(xxii) в нуклеотидных последовательностях, происходящих из нуклеотидных последовательностей согласно SEQ ID NO: 41 или 50, присутствуют мутации 818G>A; 824G>H; 845T>C, 846T>C; 848A>B, 849A>T и 850G>C; и

(xxiii) в нуклеотидных последовательностях, происходящих из нуклеотидных последовательностей согласно SEQ ID NO: 42 или 51, присутствуют мутации 830T>V, 833T>C, 845T>C, 846T>C; 848A>B, 849A>T и 850G>C.

Предпочтительно указанные нуклеиновые кислоты обладают по меньшей мере 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 95,5%, 96%, 96,5%, 97%, 97,5%, 98%, 98,2%, 98,4%, 98,6%, 98,8%, 99%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8% или 99,9% идентичностью последовательности с нуклеиновой кислотой, как определено выше. В конкретных вариантах осуществления такие нуклеиновые кислоты имеют 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидных делеций, инсерций или замен (обменов).

Соответствующие нуклеиновые кислоты, имеющие определенную идентичность последовательности с нуклеиновой кислотой, как определено выше, или имеющие конкретные делеции, инсерции или замены нуклеотидов относительно нуклеиновой кислоты, как определено выше, не включают никакие нуклеиновые кислоты, имеющие мутацию со сдвигом рамки считывания любого типа, а также нуклеиновые кислоты, кодирующие нефункциональные белки Rep78 и Rep68, т.е. указанные нуклеиновые кислоты все еще кодируют функциональные белки Rep78 и Rep68.

В предпочтительных вариантах осуществления нуклеиновая кислота, находящаяся в клетках-хозяевах по настоящему изобретению, стабильно встроена в геном клетки-хозяина. В других предпочтительных вариантах осуществления нуклеиновая кислота, содержащаяся в клетка-хозяевах по настоящему изобретению, содержится в векторе, т.е. является частью вектора. Указанный вектор предпочтительно представляет собой вектор, выбранный из группы, состоящей из плазмидных векторов, вирусных векторов, космидных векторов и векторов на основе искусственных хромосом. Предпочтительно указанный вектор представляет собой экспрессирующий вектор.

В соответствии с настоящим изобретением внутренний промотор p19 AAV инактивирован путем внесения молчащих мутаций или мутаций, приводящих к консервативным аминокислотным заменам. Таким образом, нуклеиновая кислота, кодирующая Rep78 и Rep68, может быть помещена под контроль индуцибельного промотора, где не происходит конститутивная экспрессия Rep52 и Rep40. Однако поскольку продуцирование AAV требует всех четырех белков Rep, дополнительная нуклеиновая кислота, кодирующая Rep52 и Rep40, может быть помещена под контроль того же промотора, идентичного промотора или отличающегося промотора. Таким образом, в конкретных вариантах осуществления клетка-хозяин по настоящему изобретению, кроме того, содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую белки Rep AAV Rep52 и Rep40 под контролем индуцибельного промотора. Эта нуклеиновая кислота может быть частью вектора, как определено выше, или нуклеиновой кислоты, кодирующей Rep78 и Rep68.

Клетки-хозяева, пригодные в рамках настоящего изобретения, конкретно не ограничены и известны в данной области. Предпочтительно, указанные клетки-хозяева обладают конститутивной экспрессией E1A. В предпочтительных вариантах осуществления указанные клетки-хозяева представляют собой клетки CAP, клетки HEK293 или клетки Per.C6, т.е. происходят из указанных клеточных линий.

Способы получения клеток-хозяев по настоящему изобретению, т.е. способы внесения нуклеиновых кислот по настоящему изобретению в подходящие клетки-хозяева конкретно не ограничены и известны в данной области. Указанное применимо к способам получения нуклеиновых кислот и векторов по настоящему изобретению.

Во втором аспекте настоящее изобретение относится к нуклеиновым кислотам и векторам, как определено выше.

В третьем аспекте настоящее изобретение относится к способу продуцирования аденоассоциированного вируса (AAV), включающему стадию рекомбинантной экспрессии белков Rep AAV Rep78 и Rep68 в клетке-хозяине в соответствии с настоящим изобретением.

Соответствующие способы получения необходимых нуклеиновых кислот, векторов и/или клеток-хозяев, а также соответствующие способы экспрессии, конкретно не ограничены и известны в данной области.

Предпочтительно, способ по настоящему изобретению, кроме того, включает стадию рекомбинантной экспрессии белков Rep AAV Rep52 и Rep40 в указанных клетках-хозяевах.

Как используют в рамках изобретения, термин "содержащий"/"содержит" прямо включает термины "по существу состоящий из"/"по существу состоит из" и "состоящий из"/"состоит из", т.е. все из указанных терминов являются взаимозаменяемыми друг с другом.

В соответствии с настоящим изобретением предусматриваются клетки-хозяева, которые могут экспрессировать белки Rep AAV Rep78 и Rep68 без конститутивной экспрессии Rep52 и Rep40. Этого достигают путем предоставления нуклеиновых кислот, где внутренняя промоторная область p19 AAV инактивирована путем внесения конкретных мутаций.

Промоторы активируются путем связывания определенных факторов транскрипции и базового транскрипционного комплекса; эти факторы распознают определенные участки связывания в промоторной области, которые ранее были описаны для промотора p19. Внесение мутаций в эти участки связывания препятствуют активации промотора. Поскольку целостность длинных белков Rep должна быть сохранена, выбирают мутации, которые не изменяют нуклеотидную последовательность, а в генетическом коде кодируют ту же аминокислоту и, таким образом, приводят к образованию того же белка (молчащие мутации), или выбирают мутации, которые изменяют нуклеотидную последовательность, чтобы произошли консервативные аминокислотные замены.

После внесения вышеуказанных мутаций является возможным разделение элементов экспрессии для длинных и коротких белков Rep: экспрессирующая кассета для длинных белков Rep содержит мутантный промотор p19 с указанными мутациями. Выделенный элемент экспрессии для коротких белков Rep начинается ниже промотора p19 с инициирующим кодоном. Затем экспрессия обоих элементов может быть помещена под контроль индуцибельного промотора (например, как в случае индуцибельных промоторов Tet). Исходя из этого, можно получать стабильную упаковывающую/продуцирующую клеточную линию.

Клетки-хозяева, нуклеиновые кислоты, векторы и способы по настоящему изобретению представляют собой систему продуцирования AAV, которая преимущественно характеризуется лучшей воспроизводимостью, обеспечивающей неизменное качество, масштабируемость и экономичность, и которая не требует использования вируса-помощника.

На чертежах представлено:

Фиг.1:

Схематичный обзор локуса rep.

Фиг.2:

Схематичный обзор экспрессирующей конструкции для индуцибельных белков Rep.

Фиг.3:

Обзор проанализированных паттернов мутаций с SEQ ID NO: соответствующей кодирующей области белков Rep AAV2 (также см. таблицу 2). Указание на "SEQ-ID" на фиг.3 относится к соответствующим SEQ ID NO.

Фиг.4:

Экспрессия различных белков Rep в клетках CAP при трансфекции различными конструкциями, содержащими молчащие мутации в регуляторных последовательностях промотора p19 (таблица 2), и конструкциями дикого типа (wt). Детекцию уровней белков проводили в клеточных лизатах временно трансфицированных CAP-T-клеток через 72 ч после трансфекции с использованием антитела против репликазы (Progen). В качестве контроля был включен клеточный лизат нетрансфицированных клеток (Bl). Указание на номера "ID" на фиг.4 относится к соответствующим SEQ ID NO.

Фиг.5:

Количественное определение на вестерн-блотах с антителом против Rep. Полосы белка Rep количественно определяли посредством денситометрического анализа с использованием ImageJ. Вычисляли соотношение полос длинного и короткого белка Rep и это значение wt принимали за 1. Все другие величины приводили к wt. Указание на номера "ID" на фиг.5 относится к соответствующим SEQ ID NO.

Фиг.6:

Индуцибельная экспрессия белков Rep в стабильной происходящей из CAP клеточной линии при индукции посредством 1 мкг/мл доксицилина. Детекцию белков Rep проводили посредством иммуноблоттинга с антителом против репликазы (Progen). В качестве контроля загружали клеточный лизат неиндуцированных клеток (-Dox). На уровне ~80 кДа определялась неспецифическая фоновая полоса.

Фиг.7:

Индукция белков Rep добавлением 1 мкг/мл доксицилина в клонах единичных клеток, происходящих из стабильной клеточной линии. Клетки временно трансфицировали необходимыми компонентами для продуцирования rAAV5 и индуцировали 1 мкг/мл доксицилина через 5 ч после трансфекции. Через 72 ч после трансфекции получали клеточные лизаты и проводили детекцию экспрессии белков Rep посредством иммуноблоттинга с антителом против репликазы (Progen). Клоны 5B6 и 2E3 экспрессируют очень низкие уровни длинных белков Rep.

Фиг.8:

Титры вирусов для продуцирования rAAV5 клонами с индуцибельной экспрессией Rep. Измерение количества вирусных геномов/мл проводили посредством кПЦР с комбинацией праймеров/зондов, выявляющих промотор CMV, с использованием линеаризованнной плазмиды для переноса в качестве стандарта. Клоны единичных клеток 5B6 и 2E3 не демонстрируют заметной экспрессии длинных и коротких белков Rep и, таким образом, продуцируют только очень низкие титры rAAV5.

Фиг.9:

(A и B): Экспрессия различных белков Rep в клетках CAP при трансфекции различными конструкциями, содержащими мутации в регуляторных последовательностях промотора p19 (таблица 3), приводящими к консервативным аминокислотным заменам, и конструкцией дикого типа (wt). Определение уровней белков в клеточных лизатах временно трансфицированных клеток CAP-T проводили через 72 ч после трансфекции с использованием антитела против репликазы (Progen). В качестве контроля включали клеточный лизат нетрансфицированных клеток (Bl).

(C): Продуцирование вируса при трансфекции клеток CAP следующей комбинацией конструкций: pStbl-Rep-p19mut-ID 47, 48 или 37 или wt, pStbl-TRE3G-Rep50/42, pCMV-Tet3G, pHelper, pStbl-CMV-Cap5, pAAV-GFP. Определение количества вирусных геномов/мл проводили посредством кПЦР с комбинацией праймер/зонд, определяющей поли-A SV40, с использованием линеаризованной плазмиды для переноса в качестве стандарта.

Указание на номера "ID" на фиг.9 относится к соответствующим SEQ ID NO.

Настоящее изобретение далее проиллюстрировано с использованием следующих примеров, но оно не ограничивается ими.

Примеры

Методики экспериментов:

Клонирование экспрессирующих конструкций.

Синтез локуса rep AAV2 с участками рестрикции HpaI на каждом конце и регуляторными участками в промоторе p19. Геномная последовательность AAV2 была взята из GenBank: AF043303 (нуклеотиды 162-2332). Последовательность синтетического локуса представлена в SEQ ID NO: 29.

Конструировали различные конструкции для промоторной области p19 (нуклеотиды 651-1053 генома AAV2), содержавшие различные количества молчащих мутаций в регуляторных последовательностях (таблица 2), и получали их путем синтеза.

Соответствующие экспрессирующие конструкции получали стандартными способами клонирования и подтверждали секвенированием. Компоненты конечных экспрессирующих конструкций pStbl-bsd-Rep, pStbl-bsd-Rep-p19mut-SEQ ID NO: 1-14, 34-42 представляли собой промотор p5, локус Rep, содержавший либо мутантный промотор p19, либо промотор p19 wt, поли(A) SV40, кассету для селекции с бластицидином под контролем промотора Ubc человека, энхансерный элемент для стабильной транскрипции встроенных ORF, ori pUC для увеличения в количестве в E. coli, и кассету устойчивости к ампициллину для селекции в E. coli.

Конструкцию, помещающую белки Rep по контроль Tet-индуцируемого промотора третьего поколения (промотор TRE3G) (фиг.2), получали стандартными способами клонирования и подтверждали секвенированием. Конечная последовательность этой конструкции pStbl-bsd-TRE3G-Rep52/40-IRES-Rep78/68, начиная с промотора TRE3G до поли(A) SV40, представлена в SEQ ID NO: 30. Компонентами pStbl-bsd-TRE3G-Rep52/40-IRES-Rep78/68 являются промотор TRE3G, локус Rep, начинающийся с инициирующего кодона коротких белков Rep, последовательность IRES ECMV, локус Rep, содержащий мутантный промотор p19, начинающийся с инициирующего кодона длинных белков Rep, поли(A) SV40, кассета для селекции с бластицидином под контролем промотора Ubc человека и энхансерный элемент для стабильной транскрипции встроенных ORF.

Клеточная культура

Клетки CAP стандартным образом культивировали в бессывороточной среде PEM с определенным химическим составом (Thermo Fisher Scientific), дополненной 4 мМ L-аланил-L-глутамином (Biochrom, Germany) во вращающихся флаконах (125 мл; Corning) на вращающем инкубаторе при 185 об/мин (орбита 5 см), 5% CO₂ и 37°C.

В ходе стандартного культивирования клетки разбавляли свежей средой до плотности жизнеспособных клеток 1×10⁶ клеток/мл каждые 72-96 ч. Плотность жизнеспособных клеток и жизнеспособность определяли по исключению трипанового синего с использованием устройства для подсчета клеток CEDEX XS (Innovatis, Roche Applied Science). Стабильную клеточную линию, экспрессирующую активатор Tet-on-3G, культивировали в присутствии 25 мкг/мл G418; при нуклеофекции с pStbl-bsd-TRE3G-Rep50/42-IRES-Rep78/68 добавляли 5 мкг/мл бластицидина.

Временная трансфекция и вестерн-блоттинг для тестирования на экспрессию белка Rep.

Временную трансфекцию проводили с использованием PEImax (PolySciences) в среде FreeStyle 293 (Thermo Fisher Scientific). Через 5 ч после трансфекции клетки подпитывали полной средой PEM (Thermo Fisher Scientific). Обзор полученных совокупностей клеток после временной трансфекции приведен в таблице 4, ниже.

Анализ посредством вестерн-блоттинга проводили с использованием клеточных лизатов 1×10⁵ трансфицированных клеток с использованием антитела мыши против репликазы (Progen, Germany) и меченного пероксидазой хрена антитела против антител мыши (Cell Signaling). Детекцию белков проводили с использованием набора Pierce ECL WB Substrate Kit с использованием детектора хемилюминесценции (INTAS).

Нуклеофекция и получение стабильных совокупностей клеток.

Стабильные совокупности клеток получали с использованием Lonza’s Nucleofector в соответствии с инструкциями изготовителя. Стабильную клеточную линию CAP, экспрессирующую трансактиватор Tet-on-3G третьего поколения, использовали для нуклеофекции с индуцибельной конструкцией, экспрессирующей Rep. Для каждой реакции нуклеофекции 1×10⁷ собирали центрифугированием (150×g, 5 мин). Клетки ресуспендировали в 100 мкл раствора Complete nucleofector solution V (Lonza) и смешивали с 5 мкг линеаризованного экспрессирующего вектора. Суспензию ДНК/клетки переносили в кювету и проводили нуклеофекцию с использованием программы X001. Трансфицированные клетки переносили в 12,5 мл среды для роста и культивировали, как описано выше, при 37°C, 5% CO₂ при 185 об/мин.

Для получения стабильных совокупностей клеток клетки осаждали центрифугированием и ресуспендировали в селективной среде (см. таблицу 4) через 72-96 ч после трансфекции с последующим культивированием в инкубаторе со вращением, как описано выше.

Таблица 4: Полученные совокупности клеток с временной экспрессией CAP-T и стабильные совокупности клеток CAP с соответствующими экспрессирующими векторами и средами.

Клеточная линия	Плазмида	Селективная среда
CAP-T	pStbl-bsd-Rep wt	временная
CAP-T	pStbl-bsd-Rep p19mut-ID 15	Временная
CAP-T	pStbl-bsd-Rep p19mut-ID 16	Временная
CAP-T	pStbl-bsd-Rep p19mut-ID 17	Временная
CAP-T	pStbl-bsd-Rep p19mut-ID 18	Временная
CAP-T	pStbl-bsd-Rep p19mut-ID 19	Временная
CAP-T	pStbl-bsd-Rep p19mut ID 20	Временная
CAP-T	pStbl-bsd-Rep p19mut-ID 21	Временная
CAP-T	pStbl-bsd-Rep p19mut-ID 22	Временная
CAP-T	pStbl-bsd-Rep p19mut-ID 25	временная
CAP-T	pStbl-bsd-Rep p19mut-ID 26	Временная
CAP-T	pStbl-bsd-Rep p19mut-ID 27	Временная
CAP-T	pStbl-bsd-Rep p19mut-ID 28	Временная
CAP-T	pStbl-bsd-Rep p19mut-ID 43	Временная
CAP-T	pStbl-bsd-Rep p19mut-ID 44	Временная
CAP-T	pStbl-bsd-Rep p19mut-ID 45	Временная
CAP-T	pStbl-bsd-Rep p19mut-ID 46	Временная
CAP-T	pStbl-bsd-Rep p19mut-ID 47	Временная
CAP-T	pStbl-bsd-Rep p19mut-ID 48	Временная
CAP-T	pStbl-bsd-Rep p19mut-ID 49	Временная
CAP-T	pStbl-bsd-Rep p19mut-ID 50	Временная
CAP-T	pStbl-bsd-Rep p19mut-ID 51	Временная
CAP-T	pStbl-bsd-Rep p19mut-ID 23	Временная
CAP-T	pStbl-bsd-Rep p19mut-ID 24	Временная
CAP-Tet-on-3G	pStbl-bsd-TRE3G-Rep50/42-IRES-Rep78/68	PEM+4 мМ Gln+5 мкг/мл бластицидина+25 мкг/мл G418

Указание на номера "ID" в приведенной выше таблице 4 относится к соответствующим SEQ ID NO.

Индукция и временная трансфекция для тестирования продуцирования AAV.

Для тестирования продуцирования AAV стабильными клонами единичных клеток с индуцибельной экспрессией Rep проводили временные трансфекции, как описано выше. Следующие три конструкции использовали для обеспечения дополнительных компонентов для продуцирования rAAV5 в соотношении 1:1:0,5 (pAAV-GFP:pHelper:pStbl-CMV-Cap5). Через 5 ч после трансфекции добавляли доксицилин (Clontech) до конечной концентрации 1 мкг/мл для индукции экспрессии белков Rep.

Через 72 ч после трансфекции суспензию клеток собирали. Клетки лизировали добавлением 0,5% Triton-X и инкубацией в течение 30 мин при 37°C и 1300 об/мин. После центрифугирования, супернатанты разбавляли в 10 раз буфером (50 мМ Tris/HCl, pH 8,0; 2 мМ MgCl₂) и инкубировали с 125 Е/мл бензоназы (Merck Millipore) в течение 2 ч при 37°C. Для инактивации бензоназы использовали добавление 2 мМ EDTA и инкубацию при 70°C в течение 10 мин. Вирусную ДНК очищали с использованием набора Pure Link Viral RNA/ДНК mini kit (Thermo Fisher Scientific) в соответствии с инструкциями изготовителя.

кПЦР для определения титра вируса

Для определения титра вируса использовали следующую комбинацию праймера/зонда с двойным мечением (заказанного у MWG, Eurofins; таблица 5), направленных против промотора CMV или поли A SV40:

Таблица 5: Комбинация праймер/зонд, использованная для определения титра вируса

Праймер/зонд	Последовательность
CMV Primer for (SEQ ID NO: 31)	5'-AAATGGCCCGCCTGGCATTATG-3'
CMV Primer rev (SEQ ID NO: 32)	5'-AAACCGCTATCCACGCCCATTG-3'
CMV Probe (SEQ ID NO: 33)	ROX-5'-ACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATC-3'-BHQ2
SV40 PolyA fw (SEQ ID NO: 52)	5'-AGCAATAGCATCACAAATTTCACAA-3'
SV40 PolyA rev (SEQ ID NO: 53)	5'-CCAGACATGATAAGATACATTGATGAGTT-3'
SV40 PolyA Probe (SEQ ID NO: 54)	FAM-5'-AGC ATT TTT TTC ACT GCA TTC TAG TTG TGG TTT GTC-3'-BHQ1

В качестве стандарта использовали линеаризованную плазмиду трансгена с определенным количеством копий. Реакция кПЦР включала следующие компоненты: 2× основная смесь Brilliant Multiplex qPCR Master Mix (Agilent), свободная от нуклеаз H₂O (Thermo Fisher Scientific), смесь праймеров/зондов и образец/стандарт. кПЦР проводили на Agilent Mx3005P в соответствии с инструкциями изготовителя.

Пример 1:

Эффекты молчащих мутаций на экспрессию белков REP.

