Полинуклеотид и способ для осуществления контроля над поражением насекомыми
Изобретение относится к области биохимии, в частности к выделенному полинуклеотиду для ингибирования роста насекомого-вредителя Monolepta hieroglyphica. Также раскрыты рибонуклеиновая кислота, композиция, экспрессионная кассета и экспрессионный вектор, содержащий указанный полинуклеотид. Раскрыты применение указанного полинуклеотида для подавления нашествия насекомого-вредителя Monolepta hieroglyphica, способ подавления нашествия насекомого-вредителя Monolepta hieroglyphica, способ повышения устойчивости растения к насекомому Monolepta hieroglyphica с помощью указанного полинуклеотида. Изобретение позволяет эффективно бороться с насекомым-вредителем Monolepta hieroglyphica. 9 н. и 6 з.п. ф-лы, 2 ил., 5 табл., 12 пр.
Область изобретения
Настоящее изобретение относится к области защиты растений, главным образом защиты сельскохозяйственных культур. В частности, настоящее изобретение относится к полинуклеотиду и способу осуществления контроля над нашествиями насекомых, главным образом к способу осуществления контроля над нашествиями Monolepta hieroglyphics (Motschulsky) посредством снижения уровня или подавления экспрессии последовательности-мишени в теле Monolepta hieroglyphica (Motschulsky), используя технологию РНКи (РНК-интерференция).
Предшествующий уровень техники
Сельскохозяйственные культуры обычно являются мишенями нападений насекомых. За последние несколько десятилетий сделаны существенные успехи в разработке более эффективных способов и композиций для осуществления контроля над нашествиями насекомых в сельскохозяйственных культурах. Например, химические пестициды, микробные пестициды и методы генной инженерии использовались для того, чтобы контролировать нашествия вредителей.
Химические пестициды представляют собой относительно эффективное средство для осуществления контроля над нашествиями вредителей. Тем не менее, применение химических пестицидов также имеет много недостатков. Во-первых, химические пестициды являются неселективными, и поскольку люди склонны применять химические пестициды для осуществления контроля над насекомыми, которые вредны множеству сельскохозяйственных культур и других растений, химические пестициды также наносят вред нецелевым организмам, таким как земляные черви, за счет их недостатка селективности. Кроме того, после применения химических пестицидов на протяжении периода времени, поле обычно становится бесплодным. Химические пестициды будут постоянно присутствовать в окружающей среде и обычно будут медленно метаболизироваться. Такой медленный метаболизм приводит к наличию остатков химических пестицидов в сельскохозяйственных культурах и окружающей среде, которые будут накапливаться в пищевой цепи, особенно в пищевой цепи высших хищных животных. Накопление данных химических пестицидов приводит к вызыванию заболеваний у высших видов, например, раковых заболеваний у человека. Таким образом, существует сильная потребность в экологически безопасном способе осуществления контроля или устранения нашествий насекомых при производстве сельскохозяйственных культур, а именно селективном, экологически безопасном способе со способностью к биодеградации, который можно также успешно использовать в системе управления устойчивостью к вредителям.
За последние несколько десятилетий разработка эффективного способа осуществления контроля над насекомыми-вредителями растений достигла существенного прогресса. Химические пестициды очень эффективны для уничтожения насекомых-вредителей растений; однако, данные пестициды также действуют на нецелевых насекомых, и, кроме того, химические пестициды постоянно присутствуют в окружающей среде, что не только вызывает необратимое загрязнение окружающей среды, но также приводит к появлению насекомых, устойчивых к лекарственным средствам. Микробные пестициды, в частности пестициды, полученные из штамма Bacillus thuringiensis (сокращенно Bt), играют важную роль в сельскохозяйственном производстве в качестве замены для химических пестицидов и обладают определенной инсектицидной активностью в отношении насекомых, включая Lepidoptera, Diptera, Coleoptera и т.д. Тем не менее, микробные пестициды имеют относительно высокие требования к условиям применения пестицидов, и, если данные условия не подходят для роста данных микроорганизмов, необходимо проводить повторное применение во время возделывания, и, в некоторых случаях, даже повторное применение не может достигать цели осуществления контроля над вредителями, значительно увеличивая, вследствие этого, производственные затраты. Некоторые трансгенные растения, которые обладают повышенной устойчивостью к вредителям, могут быть получены посредством введения в растения одного или более генов, кодирующих Bt инсектицидные белки, посредством генной инженерии, например, растения генетически сконструированная кукуруза и хлопок, способные продуцировать токсины Cry, широко использованы в сельскохозяйственном производстве в США и обеспечивают фермеров решением, являющимся альтернативным традиционным способам контроля над вредителями. Тем не менее, разработанные в настоящее время трансгенные сельскохозяйственные культуры, содержащие токсины Cry, могут быть только использованы для предотвращения и осуществления контроля над узким спектром вредителей Coleoptera, таких как кукурузный корневой жук и колорадский картофельный жук. Тем не менее, нет релевантного сообщения о применении токсинов Cry для контроля Monolepta hieroglyphica (Motschulsky), одного из основных вредителей кукурузы. Тем временем, Monolepta hieroglyphica (Motschulsky) присутствует в почве в виде яиц на протяжении зимы, и в июне следующего года личинки, вылупившиеся из данных яиц, также активно передвигаются в почве. В связи с широкой популярностью в последние годы мероприятий по возвращению соломы на поле, с каждым годом все сложнее и сложнее контролировать Monolepta hieroglyphica (Motschulsky) посредством использования химических пестицидов. В частности, в конце июля и в начале августа, когда взрослые насекомые Monolepta hieroglyphica (Motschulsky) появляются из земли и кукуруза вырастает до определенной высоты, сложнее осуществлять контроль над взрослыми насекомыми посредством применения химических пестицидов.
РНК-интерференция или РНКи представляет собой способ понижающей регуляции экспрессии гена специфичным в отношении последовательности образом в клетке или во всем организме, в котором цель направленного воспрепятствования экспрессии гена-мишени может быть достигнута посредством отбора конкретной мишени и эффективной репрессии мРНК. Несмотря на то, что в данной области известно, что технология РНКи может использоваться для предотвращения и осуществления контроля над вредителями, поскольку существует множество видов насекомых, данная технология не только отличается по своим значительно отличающимся воздействиям на разных насекомых, и ключевой фактор для использования такой методики в качестве меры для осуществления контроля над нашествиями насекомых дополнительно заключается в отборе наиболее подходящего гена-мишени, а именно гена, функция которого будет утеряна, приводя, таким образом, к серьезному нарушению жизненно-важных биологических процессов и/или гибели организмов. Таким образом, настоящим изобретением достигается контроль над нашествиями насекомых, в частности контроль над нашествиями насекомых в растении, посредством понижающей регуляции конкретного гена-мишени у вредителя.
Краткое изложение сущности изобретения
Цель настоящего изобретения заключается в предложении полинуклеотида и способа осуществления контроля над нашествиями насекомых, а именно понижающей регуляции экспрессии гена-мишени с использованием технологии РНКи путем ослабления способностей насекомого выживать, расти, размножаться, колонизировать в конкретной окружающей среде и/или поражать хозяина, таким образом, чтобы достичь контроля над нашествиями насекомых и наносимым ими вредом.
Для достижения упомянутой выше цели, согласно настоящему изобретению предложены следующие технические решения.
В одном аспекте согласно настоящему изобретению предложен выделенный полинуклеотид, который выбран из:
(a) полинуклеотидной последовательности, как показано в SEQ ID NO: 1; или
(b) полинуклеотидной последовательности по меньшей мере из 15 последовательных нуклеотидов SEQ ID NO: 1, где двухцепочечная РНК, содержащая по меньшей мере одну цепь, комплементарную полинуклеотидной последовательности, при поглощении насекомым-вредителем отряда Coleoptera (Жесткокрылые), ингибирует рост данного насекомого-вредителя отряда Coleoptera; или
(c) полинуклеотидной последовательности по меньшей мере из 17 последовательных нуклеотидов SEQ ID NO: 1, где двухцепочечная РНК, содержащая по меньшей мере одну цепь, комплементарную полинуклеотидной последовательности, при поглощении насекомым-вредителем отряда Coleoptera, ингибирует рост данного насекомого-вредителя отряда Coleoptera; или
(d) полинуклеотидной последовательности по меньшей мере из 19 последовательных нуклеотидов SEQ ID NO: 1, где двухцепочечная РНК, содержащая по меньшей мере одну цепь, комплементарную полинуклеотидной последовательности, при поглощении насекомым-вредителем отряда Coleoptera, ингибирует рост данного насекомого-вредителя отряда Coleoptera; или
(e) полинуклеотидной последовательности по меньшей мере из 21 последовательного нуклеотида SEQ ID NO: 1, где двухцепочечная РНК, содержащая по меньшей мере одну цепь, комплементарную полинуклеотидной последовательности, при поглощении насекомым-вредителем отряда Coleoptera, ингибирует рост данного насекомого-вредителя отряда Coleoptera; или
(f) любой из полинуклеотидных последовательностей, как показано в SEQ ID NO: 3 - SEQ ID NO: 6; или
(g) полинуклеотидной последовательности, которая гибридизуется с или комплементарна полинуклеотидной последовательности, как определено в любом из упомянутых выше (а)-(f), в жестких условиях.
Предпочтительно, полинуклеотид также содержит комплементарную последовательность полинуклеотидной последовательности.
Более предпочтительно, полинуклеотидная последовательность также содержит спейсерную последовательность.
Наиболее предпочтительно, спейсерная последовательность представляет собой SEQ ID NO: 9.
На основе упомянутых выше технических решений насекомое-вредитель отряда Coleoptera представляет собой Monolepta hieroglyphica (Motschulsky).
В еще одном аспекте согласно настоящему изобретению предложена экспрессионная кассета, содержащая полинуклеотидную последовательность под контролем эффективно связанной регуляторной последовательности.
В еще одном аспекте согласно настоящему изобретению предложен рекомбинантный вектор, содержащий полинуклеотидную последовательность или экспрессионную кассету.
В еще одном аспекте согласно настоящему изобретению также предложено применение полинуклеотидной последовательности для воспрепятствования экспрессии последовательности-мишени у насекомого-вредителя отряда Coleoptera или подавления роста насекомого-вредителя отряда Coleoptera.
В еще одном аспекте согласно настоящему изобретению также предложена интерферирующая рибонуклеиновая кислота, где данная интерферирующая рибонуклеиновая кислота действует с понижающей регуляцией экспрессии по меньшей мере одного гена-мишени у насекомого-вредителя отряда Coleoptera после поглощения насекомым-вредителем, где интерферирующая рибонуклеиновая кислота содержит по меньшей мере один сайленсирующий элемент, где данный сайленсирующий элемент представляет собой область двухцепочечной РНК, содержащую комплементарные цепи, которые были отожжены, и из которых одна цепь содержит или состоит из нуклеотидной последовательности, по меньшей мере частично комплементарной последовательности-мишени в пределах гена-мишени, и ген-мишень содержит полинуклеотидную последовательность.
Предпочтительно, сайленсирующий элемент содержит или состоит из последовательности по меньшей мере из 15 последовательных нуклеотидов, комплементарной или по меньшей мере частично комплементарной фрагменту-мишени в пределах последовательности-мишени.
Предпочтительно, сайленсирующий элемент содержит или состоит из последовательности по меньшей мере из 17 последовательных нуклеотидов, комплементарной или по меньшей мере частично комплементарной фрагменту-мишени в пределах последовательности-мишени.
Предпочтительно, сайленсирующий элемент содержит или состоит из последовательности по меньшей мере из 19 последовательных нуклеотидов, комплементарной или по меньшей мере частично комплементарной фрагменту-мишени в пределах последовательности-мишени.
Предпочтительно, сайленсирующий элемент содержит или состоит из последовательности по меньшей мере из 21 последовательного нуклеотида, комплементарной или по меньшей мере частично комплементарной фрагменту-мишени в пределах последовательности-мишени.
Возможно, интерферирующая рибонуклеиновая кислота содержит по меньшей мере два сайленсирующих элемента, каждый из которых содержит или состоит из нуклеотидной последовательности, по меньшей мере частично комплементарной последовательности-мишени в пределах гена-мишени.
Предпочтительно, каждый из сайленсирующих элементов содержит или состоит из отличающейся нуклеотидной последовательности, комплементарной отличающейся последовательности-мишени.
Более предпочтительно, отличающаяся последовательность-мишень происходит из одного гена-мишени или из гена-мишени, отличного от данного гена-мишени.
Еще более предпочтительно, ген-мишень, отличный от гена-мишени, происходит из того же насекомого-вредителя отряда Coleoptera или другого насекомого-вредителя отряда Coleoptera.
Наиболее предпочтительно, насекомое-вредитель отряда Coleoptera представляет собой Monolepta hieroglyphica (Motschulsky).
На основе упомянутых выше технических решений интерферирующая рибонуклеиновая кислота также содержит спейсерную последовательность.
В частности, спейсерная последовательность представляет собой SEQ ID NO: 9.
В еще одном аспекте согласно настоящему изобретению также предложена композиция для осуществления контроля над нашествием насекомого-вредителя отряда Coleoptera, содержащая по меньшей мере одну из интерферирующих рибонуклеиновых кислот и по меньшей мере один подходящий носитель, вспомогательное вещество или разбавитель.
Предпочтительно, композиция содержит клетку-хозяина, экспрессирующую или способную к экспрессии интерферирующей рибонуклеиновой кислоты. В частности, клетка-хозяин представляет собой бактериальную клетку.
Более предпочтительно, композиция представляет собой твердое вещество, жидкость или гель. В частности, композиция представляет собой инсектицидный спрей.
Возможно, композиция также содержит по меньшей мере один пестицид, где данный пестицид представляет собой химический пестицид, белок, специфичный к клубню картофеля, инсектицидный белок Bacillus thuringiensis, инсектицидный белок Xenorhabdus ehlersii, инсектицидный белок Photorhabdus, инсектицидный белок Bacillus laterosporus или инсектицидный белок Bacillus sphaericus.
В еще одном аспекте согласно настоящему изобретению также предложено применение композиции для осуществления контроля над нашествием насекомого-вредителя отряда Coleoptera для предотвращения и/или осуществления контроля над нашествием насекомого-вредителя отряда Coleoptera.
Предпочтительно, насекомое-вредитель отряда Coleoptera представляет собой Monolepta hieroglyphica (Motschulsky).
В еще одном аспекте согласно настоящему изобретению также предложен способ осуществления контроля над нашествием насекомого-вредителя отряда Coleoptera, включающий приведение насекомого-вредителя отряда Coleoptera в контакт с эффективным количеством по меньшей мере одной из последовательностей интерферирующей рибонуклеиновой кислоты.
В еще одном аспекте согласно настоящему изобретению также предложен способ повышения устойчивости растения к насекомому-вредителю отряда Coleoptera, включающий введение в растение полинуклеотида, экспрессионной кассеты, рекомбинантного вектора или конструкции, содержащих интерферирующую рибонуклеиновую кислоту.
В еще одном аспекте согласно настоящему изобретению также предложен способ получения растения, способного осуществлять контроль над насекомым-вредителем отряда Coleoptera, включающий введение в растение полинуклеотида, экспрессионной кассеты, рекомбинантного вектора или конструкции, содержащей интерферирующую рибонуклеиновую кислоту.
В еще одном аспекте согласно настоящему изобретению также предложен способ защиты растения от повреждения, вызываемого насекомым-вредителем отряда Coleoptera, включающий введение в растение полинуклеотида, экспрессионной кассеты, рекомбинантного вектора или конструкции, содержащих интерферирующую рибонуклеиновую кислоту, причем растение, в которое осуществляют указанное введение, оказывает ингибирующее воздействие на рост насекомого-вредителя отряда Coleoptera при поглощении этого растения насекомым-вредителем отряда Coleoptera.
На основе упомянутых выше технических решений растение представляет собой сою, пшеницу, ячмень, кукурузу, табак, рис, рапс, хлопок или подсолнечники Настоящее изобретение включает способ регуляции или ингибирования экспрессии одного или более генов-мишеней в насекомом-вредителе отряда Coleoptera, причем данный способ включает: введение части или всей стабилизированной двухцепочечной РНК (как например, дцРНК) или ее модифицированной формы (например, последовательность малых интерферирующих РНК) в клетку беспозвоночного вредного насекомого или его внеклеточную среду. В теле насекомого дцРНК или миРНК поступает в клетку, ингибирует экспрессию по меньшей мере одного или более генов-мишеней, и такое ингибирование приводит к ослаблению способностей насекомого выживать, расти, размножаться и поражать хозяина.
Согласно настоящему изобретению предложен выделенный и очищенный полинуклеотид, имеющий последовательность, как показано в SEQ ID NO: 1. Согласно настоящему изобретению также предложена любая РНК, экспрессируемая полинуклеотидом, включая дцРНК. Кроме того, согласно настоящему изобретению предложена молекула стабилизированной двухцепочечной РНК для ингибирования экспрессии последовательности-мишени во вредителе отряда Coleoptera. Стабилизированная двухцепочечная РНК содержит по меньшей мере две кодирующие последовательности, которые расположены в смысловом и антисмысловом направлениях относительно по меньшей мере одного промотора, где нуклеотидные последовательности, содержащие смысловую цепь и антисмысловую цепь, соединены или связаны спейсерной последовательностью по меньшей мере из примерно 5-1000 нуклеотидов, где смысловая цепь и антисмысловая цепь могут быть разной длины, и где по меньшей мере одна из двух данных кодирующих последовательностей обладает по меньшей 80%-ной, по меньшей 90%-ной, по меньшей 95%-ной, по меньшей 98%-ной или 100%-ной идентичностью последовательностей с любой нуклеотидной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 1.
При экспрессии в виде дцРНК и введении вредителю, фрагмент можно определить как фрагмент, приводящий к гибели и ингибированной, замедленной или приостановленной активности питания вредителя. Фрагмент может, например, содержать по меньшей мере примерно 19, 21, 23, 25, 40, 60, 80, 100, 125 или больше последовательных нуклеотидов или от примерно 19 до примерно 100 нуклеотидов или больше любой одной или более последовательностей SEQ ID NO: 1 или ее комплементарных последовательностей, таких как SEQ ID NO: 3 - SEQ ID NO: 6. Особенно полезной является последовательность дцРНК, содержащая примерно 19 - 300 нуклеотидов, гомологичных последовательности-мишени вредителя. Согласно настоящему изобретению также предложена РНК, экспрессируемая любой из полинуклеотидных последовательностей, включая дцРНК. Последовательность, выбранная для экспрессии ингибитора гена и для экспрессии РНК, ингибирующей один ген или семейство генов в одном или более целевых вредителях, может быть сконструирована с использованием одной последовательности из одного или более целевых вредителей, или последовательность ДНК может быть сконструирована в виде химеры из множества последовательностей ДНК.
Растение в настоящем изобретении может включать любой материал для размножения или репродукции растения и может также включать растительную клетку, растительный протопласт, культуру ткани растения, растительный каллус и интактную растительную клетку в растении или его частях, причем данные части растения представляют собой, например, зародыши, пыльцу, семязачатки, семена, листья, цветки, ветви, плоды, косточки, колоски, початки, оболочки, стебли, корни или корневые волоски.
Monolepta hieroglyphica (Motschulsky) в настоящем изобретении представляет собой насекомое Galeruca с полным превращением, принадлежащее к семейству Chrysomelidae Coleoptera. Его яйца, личинки и куколки живут в почве, и взрослые насекомые после появления будут вылетать из почвы. Оно дает одно поколение в год и зимует в виде яиц в состоянии покоя, которые начинают вылупляться в мае каждый год; личинок можно наблюдать в почве на поле с мая до начала июля; куколок можно часто наблюдать в поле с конца июня до середины июля; взрослые насекомые после появления обычно вылетают на поля кукурузы, сои или других растений, нанося вред в середине июля; периодом максимального появления является конец июля - начало августа. Взрослые насекомые будут готовы откладывать яйца примерно через 15 дней после появления. Период яйцекладки длится на протяжении примерно 1 месяца.
Личинки Monolepta hieroglyphica (Motschulsky) питаются главным образом на корнях сельскохозяйственных культур на пахотном поле, и, таким образом, наносимый тем самым вред не может быть виден над уровнем земли; в середине июля каждый год можно обнаружить, что их взрослые насекомые повреждают листья на полях кукурузы и сои; с конца июля до начала августа большое число взрослых насекомых повреждает кукурузные столбики с рыльцами, откусывая кукурузные столбики с рыльцами, и серьезно нарушают опыление, приводя к получению заостренных и веретеновидных початков и, таким образом, более низкой урожайности кукурузы. Затем, взрослые насекомые Monolepta hieroglyphica (Motschulsky) будут мигрировать на поля сои для того, чтобы объесть листья сои, или на окрестные овощные поля, повреждая овощи. Площадь поражения кукурузы, вызванного Monolepta hieroglyphica (Motschulsky) с 2009 года по 2016 год в Китае, была удвоена с 16 миллионов му (то есть примерно 1,07 миллион гектаров) до 40 миллионов му (то есть примерно 2,67 миллиона гектаров), и области поражения распространились с Северо-Запада до основных областей выращивания кукурузы, таких как Северо-Восточная и Северная части Китая.