Введение:

Клетки CAP представляют собой происходящие из амниоцитов суспензионные клетки, иммортализованные посредством стабильной трансфекции конструкцией, кодирующей E1A/E1B.

Белки Rep AAV кодируются геномом AAV. Всего существует четыре белка Rep: Rep78 и Rep68 (экспрессируемых с промотора p5); а также Rep52 и Rep40 (экспрессируемых с промотора p19, расположенного в кодирующей области длинных белков Rep). Эти белки опосредуют репликацию и упаковывание генома AAV. Однако указанные белки являются токсичными для клеток при стабильной экспрессии.

Для инактивации внутреннего промотора p19 путем внесения молчащих мутаций были идентифицированы регуляторные элементы промотора p19 и в нуклеотидную последовательность этих регуляторных элементов были вставлены различные молчащие мутации, не влияющие на конечную белковую последовательность.

Результаты:

Экспрессию длинных и коротких белков Rep успешно разделяли путем внесения молчащих мутаций в регуляторные последовательности промотора p19. Большинство версий с мутациями продемонстрировали значительно сниженную экспрессию коротких белков Rep. Снижение экспрессии коротких белков Rep было заметно уже при внесении одной мутации, и становилось более выраженным при внесении вплоть до 20 мутаций (фиг.4, фиг.5). Разделение 5'- и 3'-мотивов показали, что особенно важными для активации внутреннего промотора p19 являются 3'-мотивы рядом с промотором (SP1 -50; TATA -35, TATA -20). Внесение мутации только в мотив TATA -20 привело к значительному, но не полному снижению экспрессии коротких белков rep, что указывает на то, что SP1 -50 и TATA -35 также являются важными для активации экспрессии, что далее подтверждается тем фактом, что мутация где-либо за исключением TATA -20 также приводила к заметному снижению экспрессии коротких белков rep. Более близкое изучение единичных мотивов, особенно мотива SP1 -50 и точнее мутации 824G>H, обеспечивало очень заметное снижение экспрессии коротких белков rep. Кроме того, мутация TATA -20 значительно снижала экспрессию коротких белков rep. Для TATA -35, только комбинация различных мутаций в мотиве приводила к очень заметному снижению, причем мутация 848A>G имела наибольший эффект на экспрессию.

Для получения стабильной клеточной линии с индуцибельной экспрессией белков Rep гены для длинных белков Rep, содержащие молчащие мутации, и гены для коротких белков Rep разделяли и каждый из них помещали под контроль индуцибельного промотора. Для дальнейших экспериментов была выбрана конструкция p19mut с 19 мутациями.

Пример 2:

Получение стабильных клонов CAP с индуцибельной экспрессией белков Rep AAV2.

Введение:

Для получения индуцибельной экспрессирующей кассеты для белков Rep AAV2 был выбран вариант p19mut с 19 молчащими мутациями.

Tet-индуцируемые промоторы третьего поколения (промотор TRE3G) использовали для регуляции экспрессии белков Rep путем добавления доксицилина (для обзора конструкции см. фиг.2). Клетки CAP, экспрессирующие трансактиватор Tet-on-3G, предварительно получали путем нуклеофекции и селекции с 25 мкг/мл G418. Конструкцию pStbl-bsd-TRE3G-Rep52/40-IRES-Rep78/68 вводили путем нуклеофекции в эту стабильную совокупность клеток и подвергали селекции с 5 мкг/мл бластицидина. Проводили клонирование единичных клеток с использованием лимитирующих разведений и клоны подвергали скринингу вестерн-блоттингом на белки Rep.

Результаты:

Стабильную совокупность клеток CAP, содержавших трансактиватор Tet-on-3G и pStbl-bsd-TRE3G-Rep52/40-IRES-Rep78/68, анализировали с использованием вестерн-блоттинга в отношении экспрессии различных белков rep до и после индукции доксициклином (фиг.6). Без индукции доксициклином нельзя было выявить сигнал, специфический для белков Rep, в то время как при индукции доксициклином экспрессировались как длинные, так и короткие белки Rep.

Из стабильной совокупности клеток получали колонии единичных клеток посредством лимитирующего разведения. Клоны, происходящие из единичных клеток, анализировали в отношении экспрессии белков Rep после индукции доксициклином. Из 5 клонов 3 клона экспрессировали как длинные, так и короткие белки Rep в ожидаемом соотношении, в то время как 2 из клонов имели сниженные уровни длинных белков Rep (фиг.7).

Данные демонстрируют, что с использованием конструкций rep с молчащими мутациями в промоторе p19 можно получать клональные клеточные популяции с индуцибельной экспрессией как длинных, так и коротких белков Rep. Такие клоны могут служить в качестве основы для получения упаковывающих/продуцирующих клеточных линий.

Пример 3:

Продуцирование AAV в стабильных клонах CAP с индуцибельной экспрессией белков Rep AAV2.

Введение:

Чтобы доказать, что клеточные линии с индуцибельным Rep способны продуцировать векторы AAV, недостающие компоненты для продуцирования AAV временно вводили в клетки 5 различных клонов: капсидные белки из AAV5, клонированные под контролем промотора CMV в вектор pStbl, дополнительная РНК генов-помощников E2A, E4orf6, VA, а также вектор для переноса с представляющим интерес геном (GOI): pAAV-GFP.

Результаты:

С использованием клонов единичных клеток стабильной клеточной линии, экспрессирующей индуцибельный Rep, продуцирование AAV можно было продемонстрировать при трансфекции клеток недостающими необходимыми компонентами и индукции доксицилином (фиг.8). Два клона с наиболее низкими уровнями длинных белков Rep также продемонстрировали более низкие титры AAV, как и ожидалось. Этот доказывает, что этот подход приводит к продуцированию вирусных векторов и что теперь является возможным получение упаковывающей клеточной линии с высокой продукцией AAV.

Пример 4:

Продуцирование AAV с использованием белков Rep с консервативной аминокислотной заменой

Для инактивации внутреннего промотора p19 путем внесения мутаций в промоторные области, приводящих к консервативным аминокислотным заменам, были идентифицированы регуляторные элементы промотора p19. Три отдельных мутации, 846T>G, 847T>C, 848A>B, встраивали в нуклеотидную последовательность области TATA -20, что приводило к консервативной замене Leu176>Ala (ID23). Две отдельных мутации, 823C>G, 824G>H, встраивали в нуклеотидную последовательность области SP1 -50, что приводило к консервативной замене Ala168>Gly (ID24). Различные конструкции временно вводили в клетки CAP-T и уровень экспрессии длинных и коротких белков Rep анализировали и сравнивали с wt и mut-20 (ID28) (фиг.9 A, B).

Для подтверждения функциональности длинных белков rep с консервативными аминокислотными заменами в области TATA -20 или SP1 -50, AAV продуцировали путем внесения следующей комбинации конструкций временно в клетки CAP-T: конструкция, кодирующая длинные белки Rep, либо pStbl-Rep-p19mut-ID23, либо -ID24, либо -mut20, либо -wt, вместе с конструкцией, кодирующей короткие белки Rep (pStbl-TRE3G-Rep50/42), pCMV-Tet3G и дополнительные гены-помощники: РНК E2A, E4orf6, VA, а также вектор для переноса с представляющим интерес геном (GOI), pAAV-GFP (фиг. 9C).

Результаты:

Анализ с использованием вестерн-блоттинга продемонстрировал, что экспрессия длинных и коротких белков Rep была успешным образом разделена путем внесения различных мутаций в регуляторные последовательности промотора p19, что приводило к консервативным заменам либо в области SP1 -50, либо в области TATA -20.

Как описано выше, мутация в области SP1 -50 имела более выраженный эффект, чем внесенные мутации в TATA -20 боксе, подтверждая важную роль SP1 -50 (фиг.9 A, B).

Важно, что функциональность длинных белков Rep, содержащих замену Leu176>Ala (ID23) или Ala168>Gly (ID24), можно было доказать путем продуцирования частиц AAV посредством временного продуцирования. Титр частиц AAV, продуцированных с помощью белков Rep, содержащих консервативную аминокислотную замену, находится в том же диапазоне, что и для контроля в виде wt или mut-20, с небольшим снижением титра AAV в образце ID24 (фиг.9C).

Настоящее изобретение относится к следующим нуклеотидным последовательностям.

SEQ ID NO: 1

Мутантная промоторная область mut19 p19 AAV2

полужирный шрифт: регуляторный участки в промоторе p19

подчеркивание: мутации в промоторной области p19

CAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCCGACTTTGCCAAACTGGTTCGCGGTCACAAAGACDCGBAACGGCGCCGGGGGDGGHAACAAAGTHGTHGATGAGTGCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAAACCCAGCCTGAGCTCCAATGGGCHTGGACVAACATGGAACAGTACTTGTCDGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACGGTTGGTGGCGCAGCATCTGACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCCCAATTCTGATGCGCCGGTGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAGCTGGTCGGGTGGCTCGTGGACAAGGGGATTACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGG

SEQ ID NO: 2

Мутантная промоторная область mut5 p19 AAV2

полужирный шрифт: регуляторный участки в промоторе p19

подчеркивание: мутации в промоторной области p19

CAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCCGACTTTGCCAAACTGGTTCGCGGTCACAAAGACCAGAAATGGCGCCGGAGGCGGGAACAAGGTGGTGGATGAGTGCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAAACCCAGCCTGAGCTCCAGTGGGCGTGGACTAATATGGAACAGTACTTGTCDGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACGGTTGGTGGCGCAGCATCTGACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCCCAATTCTGATGCGCCGGTGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAGCTGGTCGGGTGGCTCGTGGACAAGGGGATTACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGG

SEQ ID NO: 3

Мутантная промоторная область mut1 p19 AAV2

полужирный шрифт: регуляторный участки в промоторе p19

подчеркивание: мутации в промоторной области p19

CAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCCGACTTTGCCAAACTGGTTCGCGGTCACAAAGACCAGAAATGGCGCCGGAGGCGGGAACAAGGTGGTGGATGAGTGCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAAACCCAGCCTGAGCTCCAGTGGGCGTGGACTAATATGGAACAGTATTTGAGCGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACGGTTGGTGGCGCAGCATCTGACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCCCAATTCTGATGCGCCGGTGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAGCTGGTCGGGTGGCTCGTGGACAAGGGGATTACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGG

SEQ ID NO: 4

Мутантная промоторная область mut2 p19 AAV2

полужирный шрифт: регуляторный участки в промоторе p19

подчеркивание: мутации в промоторной области p19

CAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCCGACTTTGCCAAACTGGTTCGCGGTCACAAAGACCAGAAATGGCGCCGGAGGCGGGAACAAGGTGGTGGATGAGTGCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAAACCCAGCCTGAGCTCCAGTGGGCGTGGACTAATATGGAACAGTATTTATCCGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACGGTTGGTGGCGCAGCATCTGACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCCCAATTCTGATGCGCCGGTGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAGCTGGTCGGGTGGCTCGTGGACAAGGGGATTACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGG

SEQ ID NO: 5

Мутантная промоторная область mut1-2 p19 AAV2

полужирный шрифт: регуляторный участки в промоторе p19

подчеркивание: мутации в промоторной области p19

CAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCCGACTTTGCCAAACTGGTTCGCGGTCACAAAGACCAGAAATGGCGCCGGAGGCGGGAACAAGGTGGTGGATGAGTGCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAAACCCAGCCTGAGCTCCAGTGGGCGTGGACTAATATGGAACAGTACTTAAGCGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACGGTTGGTGGCGCAGCATCTGACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCCCAATTCTGATGCGCCGGTGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAGCTGGTCGGGTGGCTCGTGGACAAGGGGATTACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGG

SEQ ID NO: 6

Мутантная промоторная область mut14 p19 AAV2

полужирный шрифт: регуляторный участки в промоторе p19

подчеркивание: мутации в промоторной области p19

CAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCCGACTTTGCCAAACTGGTTCGCGGTCACAAAGACDCGBAACGGCGCCGGGGGDGGHAACAAAGTHGTHGATGAGTGCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAAACCCAGCCTGAGCTCCAATGGGCHTGGACVAACATGGAACAGTATTTAAGCGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACGGTTGGTGGCGCAGCATCTGACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCCCAATTCTGATGCGCCGGTGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAGCTGGTCGGGTGGCTCGTGGACAAGGGGATTACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGG

SEQ ID NO: 7

Мутантная промоторная область mut10 p19 AAV2

полужирный шрифт: регуляторный участки в промоторе p19

подчеркивание: мутации в промоторной области p19

CAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCCGACTTTGCCAAACTGGTTCGCGGTCACAAAGACDCGBAACGGCGCCGGGGGDGGHAACAAAGTHGTHGATGAGTGCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAAACCCAGCCTGAGCTCCAGTGGGCGTGGACTAATATGGAACAGTATTTAAGCGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACGGTTGGTGGCGCAGCATCTGACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCCCAATTCTGATGCGCCGGTGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAGCTGGTCGGGTGGCTCGTGGACAAGGGGATTACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGG

SEQ ID NO: 8

Мутантная промоторная область mut10-2 p19 AAV2

полужирный шрифт: регуляторный участки в промоторе p19

подчеркивание: мутации в промоторной области p19

CAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCCGACTTTGCCAAACTGGTTCGCGGTCACAAAGACCAGAAATGGCGCCGGAGGCGGGAACAAGGTGGTGGATGAGTGCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAAACCCAGCCTGAGCTCCAATGGGCHTGGACVAACATGGAACAGTACCTBTCDGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACGGTTGGTGGCGCAGCATCTGACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCCCAATTCTGATGCGCCGGTGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAGCTGGTCGGGTGGCTCGTGGACAAGGGGATTACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGG

SEQ ID NO: 9

Мутантная промоторная область mut3 p19 AAV2

полужирный шрифт: регуляторный участки в промоторе p19

подчеркивание: мутации в промоторной области p19

CAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCCGACTTTGCCAAACTGGTTCGCGGTCACAAAGACCAGAAATGGCGCCGGAGGCGGGAACAAGGTGGTGGATGAGTGCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAAACCCAGCCTGAGCTCCAGTGGGCGTGGACTAATATGGAACAGTATGCBAGCGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACGGTTGGTGGCGCAGCATCTGACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCCCAATTCTGATGCGCCGGTGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAGCTGGTCGGGTGGCTCGTGGACAAGGGGATTACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGG

SEQ ID NO: 10

Мутантная промоторная область mut2-2 p19 AAV2

полужирный шрифт: регуляторный участки в промоторе p19

подчеркивание: мутации в промоторной области p19

CAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCCGACTTTGCCAAACTGGTTCGCGGTCACAAAGACCAGAAATGGCGCCGGAGGCGGGAACAAGGTGGTGGATGAGTGCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAAACCCAGCCTGAGCTCCAGTGGGGHTGGACTAATATGGAACAGTATTTAAGCGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACGGTTGGTGGCGCAGCATCTGACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCCCAATTCTGATGCGCCGGTGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAGCTGGTCGGGTGGCTCGTGGACAAGGGGATTACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGG

SEQ ID NO: 11

Мутантная промоторная область mut2-3 p19 AAV2

полужирный шрифт: регуляторный участки в промоторе p19

подчеркивание: мутации в промоторной области p19

CAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCCGACTTTGCCAAACTGGTTCGCGGTCACAAAGACCAGAAATGGCGCCGGAGGCGGGAACAAGGTGGTGGATGAGTGCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAAACCCAGCCTGAGCTCCAGTGGGCGTGGACTAATATGGAACAGTATCTBAGCGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACGGTTGGTGGCGCAGCATCTGACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCCCAATTCTGATGCGCCGGTGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAGCTGGTCGGGTGGCTCGTGGACAAGGGGATTACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGG

SEQ ID NO: 12

Мутантная промоторная область mut1-3 p19 AAV2

полужирный шрифт: регуляторный участки в промоторе p19

подчеркивание: мутации в промоторной области p19

CAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCCGACTTTGCCAAACTGGTTCGCGGTCACAAAGACCAGAAATGGCGCCGGAGGCGGGAACAAGGTGGTGGATGAGTGCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAAACCCAGCCTGAGCTCCAGTGGGCGTGGACTAATATGGAACAGTATCTAAGCGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACGGTTGGTGGCGCAGCATCTGACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCCCAATTCTGATGCGCCGGTGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAGCTGGTCGGGTGGCTCGTGGACAAGGGGATTACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGG

SEQ ID NO: 13

Мутантная промоторная область mut5-2 p19 AAV2

полужирный шрифт: регуляторный участки в промоторе p19

подчеркивание: мутации в промоторной области p19

CAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCCGACTTTGCCAAACTGGTTCGCGGTCACAAAGACCAGAAATGGCGCCGGAGGCGGGAACAAGGTGGTGGATGAGTGCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAAACCCAGCCTGAGCTCCAGTGGGCGTGGACTAATATGGAACAGTACCTBTCCGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACGGTTGGTGGCGCAGCATCTGACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCCCAATTCTGATGCGCCGGTGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAGCTGGTCGGGTGGCTCGTGGACAAGGGGATTACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGG

SEQ ID NO: 14

Мутантная промоторная область mut20 p19 AAV2

полужирный шрифт: регуляторный участки в промоторе p19

подчеркивание: мутации в промоторной области p19

CAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCCGACTTTGCCAAACTGGTTCGCGGTCACAAAGACDCGBAACGGCGCCGGGGGDGGHAACAAAGTHGTHGATGAGTGCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAAACCCAGCCTGAGCTCCAATGGGCHTGGACVAACATGGAACAGTACCTBTCDGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACGGTTGGTGGCGCAGCATCTGACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCCCAATTCTGATGCGCCGGTGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAGCTGGTCGGGTGGCTCGTGGACAAGGGGATTACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGG

SEQ ID NO: 15

Кодирующая область белков Rep AAV2 с мутантной промоторной областью mut19 p19

полужирный шрифт: регуляторный участки в промоторе p19

подчеркивание: мутации в промоторной области p19

ATGCCGGGGTTTTACGAGATTGTGATTAAGGTCCCCAGCGACCTTGACGAGCATCTGCCCGGCATTTCTGACAGCTTTGTGAACTGGGTGGCCGAGAAGGAATGGGAGTTGCCGCCAGATTCTGACATGGATCTGAATCTGATTGAGCAGGCACCCCTGACCGTGGCCGAGAAGCTGCAGCGCGACTTTCTGACGGAATGGCGCCGTGTGAGTAAGGCCCCGGAGGCCCTTTTCTTTGTGCAATTTGAGAAGGGAGAGAGCTACTTCCACATGCACGTGCTCGTGGAAACCACCGGGGTGAAATCCATGGTTTTGGGACGTTTCCTGAGTCAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCCGACTTTGCCAAACTGGTTCGCGGTCACAAAGACDCGBAACGGCGCCGGGGGDGGHAACAAAGTHGTHGATGAGTGCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAAACCCAGCCTGAGCTCCAATGGGCHTGGACVAACATGGAACAGTACTTGTCDGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACGGTTGGTGGCGCAGCATCTGACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCCCAATTCTGATGCGCCGGTGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAGCTGGTCGGGTGGCTCGTGGACAAGGGGATTACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGGAGGACCAGGCCTCATACATCTCCTTCAATGCGGCCTCCAACTCGCGGTCCCAAATCAAGGCTGCCTTGGACAATGCGGGAAAGATTATGAGCCTGACTAAAACCGCCCCCGACTACCTGGTGGGCCAGCAGCCCGTGGAGGACATTTCCAGCAATCGGATTTATAAAATTTTGGAACTAAACGGGTACGATCCCCAATATGCGGCTTCCGTCTTTCTGGGATGGGCCACGAAAAAGTTCGGCAAGAGGAACACCATCTGGCTGTTTGGGCCTGCAACTACCGGGAAGACCAACATCGCGGAGGCCATAGCCCACACTGTGCCCTTCTACGGGTGCGTAAACTGGACCAATGAGAACTTTCCCTTCAACGACTGTGTCGACAAGATGGTGATCTGGTGGGAGGAGGGGAAGATGACCGCCAAGGTCGTGGAGTCGGCCAAAGCCATTCTCGGAGGAAGCAAGGTGCGCGTGGACCAGAAATGCAAGTCCTCGGCCCAGATAGACCCGACTCCCGTGATCGTCACCTCCAACACCAACATGTGCGCCGTGATTGACGGGAACTCAACGACCTTCGAACACCAGCAGCCGTTGCAAGACCGGATGTTCAAATTTGAACTCACCCGCCGTCTGGATCATGACTTTGGGAAGGTCACCAAGCAGGAAGTCAAAGACTTTTTCCGGTGGGCAAAGGATCACGTGGTTGAGGTGGAGCATGAATTCTACGTCAAAAAGGGTGGAGCCAAGAAAAGACCCGCCCCCAGTGACGCAGATATAAGTGAGCCCAAACGGGTGCGCGAGTCAGTTGCGCAGCCATCGACGTCAGACGCGGAAGCTTCGATCAACTACGCAGACAGGTACCAAAACAAATGTTCTCGTCACGTGGGCATGAATCTGATGCTGTTTCCCTGCAGACAATGCGAGAGAATGAATCAGAATTCAAATATCTGCTTCACTCACGGACAGAAAGACTGTTTAGAGTGCTTTCCCGTGTCAGAATCTCAACCCGTTTCTGTCGTCAAAAAGGCGTATCAGAAACTGTGCTACATTCATCATATCATGGGAAAGGTGCCAGACGCTTGCACTGCCTGCGATCTGGTCAATGTGGATTTGGATGACTGCATCTTTGAACAATAAATGATTTAAATCAGGTATGGCTGCCGATGGTTATCTTCCAGATTGGCTCGAGGACACTCTCTCTGA