Тем временем, при непрерывном совершенствовании мер по возвращению соломы на поле, гумус на полях и вещества, покрывающие поверхность почвы, все больше и больше обогащаются и аккумулируются, и, таким образом, труднее наносить пестициды на почву, и контроль над Monolepta hieroglyphica (Motschulsky) также становится более проблематичным. Иными словами, возвращение соломы на поле, которая предоставляет природное укрытие для личинок Monolepta hieroglyphica (Motschulsky), может приводить к гораздо более высокому коэффициенту выживаемости личинок Monolepta hieroglyphica (Motschulsky), что приводит, вследствие этого, к более высокой плотности популяции насекомых Monolepta hieroglyphica (Motschulsky). Взрослые насекомые Monolepta hieroglyphica (Motschulsky), как насекомые, которые могут искусно летать и прыгать, будут начинать повреждать кукурузу в середине-конце июля после появления, когда кукуруза растет на стадии выметывания пестичных столбиков. В данном случае, кукуруза выросла до определенной высоты; и применение пестицидов становится сложнее и, вероятно, приведет к печальной трагедии, заключающейся в случайном причинении вреда человеку, который их применяет. Кроме того, неселективное инсектицидное действие может наносить вред сельскохозяйственным культурам и нецелевым организмам. Кроме того, химические пестициды могут оказывать кумулятивное действие в организме человека, становясь мутагенами или канцерогенами. Таким образом, существует необходимость в нахождении точного и экологически безопасного способа, которым мог бы просто и легко пользоваться фермер для контроля вреда, наносимого Monolepta hieroglyphica (Motschulsky). Посредством использования генетической модификации, сельскохозяйственные культуры могут обладать определенной инсектицидной эффективностью в отношении вредителей на протяжении всего вегетационного периода, и целые растения защищены на протяжении всего их вегетационного периода. Для решения указанной выше проблемы, наилучшим решением является принятие способа осуществления контроля над Monolepta hieroglyphica (Motschulsky) посредством использования средств генетического модифицирования на основе РНКи таким образом, чтобы обеспечить кукурузе полный контроль над целостным растением на протяжении всего вегетационного периода.
Выражение «осуществление контроля над насекомым» или «осуществление контроля над вредителем» в настоящем изобретении означает любое воздействие на насекомое, которое может приводить к ограничению вреда, наносимого данным насекомым, включая, но, не ограничиваясь уничтожением насекомого, ингибированием развития насекомого, изменением фертильности или роста насекомого таким образом, чтобы насекомое могло лишь наносить растению меньше вреда, уменьшением количества потомства, которое дает насекомое, получением меньшего количества здоровых насекомых, получением насекомых, на которых будут легче нападать хищники, или предотвращением поедания растений насекомыми.
Выражение «ген-мишень» в настоящем изобретении означает любую последовательность, подлежащую понижающей регуляции в насекомом. Поражения насекомыми контролируются посредством осуществления понижающей регуляции гена-мишени, например, посредством нарушения необходимых биологических процессов в насекомых. Вследствие этого, предпочтительные гены-мишени включают гены, играющие жизненно важные роли в регуляции активности питания, выживаемости, росте, развитии, размножении, инвазии и инфицировании, но не ограничиваются ими. Когда экспрессия гена-мишени понижающим образом регулируется или ингибирована, по меньшей мере 30% насекомых уничтожается; или рост по меньшей мере 30% насекомых предотвращен/замедлен/заторможен/задержан/блокирован, предотвращается размножение по меньшей мере 30% насекомых, и предотвращается превращение по меньшей мере в 30% насекомых за их жизненный цикл; или уменьшается повреждение, вызываемое данными насекомыми, и/или способности насекомых инфицировать или заражать окружающую среду, поверхность и/или растения или виды сельскохозяйственных культур; или по меньшей мере у 30% насекомых прекращено питание из их природных источников пищи (как например растение и растительный продукт). Данные гены-мишени могут экспрессироваться во всех или части клеток насекомого. Кроме того, данные гены-мишени могут только экспрессироваться на конкретной стадии жизненного цикла насекомых, например, на стадии взрослого насекомого, в фазе личинки или на стадии яйца.
В настоящем изобретении термин «вредитель» предпочтительно представляет собой насекомое, вызывающее нашествие на растение/поражение растения/инфицирования растения, и принадлежит к Coleoptera, предпочтительно Monolepta hieroglyphica (Motschulsky). Термины «поражение», «инфицирование» и/или «нашествие» могут обычно использоваться взаимозаменяемо на протяжении всего документа.
Термин «РНК-интерференция (РНКи)» в настоящем изобретении означает некие РНК, которые могут высоко эффективно и специфично блокировать экспрессию конкретного гена in vivo, стимулировать деградацию мРНК и являться причиной того, что клетка демонстрирует фенотип делеции конкретного гена; данная технология также называется РНК-вмешательством или интерференцией. РНК-интерференция представляет собой высокоспецифичный механизм сайленсинга генов на уровне мРНК.
Термин «нуклеиновая кислота» в настоящем изобретении означает одноцепочечный или двухцепочечный полимер из оснований дезоксирибонуклеиновой кислоты или рибонуклеиновой кислоты, считываемый от 5'-конца к 3'-концу. Возможно, термин «нуклеиновая кислота» может также включать основания, не встречающиеся в природе, или измененные основания, которые обеспечивают правильное считывание посредством полимеразы и не будут снижать уровень экспрессии полипептида, кодируемого данной нуклеиновой кислотой. Термин «нуклеотидная последовательность» означает смысловую цепь и антисмысловую цепь нуклеиновой кислоты, присутствующие в виде отдельных одиночных цепей или присутствующие в димере. Термин «рибонуклеиновая кислота» (РНК) включает РНКи (РНК-интерференцию), дцРНК (двухцепочечную РНК), миРНК (малую интерферирующую РНК), мРНК (матричную РНК), микроРНК (микроРНК), тРНК (транспортную РНК, нагруженную или без соответствующих ацилированных аминокислот) и кДНК и геномную ДНК, а также гибриды ДНК-РНК. Специалист в данной области будет понимать, что термин «фрагмент нуклеиновой кислоты», «фрагмент последовательности нуклеиновой кислоты» или более общеизвестный термин «фрагмент» включает геномную последовательность, последовательность рибосомальной РНК, последовательность транспортной РНК, последовательность матричной РНК, последовательность оперона и меньшую по размеру сконструированную нуклеотидную последовательность, где данные последовательности экспрессируют или могут быть сконструированы таким образом, чтобы экспрессировать белок, полипептид или пептид.
Термин «интерферирующая рибонуклеиновая кислота» в настоящем изобретении охватывает любой тип молекулы РНК, способной к понижающей регуляции или «сайленсингу» экспрессии последовательности-мишени, включая смысловую РНК, антисмысловую РНК, миРНК, микроРНК, дцРНК, шпилечную РНК (шпРНК) и т.п, но, не ограничиваясь ими. Способы измерения молекул функциональной интерферирующей РНК хорошо известны в данной области и раскрыты.
Интерферирующая рибонуклеиновая кислота в настоящем изобретении достигает специфичной понижающей регуляции экспрессии гена-мишени посредством связывания с последовательностью-мишенью в пределах гена-мишени. Причиной возникновения связывания является спаривание оснований между комплементарными областями интерферирующей РНК и последовательности-мишени.
Настоящее изобретение охватывает молекулы нуклеиновых кислот или их фрагменты, которые гибридизуются (в частности, специфично гибридизуются) с полинуклеотидом согласно настоящему изобретению в «жестких условиях». Как известно специалисту в данной области, молекулы нуклеиновых кислот или их фрагменты могут специфично гибридизоваться с другими молекулами нуклеиновых кислот в определенных условиях. В настоящем изобретении, если две молекулы нуклеиновой кислоты могут образовать антипараллельную структуру нуклеиновой кислоты с двойными цепями, может быть определено, что данные две молекулы могут специфично гибридизоваться друг с другом. Если две молекулы нуклеиновой кислоты полностью комплементарны, одна из данных двух молекул называется «комплементом» другой молекулы. В данном изобретении, когда каждый нуклеотид молекулы нуклеиновой кислоты комплементарен соответствующему нуклеотиду другой молекулы нуклеиновой кислоты, идентифицировано, что данные две молекулы «полностью комплементарны». Если две молекулы нуклеиновой кислоты могут гибридизоваться друг с другом с достаточной стабильностью, таким образом, чтобы они могли отжигаться и связываться друг с другом в по меньшей мере нормальных «низко-жестких» условиях, данные две нуклеиновые кислоты идентифицируют как «минимально комплементарные». Аналогично, если две молекулы нуклеиновой кислоты могут гибридизоваться друг с другом с достаточной стабильностью таким образом, что они могут отжигаться и связываться друг с другом в нормальных «высоко-жестких» условиях, идентифицировано, что данные две нуклеиновые кислоты «комплементарны». Отклонение от «полностью комплементарных» может быть допустимым, при условии, что данное отклонение полностью не предотвращает образование данными двумя молекулами двухцепочечной структуры. Молекула нуклеиновой кислоты, которая может быть принята в качестве праймера или зонда, должна иметь последовательности, достаточно комплементарные для образования стабильной двухцепочечной структуры в конкретном растворителе при конкретной концентрации соли. В настоящем изобретении по существу гомологичная последовательность относится к молекуле нуклеиновой кислоты, которая может специфично гибридизоваться с комплементарной цепью другой соответствующей молекулы нуклеиновой кислоты в «высоко-жестких» условиях. Жесткие условия для гибридизации ДНК хорошо известны специалистам в данной области, такие как обработка 6,0× раствором хлорида натрия/цитрата натрия (SSC) при примерно 45°С и промывка 2,0×SSC при 50°С. Например, концентрация соли на стадии промывки выбрана из 2,0×SSC и 50°С в случае «низко-жестких» условий и 0,2×SSC и 50°С в случае «высокожестких» условий. Кроме того, температура на стадии промывки находится в интервале от примерно 22°С в случае «низко-жестких» условий до примерно 65°С в случае «высоко-жестких» условий. Как температура, так и концентрация соли могут одновременно варьировать, или одна из них может оставаться неизменной, в то время как другая переменная меняется. Предпочтительно, полинуклеотид по данному изобретению специфично гибридизуется в 6,0×SSC и 0,5%-ном растворе SDS (от англ. sodium dodecyl sulphate - додецилсульфат натрия) при 65°С в случае «высоко-жестких» условий; затем мембрану один раз промывают в 2×SSC и 0,1%-ном растворе SDS и в 1×SSC и 0,1%-ном растворе SDS, соответственно.
Термин «сайленсирующий элемент» относится к части или области интерферирующей рибонуклеиновой кислоты, содержащей или состоящей из нуклеотидной последовательности, комплементарной или по меньшей мере частично комплементарной последовательности-мишени в пределах гена-мишени, где часть или область действует как активная часть интерферирующей рибонуклеиновой кислоты таким образом, чтобы направлять понижающую регуляцию экспрессии гена-мишени. Сайленсирующий элемент содержит последовательность, имеющую по меньшей мере 15 последовательных нуклеотидов, предпочтительно по меньшей мере 18 или 19 последовательных нуклеотидов, более предпочтительно по меньшей мере 21 последовательный нуклеотид и даже более предпочтительно по меньшей мере 22, 23, 24 или 25 последовательных нуклеотидов, комплементарных последовательности-мишени в пределах гена-мишени; или интерферирующей рибонуклеиновой кислоте, состоящей из них.
Термин «экспрессия гена-мишени» в настоящем изобретении относится к транскрипции и аккумуляции РНК-транскриптов, кодируемых геном-мишенью, и/или трансляции мРНК в белок.
Термин «понижающая регуляция» относится к любому из способов, известных в данной области, посредством которого интерферирующая рибонуклеиновая кислота снижает уровень первичного РНК-транскрипта, мРНК или белка, образованного с гена-мишени. Понижающая регуляция относится к ситуации, при которой уровень РНК или белков, образующихся с гена, снижается по меньшей мере на 10%, предпочтительно по меньшей мере на 33%, более предпочтительно по меньшей мере на 50% и даже более предпочтительно по меньшей мере на 80%. Конкретно, понижающая регуляция относится к снижению уровня РНК или белков, образующихся с гена в клетке насекомого, по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 90%, более предпочтительно по меньшей мере на 95% и наиболее предпочтительно по меньшей мере на 99%, по сравнению с насекомым, контролируемым подходящим образом (например, насекомым, которое не подвергалось воздействию интерферирующей рибонуклеиновой кислоты или подвергалось воздействию контрольной интерферирующей рибонуклеиновой кислоты). Способы выявления снижения уровней РНК и белка хорошо известны в данной области и включают РНК гибридизацию в растворе, гибридизацию с использованием нозерн-блоттинга, обратную транскрипцию (например, количественный анализ ОТ-ПЦР (ПЦРс обратной транскрипцией)), микроматричный анализ, связывание антител, твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA - от англ. enzyme-linked immunosorbent assay) и вестерн-блоттинг. Между тем, понижающая регуляция может также означать, что, по сравнению с подходящим контролем насекомого, уровень РНК или белков снижается до уровня, достаточного для того, чтобы приводить к получению фенотипа насекомого, генерирующего выявляемое изменение, например, клеточную гибель, прекращение роста и т.п. Таким образом, понижающая регуляция может быть измерена посредством анализа фенотипа насекомого с использованием общепринятых методик в данной области.
Выражение «ингибирование экспрессии гена-мишени» в настоящем изобретении относится к снижению или отсутствию (ниже порога обнаружения) уровня белков и/или продукта мРНК гена-мишени. Специфичность относится к способности ингибировать ген-мишень и не воздействовать на другие гены в клетке, и не оказывать действие на какой-либо ген в клетке с образованием молекул дцРНК.
«Смысловая» РНК в настоящем изобретении относится к транскрипту РНК, соответствующему последовательности или фрагменту, присутствующему в виде мРНК, который может транслироваться в белок растительной клеткой. «Антисмысловая» РНК в настоящем изобретении относится к РНК, комплементарной всей или части мРНК, образующейся в растении в обычных условиях. Комплементарность антисмысловой РНК может быть направлена на любую часть транскрипта конкретного гена, а именно 5'-некодирующую последовательность, 3'-некодирующую последовательность, интрон или кодирующую последовательность. Термин «РНК-транскрипт» в настоящем изобретении относится к продукту, полученному посредством транскрипции, катализируемой РНК-полимеразой, осуществляемой на последовательности ДНК. Когда РНК-транскрипт представляет собой полностью комплементарную копию последовательности ДНК, данный РНК-транскрипт называется первичным транскриптом, или представляет собой РНК, полученную в результате посттранскрипционного процессинга первичного транскрипта, которая называется зрелой РНК.
Интерферирующая рибонуклеиновая кислота в настоящем изобретении осуществляет понижающую регуляцию экспрессии гена посредством РНК-интерференции или РНКи. РНКи представляет собой типичный метод специфичной в отношении последовательности регуляции экспрессии генов, опосредованный молекулой двухцепочечной РНК (такой как миРНК). миРНК содержит смысловую цепь РНК, отожженную с антисмысловой цепью РНК за счет спаривания комплементарных оснований. Смысловая цепь или «лидирующая цепь» в молекуле ми РНК содержит нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеотидной последовательности, расположенной в пределах РНК-транскрипта гена-мишени. Таким образом, смысловая цепь миРНК может отжигаться с РНК-транскриптом за счет спаривания оснований по Уотсону и Крику и нацеливается на РНК таким образом, что РНК деградирует в клеточном комплексе, называемом РНКи-индуцируемым комплексом выключения гена или RISC (от англ. RNAi induced silencing complex). В случае предпочтительной интерферирующей рибонуклеиновой кислоты в настоящем изобретении сайленсирующий элемент может представлять собой двухцепочечную область, содержащую отожженные комплементарные цепи, из которых по меньшей мере одна цепь содержит нуклеотидную цепь, комплементарную или по меньшей мере частично комплементарную последовательности-мишени в гене-мишени; или содержит интерферирующую рибонуклеиновую кислоту, состоящую из них. Двухцепочечная область имеет длину по меньшей мере от примерно 15 до примерно 25 пар оснований или длину от примерно 25 до примерно 100 пар оснований, или даже длину примерно 3000 пар оснований.
Молекула дцРНК в настоящем изобретении может служить предшественником для активных молекул миРНК, которые направляют РНК-транскрипты к комплексу RISC для последующей деградации. Молекула дцРНК, находящаяся в организме или его клеточной среде, может быть поглощена организмом и обработана ферментом, известным как DICER, с получением молекулы миРНК. Возможно, молекула дцРНК может быть получена in vivo, а именно один или более полинуклеотидов, кодирующих дцРНК, находящихся в клетке (например, бактериальная клетка или растительная клетка), транскрибируются и обрабатываются DICER в клетке-хозяине или предпочтительно в клетке насекомого после поглощения более длинного предшественника дцРНК. дцРНК может быть образована двумя отдельными (смысловой и антисмысловой) отожженными цепями РНК посредством спаривания комплементарных оснований. В качестве альтернативы, дцРНК может представлять собой одну цепь, которая повторно сворачивается с образованием шпилечной РНК или структуры «стебель-петля». В случае одной единственной РНК двухцепочечная область или «стебель» образован двумя областями или сегментами РНК, где данные области или сегменты по существу представляют собой последовательности инвертированных повторов друг для друга и обладают комплементарностью, достаточной для обеспечения образования двухцепочечной области. Один или более функциональных двухцепочечных сайленсирующих элементов могут находиться в данной «стеблевой области» молекулы. Области инвертированных повторов обычно разделены областью или сегментом, называемым «петлевой» областью в РНК. Данная область может содержать любую нуклеотидную последовательность, которая придает гибкости, достаточной для обеспечения самоспаривания между фланкирующими комплементарными областями РНК, и, в общем, петлевая область по существу является одноцепочечной и служит спейсерной областью между последовательностями инвертированных повторов.
Интерферирующая рибонуклеиновая кислота в настоящем изобретении содержит по меньшей мере одну двух цепочечную область, обычно сайленсирующий элемент интерферирующей рибонуклеиновой кислоты, которая содержит смысловую цепь РНК, отожженную с антисмысловой цепью РНК посредством спаривания комплементарных оснований, где смысловая цепь молекулы дцРНК содержит нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеотидной последовательности, распложенной в РНК-транскрипте гена-мишени. Сайленсирующий элемент или по меньшей мере одна его цепь (когда данный сайленсирующий элемент является двухцепочечным) может быть полностью или частично комплементарен последовательности-мишени гена-мишени. Термин «полностью комплементарный» означает, что все основания нуклеотидной последовательности сайленсирующего элемента комплементарны или «соответствуют» основаниям последовательности-мишени. Термин «по меньшей мере частично комплементарный» относится к меньше чем 100% степени соответствия, существующей между основаниями сайленсирующего элемента и основаниями последовательности-мишени. Специалисту в данной области будет понятно, что для того, чтобы опосредовать понижающую регуляцию экспрессии гена-мишени, сайленсирующий элемент должен быть лишь по меньшей мере частично комплементарен последовательности-мишени. В данной области известно, что последовательность РНК, имеющая вставку, делецию и ошибку спаривания относительно гена-мишени, может быть все еще эффективной с точки зрения РНКи. Предпочтительно, сайленсирующий элемент и последовательность-мишень гена-мишени обладают по меньшей мере 80%-ной или 85%-ной идентичностью последовательностей, предпочтительно по меньшей мере 90%-ной или 95%-ной идентичностью последовательностей или более предпочтительно по меньшей мере 97%-ной или 98%-ной идентичностью последовательностей и еще более предпочтительно по меньшей мере 99%-ной идентичностью последовательностей. Возможно, на протяжении каждой длины из 24 частично комплементарных нуклеотидов, в сравнении с последовательностью-мишенью, сайленсирующий элемент может содержать 1, 2 или 3 ошибки спаривания. Специалисту в данной области хорошо известно, что степень комплементарности, разделяемая сайленсирующим элементом и последовательностью-мишенью, варьирует в зависимости от экспрессии гена-мишени, подлежащей понижающей регуляции, или вида насекомого, подлежащего контролю.
Последовательность-мишень в настоящем изобретении может быть выбрана из любой подходящей области или нуклеотидной последовательности гена-мишени или его РНК-транскрипта. Например, последовательность-мишень может быть расположена в пределах 5' UTR (от англ. untranslated region - нетранслируемая область) или 3' UTR гена-мишени или РНК-транскрипта, или в области экзона или интрона данного гена.
Интерферирующая рибонуклеиновая кислота в настоящем изобретении может содержать один или более сайленсирующих элементов, где каждый сайленсирующий элемент содержит или состоит из нуклеотидной последовательности, по меньшей мере частично комплементарной последовательности-мишени в пределах гена-мишени, и функционирует с понижающей регуляцией экспрессии гена-мишени после поглощения насекомым. Термин «множество» или «более» означает по меньшей мере два, по меньшей мере три, по меньшей мере четыре и т.д. до по меньшей мере 10, 15, 20 или по меньшей мере 30. Интерферирующая рибонуклеиновая кислота содержит множество копий одного сайленсирующего элемента, то есть повторов сайленсирующего элемента, связывающегося с конкретной последовательностью-мишенью в пределах конкретного гена-мишени. Сайленсирующий элемент в интерферирующей рибонуклеиновой кислоте может также содержать или состоять из разных нуклеотидных последовательностей, комплементарных разным последовательностям-мишеням. Будет очевидно, что комбинация множества копий одного и того же сайленсирующего элемента и сайленсирующего элемента, связывающегося с отличной последовательностью-мишенью, также попадает в объем настоящего изобретения.
В настоящем изобретении для достижения понижающей регуляции конкретного гена-мишени в насекомом из Coleoptera, разные последовательности-мишени могут происходить из одного гена-мишени в насекомом. В данном случае сайленсирующие элементы в интерферирующей рибонуклеиновой кислоте могут быть объединены в соответствии с исходным порядком последовательностей-мишеней, находящихся в гене-мишени, или по сравнению с порядком последовательностей-мишеней в гене-мишени, сайленсирующие элементы могут быть дезорганизованы и случайным образом объединены в любом порядке ранжирования в окружающей среде интерферирующей рибонуклеиновой кислоты.