SEQ ID NO: 16

Кодирующая область белков Rep AAV2 с мутантной промоторной областью mut5 p19

полужирный шрифт: регуляторный участки в промоторе p19

подчеркивание: мутации в промоторной области p19

ATGCCGGGGTTTTACGAGATTGTGATTAAGGTCCCCAGCGACCTTGACGAGCATCTGCCCGGCATTTCTGACAGCTTTGTGAACTGGGTGGCCGAGAAGGAATGGGAGTTGCCGCCAGATTCTGACATGGATCTGAATCTGATTGAGCAGGCACCCCTGACCGTGGCCGAGAAGCTGCAGCGCGACTTTCTGACGGAATGGCGCCGTGTGAGTAAGGCCCCGGAGGCCCTTTTCTTTGTGCAATTTGAGAAGGGAGAGAGCTACTTCCACATGCACGTGCTCGTGGAAACCACCGGGGTGAAATCCATGGTTTTGGGACGTTTCCTGAGTCAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCCGACTTTGCCAAACTGGTTCGCGGTCACAAAGACCAGAAATGGCGCCGGAGGCGGGAACAAGGTGGTGGATGAGTGCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAAACCCAGCCTGAGCTCCAGTGGGCGTGGACTAATATGGAACAGTACTTGTCDGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACGGTTGGTGGCGCAGCATCTGACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCCCAATTCTGATGCGCCGGTGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAGCTGGTCGGGTGGCTCGTGGACAAGGGGATTACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGGAGGACCAGGCCTCATACATCTCCTTCAATGCGGCCTCCAACTCGCGGTCCCAAATCAAGGCTGCCTTGGACAATGCGGGAAAGATTATGAGCCTGACTAAAACCGCCCCCGACTACCTGGTGGGCCAGCAGCCCGTGGAGGACATTTCCAGCAATCGGATTTATAAAATTTTGGAACTAAACGGGTACGATCCCCAATATGCGGCTTCCGTCTTTCTGGGATGGGCCACGAAAAAGTTCGGCAAGAGGAACACCATCTGGCTGTTTGGGCCTGCAACTACCGGGAAGACCAACATCGCGGAGGCCATAGCCCACACTGTGCCCTTCTACGGGTGCGTAAACTGGACCAATGAGAACTTTCCCTTCAACGACTGTGTCGACAAGATGGTGATCTGGTGGGAGGAGGGGAAGATGACCGCCAAGGTCGTGGAGTCGGCCAAAGCCATTCTCGGAGGAAGCAAGGTGCGCGTGGACCAGAAATGCAAGTCCTCGGCCCAGATAGACCCGACTCCCGTGATCGTCACCTCCAACACCAACATGTGCGCCGTGATTGACGGGAACTCAACGACCTTCGAACACCAGCAGCCGTTGCAAGACCGGATGTTCAAATTTGAACTCACCCGCCGTCTGGATCATGACTTTGGGAAGGTCACCAAGCAGGAAGTCAAAGACTTTTTCCGGTGGGCAAAGGATCACGTGGTTGAGGTGGAGCATGAATTCTACGTCAAAAAGGGTGGAGCCAAGAAAAGACCCGCCCCCAGTGACGCAGATATAAGTGAGCCCAAACGGGTGCGCGAGTCAGTTGCGCAGCCATCGACGTCAGACGCGGAAGCTTCGATCAACTACGCAGACAGGTACCAAAACAAATGTTCTCGTCACGTGGGCATGAATCTGATGCTGTTTCCCTGCAGACAATGCGAGAGAATGAATCAGAATTCAAATATCTGCTTCACTCACGGACAGAAAGACTGTTTAGAGTGCTTTCCCGTGTCAGAATCTCAACCCGTTTCTGTCGTCAAAAAGGCGTATCAGAAACTGTGCTACATTCATCATATCATGGGAAAGGTGCCAGACGCTTGCACTGCCTGCGATCTGGTCAATGTGGATTTGGATGACTGCATCTTTGAACAATAAATGATTTAAATCAGGTATGGCTGCCGATGGTTATCTTCCAGATTGGCTCGAGGACACTCTCTCTGA

SEQ ID NO: 17

Кодирующая область белков Rep AAV2 с мутантной промоторной областью mut1 p19

полужирный шрифт: регуляторный участки в промоторе p19

подчеркивание: мутация в промоторной области p19

ATGCCGGGGTTTTACGAGATTGTGATTAAGGTCCCCAGCGACCTTGACGAGCATCTGCCCGGCATTTCTGACAGCTTTGTGAACTGGGTGGCCGAGAAGGAATGGGAGTTGCCGCCAGATTCTGACATGGATCTGAATCTGATTGAGCAGGCACCCCTGACCGTGGCCGAGAAGCTGCAGCGCGACTTTCTGACGGAATGGCGCCGTGTGAGTAAGGCCCCGGAGGCCCTTTTCTTTGTGCAATTTGAGAAGGGAGAGAGCTACTTCCACATGCACGTGCTCGTGGAAACCACCGGGGTGAAATCCATGGTTTTGGGACGTTTCCTGAGTCAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCCGACTTTGCCAAACTGGTTCGCGGTCACAAAGACCAGAAATGGCGCCGGAGGCGGGAACAAGGTGGTGGATGAGTGCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAAACCCAGCCTGAGCTCCAGTGGGCGTGGACTAATATGGAACAGTATTTGAGCGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACGGTTGGTGGCGCAGCATCTGACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCCCAATTCTGATGCGCCGGTGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAGCTGGTCGGGTGGCTCGTGGACAAGGGGATTACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGGAGGACCAGGCCTCATACATCTCCTTCAATGCGGCCTCCAACTCGCGGTCCCAAATCAAGGCTGCCTTGGACAATGCGGGAAAGATTATGAGCCTGACTAAAACCGCCCCCGACTACCTGGTGGGCCAGCAGCCCGTGGAGGACATTTCCAGCAATCGGATTTATAAAATTTTGGAACTAAACGGGTACGATCCCCAATATGCGGCTTCCGTCTTTCTGGGATGGGCCACGAAAAAGTTCGGCAAGAGGAACACCATCTGGCTGTTTGGGCCTGCAACTACCGGGAAGACCAACATCGCGGAGGCCATAGCCCACACTGTGCCCTTCTACGGGTGCGTAAACTGGACCAATGAGAACTTTCCCTTCAACGACTGTGTCGACAAGATGGTGATCTGGTGGGAGGAGGGGAAGATGACCGCCAAGGTCGTGGAGTCGGCCAAAGCCATTCTCGGAGGAAGCAAGGTGCGCGTGGACCAGAAATGCAAGTCCTCGGCCCAGATAGACCCGACTCCCGTGATCGTCACCTCCAACACCAACATGTGCGCCGTGATTGACGGGAACTCAACGACCTTCGAACACCAGCAGCCGTTGCAAGACCGGATGTTCAAATTTGAACTCACCCGCCGTCTGGATCATGACTTTGGGAAGGTCACCAAGCAGGAAGTCAAAGACTTTTTCCGGTGGGCAAAGGATCACGTGGTTGAGGTGGAGCATGAATTCTACGTCAAAAAGGGTGGAGCCAAGAAAAGACCCGCCCCCAGTGACGCAGATATAAGTGAGCCCAAACGGGTGCGCGAGTCAGTTGCGCAGCCATCGACGTCAGACGCGGAAGCTTCGATCAACTACGCAGACAGGTACCAAAACAAATGTTCTCGTCACGTGGGCATGAATCTGATGCTGTTTCCCTGCAGACAATGCGAGAGAATGAATCAGAATTCAAATATCTGCTTCACTCACGGACAGAAAGACTGTTTAGAGTGCTTTCCCGTGTCAGAATCTCAACCCGTTTCTGTCGTCAAAAAGGCGTATCAGAAACTGTGCTACATTCATCATATCATGGGAAAGGTGCCAGACGCTTGCACTGCCTGCGATCTGGTCAATGTGGATTTGGATGACTGCATCTTTGAACAATAAATGATTTAAATCAGGTATGGCTGCCGATGGTTATCTTCCAGATTGGCTCGAGGACACTCTCTCTGA

SEQ ID NO: 18

Кодирующая область белков Rep AAV2 с мутантной промоторной областью mut2 p19

полужирный шрифт: регуляторный участки в промоторе p19

подчеркивание: мутация в промоторной области p19

ATGCCGGGGTTTTACGAGATTGTGATTAAGGTCCCCAGCGACCTTGACGAGCATCTGCCCGGCATTTCTGACAGCTTTGTGAACTGGGTGGCCGAGAAGGAATGGGAGTTGCCGCCAGATTCTGACATGGATCTGAATCTGATTGAGCAGGCACCCCTGACCGTGGCCGAGAAGCTGCAGCGCGACTTTCTGACGGAATGGCGCCGTGTGAGTAAGGCCCCGGAGGCCCTTTTCTTTGTGCAATTTGAGAAGGGAGAGAGCTACTTCCACATGCACGTGCTCGTGGAAACCACCGGGGTGAAATCCATGGTTTTGGGACGTTTCCTGAGTCAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCCGACTTTGCCAAACTGGTTCGCGGTCACAAAGACCAGAAATGGCGCCGGAGGCGGGAACAAGGTGGTGGATGAGTGCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAAACCCAGCCTGAGCTCCAGTGGGCGTGGACTAATATGGAACAGTATTTATCCGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACGGTTGGTGGCGCAGCATCTGACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCCCAATTCTGATGCGCCGGTGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAGCTGGTCGGGTGGCTCGTGGACAAGGGGATTACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGGAGGACCAGGCCTCATACATCTCCTTCAATGCGGCCTCCAACTCGCGGTCCCAAATCAAGGCTGCCTTGGACAATGCGGGAAAGATTATGAGCCTGACTAAAACCGCCCCCGACTACCTGGTGGGCCAGCAGCCCGTGGAGGACATTTCCAGCAATCGGATTTATAAAATTTTGGAACTAAACGGGTACGATCCCCAATATGCGGCTTCCGTCTTTCTGGGATGGGCCACGAAAAAGTTCGGCAAGAGGAACACCATCTGGCTGTTTGGGCCTGCAACTACCGGGAAGACCAACATCGCGGAGGCCATAGCCCACACTGTGCCCTTCTACGGGTGCGTAAACTGGACCAATGAGAACTTTCCCTTCAACGACTGTGTCGACAAGATGGTGATCTGGTGGGAGGAGGGGAAGATGACCGCCAAGGTCGTGGAGTCGGCCAAAGCCATTCTCGGAGGAAGCAAGGTGCGCGTGGACCAGAAATGCAAGTCCTCGGCCCAGATAGACCCGACTCCCGTGATCGTCACCTCCAACACCAACATGTGCGCCGTGATTGACGGGAACTCAACGACCTTCGAACACCAGCAGCCGTTGCAAGACCGGATGTTCAAATTTGAACTCACCCGCCGTCTGGATCATGACTTTGGGAAGGTCACCAAGCAGGAAGTCAAAGACTTTTTCCGGTGGGCAAAGGATCACGTGGTTGAGGTGGAGCATGAATTCTACGTCAAAAAGGGTGGAGCCAAGAAAAGACCCGCCCCCAGTGACGCAGATATAAGTGAGCCCAAACGGGTGCGCGAGTCAGTTGCGCAGCCATCGACGTCAGACGCGGAAGCTTCGATCAACTACGCAGACAGGTACCAAAACAAATGTTCTCGTCACGTGGGCATGAATCTGATGCTGTTTCCCTGCAGACAATGCGAGAGAATGAATCAGAATTCAAATATCTGCTTCACTCACGGACAGAAAGACTGTTTAGAGTGCTTTCCCGTGTCAGAATCTCAACCCGTTTCTGTCGTCAAAAAGGCGTATCAGAAACTGTGCTACATTCATCATATCATGGGAAAGGTGCCAGACGCTTGCACTGCCTGCGATCTGGTCAATGTGGATTTGGATGACTGCATCTTTGAACAATAAATGATTTAAATCAGGTATGGCTGCCGATGGTTATCTTCCAGATTGGCTCGAGGACACTCTCTCTGA

SEQ ID NO: 19

Кодирующая область белков Rep AAV2 с мутантной промоторной областью mut1-2 p19

полужирный шрифт: регуляторный участки в промоторе p19

подчеркивание: мутация в промоторной области p19

ATGCCGGGGTTTTACGAGATTGTGATTAAGGTCCCCAGCGACCTTGACGAGCATCTGCCCGGCATTTCTGACAGCTTTGTGAACTGGGTGGCCGAGAAGGAATGGGAGTTGCCGCCAGATTCTGACATGGATCTGAATCTGATTGAGCAGGCACCCCTGACCGTGGCCGAGAAGCTGCAGCGCGACTTTCTGACGGAATGGCGCCGTGTGAGTAAGGCCCCGGAGGCCCTTTTCTTTGTGCAATTTGAGAAGGGAGAGAGCTACTTCCACATGCACGTGCTCGTGGAAACCACCGGGGTGAAATCCATGGTTTTGGGACGTTTCCTGAGTCAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCCGACTTTGCCAAACTGGTTCGCGGTCACAAAGACCAGAAATGGCGCCGGAGGCGGGAACAAGGTGGTGGATGAGTGCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAAACCCAGCCTGAGCTCCAGTGGGCGTGGACTAATATGGAACAGTACTTAAGCGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACGGTTGGTGGCGCAGCATCTGACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCCCAATTCTGATGCGCCGGTGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAGCTGGTCGGGTGGCTCGTGGACAAGGGGATTACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGGAGGACCAGGCCTCATACATCTCCTTCAATGCGGCCTCCAACTCGCGGTCCCAAATCAAGGCTGCCTTGGACAATGCGGGAAAGATTATGAGCCTGACTAAAACCGCCCCCGACTACCTGGTGGGCCAGCAGCCCGTGGAGGACATTTCCAGCAATCGGATTTATAAAATTTTGGAACTAAACGGGTACGATCCCCAATATGCGGCTTCCGTCTTTCTGGGATGGGCCACGAAAAAGTTCGGCAAGAGGAACACCATCTGGCTGTTTGGGCCTGCAACTACCGGGAAGACCAACATCGCGGAGGCCATAGCCCACACTGTGCCCTTCTACGGGTGCGTAAACTGGACCAATGAGAACTTTCCCTTCAACGACTGTGTCGACAAGATGGTGATCTGGTGGGAGGAGGGGAAGATGACCGCCAAGGTCGTGGAGTCGGCCAAAGCCATTCTCGGAGGAAGCAAGGTGCGCGTGGACCAGAAATGCAAGTCCTCGGCCCAGATAGACCCGACTCCCGTGATCGTCACCTCCAACACCAACATGTGCGCCGTGATTGACGGGAACTCAACGACCTTCGAACACCAGCAGCCGTTGCAAGACCGGATGTTCAAATTTGAACTCACCCGCCGTCTGGATCATGACTTTGGGAAGGTCACCAAGCAGGAAGTCAAAGACTTTTTCCGGTGGGCAAAGGATCACGTGGTTGAGGTGGAGCATGAATTCTACGTCAAAAAGGGTGGAGCCAAGAAAAGACCCGCCCCCAGTGACGCAGATATAAGTGAGCCCAAACGGGTGCGCGAGTCAGTTGCGCAGCCATCGACGTCAGACGCGGAAGCTTCGATCAACTACGCAGACAGGTACCAAAACAAATGTTCTCGTCACGTGGGCATGAATCTGATGCTGTTTCCCTGCAGACAATGCGAGAGAATGAATCAGAATTCAAATATCTGCTTCACTCACGGACAGAAAGACTGTTTAGAGTGCTTTCCCGTGTCAGAATCTCAACCCGTTTCTGTCGTCAAAAAGGCGTATCAGAAACTGTGCTACATTCATCATATCATGGGAAAGGTGCCAGACGCTTGCACTGCCTGCGATCTGGTCAATGTGGATTTGGATGACTGCATCTTTGAACAATAAATGATTTAAATCAGGTATGGCTGCCGATGGTTATCTTCCAGATTGGCTCGAGGACACTCTCTCTGA

SEQ ID NO: 20

Кодирующая область белков Rep AAV2 с мутантной промоторной областью mut14 p19

полужирный шрифт: регуляторный участки в промоторе p19

подчеркивание: мутация в промоторной области p19

ATGCCGGGGTTTTACGAGATTGTGATTAAGGTCCCCAGCGACCTTGACGAGCATCTGCCCGGCATTTCTGACAGCTTTGTGAACTGGGTGGCCGAGAAGGAATGGGAGTTGCCGCCAGATTCTGACATGGATCTGAATCTGATTGAGCAGGCACCCCTGACCGTGGCCGAGAAGCTGCAGCGCGACTTTCTGACGGAATGGCGCCGTGTGAGTAAGGCCCCGGAGGCCCTTTTCTTTGTGCAATTTGAGAAGGGAGAGAGCTACTTCCACATGCACGTGCTCGTGGAAACCACCGGGGTGAAATCCATGGTTTTGGGACGTTTCCTGAGTCAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCCGACTTTGCCAAACTGGTTCGCGGTCACAAAGACDCGBAACGGCGCCGGGGGDGGHAACAAAGTHGTHGATGAGTGCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAAACCCAGCCTGAGCTCCAATGGGCHTGGACVAACATGGAACAGTATTTAAGCGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACGGTTGGTGGCGCAGCATCTGACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCCCAATTCTGATGCGCCGGTGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAGCTGGTCGGGTGGCTCGTGGACAAGGGGATTACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGGAGGACCAGGCCTCATACATCTCCTTCAATGCGGCCTCCAACTCGCGGTCCCAAATCAAGGCTGCCTTGGACAATGCGGGAAAGATTATGAGCCTGACTAAAACCGCCCCCGACTACCTGGTGGGCCAGCAGCCCGTGGAGGACATTTCCAGCAATCGGATTTATAAAATTTTGGAACTAAACGGGTACGATCCCCAATATGCGGCTTCCGTCTTTCTGGGATGGGCCACGAAAAAGTTCGGCAAGAGGAACACCATCTGGCTGTTTGGGCCTGCAACTACCGGGAAGACCAACATCGCGGAGGCCATAGCCCACACTGTGCCCTTCTACGGGTGCGTAAACTGGACCAATGAGAACTTTCCCTTCAACGACTGTGTCGACAAGATGGTGATCTGGTGGGAGGAGGGGAAGATGACCGCCAAGGTCGTGGAGTCGGCCAAAGCCATTCTCGGAGGAAGCAAGGTGCGCGTGGACCAGAAATGCAAGTCCTCGGCCCAGATAGACCCGACTCCCGTGATCGTCACCTCCAACACCAACATGTGCGCCGTGATTGACGGGAACTCAACGACCTTCGAACACCAGCAGCCGTTGCAAGACCGGATGTTCAAATTTGAACTCACCCGCCGTCTGGATCATGACTTTGGGAAGGTCACCAAGCAGGAAGTCAAAGACTTTTTCCGGTGGGCAAAGGATCACGTGGTTGAGGTGGAGCATGAATTCTACGTCAAAAAGGGTGGAGCCAAGAAAAGACCCGCCCCCAGTGACGCAGATATAAGTGAGCCCAAACGGGTGCGCGAGTCAGTTGCGCAGCCATCGACGTCAGACGCGGAAGCTTCGATCAACTACGCAGACAGGTACCAAAACAAATGTTCTCGTCACGTGGGCATGAATCTGATGCTGTTTCCCTGCAGACAATGCGAGAGAATGAATCAGAATTCAAATATCTGCTTCACTCACGGACAGAAAGACTGTTTAGAGTGCTTTCCCGTGTCAGAATCTCAACCCGTTTCTGTCGTCAAAAAGGCGTATCAGAAACTGTGCTACATTCATCATATCATGGGAAAGGTGCCAGACGCTTGCACTGCCTGCGATCTGGTCAATGTGGATTTGGATGACTGCATCTTTGAACAATAAATGATTTAAATCAGGTATGGCTGCCGATGGTTATCTTCCAGATTGGCTCGAGGACACTCTCTCTGA

SEQ ID NO: 21

Кодирующая область белков Rep AAV2 с мутантной промоторной областью mut10 p19

полужирный шрифт: регуляторный участки в промоторе p19

подчеркивание: мутация в промоторной области p19

ATGCCGGGGTTTTACGAGATTGTGATTAAGGTCCCCAGCGACCTTGACGAGCATCTGCCCGGCATTTCTGACAGCTTTGTGAACTGGGTGGCCGAGAAGGAATGGGAGTTGCCGCCAGATTCTGACATGGATCTGAATCTGATTGAGCAGGCACCCCTGACCGTGGCCGAGAAGCTGCAGCGCGACTTTCTGACGGAATGGCGCCGTGTGAGTAAGGCCCCGGAGGCCCTTTTCTTTGTGCAATTTGAGAAGGGAGAGAGCTACTTCCACATGCACGTGCTCGTGGAAACCACCGGGGTGAAATCCATGGTTTTGGGACGTTTCCTGAGTCAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCCGACTTTGCCAAACTGGTTCGCGGTCACAAAGACDCGBAACGGCGCCGGGGGDGGHAACAAAGTHGTHGATGAGTGCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAAACCCAGCCTGAGCTCCAGTGGGCGTGGACTAATATGGAACAGTATTTAAGCGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACGGTTGGTGGCGCAGCATCTGACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCCCAATTCTGATGCGCCGGTGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAGCTGGTCGGGTGGCTCGTGGACAAGGGGATTACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGGAGGACCAGGCCTCATACATCTCCTTCAATGCGGCCTCCAACTCGCGGTCCCAAATCAAGGCTGCCTTGGACAATGCGGGAAAGATTATGAGCCTGACTAAAACCGCCCCCGACTACCTGGTGGGCCAGCAGCCCGTGGAGGACATTTCCAGCAATCGGATTTATAAAATTTTGGAACTAAACGGGTACGATCCCCAATATGCGGCTTCCGTCTTTCTGGGATGGGCCACGAAAAAGTTCGGCAAGAGGAACACCATCTGGCTGTTTGGGCCTGCAACTACCGGGAAGACCAACATCGCGGAGGCCATAGCCCACACTGTGCCCTTCTACGGGTGCGTAAACTGGACCAATGAGAACTTTCCCTTCAACGACTGTGTCGACAAGATGGTGATCTGGTGGGAGGAGGGGAAGATGACCGCCAAGGTCGTGGAGTCGGCCAAAGCCATTCTCGGAGGAAGCAAGGTGCGCGTGGACCAGAAATGCAAGTCCTCGGCCCAGATAGACCCGACTCCCGTGATCGTCACCTCCAACACCAACATGTGCGCCGTGATTGACGGGAACTCAACGACCTTCGAACACCAGCAGCCGTTGCAAGACCGGATGTTCAAATTTGAACTCACCCGCCGTCTGGATCATGACTTTGGGAAGGTCACCAAGCAGGAAGTCAAAGACTTTTTCCGGTGGGCAAAGGATCACGTGGTTGAGGTGGAGCATGAATTCTACGTCAAAAAGGGTGGAGCCAAGAAAAGACCCGCCCCCAGTGACGCAGATATAAGTGAGCCCAAACGGGTGCGCGAGTCAGTTGCGCAGCCATCGACGTCAGACGCGGAAGCTTCGATCAACTACGCAGACAGGTACCAAAACAAATGTTCTCGTCACGTGGGCATGAATCTGATGCTGTTTCCCTGCAGACAATGCGAGAGAATGAATCAGAATTCAAATATCTGCTTCACTCACGGACAGAAAGACTGTTTAGAGTGCTTTCCCGTGTCAGAATCTCAACCCGTTTCTGTCGTCAAAAAGGCGTATCAGAAACTGTGCTACATTCATCATATCATGGGAAAGGTGCCAGACGCTTGCACTGCCTGCGATCTGGTCAATGTGGATTTGGATGACTGCATCTTTGAACAATAAATGATTTAAATCAGGTATGGCTGCCGATGGTTATCTTCCAGATTGGCTCGAGGACACTCTCTCTGA

SEQ ID NO: 22

Кодирующая область белков Rep AAV2 с мутантной промоторной областью mut10-2 p19

полужирный шрифт: регуляторный участки в промоторе p19

подчеркивание: мутация в промоторной области p19

ATGCCGGGGTTTTACGAGATTGTGATTAAGGTCCCCAGCGACCTTGACGAGCATCTGCCCGGCATTTCTGACAGCTTTGTGAACTGGGTGGCCGAGAAGGAATGGGAGTTGCCGCCAGATTCTGACATGGATCTGAATCTGATTGAGCAGGCACCCCTGACCGTGGCCGAGAAGCTGCAGCGCGACTTTCTGACGGAATGGCGCCGTGTGAGTAAGGCCCCGGAGGCCCTTTTCTTTGTGCAATTTGAGAAGGGAGAGAGCTACTTCCACATGCACGTGCTCGTGGAAACCACCGGGGTGAAATCCATGGTTTTGGGACGTTTCCTGAGTCAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCCGACTTTGCCAAACTGGTTCGCGGTCACAAAGACCAGAAATGGCGCCGGAGGCGGGAACAAGGTGGTGGATGAGTGCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAAACCCAGCCTGAGCTCCAATGGGCHTGGACVAACATGGAACAGTACCTBTCDGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACGGTTGGTGGCGCAGCATCTGACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCCCAATTCTGATGCGCCGGTGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAGCTGGTCGGGTGGCTCGTGGACAAGGGGATTACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGGAGGACCAGGCCTCATACATCTCCTTCAATGCGGCCTCCAACTCGCGGTCCCAAATCAAGGCTGCCTTGGACAATGCGGGAAAGATTATGAGCCTGACTAAAACCGCCCCCGACTACCTGGTGGGCCAGCAGCCCGTGGAGGACATTTCCAGCAATCGGATTTATAAAATTTTGGAACTAAACGGGTACGATCCCCAATATGCGGCTTCCGTCTTTCTGGGATGGGCCACGAAAAAGTTCGGCAAGAGGAACACCATCTGGCTGTTTGGGCCTGCAACTACCGGGAAGACCAACATCGCGGAGGCCATAGCCCACACTGTGCCCTTCTACGGGTGCGTAAACTGGACCAATGAGAACTTTCCCTTCAACGACTGTGTCGACAAGATGGTGATCTGGTGGGAGGAGGGGAAGATGACCGCCAAGGTCGTGGAGTCGGCCAAAGCCATTCTCGGAGGAAGCAAGGTGCGCGTGGACCAGAAATGCAAGTCCTCGGCCCAGATAGACCCGACTCCCGTGATCGTCACCTCCAACACCAACATGTGCGCCGTGATTGACGGGAACTCAACGACCTTCGAACACCAGCAGCCGTTGCAAGACCGGATGTTCAAATTTGAACTCACCCGCCGTCTGGATCATGACTTTGGGAAGGTCACCAAGCAGGAAGTCAAAGACTTTTTCCGGTGGGCAAAGGATCACGTGGTTGAGGTGGAGCATGAATTCTACGTCAAAAAGGGTGGAGCCAAGAAAAGACCCGCCCCCAGTGACGCAGATATAAGTGAGCCCAAACGGGTGCGCGAGTCAGTTGCGCAGCCATCGACGTCAGACGCGGAAGCTTCGATCAACTACGCAGACAGGTACCAAAACAAATGTTCTCGTCACGTGGGCATGAATCTGATGCTGTTTCCCTGCAGACAATGCGAGAGAATGAATCAGAATTCAAATATCTGCTTCACTCACGGACAGAAAGACTGTTTAGAGTGCTTTCCCGTGTCAGAATCTCAACCCGTTTCTGTCGTCAAAAAGGCGTATCAGAAACTGTGCTACATTCATCATATCATGGGAAAGGTGCCAGACGCTTGCACTGCCTGCGATCTGGTCAATGTGGATTTGGATGACTGCATCTTTGAACAATAAATGATTTAAATCAGGTATGGCTGCCGATGGTTATCTTCCAGATTGGCTCGAGGACACTCTCTCTGA

SEQ ID NO: 23

Кодирующая область белков Rep AAV2 с мутантной промоторной областью mut3 p19

полужирный шрифт: регуляторный участки в промоторе p19

подчеркивание: мутация в промоторной области p19

ATGCCGGGGTTTTACGAGATTGTGATTAAGGTCCCCAGCGACCTTGACGAGCATCTGCCCGGCATTTCTGACAGCTTTGTGAACTGGGTGGCCGAGAAGGAATGGGAGTTGCCGCCAGATTCTGACATGGATCTGAATCTGATTGAGCAGGCACCCCTGACCGTGGCCGAGAAGCTGCAGCGCGACTTTCTGACGGAATGGCGCCGTGTGAGTAAGGCCCCGGAGGCCCTTTTCTTTGTGCAATTTGAGAAGGGAGAGAGCTACTTCCACATGCACGTGCTCGTGGAAACCACCGGGGTGAAATCCATGGTTTTGGGACGTTTCCTGAGTCAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCCGACTTTGCCAAACTGGTTCGCGGTCACAAAGACCAGAAATGGCGCCGGAGGCGGGAACAAGGTGGTGGATGAGTGCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAAACCCAGCCTGAGCTCCAGTGGGCGTGGACTAATATGGAACAGTATGCBAGCGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACGGTTGGTGGCGCAGCATCTGACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCCCAATTCTGATGCGCCGGTGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAGCTGGTCGGGTGGCTCGTGGACAAGGGGATTACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGGAGGACCAGGCCTCATACATCTCCTTCAATGCGGCCTCCAACTCGCGGTCCCAAATCAAGGCTGCCTTGGACAATGCGGGAAAGATTATGAGCCTGACTAAAACCGCCCCCGACTACCTGGTGGGCCAGCAGCCCGTGGAGGACATTTCCAGCAATCGGATTTATAAAATTTTGGAACTAAACGGGTACGATCCCCAATATGCGGCTTCCGTCTTTCTGGGATGGGCCACGAAAAAGTTCGGCAAGAGGAACACCATCTGGCTGTTTGGGCCTGCAACTACCGGGAAGACCAACATCGCGGAGGCCATAGCCCACACTGTGCCCTTCTACGGGTGCGTAAACTGGACCAATGAGAACTTTCCCTTCAACGACTGTGTCGACAAGATGGTGATCTGGTGGGAGGAGGGGAAGATGACCGCCAAGGTCGTGGAGTCGGCCAAAGCCATTCTCGGAGGAAGCAAGGTGCGCGTGGACCAGAAATGCAAGTCCTCGGCCCAGATAGACCCGACTCCCGTGATCGTCACCTCCAACACCAACATGTGCGCCGTGATTGACGGGAACTCAACGACCTTCGAACACCAGCAGCCGTTGCAAGACCGGATGTTCAAATTTGAACTCACCCGCCGTCTGGATCATGACTTTGGGAAGGTCACCAAGCAGGAAGTCAAAGACTTTTTCCGGTGGGCAAAGGATCACGTGGTTGAGGTGGAGCATGAATTCTACGTCAAAAAGGGTGGAGCCAAGAAAAGACCCGCCCCCAGTGACGCAGATATAAGTGAGCCCAAACGGGTGCGCGAGTCAGTTGCGCAGCCATCGACGTCAGACGCGGAAGCTTCGATCAACTACGCAGACAGGTACCAAAACAAATGTTCTCGTCACGTGGGCATGAATCTGATGCTGTTTCCCTGCAGACAATGCGAGAGAATGAATCAGAATTCAAATATCTGCTTCACTCACGGACAGAAAGACTGTTTAGAGTGCTTTCCCGTGTCAGAATCTCAACCCGTTTCTGTCGTCAAAAAGGCGTATCAGAAACTGTGCTACATTCATCATATCATGGGAAAGGTGCCAGACGCTTGCACTGCCTGCGATCTGGTCAATGTGGATTTGGATGACTGCATCTTTGAACAATAAATGATTTAAATCAGGTATGGCTGCCGATGGTTATCTTCCAGATTGGCTCGAGGACACTCTCTCTGA

SEQ ID NO: 24

Кодирующая область белков Rep AAV2 с мутантной промоторной областью mut2-2 p19

полужирный шрифт: регуляторный участки в промоторе p19

подчеркивание: мутация в промоторной области p19

ATGCCGGGGTTTTACGAGATTGTGATTAAGGTCCCCAGCGACCTTGACGAGCATCTGCCCGGCATTTCTGACAGCTTTGTGAACTGGGTGGCCGAGAAGGAATGGGAGTTGCCGCCAGATTCTGACATGGATCTGAATCTGATTGAGCAGGCACCCCTGACCGTGGCCGAGAAGCTGCAGCGCGACTTTCTGACGGAATGGCGCCGTGTGAGTAAGGCCCCGGAGGCCCTTTTCTTTGTGCAATTTGAGAAGGGAGAGAGCTACTTCCACATGCACGTGCTCGTGGAAACCACCGGGGTGAAATCCATGGTTTTGGGACGTTTCCTGAGTCAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCCGACTTTGCCAAACTGGTTCGCGGTCACAAAGACCAGAAATGGCGCCGGAGGCGGGAACAAGGTGGTGGATGAGTGCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAAACCCAGCCTGAGCTCCAGTGGGGHTGGACTAATATGGAACAGTATTTAAGCGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACGGTTGGTGGCGCAGCATCTGACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCCCAATTCTGATGCGCCGGTGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAGCTGGTCGGGTGGCTCGTGGACAAGGGGATTACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGGAGGACCAGGCCTCATACATCTCCTTCAATGCGGCCTCCAACTCGCGGTCCCAAATCAAGGCTGCCTTGGACAATGCGGGAAAGATTATGAGCCTGACTAAAACCGCCCCCGACTACCTGGTGGGCCAGCAGCCCGTGGAGGACATTTCCAGCAATCGGATTTATAAAATTTTGGAACTAAACGGGTACGATCCCCAATATGCGGCTTCCGTCTTTCTGGGATGGGCCACGAAAAAGTTCGGCAAGAGGAACACCATCTGGCTGTTTGGGCCTGCAACTACCGGGAAGACCAACATCGCGGAGGCCATAGCCCACACTGTGCCCTTCTACGGGTGCGTAAACTGGACCAATGAGAACTTTCCCTTCAACGACTGTGTCGACAAGATGGTGATCTGGTGGGAGGAGGGGAAGATGACCGCCAAGGTCGTGGAGTCGGCCAAAGCCATTCTCGGAGGAAGCAAGGTGCGCGTGGACCAGAAATGCAAGTCCTCGGCCCAGATAGACCCGACTCCCGTGATCGTCACCTCCAACACCAACATGTGCGCCGTGATTGACGGGAACTCAACGACCTTCGAACACCAGCAGCCGTTGCAAGACCGGATGTTCAAATTTGAACTCACCCGCCGTCTGGATCATGACTTTGGGAAGGTCACCAAGCAGGAAGTCAAAGACTTTTTCCGGTGGGCAAAGGATCACGTGGTTGAGGTGGAGCATGAATTCTACGTCAAAAAGGGTGGAGCCAAGAAAAGACCCGCCCCCAGTGACGCAGATATAAGTGAGCCCAAACGGGTGCGCGAGTCAGTTGCGCAGCCATCGACGTCAGACGCGGAAGCTTCGATCAACTACGCAGACAGGTACCAAAACAAATGTTCTCGTCACGTGGGCATGAATCTGATGCTGTTTCCCTGCAGACAATGCGAGAGAATGAATCAGAATTCAAATATCTGCTTCACTCACGGACAGAAAGACTGTTTAGAGTGCTTTCCCGTGTCAGAATCTCAACCCGTTTCTGTCGTCAAAAAGGCGTATCAGAAACTGTGCTACATTCATCATATCATGGGAAAGGTGCCAGACGCTTGCACTGCCTGCGATCTGGTCAATGTGGATTTGGATGACTGCATCTTTGAACAATAAATGATTTAAATCAGGTATGGCTGCCGATGGTTATCTTCCAGATTGGCTCGAGGACACTCTCTCTGA

SEQ ID NO: 25

Кодирующая область белков Rep AAV2 с мутантной промоторной областью mut2-3 p19

полужирный шрифт: регуляторный участки в промоторе p19

подчеркивание: мутация в промоторной области p19

ATGCCGGGGTTTTACGAGATTGTGATTAAGGTCCCCAGCGACCTTGACGAGCATCTGCCCGGCATTTCTGACAGCTTTGTGAACTGGGTGGCCGAGAAGGAATGGGAGTTGCCGCCAGATTCTGACATGGATCTGAATCTGATTGAGCAGGCACCCCTGACCGTGGCCGAGAAGCTGCAGCGCGACTTTCTGACGGAATGGCGCCGTGTGAGTAAGGCCCCGGAGGCCCTTTTCTTTGTGCAATTTGAGAAGGGAGAGAGCTACTTCCACATGCACGTGCTCGTGGAAACCACCGGGGTGAAATCCATGGTTTTGGGACGTTTCCTGAGTCAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCCGACTTTGCCAAACTGGTTCGCGGTCACAAAGACCAGAAATGGCGCCGGAGGCGGGAACAAGGTGGTGGATGAGTGCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAAACCCAGCCTGAGCTCCAGTGGGCGTGGACTAATATGGAACAGTATCTBAGCGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACGGTTGGTGGCGCAGCATCTGACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCCCAATTCTGATGCGCCGGTGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAGCTGGTCGGGTGGCTCGTGGACAAGGGGATTACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGGAGGACCAGGCCTCATACATCTCCTTCAATGCGGCCTCCAACTCGCGGTCCCAAATCAAGGCTGCCTTGGACAATGCGGGAAAGATTATGAGCCTGACTAAAACCGCCCCCGACTACCTGGTGGGCCAGCAGCCCGTGGAGGACATTTCCAGCAATCGGATTTATAAAATTTTGGAACTAAACGGGTACGATCCCCAATATGCGGCTTCCGTCTTTCTGGGATGGGCCACGAAAAAGTTCGGCAAGAGGAACACCATCTGGCTGTTTGGGCCTGCAACTACCGGGAAGACCAACATCGCGGAGGCCATAGCCCACACTGTGCCCTTCTACGGGTGCGTAAACTGGACCAATGAGAACTTTCCCTTCAACGACTGTGTCGACAAGATGGTGATCTGGTGGGAGGAGGGGAAGATGACCGCCAAGGTCGTGGAGTCGGCCAAAGCCATTCTCGGAGGAAGCAAGGTGCGCGTGGACCAGAAATGCAAGTCCTCGGCCCAGATAGACCCGACTCCCGTGATCGTCACCTCCAACACCAACATGTGCGCCGTGATTGACGGGAACTCAACGACCTTCGAACACCAGCAGCCGTTGCAAGACCGGATGTTCAAATTTGAACTCACCCGCCGTCTGGATCATGACTTTGGGAAGGTCACCAAGCAGGAAGTCAAAGACTTTTTCCGGTGGGCAAAGGATCACGTGGTTGAGGTGGAGCATGAATTCTACGTCAAAAAGGGTGGAGCCAAGAAAAGACCCGCCCCCAGTGACGCAGATATAAGTGAGCCCAAACGGGTGCGCGAGTCAGTTGCGCAGCCATCGACGTCAGACGCGGAAGCTTCGATCAACTACGCAGACAGGTACCAAAACAAATGTTCTCGTCACGTGGGCATGAATCTGATGCTGTTTCCCTGCAGACAATGCGAGAGAATGAATCAGAATTCAAATATCTGCTTCACTCACGGACAGAAAGACTGTTTAGAGTGCTTTCCCGTGTCAGAATCTCAACCCGTTTCTGTCGTCAAAAAGGCGTATCAGAAACTGTGCTACATTCATCATATCATGGGAAAGGTGCCAGACGCTTGCACTGCCTGCGATCTGGTCAATGTGGATTTGGATGACTGCATCTTTGAACAATAAATGATTTAAATCAGGTATGGCTGCCGATGGTTATCTTCCAGATTGGCTCGAGGACACTCTCTCTGA