Возможно, разные последовательности-мишени представляют один ген-мишень соответственно, но происходят из разных видов насекомых.
Возможно, разные последовательности-мишени могут происходить из разных генов-мишеней. Если интерферирующая рибонуклеиновая кислота используется для предотвращения и/или осуществления контроля над нашествиями вредителей, тогда предпочтительно, чтобы разные последовательности-мишени были выбраны из группы, состоящей из генов, регулирующих необходимые биологические функции насекомого, где данные биологические функции включают выживаемость, рост, развитие, размножение и патогенность, но не ограничиваются ими. Последовательности-мишени могут регулировать один и тот же или разные биологические пути или процессы.
В настоящем изобретении разные гены, на которые нацелены разные сайленсирующие элементы, могут происходить из одного и того же насекомого. Данный способ может быть использован для достижения усиленного нападения на одно насекомое. В частности, разные гены-мишени могут дифференцированно экспрессироваться на разных стадиях жизненного цикла насекомого, например, стадии зрелого взрослого насекомого, стадии незрелой личинки и стадии яйца. Таким образом, интерферирующая рибонуклеиновая кислота в настоящем изобретении может использоваться для предотвращения и/или осуществления контроля над нашествиями насекомых на одной или более стадиях жизненного цикла насекомого. В качестве альтернативы разные гены, на которые нацелены разные сайленсирующие элементы, происходят из разных насекомых; таким образом, интерферирующая рибонуклеиновая кислота в настоящем изобретении может также использоваться одновременно для предотвращения и/или осуществления контроля над нашествиями одного или более типов насекомых.
Сайленсирующий элемент в настоящем изобретении может представлять собой непрерывно следующую область интерферирующей рибонуклеиновой кислоты или может быть разделен линкерной последовательностью. Линкерная последовательность может содержать короткую случайную нуклеотидную последовательность, которая не является комплементарной никакой последовательности-мишени или гену-мишени. Линкерная последовательность может представлять собой саморасщепляемую в определенных условиях последовательность РНК, предпочтительно рН-чувствительный линкер или гидрофобный чувствительный линкер. Линкер может также содержать нуклеотидную последовательность, эквивалентную последовательности интрона. Длина линкерной последовательности может находиться в интервале от 1 пары оснований до примерно 10000 пар нуклеотидов, при условии, что линкер не будет ослаблять способность интерферирующей рибонуклеиновой кислоты к понижающей регуляции экспрессии гена.
Помимо одного или более сайленсирующих элементов и любой линкерной последовательности, интерферирующая рибонуклеиновая кислота в настоящем изобретении может также содержать по меньшей мере одну дополнительную полинуклеотидную последовательность. Дополнительная полинуклеотидная последовательность выбрана из: (1) последовательности, способной к защите интерферирующей рибонуклеиновой кислоты от процессинга РНК; (2) последовательности, воздействующей на стабильность интерферирующей рибонуклеиновой кислоты; (3) последовательности, которая обеспечивает связывание белка для облегчения поглощения интерферирующей рибонуклеиновой кислоты клеткой насекомого; (4) последовательности, облегчающей крупномасштабное получение интерферирующей рибонуклеиновой кислоты; (5) последовательности аптамера, способной связываться с рецептором или связываться с молекулой на поверхности клетки насекомого таким образом, чтобы облегчать поглощение; или (6) последовательности, катализирующей процессинг интерферирующей рибонуклеиновой кислоты в клетке насекомого и, вследствие этого, усиливающей эффективность интерферирующей рибонуклеиновой кислоты.
Длина интерферирующей рибонуклеиновой кислоты в настоящем изобретении должна быть достаточной для поглощения клеткой насекомого и понижающей регуляции гена-мишени в насекомом. Верхний предел длины может зависеть от: (1) потребности в поглощении интерферирующей рибонуклеиновой кислоты клеткой насекомого и (2) потребности в опосредовании сайленсинга гена процессированной интерферирующей рибонуклеиновой кислотой в клетке насекомого посредством подхода РНКи, и длина может быть также обусловлена способом получения и композицией для доставки интерферирующей рибонуклеиновой кислоты в клетку. Предпочтительно, длина интерферирующей рибонуклеиновой кислоты в настоящем изобретении будет составлять от 19 до 10000 нуклеотидов, предпочтительно от 50 до 5000 нуклеотидов или от 100 до 2500 нуклеотидов, более предпочтительно имея длину от 80 и 2000 нуклеотидов.
Интерферирующая рибонуклеиновая кислота в настоящем изобретении может содержать основания ДНК, неприродные основания или неприродное основное соединение или модификации сахарофосфатного остова, например, для усиления стабильности во время хранения или усиления устойчивости к деградации под действием нуклеаз. Кроме того, интерферирующая рибонуклеиновая кислота может быть получена специалистом в данной области химически или ферментативно в ходе ручной или автоматической реакции. Возможно, интерферирующая рибонуклеиновая кислота может быть транскрибирована с кодирующего ее полинуклеотида. Таким образом, согласно настоящему изобретению предложен выделенный полинуклеотид для кодирования любой из интерферирующих рибонуклеиновых кислот.
Полинуклеотид в настоящем изобретении может быть вставлен в ДНК-конструкцию или вектор, известный в данной области, посредством общепринятой методики молекулярного клонирования. ДНК-конструкция может представлять собой рекомбинантный ДНК-вектор, например, бактериальный, вирусный или дрожжевой вектор. ДНК-конструкция представляет собой экспрессионную конструкцию, в которой полинуклеотид функционально связан с по меньшей мере одной регуляторной последовательностью, способной управлять экспрессией полинуклеотидной последовательности. Термин «регуляторная последовательность» относится к любой нуклеотидной последовательности, способной воздействовать на экспрессию функционально связанного полинуклеотида, включая промотор, энхансер и другие полученные естественным путем или синтезированные элементы активации транскрипции, но, не ограничиваясь ими. Регуляторная последовательность может быть расположена на 5'- или 3'-конце полинуклеотидной последовательности. Термин «функционально связанный» относится к функциональному соединению между регуляторной последовательностью и полинуклеотидной последовательностью, в котором соединение заставляет регуляторную последовательность управлять экспрессией полинуклеотида. Функционально связанные элементы могут быть последовательными или непоследовательными.
Регуляторная последовательность в настоящем изобретении может представлять собой промотор. Предпочтительно, промотор представляет собой растительный промотор, поддающийся экспрессии. «Растительный промотор, поддающийся экспрессии» относится к промотору, который обеспечивает экспрессию полинуклеотида, связанного с ним, в растительной клетке. Растительный промотор, поддающийся экспрессии, может представлять собой конститутивный промотор. Примеры промоторов, управляющих конститутивной экспрессией в растениях, включают 35S промотор, происходящий из вируса мозаики цветной капусты, промоторы убиквитина кукурузы, промоторы гена GOS2 риса и т.п., но не ограничиваются ими. В качестве альтернативы, растительный промотор, поддающийся экспрессии, может представлять собой тканеспецифичный промотор, то есть промотор направляет экспрессию кодирующей последовательности в нескольких тканях, таких как зеленые ткани, на уровне, выше, чем в других тканях растения (который можно измерить с помощью общепринятых проб РНК), такой как промотор ФЕП-карбоксилазы (Фосфоенолпируваткарбоксилазы). В качестве альтернативы, растительный промотор, поддающийся экспрессии, может представлять собой промотор, индуцируемый поранением. Под промотором, индуцируемым поранением, или промотором, направляющим способ экспрессии, индуцируемым поранением, подразумевается, что когда растение страдает от поранения, причиняемого механическим фактором или обгладыванием насекомыми, экспрессия полинуклеотида под регуляцией данного промотора значимо улучшена, чем в случае нормальных условий роста. Примеры промоторов, индуцируемых поранением, включают промоторы генов ингибиторов протеаз картофеля и томата (pinI и pinII) и генов ингибиторов протеаз кукурузы (MPI), но не ограничиваются ими.
Возможно, одна или более последовательностей терминации транскрипции могут быть включены в экспрессионную конструкцию в настоящем изобретении. Термин «последовательность терминации транскрипции» охватывает регуляторную последовательность на конце единицы транскрипции, и отправляет сигналы о терминации транскрипции, 3' процессинге и полиаденилировании первичного транскрипта. Дополнительный регуляторный элемент включает, но не ограничивается энхансером транскрипции или трансляции, который может быть включен в экспрессионную конструкцию, например, двойной усиливающий промотор CaMV35S.
Способ получения любой интерферирующей рибонуклеиновой кислоты в настоящем изобретении включает следующие стадии: (1) приведение полинуклеотида, кодирующего интерферирующую рибонуклеиновую кислоту, или ДНК-конструкции, содержащей данный полинуклеотид, в контакт с бесклеточным компонентом; и (2) введение в клетку полинуклеотида, кодирующего интерферирующую рибонуклеиновую кислоту, или ДНК-конструкции, содержащей данный полинуклеотид (например, посредством трансформации, трансфекции или инъекции).
В настоящем изобретении клетка-хозяин, содержащая любую интерферирующую рибонуклеиновую кислоту по настоящему изобретению, любой полинуклеотид по настоящему изобретению или ДНК-конструкцию, содержащую данные полинуклеотиды, может представлять собой прокариотическую клетку, включая клетки грамположительных и грамотрицательных бактерий, но, не ограничиваясь ими; или эукариотическую клетку, включая дрожжевую клетку или растительную клетку, но, не ограничиваясь ими. Предпочтительно, клетка-хозяин представляет собой бактериальную клетку или растительную клетку. Полинуклеотид или ДНК-конструкция в настоящем изобретении могут находиться или сохраняться в виде внехромосомного элемента в клетке-хозяине или могут быть стабильно включены в геном клетки-хозяина.
В настоящем изобретении в случае интерферирующей нуклеиновой кислоты, экспрессируемой в клетке-хозяине, и/или используемой для предотвращения и/или контроля над поражениями насекомыми в организме-хозяине, предпочтительно, что интерферирующая рибонуклеиновая кислота не демонстрирует значимого «нецелевого» воздействия, то есть интерферирующая рибонуклеиновая кислота не влияет на экспрессию гена, не являющегося мишенью, в хозяине. Предпочтительно, сайленсирующий ген не демонстрирует значимой комплементарности в отношении нуклеотидной последовательности, помимо данной последовательности-мишени гена-мишени. Сайленсирующий элемент демонстрирует меньше чем 30%-ную, более предпочтительно меньше чем 20%-ную, более предпочтительно меньше чем 10%-ную и даже более предпочтительно меньше чем 5%-ную идентичность последовательностей с любым геном клетки-хозяина или организма. Если доступны данные по геномным последовательностям организма-хозяина, тогда идентичность сайленсирующему элементу может быть перекрестно проверена с использованием стандартных биоинформатических инструментов. В области, имеющей 17 последовательных нуклеотидов, более предпочтительно в области, имеющей 18 или 19 последовательных нуклеотидов, и наиболее предпочтительно в области, имеющей 19 или 20 или 21 последовательный нуклеотид, сайленсирующий элемент и ген из клетки-хозяина или организма не обладают идентичностью последовательностей.