SEQ ID NO: 26

Кодирующая область белков Rep AAV2 с мутантной промоторной областью mut1-3 p19

полужирный шрифт: регуляторный участки в промоторе p19

подчеркивание: мутация в промоторной области p19

ATGCCGGGGTTTTACGAGATTGTGATTAAGGTCCCCAGCGACCTTGACGAGCATCTGCCCGGCATTTCTGACAGCTTTGTGAACTGGGTGGCCGAGAAGGAATGGGAGTTGCCGCCAGATTCTGACATGGATCTGAATCTGATTGAGCAGGCACCCCTGACCGTGGCCGAGAAGCTGCAGCGCGACTTTCTGACGGAATGGCGCCGTGTGAGTAAGGCCCCGGAGGCCCTTTTCTTTGTGCAATTTGAGAAGGGAGAGAGCTACTTCCACATGCACGTGCTCGTGGAAACCACCGGGGTGAAATCCATGGTTTTGGGACGTTTCCTGAGTCAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCCGACTTTGCCAAACTGGTTCGCGGTCACAAAGACCAGAAATGGCGCCGGAGGCGGGAACAAGGTGGTGGATGAGTGCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAAACCCAGCCTGAGCTCCAGTGGGCGTGGACTAATATGGAACAGTATCTAAGCGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACGGTTGGTGGCGCAGCATCTGACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCCCAATTCTGATGCGCCGGTGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAGCTGGTCGGGTGGCTCGTGGACAAGGGGATTACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGGAGGACCAGGCCTCATACATCTCCTTCAATGCGGCCTCCAACTCGCGGTCCCAAATCAAGGCTGCCTTGGACAATGCGGGAAAGATTATGAGCCTGACTAAAACCGCCCCCGACTACCTGGTGGGCCAGCAGCCCGTGGAGGACATTTCCAGCAATCGGATTTATAAAATTTTGGAACTAAACGGGTACGATCCCCAATATGCGGCTTCCGTCTTTCTGGGATGGGCCACGAAAAAGTTCGGCAAGAGGAACACCATCTGGCTGTTTGGGCCTGCAACTACCGGGAAGACCAACATCGCGGAGGCCATAGCCCACACTGTGCCCTTCTACGGGTGCGTAAACTGGACCAATGAGAACTTTCCCTTCAACGACTGTGTCGACAAGATGGTGATCTGGTGGGAGGAGGGGAAGATGACCGCCAAGGTCGTGGAGTCGGCCAAAGCCATTCTCGGAGGAAGCAAGGTGCGCGTGGACCAGAAATGCAAGTCCTCGGCCCAGATAGACCCGACTCCCGTGATCGTCACCTCCAACACCAACATGTGCGCCGTGATTGACGGGAACTCAACGACCTTCGAACACCAGCAGCCGTTGCAAGACCGGATGTTCAAATTTGAACTCACCCGCCGTCTGGATCATGACTTTGGGAAGGTCACCAAGCAGGAAGTCAAAGACTTTTTCCGGTGGGCAAAGGATCACGTGGTTGAGGTGGAGCATGAATTCTACGTCAAAAAGGGTGGAGCCAAGAAAAGACCCGCCCCCAGTGACGCAGATATAAGTGAGCCCAAACGGGTGCGCGAGTCAGTTGCGCAGCCATCGACGTCAGACGCGGAAGCTTCGATCAACTACGCAGACAGGTACCAAAACAAATGTTCTCGTCACGTGGGCATGAATCTGATGCTGTTTCCCTGCAGACAATGCGAGAGAATGAATCAGAATTCAAATATCTGCTTCACTCACGGACAGAAAGACTGTTTAGAGTGCTTTCCCGTGTCAGAATCTCAACCCGTTTCTGTCGTCAAAAAGGCGTATCAGAAACTGTGCTACATTCATCATATCATGGGAAAGGTGCCAGACGCTTGCACTGCCTGCGATCTGGTCAATGTGGATTTGGATGACTGCATCTTTGAACAATAAATGATTTAAATCAGGTATGGCTGCCGATGGTTATCTTCCAGATTGGCTCGAGGACACTCTCTCTGA

SEQ ID NO: 27

Кодирующая область белков Rep AAV2 с мутантной промоторной областью mut5-2 p19

полужирный шрифт: регуляторный участки в промоторе p19

подчеркивание: мутация в промоторной области p19

ATGCCGGGGTTTTACGAGATTGTGATTAAGGTCCCCAGCGACCTTGACGAGCATCTGCCCGGCATTTCTGACAGCTTTGTGAACTGGGTGGCCGAGAAGGAATGGGAGTTGCCGCCAGATTCTGACATGGATCTGAATCTGATTGAGCAGGCACCCCTGACCGTGGCCGAGAAGCTGCAGCGCGACTTTCTGACGGAATGGCGCCGTGTGAGTAAGGCCCCGGAGGCCCTTTTCTTTGTGCAATTTGAGAAGGGAGAGAGCTACTTCCACATGCACGTGCTCGTGGAAACCACCGGGGTGAAATCCATGGTTTTGGGACGTTTCCTGAGTCAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCCGACTTTGCCAAACTGGTTCGCGGTCACAAAGACCAGAAATGGCGCCGGAGGCGGGAACAAGGTGGTGGATGAGTGCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAAACCCAGCCTGAGCTCCAGTGGGCGTGGACTAATATGGAACAGTACCTBTCCGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACGGTTGGTGGCGCAGCATCTGACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCCCAATTCTGATGCGCCGGTGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAGCTGGTCGGGTGGCTCGTGGACAAGGGGATTACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGGAGGACCAGGCCTCATACATCTCCTTCAATGCGGCCTCCAACTCGCGGTCCCAAATCAAGGCTGCCTTGGACAATGCGGGAAAGATTATGAGCCTGACTAAAACCGCCCCCGACTACCTGGTGGGCCAGCAGCCCGTGGAGGACATTTCCAGCAATCGGATTTATAAAATTTTGGAACTAAACGGGTACGATCCCCAATATGCGGCTTCCGTCTTTCTGGGATGGGCCACGAAAAAGTTCGGCAAGAGGAACACCATCTGGCTGTTTGGGCCTGCAACTACCGGGAAGACCAACATCGCGGAGGCCATAGCCCACACTGTGCCCTTCTACGGGTGCGTAAACTGGACCAATGAGAACTTTCCCTTCAACGACTGTGTCGACAAGATGGTGATCTGGTGGGAGGAGGGGAAGATGACCGCCAAGGTCGTGGAGTCGGCCAAAGCCATTCTCGGAGGAAGCAAGGTGCGCGTGGACCAGAAATGCAAGTCCTCGGCCCAGATAGACCCGACTCCCGTGATCGTCACCTCCAACACCAACATGTGCGCCGTGATTGACGGGAACTCAACGACCTTCGAACACCAGCAGCCGTTGCAAGACCGGATGTTCAAATTTGAACTCACCCGCCGTCTGGATCATGACTTTGGGAAGGTCACCAAGCAGGAAGTCAAAGACTTTTTCCGGTGGGCAAAGGATCACGTGGTTGAGGTGGAGCATGAATTCTACGTCAAAAAGGGTGGAGCCAAGAAAAGACCCGCCCCCAGTGACGCAGATATAAGTGAGCCCAAACGGGTGCGCGAGTCAGTTGCGCAGCCATCGACGTCAGACGCGGAAGCTTCGATCAACTACGCAGACAGGTACCAAAACAAATGTTCTCGTCACGTGGGCATGAATCTGATGCTGTTTCCCTGCAGACAATGCGAGAGAATGAATCAGAATTCAAATATCTGCTTCACTCACGGACAGAAAGACTGTTTAGAGTGCTTTCCCGTGTCAGAATCTCAACCCGTTTCTGTCGTCAAAAAGGCGTATCAGAAACTGTGCTACATTCATCATATCATGGGAAAGGTGCCAGACGCTTGCACTGCCTGCGATCTGGTCAATGTGGATTTGGATGACTGCATCTTTGAACAATAAATGATTTAAATCAGGTATGGCTGCCGATGGTTATCTTCCAGATTGGCTCGAGGACACTCTCTCTGA

SEQ ID NO: 28

Кодирующая область белков Rep AAV2 с мутантной промоторной областью mut20 p19

полужирный шрифт: регуляторный участки в промоторе p19

подчеркивание: мутация в промоторной области p19

ATGCCGGGGTTTTACGAGATTGTGATTAAGGTCCCCAGCGACCTTGACGAGCATCTGCCCGGCATTTCTGACAGCTTTGTGAACTGGGTGGCCGAGAAGGAATGGGAGTTGCCGCCAGATTCTGACATGGATCTGAATCTGATTGAGCAGGCACCCCTGACCGTGGCCGAGAAGCTGCAGCGCGACTTTCTGACGGAATGGCGCCGTGTGAGTAAGGCCCCGGAGGCCCTTTTCTTTGTGCAATTTGAGAAGGGAGAGAGCTACTTCCACATGCACGTGCTCGTGGAAACCACCGGGGTGAAATCCATGGTTTTGGGACGTTTCCTGAGTCAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCCGACTTTGCCAAACTGGTTCGCGGTCACAAAGACDCGBAACGGCGCCGGGGGDGGHAACAAAGTHGTHGATGAGTGCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAAACCCAGCCTGAGCTCCAATGGGCHTGGACVAACATGGAACAGTACCTBTCDGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACGGTTGGTGGCGCAGCATCTGACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCCCAATTCTGATGCGCCGGTGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAGCTGGTCGGGTGGCTCGTGGACAAGGGGATTACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGGAGGACCAGGCCTCATACATCTCCTTCAATGCGGCCTCCAACTCGCGGTCCCAAATCAAGGCTGCCTTGGACAATGCGGGAAAGATTATGAGCCTGACTAAAACCGCCCCCGACTACCTGGTGGGCCAGCAGCCCGTGGAGGACATTTCCAGCAATCGGATTTATAAAATTTTGGAACTAAACGGGTACGATCCCCAATATGCGGCTTCCGTCTTTCTGGGATGGGCCACGAAAAAGTTCGGCAAGAGGAACACCATCTGGCTGTTTGGGCCTGCAACTACCGGGAAGACCAACATCGCGGAGGCCATAGCCCACACTGTGCCCTTCTACGGGTGCGTAAACTGGACCAATGAGAACTTTCCCTTCAACGACTGTGTCGACAAGATGGTGATCTGGTGGGAGGAGGGGAAGATGACCGCCAAGGTCGTGGAGTCGGCCAAAGCCATTCTCGGAGGAAGCAAGGTGCGCGTGGACCAGAAATGCAAGTCCTCGGCCCAGATAGACCCGACTCCCGTGATCGTCACCTCCAACACCAACATGTGCGCCGTGATTGACGGGAACTCAACGACCTTCGAACACCAGCAGCCGTTGCAAGACCGGATGTTCAAATTTGAACTCACCCGCCGTCTGGATCATGACTTTGGGAAGGTCACCAAGCAGGAAGTCAAAGACTTTTTCCGGTGGGCAAAGGATCACGTGGTTGAGGTGGAGCATGAATTCTACGTCAAAAAGGGTGGAGCCAAGAAAAGACCCGCCCCCAGTGACGCAGATATAAGTGAGCCCAAACGGGTGCGCGAGTCAGTTGCGCAGCCATCGACGTCAGACGCGGAAGCTTCGATCAACTACGCAGACAGGTACCAAAACAAATGTTCTCGTCACGTGGGCATGAATCTGATGCTGTTTCCCTGCAGACAATGCGAGAGAATGAATCAGAATTCAAATATCTGCTTCACTCACGGACAGAAAGACTGTTTAGAGTGCTTTCCCGTGTCAGAATCTCAACCCGTTTCTGTCGTCAAAAAGGCGTATCAGAAACTGTGCTACATTCATCATATCATGGGAAAGGTGCCAGACGCTTGCACTGCCTGCGATCTGGTCAATGTGGATTTGGATGACTGCATCTTTGAACAATAAATGATTTAAATCAGGTATGGCTGCCGATGGTTATCTTCCAGATTGGCTCGAGGACACTCTCTCTGA

SEQ ID NO: 29

Синтетический локус rep AAV2

полужирный шрифт: регуляторный участки в промоторе p19

подчеркивание: участки рестрикции HpaI

GTTAACTGACGTGAATTACGTCATAGGGTTAGGGAGGTCCTGTATTAGAGGTCACGTGAGTGTTTTGCGACATTTTGCGACACCATGTGGTCACGCTGGGTATTTAAGCCCGAGTGAGCACGCAGGGTCTCCATTTTGAAGCGGGAGGTTTGAACGCGCAGCCGCCATGCCGGGGTTTTACGAGATTGTGATTAAGGTCCCCAGCGACCTTGACGAGCATCTGCCCGGCATTTCTGACAGCTTTGTGAACTGGGTGGCCGAGAAGGAATGGGAGTTGCCGCCAGATTCTGACATGGATCTGAATCTGATTGAGCAGGCACCCCTGACCGTGGCCGAGAAGCTGCAGCGCGACTTTCTGACGGAATGGCGCCGTGTGAGTAAGGCCCCGGAGGCCCTTTTCTTTGTGCAATTTGAGAAGGGAGAGAGCTACTTCCACATGCACGTGCTCGTGGAAACCACCGGGGTGAAATCCATGGTTTTGGGACGTTTCCTGAGTCAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCCGACTTTGCCAAACTGGTTCGCGGTCACAAAGACCAGAAATGGCGCCGGAGGCGGGAACAAGGTGGTGGATGAGTGCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAAACCCAGCCTGAGCTCCAGTGGGCGTGGACTAATATGGAACAGTATTTAAGCGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACGGTTGGTGGCGCAGCATCTGACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCCCAATTCTGATGCGCCGGTGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAGCTGGTCGGGTGGCTCGTGGACAAGGGGATTACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGGAGGACCAGGCCTCATACATCTCCTTCAATGCGGCCTCCAACTCGCGGTCCCAAATCAAGGCTGCCTTGGACAATGCGGGAAAGATTATGAGCCTGACTAAAACCGCCCCCGACTACCTGGTGGGCCAGCAGCCCGTGGAGGACATTTCCAGCAATCGGATTTATAAAATTTTGGAACTAAACGGGTACGATCCCCAATATGCGGCTTCCGTCTTTCTGGGATGGGCCACGAAAAAGTTCGGCAAGAGGAACACCATCTGGCTGTTTGGGCCTGCAACTACCGGGAAGACCAACATCGCGGAGGCCATAGCCCACACTGTGCCCTTCTACGGGTGCGTAAACTGGACCAATGAGAACTTTCCCTTCAACGACTGTGTCGACAAGATGGTGATCTGGTGGGAGGAGGGGAAGATGACCGCCAAGGTCGTGGAGTCGGCCAAAGCCATTCTCGGAGGAAGCAAGGTGCGCGTGGACCAGAAATGCAAGTCCTCGGCCCAGATAGACCCGACTCCCGTGATCGTCACCTCCAACACCAACATGTGCGCCGTGATTGACGGGAACTCAACGACCTTCGAACACCAGCAGCCGTTGCAAGACCGGATGTTCAAATTTGAACTCACCCGCCGTCTGGATCATGACTTTGGGAAGGTCACCAAGCAGGAAGTCAAAGACTTTTTCCGGTGGGCAAAGGATCACGTGGTTGAGGTGGAGCATGAATTCTACGTCAAAAAGGGTGGAGCCAAGAAAAGACCCGCCCCCAGTGACGCAGATATAAGTGAGCCCAAACGGGTGCGCGAGTCAGTTGCGCAGCCATCGACGTCAGACGCGGAAGCTTCGATCAACTACGCAGACAGGTACCAAAACAAATGTTCTCGTCACGTGGGCATGAATCTGATGCTGTTTCCCTGCAGACAATGCGAGAGAATGAATCAGAATTCAAATATCTGCTTCACTCACGGACAGAAAGACTGTTTAGAGTGCTTTCCCGTGTCAGAATCTCAACCCGTTTCTGTCGTCAAAAAGGCGTATCAGAAACTGTGCTACATTCATCATATCATGGGAAAGGTGCCAGACGCTTGCACTGCCTGCGATCTGGTCAATGTGGATTTGGATGACTGCATCTTTGAACAATAAATGATTTAAATCAGGTATGGCTGCCGATGGTTATCTTCCAGATTGGCTCGAGGACACTCTCTCTGAAGGAATAAGACAGTGGTGGAAGCTCAAACCTGGCCCACCACCACCAAAGCCCGCAGAGCGGCATAAGGACGACAGCAGGGGTTAAC

SEQ ID NO: 30

Конструкция для индуцибельной экспрессии белков Rep AAV2

GTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATGAAGAGTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATGCAGACTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATAAGGAGTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATGACCAGTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATCTACAGTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATATCCAGTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATAAGCTTTAGGCGTGTACGGTGGGCGCCTATAAAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGCAATTCCACAACACTTTTGTCTTATACCAACTTTCCGTACCACTTCCTACCCTCGTAAAGTCGACACCGGGGCCCAGATCTATCGATCGGCCGGATAACGCCACCATGGAGCTGGTCGGGTGGCTCGTGGACAAGGGGATTACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGGAGGACCAGGCCTCATACATCTCCTTCAATGCGGCCTCCAACTCGCGGTCCCAAATCAAGGCTGCCTTGGACAATGCGGGAAAGATTATGAGCCTGACTAAAACCGCCCCCGACTACCTGGTGGGCCAGCAGCCCGTGGAGGACATTTCCAGCAATCGGATTTATAAAATTTTGGAACTAAACGGGTACGATCCCCAATATGCGGCTTCCGTCTTTCTGGGATGGGCCACGAAAAAGTTCGGCAAGAGGAACACCATCTGGCTGTTTGGGCCTGCAACTACCGGGAAGACCAACATCGCGGAGGCCATAGCCCACACTGTGCCCTTCTACGGGTGCGTAAACTGGACCAATGAGAACTTTCCCTTCAACGACTGTGTCGACAAGATGGTGATCTGGTGGGAGGAGGGGAAGATGACCGCCAAGGTCGTGGAGTCGGCCAAAGCCATTCTCGGAGGAAGCAAGGTGCGCGTGGACCAGAAATGCAAGTCCTCGGCCCAGATAGACCCGACTCCCGTGATCGTCACCTCCAACACCAACATGTGCGCCGTGATTGACGGGAACTCAACGACCTTCGAACACCAGCAGCCGTTGCAAGACCGGATGTTCAAATTTGAACTCACCCGCCGTCTGGATCATGACTTTGGGAAGGTCACCAAGCAGGAAGTCAAAGACTTTTTCCGGTGGGCAAAGGATCACGTGGTTGAGGTGGAGCATGAATTCTACGTCAAAAAGGGTGGAGCCAAGAAAAGACCCGCCCCCAGTGACGCAGATATAAGTGAGCCCAAACGGGTGCGCGAGTCAGTTGCGCAGCCATCGACGTCAGACGCGGAAGCTTCGATCAACTACGCAGACAGGTACCAAAACAAATGTTCTCGTCACGTGGGCATGAATCTGATGCTGTTTCCCTGCAGACAATGCGAGAGAATGAATCAGAATTCAAATATCTGCTTCACTCACGGACAGAAAGACTGTTTAGAGTGCTTTCCCGTGTCAGAATCTCAACCCGTTTCTGTCGTCAAAAAGGCGTATCAGAAACTGTGCTACATTCATCATATCATGGGAAAGGTGCCAGACGCTTGCACTGCCTGCGATCTGGTCAATGTGGATTTGGATGACTGCATCTTTGAACAATAAATGATTTAAATCAGGTATGGCTGCCGATGGTTATCTTCCAGATTGGCTCGAGGACACTCTCTCTGAGATAACTGAGGGATAGAATTCCGCCCCCCCCCCCTAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAATAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGTGTTTAGTCGAGGTTAAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATAATAGTTATCGCCGCCATGCCGGGGTTTTACGAGATTGTGATTAAGGTCCCCAGCGACCTTGACGAGCATCTGCCCGGCATTTCTGACAGCTTTGTGAACTGGGTGGCCGAGAAGGAATGGGAGTTGCCGCCAGATTCTGACATGGATCTGAATCTGATTGAGCAGGCACCCCTGACCGTGGCCGAGAAGCTGCAGCGCGACTTTCTGACGGAATGGCGCCGTGTGAGTAAGGCCCCGGAGGCCCTTTTCTTTGTGCAATTTGAGAAGGGAGAGAGCTACTTCCACATGCACGTGCTCGTGGAAACCACCGGGGTGAAATCCATGGTTTTGGGACGTTTCCTGAGTCAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCCGACTTTGCCAAACTGGTTCGCGGTCACAAAGACACGGAACGGCGCCGGGGGAGGCAACAAAGTCGTCGATGAGTGCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAAACCCAGCCTGAGCTCCAATGGGCTTGGACCAACATGGAACAGTACTTGTCGGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACGGTTGGTGGCGCAGCATCTGACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCCCAATTCTGATGCGCCGGTGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAGCTGGTCGGGTGGCTCGTGGACAAGGGGATTACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGGAGGACCAGGCCTCATACATCTCCTTCAATGCGGCCTCCAACTCGCGGTCCCAAATCAAGGCTGCCTTGGACAATGCGGGAAAGATTATGAGCCTGACTAAAACCGCCCCCGACTACCTGGTGGGCCAGCAGCCCGTGGAGGACATTTCCAGCAATCGGATTTATAAAATTTTGGAACTAAACGGGTACGATCCCCAATATGCGGCTTCCGTCTTTCTGGGATGGGCCACGAAAAAGTTCGGCAAGAGGAACACCATCTGGCTGTTTGGGCCTGCAACTACCGGGAAGACCAACATCGCGGAGGCCATAGCCCACACTGTGCCCTTCTACGGGTGCGTAAACTGGACCAATGAGAACTTTCCCTTCAACGACTGTGTCGACAAGATGGTGATCTGGTGGGAGGAGGGGAAGATGACCGCCAAGGTCGTGGAGTCGGCCAAAGCCATTCTCGGAGGAAGCAAGGTGCGCGTGGACCAGAAATGCAAGTCCTCGGCCCAGATAGACCCGACTCCCGTGATCGTCACCTCCAACACCAACATGTGCGCCGTGATTGACGGGAACTCAACGACCTTCGAACACCAGCAGCCGTTGCAAGACCGGATGTTCAAATTTGAACTCACCCGCCGTCTGGATCATGACTTTGGGAAGGTCACCAAGCAGGAAGTCAAAGACTTTTTCCGGTGGGCAAAGGATCACGTGGTTGAGGTGGAGCATGAATTCTACGTCAAAAAGGGTGGAGCCAAGAAAAGACCCGCCCCCAGTGACGCAGATATAAGTGAGCCCAAACGGGTGCGCGAGTCAGTTGCGCAGCCATCGACGTCAGACGCGGAAGCTTCGATCAACTACGCAGACAGGTACCAAAACAAATGTTCTCGTCACGTGGGCATGAATCTGATGCTGTTTCCCTGCAGACAATGCGAGAGAATGAATCAGAATTCAAATATCTGCTTCACTCACGGACAGAAAGACTGTTTAGAGTGCTTTCCCGTGTCAGAATCTCAACCCGTTTCTGTCGTCAAAAAGGCGTATCAGAAACTGTGCTACATTCATCATATCATGGGAAAGGTGCCAGACGCTTGCACTGCCTGCGATCTGGTCAATGTGGATTTGGATGACTGCATCTTTGAACAATAAATGATTTAAATCAGGTATGGCTGCCGATGGTTATCTTCCAGATTGGCTCGAGGACACTCTCTCTGAGTTATCATTTAAATGGCGCGCCCACGTGGGTACCGCGGCCGCGGGGATCCAGACATGATAAGATACATTGATGAGTTTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTGAAAAAAATGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTAACAACAACAATTGCATTCATTTTATGTTTCAGGTTCAGGGGGAGGTGTGGGAGGTTTTTTCGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCA

SEQ ID NO: 31

Прямой праймер CMV

AAATGGCCCGCCTGGCATTATG

SEQ ID NO: 32

Обратный праймер CMV

AAACCGCTATCCACGCCCATTG

SEQ ID NO: 33

Зонд CMV

ACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATC

SEQ ID NO: 34

Мутантная промоторная область p19 AAV2 L (SP1 -50)

полужирный шрифт: регуляторный участки в промоторе p19

подчеркивание: мутации в промоторной области p19

CAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCCGACTTTGCCAAACTGGTTCGCGGTCACAAAGACCAGAAATGGCGCCGGAGGCGGGAACAAGGTGGTGGATGAGTGCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAAACCCAGCCTGAGCTCCAATGGGCHTGGACTAATATGGAACAGTATTTAAGCGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACGGTTGGTGGCGCAGCATCTGACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCCCAATTCTGATGCGCCGGTGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAGCTGGTCGGGTGGCTCGTGGACAAGGGGATTACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGG

SEQ ID NO: 35

Мутантная промоторная область p19 AAV2 M (TATA -20)

полужирный шрифт: регуляторный участки в промоторе p19

подчеркивание: мутации в промоторной области p19

CAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCCGACTTTGCCAAACTGGTTCGCGGTCACAAAGACCAGAAATGGCGCCGGAGGCGGGAACAAGGTGGTGGATGAGTGCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAAACCCAGCCTGAGCTCCAGTGGGCGTGGACVAACATGGAACAGTATTTAAGCGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACGGTTGGTGGCGCAGCATCTGACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCCCAATTCTGATGCGCCGGTGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAGCTGGTCGGGTGGCTCGTGGACAAGGGGATTACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGG

SEQ ID NO: 36

Мутантная промоторная область p19 AAV2 N (SP1 -50 1)

полужирный шрифт: регуляторный участки в промоторе p19

подчеркивание: мутации в промоторной области p19

CAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCCGACTTTGCCAAACTGGTTCGCGGTCACAAAGACCAGAAATGGCGCCGGAGGCGGGAACAAGGTGGTGGATGAGTGCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAAACCCAGCCTGAGCTCCAATGGGCGTGGACTAATATGGAACAGTATTTAAGCGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACGGTTGGTGGCGCAGCATCTGACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCCCAATTCTGATGCGCCGGTGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAGCTGGTCGGGTGGCTCGTGGACAAGGGGATTACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGG

SEQ ID NO: 37

Мутантная промоторная область p19 AAV2 O (SP1 -50 2)

полужирный шрифт: регуляторный участки в промоторе p19

подчеркивание: мутации в промоторной области p19

CAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCCGACTTTGCCAAACTGGTTCGCGGTCACAAAGACCAGAAATGGCGCCGGAGGCGGGAACAAGGTGGTGGATGAGTGCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAAACCCAGCCTGAGCTCCAGTGGGCHTGGACTAATATGGAACAGTATTTAAGCGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACGGTTGGTGGCGCAGCATCTGACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCCCAATTCTGATGCGCCGGTGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAGCTGGTCGGGTGGCTCGTGGACAAGGGGATTACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGG

SEQ ID NO: 38

Мутантная промоторная область p19 AAV2 P (TATA -20 1)

полужирный шрифт: регуляторный участки в промоторе p19

подчеркивание: мутации в промоторной области p19

CAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCCGACTTTGCCAAACTGGTTCGCGGTCACAAAGACCAGAAATGGCGCCGGAGGCGGGAACAAGGTGGTGGATGAGTGCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAAACCCAGCCTGAGCTCCAGTGGGCGTGGACVAATATGGAACAGTATTTAAGCGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACGGTTGGTGGCGCAGCATCTGACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCCCAATTCTGATGCGCCGGTGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAGCTGGTCGGGTGGCTCGTGGACAAGGGGATTACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGG

SEQ ID NO: 39

Мутантная промоторная область p19 AAV2 Q (TATA -20 2)

полужирный шрифт: регуляторный участки в промоторе p19

подчеркивание: мутации в промоторной области p19

CAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCCGACTTTGCCAAACTGGTTCGCGGTCACAAAGACCAGAAATGGCGCCGGAGGCGGGAACAAGGTGGTGGATGAGTGCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAAACCCAGCCTGAGCTCCAGTGGGCGTGGACTAACATGGAACAGTATTTAAGCGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACGGTTGGTGGCGCAGCATCTGACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCCCAATTCTGATGCGCCGGTGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAGCTGGTCGGGTGGCTCGTGGACAAGGGGATTACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGG

SEQ ID NO: 40

Мутантная промоторная область p19 AAV2 R (SP1 -50 & TATA -35)

полужирный шрифт: регуляторный участки в промоторе p19

подчеркивание: мутации в промоторной области p19

CAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCCGACTTTGCCAAACTGGTTCGCGGTCACAAAGACCAGAAATGGCGCCGGAGGCGGGAACAAGGTGGTGGATGAGTGCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAAACCCAGCCTGAGCTCCAATGGGCHTGGACVAACATGGAACAGTATTTAAGCGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACGGTTGGTGGCGCAGCATCTGACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCCCAATTCTGATGCGCCGGTGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAGCTGGTCGGGTGGCTCGTGGACAAGGGGATTACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGG

SEQ ID NO: 41

Мутантная промоторная область p19 AAV2 S (SP1 -50 & TATA -20)

полужирный шрифт: регуляторный участки в промоторе p19

подчеркивание: мутации в промоторной области p19

CAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCCGACTTTGCCAAACTGGTTCGCGGTCACAAAGACCAGAAATGGCGCCGGAGGCGGGAACAAGGTGGTGGATGAGTGCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAAACCCAGCCTGAGCTCCAATGGGCHTGGACTAATATGGAACAGTACCTBTCDGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACGGTTGGTGGCGCAGCATCTGACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCCCAATTCTGATGCGCCGGTGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAGCTGGTCGGGTGGCTCGTGGACAAGGGGATTACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGG

SEQ ID NO: 42

Мутантная промоторная область p19 AAV2 T (TATA -20 & TATA -35)

полужирный шрифт: регуляторный участки в промоторе p19

подчеркивание: мутации в промоторной области p19

CAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCCGACTTTGCCAAACTGGTTCGCGGTCACAAAGACCAGAAATGGCGCCGGAGGCGGGAACAAGGTGGTGGATGAGTGCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAAACCCAGCCTGAGCTCCAGTGGGCGTGGACVAACATGGAACAGTACCTBTCDGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACGGTTGGTGGCGCAGCATCTGACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCCCAATTCTGATGCGCCGGTGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAGCTGGTCGGGTGGCTCGTGGACAAGGGGATTACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGG

SEQ ID NO: 43

Кодирующая область белков Rep AAV2 с мутантной промоторной областью p19 L (SP-1)

полужирный шрифт: регуляторный участки в промоторе p19

подчеркивание: мутации в промоторной области p19

ATGCCGGGGTTTTACGAGATTGTGATTAAGGTCCCCAGCGACCTTGACGAGCATCTGCCCGGCATTTCTGACAGCTTTGTGAACTGGGTGGCCGAGAAGGAATGGGAGTTGCCGCCAGATTCTGACATGGATCTGAATCTGATTGAGCAGGCACCCCTGACCGTGGCCGAGAAGCTGCAGCGCGACTTTCTGACGGAATGGCGCCGTGTGAGTAAGGCCCCGGAGGCCCTTTTCTTTGTGCAATTTGAGAAGGGAGAGAGCTACTTCCACATGCACGTGCTCGTGGAAACCACCGGGGTGAAATCCATGGTTTTGGGACGTTTCCTGAGTCAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCCGACTTTGCCAAACTGGTTCGCGGTCACAAAGACCAGAAATGGCGCCGGAGGCGGGAACAAGGTGGTGGATGAGTGCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAAACCCAGCCTGAGCTCCAATGGGCHTGGACTAATATGGAACAGTATTTAAGCGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACGGTTGGTGGCGCAGCATCTGACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCCCAATTCTGATGCGCCGGTGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAGCTGGTCGGGTGGCTCGTGGACAAGGGGATTACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGGAGGACCAGGCCTCATACATCTCCTTCAATGCGGCCTCCAACTCGCGGTCCCAAATCAAGGCTGCCTTGGACAATGCGGGAAAGATTATGAGCCTGACTAAAACCGCCCCCGACTACCTGGTGGGCCAGCAGCCCGTGGAGGACATTTCCAGCAATCGGATTTATAAAATTTTGGAACTAAACGGGTACGATCCCCAATATGCGGCTTCCGTCTTTCTGGGATGGGCCACGAAAAAGTTCGGCAAGAGGAACACCATCTGGCTGTTTGGGCCTGCAACTACCGGGAAGACCAACATCGCGGAGGCCATAGCCCACACTGTGCCCTTCTACGGGTGCGTAAACTGGACCAATGAGAACTTTCCCTTCAACGACTGTGTCGACAAGATGGTGATCTGGTGGGAGGAGGGGAAGATGACCGCCAAGGTCGTGGAGTCGGCCAAAGCCATTCTCGGAGGAAGCAAGGTGCGCGTGGACCAGAAATGCAAGTCCTCGGCCCAGATAGACCCGACTCCCGTGATCGTCACCTCCAACACCAACATGTGCGCCGTGATTGACGGGAACTCAACGACCTTCGAACACCAGCAGCCGTTGCAAGACCGGATGTTCAAATTTGAACTCACCCGCCGTCTGGATCATGACTTTGGGAAGGTCACCAAGCAGGAAGTCAAAGACTTTTTCCGGTGGGCAAAGGATCACGTGGTTGAGGTGGAGCATGAATTCTACGTCAAAAAGGGTGGAGCCAAGAAAAGACCCGCCCCCAGTGACGCAGATATAAGTGAGCCCAAACGGGTGCGCGAGTCAGTTGCGCAGCCATCGACGTCAGACGCGGAAGCTTCGATCAACTACGCAGACAGGTACCAAAACAAATGTTCTCGTCACGTGGGCATGAATCTGATGCTGTTTCCCTGCAGACAATGCGAGAGAATGAATCAGAATTCAAATATCTGCTTCACTCACGGACAGAAAGACTGTTTAGAGTGCTTTCCCGTGTCAGAATCTCAACCCGTTTCTGTCGTCAAAAAGGCGTATCAGAAACTGTGCTACATTCATCATATCATGGGAAAGGTGCCAGACGCTTGCACTGCCTGCGATCTGGTCAATGTGGATTTGGATGACTGCATCTTTGAACAATAAATGATTTAAATCAGGTATGGCTGCCGATGGTTATCTTCCAGATTGGCTCGAGGACACTCTCTCTGA

SEQ ID NO: 44

Кодирующая область белков Rep AAV2 с мутантной промоторной областью p19 M (TATA -20)

полужирный шрифт: регуляторный участки в промоторе p19

подчеркивание: мутации в промоторной области p19

ATGCCGGGGTTTTACGAGATTGTGATTAAGGTCCCCAGCGACCTTGACGAGCATCTGCCCGGCATTTCTGACAGCTTTGTGAACTGGGTGGCCGAGAAGGAATGGGAGTTGCCGCCAGATTCTGACATGGATCTGAATCTGATTGAGCAGGCACCCCTGACCGTGGCCGAGAAGCTGCAGCGCGACTTTCTGACGGAATGGCGCCGTGTGAGTAAGGCCCCGGAGGCCCTTTTCTTTGTGCAATTTGAGAAGGGAGAGAGCTACTTCCACATGCACGTGCTCGTGGAAACCACCGGGGTGAAATCCATGGTTTTGGGACGTTTCCTGAGTCAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCCGACTTTGCCAAACTGGTTCGCGGTCACAAAGACCAGAAATGGCGCCGGAGGCGGGAACAAGGTGGTGGATGAGTGCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAAACCCAGCCTGAGCTCCAGTGGGCGTGGACVAACATGGAACAGTATTTAAGCGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACGGTTGGTGGCGCAGCATCTGACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCCCAATTCTGATGCGCCGGTGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAGCTGGTCGGGTGGCTCGTGGACAAGGGGATTACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGGAGGACCAGGCCTCATACATCTCCTTCAATGCGGCCTCCAACTCGCGGTCCCAAATCAAGGCTGCCTTGGACAATGCGGGAAAGATTATGAGCCTGACTAAAACCGCCCCCGACTACCTGGTGGGCCAGCAGCCCGTGGAGGACATTTCCAGCAATCGGATTTATAAAATTTTGGAACTAAACGGGTACGATCCCCAATATGCGGCTTCCGTCTTTCTGGGATGGGCCACGAAAAAGTTCGGCAAGAGGAACACCATCTGGCTGTTTGGGCCTGCAACTACCGGGAAGACCAACATCGCGGAGGCCATAGCCCACACTGTGCCCTTCTACGGGTGCGTAAACTGGACCAATGAGAACTTTCCCTTCAACGACTGTGTCGACAAGATGGTGATCTGGTGGGAGGAGGGGAAGATGACCGCCAAGGTCGTGGAGTCGGCCAAAGCCATTCTCGGAGGAAGCAAGGTGCGCGTGGACCAGAAATGCAAGTCCTCGGCCCAGATAGACCCGACTCCCGTGATCGTCACCTCCAACACCAACATGTGCGCCGTGATTGACGGGAACTCAACGACCTTCGAACACCAGCAGCCGTTGCAAGACCGGATGTTCAAATTTGAACTCACCCGCCGTCTGGATCATGACTTTGGGAAGGTCACCAAGCAGGAAGTCAAAGACTTTTTCCGGTGGGCAAAGGATCACGTGGTTGAGGTGGAGCATGAATTCTACGTCAAAAAGGGTGGAGCCAAGAAAAGACCCGCCCCCAGTGACGCAGATATAAGTGAGCCCAAACGGGTGCGCGAGTCAGTTGCGCAGCCATCGACGTCAGACGCGGAAGCTTCGATCAACTACGCAGACAGGTACCAAAACAAATGTTCTCGTCACGTGGGCATGAATCTGATGCTGTTTCCCTGCAGACAATGCGAGAGAATGAATCAGAATTCAAATATCTGCTTCACTCACGGACAGAAAGACTGTTTAGAGTGCTTTCCCGTGTCAGAATCTCAACCCGTTTCTGTCGTCAAAAAGGCGTATCAGAAACTGTGCTACATTCATCATATCATGGGAAAGGTGCCAGACGCTTGCACTGCCTGCGATCTGGTCAATGTGGATTTGGATGACTGCATCTTTGAACAATAAATGATTTAAATCAGGTATGGCTGCCGATGGTTATCTTCCAGATTGGCTCGAGGACACTCTCTCTGA

SEQ ID NO: 45

Кодирующая область белков Rep AAV2 с мутантной промоторной областью p19 N (SP1 -50 1)

полужирный шрифт: регуляторный участки в промоторе p19

подчеркивание: мутации в промоторной области p19

ATGCCGGGGTTTTACGAGATTGTGATTAAGGTCCCCAGCGACCTTGACGAGCATCTGCCCGGCATTTCTGACAGCTTTGTGAACTGGGTGGCCGAGAAGGAATGGGAGTTGCCGCCAGATTCTGACATGGATCTGAATCTGATTGAGCAGGCACCCCTGACCGTGGCCGAGAAGCTGCAGCGCGACTTTCTGACGGAATGGCGCCGTGTGAGTAAGGCCCCGGAGGCCCTTTTCTTTGTGCAATTTGAGAAGGGAGAGAGCTACTTCCACATGCACGTGCTCGTGGAAACCACCGGGGTGAAATCCATGGTTTTGGGACGTTTCCTGAGTCAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCCGACTTTGCCAAACTGGTTCGCGGTCACAAAGACCAGAAATGGCGCCGGAGGCGGGAACAAGGTGGTGGATGAGTGCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAAACCCAGCCTGAGCTCCAATGGGCGTGGACTAATATGGAACAGTATTTAAGCGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACGGTTGGTGGCGCAGCATCTGACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCCCAATTCTGATGCGCCGGTGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAGCTGGTCGGGTGGCTCGTGGACAAGGGGATTACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGGAGGACCAGGCCTCATACATCTCCTTCAATGCGGCCTCCAACTCGCGGTCCCAAATCAAGGCTGCCTTGGACAATGCGGGAAAGATTATGAGCCTGACTAAAACCGCCCCCGACTACCTGGTGGGCCAGCAGCCCGTGGAGGACATTTCCAGCAATCGGATTTATAAAATTTTGGAACTAAACGGGTACGATCCCCAATATGCGGCTTCCGTCTTTCTGGGATGGGCCACGAAAAAGTTCGGCAAGAGGAACACCATCTGGCTGTTTGGGCCTGCAACTACCGGGAAGACCAACATCGCGGAGGCCATAGCCCACACTGTGCCCTTCTACGGGTGCGTAAACTGGACCAATGAGAACTTTCCCTTCAACGACTGTGTCGACAAGATGGTGATCTGGTGGGAGGAGGGGAAGATGACCGCCAAGGTCGTGGAGTCGGCCAAAGCCATTCTCGGAGGAAGCAAGGTGCGCGTGGACCAGAAATGCAAGTCCTCGGCCCAGATAGACCCGACTCCCGTGATCGTCACCTCCAACACCAACATGTGCGCCGTGATTGACGGGAACTCAACGACCTTCGAACACCAGCAGCCGTTGCAAGACCGGATGTTCAAATTTGAACTCACCCGCCGTCTGGATCATGACTTTGGGAAGGTCACCAAGCAGGAAGTCAAAGACTTTTTCCGGTGGGCAAAGGATCACGTGGTTGAGGTGGAGCATGAATTCTACGTCAAAAAGGGTGGAGCCAAGAAAAGACCCGCCCCCAGTGACGCAGATATAAGTGAGCCCAAACGGGTGCGCGAGTCAGTTGCGCAGCCATCGACGTCAGACGCGGAAGCTTCGATCAACTACGCAGACAGGTACCAAAACAAATGTTCTCGTCACGTGGGCATGAATCTGATGCTGTTTCCCTGCAGACAATGCGAGAGAATGAATCAGAATTCAAATATCTGCTTCACTCACGGACAGAAAGACTGTTTAGAGTGCTTTCCCGTGTCAGAATCTCAACCCGTTTCTGTCGTCAAAAAGGCGTATCAGAAACTGTGCTACATTCATCATATCATGGGAAAGGTGCCAGACGCTTGCACTGCCTGCGATCTGGTCAATGTGGATTTGGATGACTGCATCTTTGAACAATAAATGATTTAAATCAGGTATGGCTGCCGATGGTTATCTTCCAGATTGGCTCGAGGACACTCTCTCTGA