В настоящем изобретении композиция для предотвращения и/или осуществления контроля над поражениями насекомыми содержит по меньшей мере одну интерферирующую рибонуклеиновую кислоту и возможно по меньшей мере один подходящий носитель, вспомогательное вещество или разбавитель, где интерферирующая рибонуклеиновая кислота функционирует с понижающей регуляцией экспрессии гена-мишени в насекомом после поглощения данным насекомым. Интерферирующая рибонуклеиновая кислота содержит или состоит из по меньшей мере одного сайленсирующего элемента, и данный сайленсирующий элемент представляет собой область двухцепочечной РНК, содержащую отожженные комплементарные цепи, из которых одна цепь (смысловая цепь) содержит нуклеотидную последовательность, по меньшей мере частично комплементарную последовательности-мишени в гене-мишени. Ген-мишень включает гены, регулирующие выживаемость, рост, развитие, размножение и патогенность насекомого, но не ограничивается ими. Возможно, композиция содержит по меньшей мере одну клетку-хозяина, и клетка-хозяин содержит по меньшей мере одну интерферирующую рибонуклеиновую кислоту или ДНК-конструкцию, кодирующую интерферирующую рибонуклеиновую кислоту, и возможно по меньшей мере один подходящий носитель, вспомогательное вещество или разбавитель, где интерферирующая нуклеиновая кислота функционирует с понижающей регуляцией экспрессии гена-мишени в насекомом после поглощения насекомым клетки-хозяина.
Композиция по настоящему изобретению может быть представлена в виде любой подходящей формы, подлежащей применению в отношении насекомого. Например, композиция может быть в форме твердого вещества (порошок, пеллета или приманка), жидкости (включая инсектицидный спрей) или геля. Композиция может представлять собой покрытие, пасту или порошок, которые наносятся на субстрат таким образом, чтобы защитить субстрат от поражения насекомым.
Композиция может использоваться для защиты любого субстрата или материала, чувствительного к нашествиям насекомых или повреждению, вызываемому насекомым.
Свойства вспомогательного вещества и физической формы композиции могут варьировать в зависимости от свойств субстрата, который желательно обработать. Например, композиция может представлять собой жидкость, которая наносится кистью или наносится распылением на материал или субстрат, подлежащий обработке, или отпечатывается на материале или субстрате, подлежащем обработке; или покрытие или порошок, который наносят на материал или субстрат, подлежащий обработке.
В настоящем изобретении композиция может быть в виде приманки. Приманка используется для приманки насекомого, подлежащего приведению в контакт с композицией. После контакта с насекомым композиция впоследствии усваивается насекомым, например, посредством поглощения и опосредует РНКи, уничтожая, таким образом, насекомое. Приманка может содержать тип пищевого продукта, как например, тип белкового пищевого продукта, например, рыбную муку. Борная кислота может также использоваться в качестве приманки. Приманка может зависеть от вида, являющегося мишенью. Также можно использовать аттрактант, который, например, может представлять собой феромон, такой как мужской или женский феромон. Аттрактант может действовать, вызывая приведение насекомого в контакт с композицией, и может быть нацелен на конкретное насекомое или может привлекать насекомых по всему спектру, увеличивая возможность контакта заманиваемых насекомых с композицией по настоящему изобретению, достигая, таким образом, цели - уничтожения массы насекомых. Приманка может находиться в любой подходящей форме, как например, в форме твердого вещества, пасты, пеллеты или порошка.
От одного насекомого до сообщества насекомых могут использовать приманку. В таком случае приманка может служить источником пищи других членов в сообществе, обеспечивая, таким образом, эффективный контроль в отношении массы насекомых и возможно целого сообщества насекомых. Приманка может быть также предложена в подходящей «оболочке» или «ловушке».
Кроме того, композиция при контакте с насекомыми может удерживаться на поверхности насекомых. При очистке, будь то при самостоятельной очистке одного насекомого, или при очистке друг друга, композиция может поглощаться и может, таким образом, опосредовать свое действие в насекомых. Для этого композиция должна быть достаточно стабильной, таким образом, чтобы даже при воздействии внешних условий окружающей среды на протяжении периода времени (например, нескольких суток), интерферирующая рибонуклеиновая кислота все еще оставалась интактной и могла опосредовать РНКи.
Композиция в настоящем изобретении может быть предложена в форме спрея. Таким образом, человек-пользователь может непосредственно распылять композицию на насекомых. Композиция в таком случае усваивается насекомым и может опосредовать РНК-интерференцию в теле насекомого, осуществляя, таким образом, контроль над насекомым. Спрей предпочтительно представляет собой спрей под давлением/распыленный спрей или пульверизатор. Данные частицы могут иметь подходящие размер таким образом, что они могут прилипать к насекомому, например, прилипать к экзоскелету, на котором частицы могут абсорбироваться.
В настоящем изобретении носитель композиции представляет собой электростатический порошок или частицу, которые могут прилипать к насекомому. Возможно, носитель композиции может содержать магнитные частицы, которые могут прилипать к поверхности насекомого. Возможно, носитель композиции содержит металлические частицы, которые исходно являются ненамагниченными, но могут становиться поляризованными посредством магнита при попадании в электрическое поле, обеспеченное телом насекомого. Предпочтительно, композиция включена носитель, который увеличивает поглощение насекомым интерферирующей РНК. Такой носитель может представлять собой носитель на основе липидов, предпочтительно, включающий один или более из следующих носителей: эмульсия типа «масло в воде», мицелла, холестерин, липополиамин и липосома. Другие агенты, улучшающие поглощение конструкции по настоящему изобретению, также хорошо известны специалисту в данной области и включают поликатионы, декстран и катионные липиды, такие CS096 и CS102. Возможно, носитель композиции представляет собой коагулянт для нуклеиновой кислоты, и предпочтительный коагулянт включает спермидин или протамина сульфат, или их производные.
В случае, когда композиция по настоящему изобретению подходит для предотвращения и/или осуществления контроля над нашествиями насекомых в растении, композиция может содержать носитель, подходящий в области сельского хозяйства. Такой носитель может представлять собой любое вещество, которое может переноситься растением, подлежащим обработке, и данное вещество не будет наносить неподобающий вред окружающей среде или другим находящимся в ней организмам, и обеспечивает сохранение эффективности действия интерферирующей рибонуклеиновой кислоты на насекомое. В частности, композиция по настоящему изобретению может быть приготовлена в соответствии с традиционной сельскохозяйственной практикой, используемой в промышленности биологических пестицидов, таким образом, чтобы доставляться в растение. Композиция может содержать дополнительный компонент, способный выполнять другие функции, где данные функции включают следующие: (1) усиление или улучшение поглощения интерферирующей рибонуклеиновой кислоты клеткой насекомого, и (2) стабилизация активных компонентов композиции, но не ограничиваются ими. Такие дополнительные компоненты, содержащиеся в композиции, содержащей интерферирующую рибонуклеиновую кислоту, могут представлять собой дрожжевую тРНК или дрожжевую тотальную РНК.
Композиция может быть приготовлена для прямого применения или приготовлена в виде концентрированной формы первичной композиции, которая должна быть разведена перед применением. Возможно, композиция может быть приготовлена в виде набора, содержащего рибонуклеиновую кислоту или клетку-хозяина, содержащую/экспрессирующую интерферирующую рибонуклеиновую кислоту, в контейнере, и подходящий разбавитель или носитель для РНК или клетки-хозяина в отдельном контейнере. В применении по настоящему изобретению композицию можно наносить на растение или любую его часть на любой стадии развития растения, например, во время культивирования растения на поле композицию наносят на надземную часть растения; или когда семена растения хранятся или после того, как семена растения высевают в почву, композицию наносят на семена растения. В общем, важно достичь хорошего контроля над насекомым на ранней стадии роста растения, поскольку данная стадия представляет собой период, когда растение возможно страдает от наиболее серьезного повреждения насекомым.
В настоящем изобретении композиция может применяться в окружающей среде насекомых посредством разных методик, которые включают распыление, мелкодисперсное разбрызгивание, посыпание, рассеивание, полив, нанесение покрытия на семена, обработку семян, внесение в почву и внесение в воду для орошения, но не ограничиваются ими. Когда обрабатывают растение, которое является чувствительным к поражениям насекомыми, композиция может быть доставлена к растению или его части перед появлением насекомого (в профилактических целях) или после появления признаков нашествия насекомых (в целях борьбы).
Композиция по настоящему изобретению может быть приготовлена содержащей по меньшей мере один дополнительный активный агент. Таким образом, композиция может быть предложена в виде «набора из нескольких частей», и данный набор содержит композицию, содержащую интерферирующую рибонуклеиновую кислоту, в контейнере и один или более подходящих активных компонентов, таких как химические или биологические пестициды, в отдельном контейнере. Возможно, композиция может быть предложена в виде смеси, которая стабильна и компоненты которой могут быть использованы в комбинации друг с другом.
Подходящие активные компоненты, которые могут быть использованы взаимодополняющим образом с интерферирующей рибонуклеиновой кислотой по настоящему изобретению, включают, но не ограничиваются следующими компонентами: дурсбан, аллетрин, ресметрин, тетрабромэтил, диметанол-циклопропанкарбоновая кислота (обычно содержащаяся в жидкой композиции); и гидраметилнон, авермектин, дурсбан, сульфурамид, гидропрен, фипронил (ГАМК (гамма-аминомасляная кислота)-рецептор), сложный изопропилфенилметиловый эфир карбаминовой кислоты, индоксакарб, новифлумурон (ингибитор синтеза хитина), имипротрин, абамектин (глутамат-зависимый хлоридный канал) и имидаклоприд (ацетилхолиновый рецептор) (обычно содержащийся в композиции в виде приманки). Предпочтительно, учитывая здоровье и окружающую среду, известно, что активный компонент представляет собой пестицид, такой как гидраметилнон и авермектин.