SEQ ID NO: 46

Кодирующая область белков Rep AAV2 с мутантной промоторной областью p19 O (SP1 -50 2)

полужирный шрифт: регуляторный участки в промоторе p19

подчеркивание: мутации в промоторной области p19

ATGCCGGGGTTTTACGAGATTGTGATTAAGGTCCCCAGCGACCTTGACGAGCATCTGCCCGGCATTTCTGACAGCTTTGTGAACTGGGTGGCCGAGAAGGAATGGGAGTTGCCGCCAGATTCTGACATGGATCTGAATCTGATTGAGCAGGCACCCCTGACCGTGGCCGAGAAGCTGCAGCGCGACTTTCTGACGGAATGGCGCCGTGTGAGTAAGGCCCCGGAGGCCCTTTTCTTTGTGCAATTTGAGAAGGGAGAGAGCTACTTCCACATGCACGTGCTCGTGGAAACCACCGGGGTGAAATCCATGGTTTTGGGACGTTTCCTGAGTCAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCCGACTTTGCCAAACTGGTTCGCGGTCACAAAGACCAGAAATGGCGCCGGAGGCGGGAACAAGGTGGTGGATGAGTGCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAAACCCAGCCTGAGCTCCAGTGGGCHTGGACTAATATGGAACAGTATTTAAGCGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACGGTTGGTGGCGCAGCATCTGACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCCCAATTCTGATGCGCCGGTGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAGCTGGTCGGGTGGCTCGTGGACAAGGGGATTACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGGAGGACCAGGCCTCATACATCTCCTTCAATGCGGCCTCCAACTCGCGGTCCCAAATCAAGGCTGCCTTGGACAATGCGGGAAAGATTATGAGCCTGACTAAAACCGCCCCCGACTACCTGGTGGGCCAGCAGCCCGTGGAGGACATTTCCAGCAATCGGATTTATAAAATTTTGGAACTAAACGGGTACGATCCCCAATATGCGGCTTCCGTCTTTCTGGGATGGGCCACGAAAAAGTTCGGCAAGAGGAACACCATCTGGCTGTTTGGGCCTGCAACTACCGGGAAGACCAACATCGCGGAGGCCATAGCCCACACTGTGCCCTTCTACGGGTGCGTAAACTGGACCAATGAGAACTTTCCCTTCAACGACTGTGTCGACAAGATGGTGATCTGGTGGGAGGAGGGGAAGATGACCGCCAAGGTCGTGGAGTCGGCCAAAGCCATTCTCGGAGGAAGCAAGGTGCGCGTGGACCAGAAATGCAAGTCCTCGGCCCAGATAGACCCGACTCCCGTGATCGTCACCTCCAACACCAACATGTGCGCCGTGATTGACGGGAACTCAACGACCTTCGAACACCAGCAGCCGTTGCAAGACCGGATGTTCAAATTTGAACTCACCCGCCGTCTGGATCATGACTTTGGGAAGGTCACCAAGCAGGAAGTCAAAGACTTTTTCCGGTGGGCAAAGGATCACGTGGTTGAGGTGGAGCATGAATTCTACGTCAAAAAGGGTGGAGCCAAGAAAAGACCCGCCCCCAGTGACGCAGATATAAGTGAGCCCAAACGGGTGCGCGAGTCAGTTGCGCAGCCATCGACGTCAGACGCGGAAGCTTCGATCAACTACGCAGACAGGTACCAAAACAAATGTTCTCGTCACGTGGGCATGAATCTGATGCTGTTTCCCTGCAGACAATGCGAGAGAATGAATCAGAATTCAAATATCTGCTTCACTCACGGACAGAAAGACTGTTTAGAGTGCTTTCCCGTGTCAGAATCTCAACCCGTTTCTGTCGTCAAAAAGGCGTATCAGAAACTGTGCTACATTCATCATATCATGGGAAAGGTGCCAGACGCTTGCACTGCCTGCGATCTGGTCAATGTGGATTTGGATGACTGCATCTTTGAACAATAAATGATTTAAATCAGGTATGGCTGCCGATGGTTATCTTCCAGATTGGCTCGAGGACACTCTCTCTGA

SEQ ID NO: 47

Кодирующая область белков Rep AAV2 с мутантной промоторной областью p19 P (TATA -20 1)

полужирный шрифт: регуляторный участки в промоторе p19

подчеркивание: мутации в промоторной области p19

ATGCCGGGGTTTTACGAGATTGTGATTAAGGTCCCCAGCGACCTTGACGAGCATCTGCCCGGCATTTCTGACAGCTTTGTGAACTGGGTGGCCGAGAAGGAATGGGAGTTGCCGCCAGATTCTGACATGGATCTGAATCTGATTGAGCAGGCACCCCTGACCGTGGCCGAGAAGCTGCAGCGCGACTTTCTGACGGAATGGCGCCGTGTGAGTAAGGCCCCGGAGGCCCTTTTCTTTGTGCAATTTGAGAAGGGAGAGAGCTACTTCCACATGCACGTGCTCGTGGAAACCACCGGGGTGAAATCCATGGTTTTGGGACGTTTCCTGAGTCAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCCGACTTTGCCAAACTGGTTCGCGGTCACAAAGACCAGAAATGGCGCCGGAGGCGGGAACAAGGTGGTGGATGAGTGCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAAACCCAGCCTGAGCTCCAGTGGGCGTGGACVAATATGGAACAGTATTTAAGCGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACGGTTGGTGGCGCAGCATCTGACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCCCAATTCTGATGCGCCGGTGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAGCTGGTCGGGTGGCTCGTGGACAAGGGGATTACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGGAGGACCAGGCCTCATACATCTCCTTCAATGCGGCCTCCAACTCGCGGTCCCAAATCAAGGCTGCCTTGGACAATGCGGGAAAGATTATGAGCCTGACTAAAACCGCCCCCGACTACCTGGTGGGCCAGCAGCCCGTGGAGGACATTTCCAGCAATCGGATTTATAAAATTTTGGAACTAAACGGGTACGATCCCCAATATGCGGCTTCCGTCTTTCTGGGATGGGCCACGAAAAAGTTCGGCAAGAGGAACACCATCTGGCTGTTTGGGCCTGCAACTACCGGGAAGACCAACATCGCGGAGGCCATAGCCCACACTGTGCCCTTCTACGGGTGCGTAAACTGGACCAATGAGAACTTTCCCTTCAACGACTGTGTCGACAAGATGGTGATCTGGTGGGAGGAGGGGAAGATGACCGCCAAGGTCGTGGAGTCGGCCAAAGCCATTCTCGGAGGAAGCAAGGTGCGCGTGGACCAGAAATGCAAGTCCTCGGCCCAGATAGACCCGACTCCCGTGATCGTCACCTCCAACACCAACATGTGCGCCGTGATTGACGGGAACTCAACGACCTTCGAACACCAGCAGCCGTTGCAAGACCGGATGTTCAAATTTGAACTCACCCGCCGTCTGGATCATGACTTTGGGAAGGTCACCAAGCAGGAAGTCAAAGACTTTTTCCGGTGGGCAAAGGATCACGTGGTTGAGGTGGAGCATGAATTCTACGTCAAAAAGGGTGGAGCCAAGAAAAGACCCGCCCCCAGTGACGCAGATATAAGTGAGCCCAAACGGGTGCGCGAGTCAGTTGCGCAGCCATCGACGTCAGACGCGGAAGCTTCGATCAACTACGCAGACAGGTACCAAAACAAATGTTCTCGTCACGTGGGCATGAATCTGATGCTGTTTCCCTGCAGACAATGCGAGAGAATGAATCAGAATTCAAATATCTGCTTCACTCACGGACAGAAAGACTGTTTAGAGTGCTTTCCCGTGTCAGAATCTCAACCCGTTTCTGTCGTCAAAAAGGCGTATCAGAAACTGTGCTACATTCATCATATCATGGGAAAGGTGCCAGACGCTTGCACTGCCTGCGATCTGGTCAATGTGGATTTGGATGACTGCATCTTTGAACAATAAATGATTTAAATCAGGTATGGCTGCCGATGGTTATCTTCCAGATTGGCTCGAGGACACTCTCTCTGA

SEQ ID NO: 48

Кодирующая область белков Rep AAV2 с мутантной промоторной областью p19 Q (TATA -20 2)

полужирный шрифт: регуляторный участки в промоторе p19

подчеркивание: мутации в промоторной области p19

ATGCCGGGGTTTTACGAGATTGTGATTAAGGTCCCCAGCGACCTTGACGAGCATCTGCCCGGCATTTCTGACAGCTTTGTGAACTGGGTGGCCGAGAAGGAATGGGAGTTGCCGCCAGATTCTGACATGGATCTGAATCTGATTGAGCAGGCACCCCTGACCGTGGCCGAGAAGCTGCAGCGCGACTTTCTGACGGAATGGCGCCGTGTGAGTAAGGCCCCGGAGGCCCTTTTCTTTGTGCAATTTGAGAAGGGAGAGAGCTACTTCCACATGCACGTGCTCGTGGAAACCACCGGGGTGAAATCCATGGTTTTGGGACGTTTCCTGAGTCAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCCGACTTTGCCAAACTGGTTCGCGGTCACAAAGACCAGAAATGGCGCCGGAGGCGGGAACAAGGTGGTGGATGAGTGCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAAACCCAGCCTGAGCTCCAGTGGGCGTGGACTAACATGGAACAGTATTTAAGCGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACGGTTGGTGGCGCAGCATCTGACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCCCAATTCTGATGCGCCGGTGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAGCTGGTCGGGTGGCTCGTGGACAAGGGGATTACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGGAGGACCAGGCCTCATACATCTCCTTCAATGCGGCCTCCAACTCGCGGTCCCAAATCAAGGCTGCCTTGGACAATGCGGGAAAGATTATGAGCCTGACTAAAACCGCCCCCGACTACCTGGTGGGCCAGCAGCCCGTGGAGGACATTTCCAGCAATCGGATTTATAAAATTTTGGAACTAAACGGGTACGATCCCCAATATGCGGCTTCCGTCTTTCTGGGATGGGCCACGAAAAAGTTCGGCAAGAGGAACACCATCTGGCTGTTTGGGCCTGCAACTACCGGGAAGACCAACATCGCGGAGGCCATAGCCCACACTGTGCCCTTCTACGGGTGCGTAAACTGGACCAATGAGAACTTTCCCTTCAACGACTGTGTCGACAAGATGGTGATCTGGTGGGAGGAGGGGAAGATGACCGCCAAGGTCGTGGAGTCGGCCAAAGCCATTCTCGGAGGAAGCAAGGTGCGCGTGGACCAGAAATGCAAGTCCTCGGCCCAGATAGACCCGACTCCCGTGATCGTCACCTCCAACACCAACATGTGCGCCGTGATTGACGGGAACTCAACGACCTTCGAACACCAGCAGCCGTTGCAAGACCGGATGTTCAAATTTGAACTCACCCGCCGTCTGGATCATGACTTTGGGAAGGTCACCAAGCAGGAAGTCAAAGACTTTTTCCGGTGGGCAAAGGATCACGTGGTTGAGGTGGAGCATGAATTCTACGTCAAAAAGGGTGGAGCCAAGAAAAGACCCGCCCCCAGTGACGCAGATATAAGTGAGCCCAAACGGGTGCGCGAGTCAGTTGCGCAGCCATCGACGTCAGACGCGGAAGCTTCGATCAACTACGCAGACAGGTACCAAAACAAATGTTCTCGTCACGTGGGCATGAATCTGATGCTGTTTCCCTGCAGACAATGCGAGAGAATGAATCAGAATTCAAATATCTGCTTCACTCACGGACAGAAAGACTGTTTAGAGTGCTTTCCCGTGTCAGAATCTCAACCCGTTTCTGTCGTCAAAAAGGCGTATCAGAAACTGTGCTACATTCATCATATCATGGGAAAGGTGCCAGACGCTTGCACTGCCTGCGATCTGGTCAATGTGGATTTGGATGACTGCATCTTTGAACAATAAATGATTTAAATCAGGTATGGCTGCCGATGGTTATCTTCCAGATTGGCTCGAGGACACTCTCTCTGA

SEQ ID NO: 49

Кодирующая область белков Rep AAV2 с мутантной промоторной областью p19 R (SP1 -50 & TATA -35)

полужирный шрифт: регуляторный участки в промоторе p19

подчеркивание: мутации в промоторной области p19

ATGCCGGGGTTTTACGAGATTGTGATTAAGGTCCCCAGCGACCTTGACGAGCATCTGCCCGGCATTTCTGACAGCTTTGTGAACTGGGTGGCCGAGAAGGAATGGGAGTTGCCGCCAGATTCTGACATGGATCTGAATCTGATTGAGCAGGCACCCCTGACCGTGGCCGAGAAGCTGCAGCGCGACTTTCTGACGGAATGGCGCCGTGTGAGTAAGGCCCCGGAGGCCCTTTTCTTTGTGCAATTTGAGAAGGGAGAGAGCTACTTCCACATGCACGTGCTCGTGGAAACCACCGGGGTGAAATCCATGGTTTTGGGACGTTTCCTGAGTCAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCCGACTTTGCCAAACTGGTTCGCGGTCACAAAGACCAGAAATGGCGCCGGAGGCGGGAACAAGGTGGTGGATGAGTGCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAAACCCAGCCTGAGCTCCAATGGGCHTGGACVAACATGGAACAGTATTTAAGCGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACGGTTGGTGGCGCAGCATCTGACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCCCAATTCTGATGCGCCGGTGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAGCTGGTCGGGTGGCTCGTGGACAAGGGGATTACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGGAGGACCAGGCCTCATACATCTCCTTCAATGCGGCCTCCAACTCGCGGTCCCAAATCAAGGCTGCCTTGGACAATGCGGGAAAGATTATGAGCCTGACTAAAACCGCCCCCGACTACCTGGTGGGCCAGCAGCCCGTGGAGGACATTTCCAGCAATCGGATTTATAAAATTTTGGAACTAAACGGGTACGATCCCCAATATGCGGCTTCCGTCTTTCTGGGATGGGCCACGAAAAAGTTCGGCAAGAGGAACACCATCTGGCTGTTTGGGCCTGCAACTACCGGGAAGACCAACATCGCGGAGGCCATAGCCCACACTGTGCCCTTCTACGGGTGCGTAAACTGGACCAATGAGAACTTTCCCTTCAACGACTGTGTCGACAAGATGGTGATCTGGTGGGAGGAGGGGAAGATGACCGCCAAGGTCGTGGAGTCGGCCAAAGCCATTCTCGGAGGAAGCAAGGTGCGCGTGGACCAGAAATGCAAGTCCTCGGCCCAGATAGACCCGACTCCCGTGATCGTCACCTCCAACACCAACATGTGCGCCGTGATTGACGGGAACTCAACGACCTTCGAACACCAGCAGCCGTTGCAAGACCGGATGTTCAAATTTGAACTCACCCGCCGTCTGGATCATGACTTTGGGAAGGTCACCAAGCAGGAAGTCAAAGACTTTTTCCGGTGGGCAAAGGATCACGTGGTTGAGGTGGAGCATGAATTCTACGTCAAAAAGGGTGGAGCCAAGAAAAGACCCGCCCCCAGTGACGCAGATATAAGTGAGCCCAAACGGGTGCGCGAGTCAGTTGCGCAGCCATCGACGTCAGACGCGGAAGCTTCGATCAACTACGCAGACAGGTACCAAAACAAATGTTCTCGTCACGTGGGCATGAATCTGATGCTGTTTCCCTGCAGACAATGCGAGAGAATGAATCAGAATTCAAATATCTGCTTCACTCACGGACAGAAAGACTGTTTAGAGTGCTTTCCCGTGTCAGAATCTCAACCCGTTTCTGTCGTCAAAAAGGCGTATCAGAAACTGTGCTACATTCATCATATCATGGGAAAGGTGCCAGACGCTTGCACTGCCTGCGATCTGGTCAATGTGGATTTGGATGACTGCATCTTTGAACAATAAATGATTTAAATCAGGTATGGCTGCCGATGGTTATCTTCCAGATTGGCTCGAGGACACTCTCTCTGA

SEQ ID NO: 50

Кодирующая область белков Rep AAV2 с мутантной промоторной областью p19 S (SP1 -50 & TATA -20)

полужирный шрифт: регуляторный участки в промоторе p19

подчеркивание: мутации в промоторной области p19

ATGCCGGGGTTTTACGAGATTGTGATTAAGGTCCCCAGCGACCTTGACGAGCATCTGCCCGGCATTTCTGACAGCTTTGTGAACTGGGTGGCCGAGAAGGAATGGGAGTTGCCGCCAGATTCTGACATGGATCTGAATCTGATTGAGCAGGCACCCCTGACCGTGGCCGAGAAGCTGCAGCGCGACTTTCTGACGGAATGGCGCCGTGTGAGTAAGGCCCCGGAGGCCCTTTTCTTTGTGCAATTTGAGAAGGGAGAGAGCTACTTCCACATGCACGTGCTCGTGGAAACCACCGGGGTGAAATCCATGGTTTTGGGACGTTTCCTGAGTCAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCCGACTTTGCCAAACTGGTTCGCGGTCACAAAGACCAGAAATGGCGCCGGAGGCGGGAACAAGGTGGTGGATGAGTGCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAAACCCAGCCTGAGCTCCAATGGGCHTGGACTAATATGGAACAGTACCTBTCDGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACGGTTGGTGGCGCAGCATCTGACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCCCAATTCTGATGCGCCGGTGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAGCTGGTCGGGTGGCTCGTGGACAAGGGGATTACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGGAGGACCAGGCCTCATACATCTCCTTCAATGCGGCCTCCAACTCGCGGTCCCAAATCAAGGCTGCCTTGGACAATGCGGGAAAGATTATGAGCCTGACTAAAACCGCCCCCGACTACCTGGTGGGCCAGCAGCCCGTGGAGGACATTTCCAGCAATCGGATTTATAAAATTTTGGAACTAAACGGGTACGATCCCCAATATGCGGCTTCCGTCTTTCTGGGATGGGCCACGAAAAAGTTCGGCAAGAGGAACACCATCTGGCTGTTTGGGCCTGCAACTACCGGGAAGACCAACATCGCGGAGGCCATAGCCCACACTGTGCCCTTCTACGGGTGCGTAAACTGGACCAATGAGAACTTTCCCTTCAACGACTGTGTCGACAAGATGGTGATCTGGTGGGAGGAGGGGAAGATGACCGCCAAGGTCGTGGAGTCGGCCAAAGCCATTCTCGGAGGAAGCAAGGTGCGCGTGGACCAGAAATGCAAGTCCTCGGCCCAGATAGACCCGACTCCCGTGATCGTCACCTCCAACACCAACATGTGCGCCGTGATTGACGGGAACTCAACGACCTTCGAACACCAGCAGCCGTTGCAAGACCGGATGTTCAAATTTGAACTCACCCGCCGTCTGGATCATGACTTTGGGAAGGTCACCAAGCAGGAAGTCAAAGACTTTTTCCGGTGGGCAAAGGATCACGTGGTTGAGGTGGAGCATGAATTCTACGTCAAAAAGGGTGGAGCCAAGAAAAGACCCGCCCCCAGTGACGCAGATATAAGTGAGCCCAAACGGGTGCGCGAGTCAGTTGCGCAGCCATCGACGTCAGACGCGGAAGCTTCGATCAACTACGCAGACAGGTACCAAAACAAATGTTCTCGTCACGTGGGCATGAATCTGATGCTGTTTCCCTGCAGACAATGCGAGAGAATGAATCAGAATTCAAATATCTGCTTCACTCACGGACAGAAAGACTGTTTAGAGTGCTTTCCCGTGTCAGAATCTCAACCCGTTTCTGTCGTCAAAAAGGCGTATCAGAAACTGTGCTACATTCATCATATCATGGGAAAGGTGCCAGACGCTTGCACTGCCTGCGATCTGGTCAATGTGGATTTGGATGACTGCATCTTTGAACAATAAATGATTTAAATCAGGTATGGCTGCCGATGGTTATCTTCCAGATTGGCTCGAGGACACTCTCTCTGA

SEQ ID NO: 51

Кодирующая область белков Rep AAV2 с мутантной промоторной областью p19 T (TATA -20 & TATA -35)

полужирный шрифт: регуляторный участки в промоторе p19

подчеркивание: мутации в промоторной области p19

ATGCCGGGGTTTTACGAGATTGTGATTAAGGTCCCCAGCGACCTTGACGAGCATCTGCCCGGCATTTCTGACAGCTTTGTGAACTGGGTGGCCGAGAAGGAATGGGAGTTGCCGCCAGATTCTGACATGGATCTGAATCTGATTGAGCAGGCACCCCTGACCGTGGCCGAGAAGCTGCAGCGCGACTTTCTGACGGAATGGCGCCGTGTGAGTAAGGCCCCGGAGGCCCTTTTCTTTGTGCAATTTGAGAAGGGAGAGAGCTACTTCCACATGCACGTGCTCGTGGAAACCACCGGGGTGAAATCCATGGTTTTGGGACGTTTCCTGAGTCAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCCGACTTTGCCAAACTGGTTCGCGGTCACAAAGACCAGAAATGGCGCCGGAGGCGGGAACAAGGTGGTGGATGAGTGCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAAACCCAGCCTGAGCTCCAGTGGGCGTGGACVAACATGGAACAGTACCTBTCDGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACGGTTGGTGGCGCAGCATCTGACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCCCAATTCTGATGCGCCGGTGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAGCTGGTCGGGTGGCTCGTGGACAAGGGGATTACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGGAGGACCAGGCCTCATACATCTCCTTCAATGCGGCCTCCAACTCGCGGTCCCAAATCAAGGCTGCCTTGGACAATGCGGGAAAGATTATGAGCCTGACTAAAACCGCCCCCGACTACCTGGTGGGCCAGCAGCCCGTGGAGGACATTTCCAGCAATCGGATTTATAAAATTTTGGAACTAAACGGGTACGATCCCCAATATGCGGCTTCCGTCTTTCTGGGATGGGCCACGAAAAAGTTCGGCAAGAGGAACACCATCTGGCTGTTTGGGCCTGCAACTACCGGGAAGACCAACATCGCGGAGGCCATAGCCCACACTGTGCCCTTCTACGGGTGCGTAAACTGGACCAATGAGAACTTTCCCTTCAACGACTGTGTCGACAAGATGGTGATCTGGTGGGAGGAGGGGAAGATGACCGCCAAGGTCGTGGAGTCGGCCAAAGCCATTCTCGGAGGAAGCAAGGTGCGCGTGGACCAGAAATGCAAGTCCTCGGCCCAGATAGACCCGACTCCCGTGATCGTCACCTCCAACACCAACATGTGCGCCGTGATTGACGGGAACTCAACGACCTTCGAACACCAGCAGCCGTTGCAAGACCGGATGTTCAAATTTGAACTCACCCGCCGTCTGGATCATGACTTTGGGAAGGTCACCAAGCAGGAAGTCAAAGACTTTTTCCGGTGGGCAAAGGATCACGTGGTTGAGGTGGAGCATGAATTCTACGTCAAAAAGGGTGGAGCCAAGAAAAGACCCGCCCCCAGTGACGCAGATATAAGTGAGCCCAAACGGGTGCGCGAGTCAGTTGCGCAGCCATCGACGTCAGACGCGGAAGCTTCGATCAACTACGCAGACAGGTACCAAAACAAATGTTCTCGTCACGTGGGCATGAATCTGATGCTGTTTCCCTGCAGACAATGCGAGAGAATGAATCAGAATTCAAATATCTGCTTCACTCACGGACAGAAAGACTGTTTAGAGTGCTTTCCCGTGTCAGAATCTCAACCCGTTTCTGTCGTCAAAAAGGCGTATCAGAAACTGTGCTACATTCATCATATCATGGGAAAGGTGCCAGACGCTTGCACTGCCTGCGATCTGGTCAATGTGGATTTGGATGACTGCATCTTTGAACAATAAATGATTTAAATCAGGTATGGCTGCCGATGGTTATCTTCCAGATTGGCTCGAGGACACTCTCTCTGA

SEQ ID NO: 52

Прямой праймер для полиA SV40

AGCAATAGCATCACAAATTTCACAA

SEQ ID NO: 53

Обратный праймер для полиA SV40

CCAGACATGATAAGATACATTGATGAGTT

SEQ ID NO: 54

Зонд для полиA SV40

AGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTC

--->

Список последовательностей

<110> CEVEC Pharmaceuticals GmbH

<120> Индуцибельные гены Rep AAV

<130> C 4767WO - kl

<150> EP 17 001 562.2

<151> 2017-09-19

<160> 54

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 403

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Мутантная промоторная область mut19 p19 AAV

<400> 1

cagattcgcg aaaaactgat tcagagaatt taccgcggga tcgagccgac tttgccaaac 60

tggttcgcgg tcacaaagac dcgbaacggc gccgggggbg ghaacaaagt hgthgatgag 120

tgctacatcc ccaattactt gctccccaaa acccagcctg agctccaatg ggchtggacv 180

aacatggaac agtacttgtc dgcctgtttg aatctcacgg agcgtaaacg gttggtggcg 240

cagcatctga cgcacgtgtc gcagacgcag gagcagaaca aagagaatca gaatcccaat 300

tctgatgcgc cggtgatcag atcaaaaact tcagccaggt acatggagct ggtcgggtgg 360

ctcgtggaca aggggattac ctcggagaag cagtggatcc agg 403

<210> 2

<211> 403

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Мутантная промоторная область mut5-1 p19 AAV

<400> 2

cagattcgcg aaaaactgat tcagagaatt taccgcggga tcgagccgac tttgccaaac 60

tggttcgcgg tcacaaagac cagaaatggc gccggaggcg ggaacaaggt ggtggatgag 120

tgctacatcc ccaattactt gctccccaaa acccagcctg agctccagtg ggcgtggact 180

aatatggaac agtacttgtc dgcctgtttg aatctcacgg agcgtaaacg gttggtggcg 240

cagcatctga cgcacgtgtc gcagacgcag gagcagaaca aagagaatca gaatcccaat 300

tctgatgcgc cggtgatcag atcaaaaact tcagccaggt acatggagct ggtcgggtgg 360

ctcgtggaca aggggattac ctcggagaag cagtggatcc agg 403

<210> 3

<211> 403

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Мутантная промоторная область mut1-1 p19 AAV

<400> 3

cagattcgcg aaaaactgat tcagagaatt taccgcggga tcgagccgac tttgccaaac 60

tggttcgcgg tcacaaagac cagaaatggc gccggaggcg ggaacaaggt ggtggatgag 120

tgctacatcc ccaattactt gctccccaaa acccagcctg agctccagtg ggcgtggact 180

aatatggaac agtatttgag cgcctgtttg aatctcacgg agcgtaaacg gttggtggcg 240

cagcatctga cgcacgtgtc gcagacgcag gagcagaaca aagagaatca gaatcccaat 300

tctgatgcgc cggtgatcag atcaaaaact tcagccaggt acatggagct ggtcgggtgg 360

ctcgtggaca aggggattac ctcggagaag cagtggatcc agg 403

<210> 4

<211> 403

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Мутантная промоторная область mut2-1 p19 AAV

<400> 4

cagattcgcg aaaaactgat tcagagaatt taccgcggga tcgagccgac tttgccaaac 60

tggttcgcgg tcacaaagac cagaaatggc gccggaggcg ggaacaaggt ggtggatgag 120

tgctacatcc ccaattactt gctccccaaa acccagcctg agctccagtg ggcgtggact 180

aatatggaac agtatttatc cgcctgtttg aatctcacgg agcgtaaacg gttggtggcg 240

cagcatctga cgcacgtgtc gcagacgcag gagcagaaca aagagaatca gaatcccaat 300

tctgatgcgc cggtgatcag atcaaaaact tcagccaggt acatggagct ggtcgggtgg 360

ctcgtggaca aggggattac ctcggagaag cagtggatcc agg 403

<210> 5

<211> 403

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Мутантная промоторная область mut1-2 p19 AAV

<400> 5

cagattcgcg aaaaactgat tcagagaatt taccgcggga tcgagccgac tttgccaaac 60

tggttcgcgg tcacaaagac cagaaatggc gccggaggcg ggaacaaggt ggtggatgag 120

tgctacatcc ccaattactt gctccccaaa acccagcctg agctccagtg ggcgtggact 180

aatatggaac agtacttaag cgcctgtttg aatctcacgg agcgtaaacg gttggtggcg 240

cagcatctga cgcacgtgtc gcagacgcag gagcagaaca aagagaatca gaatcccaat 300

tctgatgcgc cggtgatcag atcaaaaact tcagccaggt acatggagct ggtcgggtgg 360

ctcgtggaca aggggattac ctcggagaag cagtggatcc agg 403

<210> 6

<211> 403

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Мутантная промоторная область mut14 p19 AAV

<400> 6

cagattcgcg aaaaactgat tcagagaatt taccgcggga tcgagccgac tttgccaaac 60

tggttcgcgg tcacaaagac dcgbaacggc gccgggggbg ghaacaaagt hgthgatgag 120

tgctacatcc ccaattactt gctccccaaa acccagcctg agctccaatg ggchtggacv 180

aacatggaac agtatttaag cgcctgtttg aatctcacgg agcgtaaacg gttggtggcg 240

cagcatctga cgcacgtgtc gcagacgcag gagcagaaca aagagaatca gaatcccaat 300

tctgatgcgc cggtgatcag atcaaaaact tcagccaggt acatggagct ggtcgggtgg 360

ctcgtggaca aggggattac ctcggagaag cagtggatcc agg 403

<210> 7

<211> 403

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Мутантная промоторная область mut10-1 p19 AAV

<400> 7

cagattcgcg aaaaactgat tcagagaatt taccgcggga tcgagccgac tttgccaaac 60

tggttcgcgg tcacaaagac acggaacggc gccgggggag gcaacaaagt cgtcgatgag 120

tgctacatcc ccaattactt gctccccaaa acccagcctg agctccagtg ggcgtggact 180

aatatggaac agtatttaag cgcctgtttg aatctcacgg agcgtaaacg gttggtggcg 240

cagcatctga cgcacgtgtc gcagacgcag gagcagaaca aagagaatca gaatcccaat 300

tctgatgcgc cggtgatcag atcaaaaact tcagccaggt acatggagct ggtcgggtgg 360

ctcgtggaca aggggattac ctcggagaag cagtggatcc agg 403

<210> 8

<211> 403

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Мутантная промоторная область mut10-2 p19 AAV

<400> 8

cagattcgcg aaaaactgat tcagagaatt taccgcggga tcgagccgac tttgccaaac 60

tggttcgcgg tcacaaagac cagaaatggc gccggaggcg ggaacaaggt ggtggatgag 120

tgctacatcc ccaattactt gctccccaaa acccagcctg agctccaatg ggchtggacv 180

aacatggaac agtacctbtc dgcctgtttg aatctcacgg agcgtaaacg gttggtggcg 240

cagcatctga cgcacgtgtc gcagacgcag gagcagaaca aagagaatca gaatcccaat 300

tctgatgcgc cggtgatcag atcaaaaact tcagccaggt acatggagct ggtcgggtgg 360

ctcgtggaca aggggattac ctcggagaag cagtggatcc agg 403

<210> 9

<211> 403

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Мутантная промоторная область mut3 p19 AAV

<400> 9

cagattcgcg aaaaactgat tcagagaatt taccgcggga tcgagccgac tttgccaaac 60

tggttcgcgg tcacaaagac cagaaatggc gccggaggcg ggaacaaggt ggtggatgag 120

tgctacatcc ccaattactt gctccccaaa acccagcctg agctccagtg ggcgtggact 180

aatatggaac agtatgcbag cgcctgtttg aatctcacgg agcgtaaacg gttggtggcg 240

cagcatctga cgcacgtgtc gcagacgcag gagcagaaca aagagaatca gaatcccaat 300

tctgatgcgc cggtgatcag atcaaaaact tcagccaggt acatggagct ggtcgggtgg 360

ctcgtggaca aggggattac ctcggagaag cagtggatcc agg 403

<210> 10

<211> 403

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Мутантная промоторная область p19 AAV

<400> 10

cagattcgcg aaaaactgat tcagagaatt taccgcggga tcgagccgac tttgccaaac 60

tggttcgcgg tcacaaagac cagaaatggc gccggaggcg ggaacaaggt ggtggatgag 120

tgctacatcc ccaattactt gctccccaaa acccagcctg agctccagtg ggghtggact 180

aatatggaac agtatttaag cgcctgtttg aatctcacgg agcgtaaacg gttggtggcg 240

cagcatctga cgcacgtgtc gcagacgcag gagcagaaca aagagaatca gaatcccaat 300

tctgatgcgc cggtgatcag atcaaaaact tcagccaggt acatggagct ggtcgggtgg 360

ctcgtggaca aggggattac ctcggagaag cagtggatcc agg 403

<210> 11

<211> 403

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Мутантная промоторная область p19 AAV

<400> 11

cagattcgcg aaaaactgat tcagagaatt taccgcggga tcgagccgac tttgccaaac 60

tggttcgcgg tcacaaagac cagaaatggc gccggaggcg ggaacaaggt ggtggatgag 120

tgctacatcc ccaattactt gctccccaaa acccagcctg agctccagtg ggcgtggact 180

aatatggaac agtatctbag cgcctgtttg aatctcacgg agcgtaaacg gttggtggcg 240

cagcatctga cgcacgtgtc gcagacgcag gagcagaaca aagagaatca gaatcccaat 300

tctgatgcgc cggtgatcag atcaaaaact tcagccaggt acatggagct ggtcgggtgg 360

ctcgtggaca aggggattac ctcggagaag cagtggatcc agg 403

<210> 12

<211> 403

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Мутантная промоторная область mut1-3 p19 AAV

<400> 12

cagattcgcg aaaaactgat tcagagaatt taccgcggga tcgagccgac tttgccaaac 60

tggttcgcgg tcacaaagac cagaaatggc gccggaggcg ggaacaaggt ggtggatgag 120

tgctacatcc ccaattactt gctccccaaa acccagcctg agctccagtg ggcgtggact 180

aatatggaac agtatctaag cgcctgtttg aatctcacgg agcgtaaacg gttggtggcg 240

cagcatctga cgcacgtgtc gcagacgcag gagcagaaca aagagaatca gaatcccaat 300

tctgatgcgc cggtgatcag atcaaaaact tcagccaggt acatggagct ggtcgggtgg 360

ctcgtggaca aggggattac ctcggagaag cagtggatcc agg 403

<210> 13

<211> 403

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Мутантная промоторная область mut5-2 p19 AAV

<400> 13

cagattcgcg aaaaactgat tcagagaatt taccgcggga tcgagccgac tttgccaaac 60

tggttcgcgg tcacaaagac cagaaatggc gccggaggcg ggaacaaggt ggtggatgag 120

tgctacatcc ccaattactt gctccccaaa acccagcctg agctccagtg ggcgtggact 180

aatatggaac agtacctbtc cgcctgtttg aatctcacgg agcgtaaacg gttggtggcg 240

cagcatctga cgcacgtgtc gcagacgcag gagcagaaca aagagaatca gaatcccaat 300

tctgatgcgc cggtgatcag atcaaaaact tcagccaggt acatggagct ggtcgggtgg 360

ctcgtggaca aggggattac ctcggagaag cagtggatcc agg 403

<210> 14

<211> 403

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Мутантная промоторная область mut20 p19 AAV

<400> 14

cagattcgcg aaaaactgat tcagagaatt taccgcggga tcgagccgac tttgccaaac 60

tggttcgcgg tcacaaagac dcgbaacggc gccgggggbg ghaacaaagt hgthgatgag 120

tgctacatcc ccaattactt gctccccaaa acccagcctg agctccaatg ggchtggacv 180

aacatggaac agtacctbtc dgcctgtttg aatctcacgg agcgtaaacg gttggtggcg 240

cagcatctga cgcacgtgtc gcagacgcag gagcagaaca aagagaatca gaatcccaat 300

tctgatgcgc cggtgatcag atcaaaaact tcagccaggt acatggagct ggtcgggtgg 360

ctcgtggaca aggggattac ctcggagaag cagtggatcc agg 403

<210> 15

<211> 1932

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Кодирующая область белков Rep AAV с мутантной промоторной областью p19

mut19

<400> 15

atgccggggt tttacgagat tgtgattaag gtccccagcg accttgacga gcatctgccc 60

ggcatttctg acagctttgt gaactgggtg gccgagaagg aatgggagtt gccgccagat 120

tctgacatgg atctgaatct gattgagcag gcacccctga ccgtggccga gaagctgcag 180

cgcgactttc tgacggaatg gcgccgtgtg agtaaggccc cggaggccct tttctttgtg 240

caatttgaga agggagagag ctacttccac atgcacgtgc tcgtggaaac caccggggtg 300

aaatccatgg ttttgggacg tttcctgagt cagattcgcg aaaaactgat tcagagaatt 360

taccgcggga tcgagccgac tttgccaaac tggttcgcgg tcacaaagac dcgbaacggc 420

gccgggggbg ghaacaaagt hgthgatgag tgctacatcc ccaattactt gctccccaaa 480

acccagcctg agctccaatg ggchtggacv aacatggaac agtacttgtc dgcctgtttg 540

aatctcacgg agcgtaaacg gttggtggcg cagcatctga cgcacgtgtc gcagacgcag 600

gagcagaaca aagagaatca gaatcccaat tctgatgcgc cggtgatcag atcaaaaact 660

tcagccaggt acatggagct ggtcgggtgg ctcgtggaca aggggattac ctcggagaag 720

cagtggatcc aggaggacca ggcctcatac atctccttca atgcggcctc caactcgcgg 780

tcccaaatca aggctgcctt ggacaatgcg ggaaagatta tgagcctgac taaaaccgcc 840

cccgactacc tggtgggcca gcagcccgtg gaggacattt ccagcaatcg gatttataaa 900

attttggaac taaacgggta cgatccccaa tatgcggctt ccgtctttct gggatgggcc 960

acgaaaaagt tcggcaagag gaacaccatc tggctgtttg ggcctgcaac taccgggaag 1020

accaacatcg cggaggccat agcccacact gtgcccttct acgggtgcgt aaactggacc 1080

aatgagaact ttcccttcaa cgactgtgtc gacaagatgg tgatctggtg ggaggagggg 1140

aagatgaccg ccaaggtcgt ggagtcggcc aaagccattc tcggaggaag caaggtgcgc 1200

gtggaccaga aatgcaagtc ctcggcccag atagacccga ctcccgtgat cgtcacctcc 1260

aacaccaaca tgtgcgccgt gattgacggg aactcaacga ccttcgaaca ccagcagccg 1320

ttgcaagacc ggatgttcaa atttgaactc acccgccgtc tggatcatga ctttgggaag 1380

gtcaccaagc aggaagtcaa agactttttc cggtgggcaa aggatcacgt ggttgaggtg 1440

gagcatgaat tctacgtcaa aaagggtgga gccaagaaaa gacccgcccc cagtgacgca 1500

gatataagtg agcccaaacg ggtgcgcgag tcagttgcgc agccatcgac gtcagacgcg 1560

gaagcttcga tcaactacgc agacaggtac caaaacaaat gttctcgtca cgtgggcatg 1620

aatctgatgc tgtttccctg cagacaatgc gagagaatga atcagaattc aaatatctgc 1680

ttcactcacg gacagaaaga ctgtttagag tgctttcccg tgtcagaatc tcaacccgtt 1740

tctgtcgtca aaaaggcgta tcagaaactg tgctacattc atcatatcat gggaaaggtg 1800

ccagacgctt gcactgcctg cgatctggtc aatgtggatt tggatgactg catctttgaa 1860

caataaatga tttaaatcag gtatggctgc cgatggttat cttccagatt ggctcgagga 1920

cactctctct ga 1932

<210> 16

<211> 1932

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Кодирующая область белков Rep AAV с мутантной промоторной областью p19

mut5-1

<400> 16

atgccggggt tttacgagat tgtgattaag gtccccagcg accttgacga gcatctgccc 60

ggcatttctg acagctttgt gaactgggtg gccgagaagg aatgggagtt gccgccagat 120

tctgacatgg atctgaatct gattgagcag gcacccctga ccgtggccga gaagctgcag 180

cgcgactttc tgacggaatg gcgccgtgtg agtaaggccc cggaggccct tttctttgtg 240

caatttgaga agggagagag ctacttccac atgcacgtgc tcgtggaaac caccggggtg 300

aaatccatgg ttttgggacg tttcctgagt cagattcgcg aaaaactgat tcagagaatt 360

taccgcggga tcgagccgac tttgccaaac tggttcgcgg tcacaaagac cagaaatggc 420

gccggaggcg ggaacaaggt ggtggatgag tgctacatcc ccaattactt gctccccaaa 480

acccagcctg agctccagtg ggcgtggact aatatggaac agtacttgtc dgcctgtttg 540