Композиция в настоящем изобретении может быть приготовлена содержащей по меньшей мере один дополнительный сельскохозяйственный реагент, такой как гербицид или дополнительный пестицид. Термин «дополнительный пестицид» или «второй пестицид» относится к пестициду помимо первой или исходной молекулы интерферирующей РНК композиции. Возможно, композиция по настоящему изобретению может быть доставлена в комбинации с по меньшей мере одним дополнительным сельскохозяйственным реагентом (например, гербицидом или вторым пестицидом). Композиция может быть предложена в комбинации с гербицидом, который выбран из любого гербицида, известного в данной области, например, глифосфата, 2,4-D, имидазолинона, сульфонилмочевины и бромоксинила. Композиция может быть предложена в комбинации с по меньшей мере одним дополнительным пестицидом, который может быть выбран из любого пестицида, известного в данной области, и/или может содержать интерферирующую рибонуклеиновую кислоту, которая функционирует с понижающей регуляцией экспрессии гена-мишени в насекомом после поглощения насекомым. Вредитель-мишень представляет собой насекомое, и интерферирующая рибонуклеиновая кислота выбрана из любой из интерферирующих рибонуклеиновых кислот в настоящем изобретении. Дополнительный пестицид содержит интерферирующую рибонуклеиновую кислоту, которая функционирует с понижающей регуляцией экспрессии известного гена в любом вредителе-мишени. Исходная интерферирующая рибонуклеиновая кислота и второй или дополнительный пестицид в композиции могут быть нацелены на одно и то же или разных насекомых. Например, исходная интерферирующая рибонуклеиновая кислота и второй пестицид могут быть нацелены на разных насекомых или могут быть нацелены на насекомых разных семейств или разные группы, например, грибы или нематоды или насекомые. Специалисту в данной области должно быть понятно то, как выявлять синергетическое действие комбинации интерферирующей рибонуклеиновой кислоты и других сельскохозяйственных реагентов. Предпочтительно, композиция содержит первую интерферирующую рибонуклеиновую кислоту и один или более дополнительных пестицидов, каждый из которых обладает токсичностью в отношении одного и того же насекомого, где один или более дополнительных пестицидов выбраны из белка, специфичного к клубню картофеля, инсектицидного белка Bacillus thuringiensis, инсектицидного белка Xenorhabdus ehlersii, инсектицидного белка Photorhabdus, инсектицидного белка Bacillus laterosporus, инсектицидного белка Bacillus sphaericus и лигнина. Разные компоненты могут доставляться одновременно или последовательно к области или организму, подлежащему обработке.
Способ предотвращения и/или осуществления контроля над нашествиями насекомых в настоящем изобретении включает приведение насекомого в контакт с эффективным количеством по меньшей мере одной интерферирующей рибонуклеиновой кислоты, где интерферирующая рибонуклеиновая кислота функционирует, осуществляя понижающую регуляцию экспрессии необходимого гена-мишени насекомого после поглощения насекомым. Необходимый ген-мишень может представлять собой любой ген насекомого, участвующий в регуляции инициации или поддержания необходимых биологических процессов, требуемых для поражения, в насекомом, и данные биологические процессы включают выживаемость, рост, развитие, размножение и патогенность, но не ограничиваются ими.
Способ предотвращения и/или осуществления контроля над нашествиями насекомых на поле с сельскохозяйственной культурой в настоящем изобретении включает экспрессию эффективного количества интерферирующей рибонуклеиновой кислоты в растении, и, в том случае, когда способ используется для осуществления контроля над нашествиями насекомых, термин «эффективное количество» относится к количеству или концентрации интерферирующей рибонуклеиновой кислоты, которые требуются для получения фенотипического эффекта на насекомое, таким образом, чтобы уменьшалось число насекомых, поражающих организм-хозяина, и/или уменьшалось количество повреждения, вызываемого насекомым. Фенотипический эффект может представлять собой гибель насекомого, и применение интерферирующей РНК достигает показателя смертности насекомого по меньшей мере 20%, 30%, 40%, предпочтительно по меньшей мере 50%, 60%, 70% и более предпочтительно по меньшей мере 80% или 90%, по сравнению с контрольным насекомым. Фенотипический эффект также может включать предотвращение роста насекомого, угнетение активности питания и уменьшение кладки яиц, но не ограничивается ими. Таким образом, по сравнению с контрольным насекомым, общее число насекомых, поражающих организм-хозяина, может уменьшаться по меньшей мере на 20%, 30%, 40%, предпочтительно по меньшей мере на 50%, 60%, 70%, и более предпочтительно по меньшей мере на 80% или 90%. Возможно, по сравнению с контрольным насекомым, вред, наносимый насекомым, может быть уменьшен по меньшей мере на 20%, 30%, 40%, предпочтительно по меньшей мере на 50%, 60%, 70%, и более предпочтительно по меньшей мере на 80% или 90%. Таким образом, настоящее изобретение может использоваться для достижения по меньшей мере 20%, 30%, 40%, предпочтительно по меньшей мере 50%, 60%, 70%, и более предпочтительно по меньшей мере 80% или 90% контроля над насекомым.
Способ и композицию в настоящем изобретении можно использовать для ограничения или исключения нашествия вредителя Coleoptera, предпочтительно Monolepta hieroglyphica (Motschulsky), в окружающей среде или на поверхности, где может находиться любой хозяин вредителя, симбионт вредителя или вредитель, посредством предложения одной или более композиций, содержащих молекулы дцРНК в настоящем изобретении, в пище вредителя. Способ особенно полезен для предотвращения нападения насекомого на растение, и вредитель определен как имеющий рН от примерно 4,5 до примерно 9,5, от примерно 5 до примерно 9, от примерно 6 до примерно 7 или примерно рН 7,0 в пищеварительной системе.
Нуклеотидная последовательность по настоящему изобретению может содержать инвертированные повторы, разнесенные «спейсерной последовательностью». Спейсерная последовательность может представлять собой область, содержащую любую из следующих нуклеотидных последовательностей, при необходимости, которая может стимулировать образование вторичной структуры между каждым сегментом повторов. Спейсерная последовательность является частью смысловой или антисмысловой кодирующей последовательности мРНК. В качестве альтернативы спейсерная последовательность может содержать любую комбинацию нуклеотидов или их гомологов, которые могут быть ковалентно связаны с молекулой нуклеиновой кислоты. Спейсерная последовательность может содержать нуклеотидную последовательность с длиной по меньшей мере примерно 10-100 нуклеотидов или длиной по меньшей мере примерно 100-200 нуклеотидов, или длиной по меньшей мере примерно 200-400 нуклеотидов или длиной по меньшей мере примерно 400-500 нуклеотидов.
В настоящем изобретении «введение» интерферирующей рибонуклеиновой кислоты в растение означает введение, которое может быть выполнено методом прямой трансформации, например, трансформации, опосредованной Agrobacterium, для ткани растения, бомбардировкой микрочастицами, электропорацией и т.д.; или введение, которое может быть выполнено посредство создания гибрида растения, имеющего гетерогенную нуклеотидную последовательность, с другим растением, таким образом, чтобы потомство имело нуклеотидную последовательность, включенную в их геномы. Такие технологии скрещивания хорошо известны специалисту в данной области.
Согласно настоящему изобретению предложен полинуклеотид и способ осуществления контроля над нашествиями насекомых, имеющий по меньшей мере следующие преимущества:
1. В настоящем изобретении впервые раскрыто множество последовательностей-мишеней для осуществления контроля над геном-мишенью с46312 насекомого-вредителя Coleoptera, Monolepta hieroglyphica (Motschulsky) и, кроме того, установлено, что ингибитор нуклеиновой кислоты, полученный на основе данных последовательностей-мишеней, можно непосредственно использовать для осуществления контроля над нашествиями насекомых-вредителей из Coleoptera.
2. Высокая видоспецифичность. Последовательности-мишени, раскрытые в данном документе для осуществления контроля над насекомым-вредителем Coleoptera, Monolepta hieroglyphica (Motschulsky), действуют с высокой специфичностью на Monolepta hieroglyphica (Motschulsky) и виды, которые разделяют близкие генетические аффинности и обладают идентичностью последовательностей.
3. Избегание развития устойчивости. Настоящее изобретение не исходит из связывания специфичной дцРНК с рецепторным белком в теле насекомого, и, таким образом, можно эффективно избежать аналогичного риска развития устойчивости к белковым Bt-токсинам в насекомом.
4. Технология РНКи, используемая в данном документе, высокоэффективна и специфична, и полученная дцРНК может быть непосредственно использована на поле для осуществления контроля над нашествием насекомых-вредителей из Coleoptera, которая является удобной, недорогой по стоимости и хорошей в совместимости с окружающей средой.
Технические решения настоящего изобретения дополнительно подробно описаны ниже посредством графических материалов и примеров.
Описание графических материалов
Фиг. 1 представляет собой электрофореграмму, показывающую уровень экспрессии гена-мишени с46312, используемого в полинуклеотиде и способе осуществления контроля над нашествиями насекомых согласно настоящему изобретению.
Фиг. 2 представляет собой схематичное изображение рекомбинантного экспрессионного вектора DBNR46312C1, используемого в полинуклеотиде и способе осуществления контроля над нашествиями насекомых согласно настоящему изобретению.
Конкретные воплощения изобретения
Техническое решение полинуклеотида и способа осуществления контроля над нашествиями насекомых в настоящем изобретении дополнительно проиллюстрировано ниже конкретными примерами.
Пример 1. Определение последовательностей-мишеней Monolepta hieroglyphica (Motschulsky)
1. Выделение тотальной РНК Monolepta hieroglyphica (Motschulsky) В качестве материала брали свежевыведенные личинки Monolepta hieroglyphica (Motschulsky), и РНК выделяли посредством использования общепринятого метода с тризолом, очищали общепринятым способом и обрабатывали ДНКазой, получая, таким образом, образец тотальной РНК с концентрацией, равной или выше 300 нг/мкл, общим количеством, равным или больше 6 мкг, и OD260/280 (от англ. optical density - оптическая плотность) 1,8-2,2.
2. Выделение мРНК и синтез кДНК
мРНК с полиА выделяли из образца тотальной РНК, полученного, как указано выше, с использованием магнитных частиц с олиго(dT), и первую цепь кДНК затем синтезировали, используя набор со случайными гексамерами и обратной транскриптазой Superscript II Invitrogen.
3. Скрининг генов-мишеней
Один ген-мишень с46312 Monolepta hieroglyphica (Motschulsky) выбирали в результате скрининга из генов, которые находятся в библиотеке личинок со средним значением аналитического выражения, и может участвовать в важных метаболических путях, и его полноразмерная нуклеотидная последовательность показана в SEQ ID NO: 1, аминокислотная последовательность показана в SEQ ID NO: 2.
4. Выбор последовательностей-мишеней в генах-мишенях
Четыре последовательности-мишени с разными положениями ORF (от англ. open reading frame - открытая рамка считывания), и/или разные длины гена-мишени с46312 выбраны, как показано в Таблице 1.
Пример 2. Получение дцРНК
дцРНК упомянутых выше четырех последовательностей мишеней синтезировали соответственно в соответствии с инструкциями набора для РНКи MEGAscript от компании ThermoFisher, а именно, c46312_g1-01 - c46312_g1-04; размер продуктов выявляли посредством электрофореза в агарозном геле с массовой концентрацией 1%, и концентрации c46312_g1-01 - c46312_g1-04 определяли соответственно посредством NanoDrop 2000 (Thermo Scientific).
Пример 3. Идентификация способности осуществления контроля над Monolepta hieroglyphica (Motschulsky) посредством кормления дцРНК
Выделенные и очищенные c46312_g1-01 - c46312_g1-04 смешивали, соответственно, и поровну добавляли в корм в соотношениях 50 мкг/г корма и 5 мкг/г корма (Feed formula references Development of an artificial diet for the western corn rootworm, Entomologia Experimentalis et Applicata 105: 1-11, 2002.) с получением корма с c46312_g1-01-50 - c46312_g1-04-50 и корма с c46312_g1-01-5 - c46312_g1-04-5, соответственно. В контрольной группе нерелевантную дцРНК (SEQ ID NO: 15) добавляли к корму CK, и другие условия были полностью неизменными. Свежевыведенных личинок Monolepta hieroglyphica (Motschulsky) кормили кормом, полученным, как указано выше. 30 свежевыведенных личинок со временем выведения не больше чем 24 часа помещали в каждую чашку, в которой корм, смешанный сдцРНК, заменяли каждые двое суток, и кормили до суток 14. Процент смертности насекомых подсчитывали каждые двое суток с начала кормления, и величину экспрессии гена-мишени определяли в сутки 0, 4, 8 и 10 с начала кормления посредством использования конкретных способов, приведенных ниже:
Стадия 301. Личинок, которых кормили кормом с с46312_g1-01-50 -c46312_g1-04-50 и кормом с c46312_g1-01-5 - c46312_g1-04-5, соответственно, собирали в сутки 0, 4, 8 и 10, соответственно, и замораживали посредством жидкого азота;
Стадия 302. Тотальную РНК упомянутых выше личинок выделяли, используя метод на основе тризола, соответственно;
Стадия 303. кДНК получали посредством обратной транскрипции тотальной РНК упомянутых выше личинок с использованием набора whole gold kit (TransGen Biotech ER301-01), соответственно.
Стадия 304. Убиквитин-С использовали в качестве внутреннего референсного гена для ПЦР-амплификации, и после амплификации 10 мкл продукта амплификации брали для электрофореза в агарозном геле с массовой концентрацией 1%.
Пять повторов было установлено для каждой обработки в упомянутом выше эксперименте, и статистические результаты показаны на Фиг. 1 и в Таблице 2. В Таблице 2 «-50» в номере материала представляет 50 мкг соответствующей дцРНК на г корма, а именно «50 мкг/г корма», как отмечалось выше; «-5» представляет 5 мкг соответствующей дцРНК на грамм корма, а именно «5 мкг/г корма», как отмечалось выше. Например, «г1-дцРНК-50» представляет 50 мкг г1-дцРНК на грамм корма. «DAI (от англ. days after incubation)» представляет количество суток после инкубации и кормления насекомых.
Измеренные результаты уровня экспрессии гена-мишени на Фиг. 1 показали, что дцРНК (50 мкг/г корма) последовательности-мишени с46312_g1-01 оказывала значимое ингибирующее действие на экспрессию гена-мишени с46312 в Monolepta hieroglyphica (Motschulsky), и уровень экспрессии гена-мишени с46312 подвергался значимой понижающей регуляции в сутки 4 кормления, экспрессия гена-мишени с46312 почти не выявлялась в сутки 10.
Результаты кормления дцРНК в Таблице 2 показали, что дцРНК последовательностей-мишеней c46312_g1-01 - c46312_g1-04 гена-мишени с46312 оказывала значимое смертельное действие на Monolepta hieroglyphica (Motschulsky), и не было выживших личинок в большинстве повторов на сутки 14 кормления.
Пример 4. Неожиданный технический эффект воспрепятствования экспрессии одного и того же гена у разных насекомых
Белок частицы распознавания сигнала 54 кДа, который принадлежит к одной из пептидных цепей в комплексе частицы распознавания сигнала, и его основная функция заключается в том, что когда предварительно секретированный белок выходит из рибосомы, белок частицы распознавания сигнала 54 кДа быстро связывается с сигнальной последовательностью предварительно секретированного белка и переносит его к мембранному белку, связанному с цепью транслокации. В связанной с этим литературе показано, что воспрепятствование экспрессии гена, кодирующего белок частицы распознавания сигнала 54 кДа, может оказывать смертельное действие на разнообразных насекомых Coleoptera, как сообщено Julia Ulrich et al. (2015), РНК-интерференцию (РНКи) проводили на гене, кодирующем белок в Tribolium castaneum, посредством инъекции (код последовательности инъецирования iB_00404), и было обнаружено, что почти все Tribolium castaneum гибли примерно через четверо суток после инъекции. Как также сообщается Avet-Rochex et al. (2010), РНК-интерференцию (РНКи) проводили на гене, кодирующем белок в Drosophila, посредством инъекции (Таблица 1), и результаты показали, что почти все Drosophila гибли после инъекции.
На основе сообщений в упомянутых выше источниках литературы и высокой гомологии последовательностей, ген, кодирующий данный белок в Monolepta hieroglyphica (Motschulsky), отбирали в результате скрининга. Что касается последовательностей для инъекции в Tribolium castaneum и Drosophila, выбирали последовательность М1 в соответствующем положении, как показано в SEQ ID NO: 16, и выбирали последовательность М2 в несоответствующем положении, как показано в SEQ ID NO: 17. Способность осуществления контроля в отношении Monolepta hieroglyphica (Motschulsky) определяли посредством использования способа кормления дцРНК (в соотношении 50 мкг/г корма) в Примере 3 настоящего изобретения. Как показано в Таблице 3, результаты экспериментов показали, что ни последовательность М1 в соответствующем положении, ни последовательность М2 в несоответствующем положении не может оказывать значимое смертельное действие на Monolepta hieroglyphica (Motschulsky), которое по существу не отличалось от контрольной группы. Похожие результаты экспериментов были утверждены в международном общественном патенте РСТ WO 2018/026770, которые подтверждались с помощью РНКи летальных генов Nematodes, Drosophila и т.д. после получения транскриптома, то есть в соответствии с несколькими известными летальными генами Nematodes и Drosophila РНК-интерференцию (РНКи) проводили на соответствующем гене в кукурузном корневом жуке, и по существу отсутствовало значимое смертельное воздействие. Подводя итог вышесказанному, технический эффект интерференции с экспрессией одного и того же гена разных насекомых был непредсказуем, и он необязательно ассоциирован с техническим эффектом известной интерференции и гомологии последовательностей.
Пример 5. Конструирование растительных экспрессионных векторов
Две экспрессионные кассеты синтезировали в соответствии с порядком p35S-RX-tNos-p35S-Hpt-tNos (X равен 1-4) и соединяли с растительными экспрессионными векторами посредством EcoR V и BamH I и называли DBNR46312CX (X равен 1-4, где схематичное изображение вектора DBNR46312C1 показано на Фиг. 2 (Кап: ген устойчивости к канамицину; RB: правая граница; pr35S: промотор вируса мозаики цветной капусты 35S (SEQ ID NO: 7); R1 (SEQ ID NO: 8): нуклеотидная последовательность g1_01 (g1_01 последовательность-мишень 1 гена-мишени c46312, SEQ ID NO: 3) плюс спейсерная последовательность (SEQ ID NO: 9) плюс обратнокомплементарная последовательность нуклеотидной последовательности r1; tNos: терминатор гена нопалинсинтазы (SEQ ID NO: 10); Hpt: ген гигромицинфосфотрансферазы (SEQ ID NO: 11); и LB: левая граница)).
Компетентные клетки Escherichia coil Т1 трансформировали рекомбинантным экспрессионным вектором DBNR46312C1 методом теплового шока со следующими условиями теплового шока: выдерживание на водяной бани 50 мкл компетентных клеток Escherichia coli Т1 и 10 мкл плазмидной ДНК (рекомбинантный экспрессионный вектор DBNR46312C1) при 42°С в течение 30 с; культивирование со встряхиванием при 37°С в течение 1 ч (используя шейкер при скорости вращения 100 об/мин для встряхивания); затем культивирование в условиях температуры 37°С в течение 12 ч на чашке с твердой средой LB (10 г/л триптона, 5 г/л дрожжевого экстракта, 10 г/л NaCl и 15 г/л агара с доведением рН до 7,5 посредством NaOH), содержащей 50 мг/л канамицина, отбор белых колоний и культивирование в условиях температуры 37°С в течение ночи в жидкой культуральной среде LB (10 г/л триптона, 5 г/л дрожжевого экстракта, 10 г/л NaCl и 50 мг/л Канамицина, с доведением рН до 7,5 с помощью NaOH). Плазмиды в клетках выделяли щелочным способом: центрифугирование раствора с бактериями со скоростью вращения 12000 об/мин на протяжении 1 мин, удаление супернатанта, и осажденные бактерии суспендировали 100 мкл ледяного предварительно охлажденного раствора I (25 мМ Tris-HCl, 10 мМ ЭДТА (Этилендиаминтетрауксусная кислота), 50 мМ глюкозы, рН 8,0); добавление 200 мкл свежеприготовленного раствора II (0,2 М NaOH, 1% SDS (от англ. sodium dodecyl sulfate - додецилсульфат натрия)), переворачивание пробирки 4 раза, перемешивание и помещение на лед на 3-5 мин; добавление 150 мкл холодного раствора III (3 М ацетата калия, 5 М уксусной кислоты), немедленно перемешивание равномерно тщательно и помещение на лед на 5-10 мин; центрифугирование в условиях температуры 4°С и скорости вращения 12000 об/мин на протяжении 5 мин, 2-кратное добавление объема безводного этанола к супернатанту, равномерное перемешивание и помещение при комнатной температуре на 5 мин; центрифугирование в условиях температуры 4°С и скорости вращения 12000 об/мин на протяжении 5 мин, отбрасывание супрнатанта и промывка осадка этанолом в концентрации (об./об.) 70% и осуществление сушки; добавление 30 мкл ТЕ (10 мМ Tris-HCl, 1 мМ ЭДТА, рН 8,0), содержащего РНКазу (20 мкг/мл), для растворения осадка; выдерживание на водяной бане при 37°С в течение 30 мин для расщепления РНК; хранение при -20°С для дальнейшего использования. Выделенные плазмиды секвенировали и идентифицировали посредством ПЦР, и результаты показали, что рекомбинантный экспрессионный вектор DBNR46312C1 был правильно сконструирован.
Согласно упомянутому выше способу, рекомбинантные экспрессионные векторы DBNR46312C2-DBNR46312C4 конструировали, соответственно, со следующими структурами векторов: Кап: ген устойчивости к канамицину; RB: правая граница; pr35S: промотор вируса мозаики цветной капусты 35S (SEQ ID NO: 7); RX: нуклеотидная последовательность g1_0X (g1_0X представляет собой последовательность-мишень X гена-мишени с46312, X равен 2-4) плюс спейсерная последовательность (SEQ ID NO: 9) плюс обратнокомплементарная последовательность нуклеотидной последовательности g1_0X); tNos: терминатор гена нопалинсинтазы (SEQ ID NO: 10); Hpt: ген гигромицинфосфотрансферазы (SEQ ID NO: 11); и LB: левая граница. Компетентные клетки Escherichia coli Т1 трансформировали, соответственно, рекомбинантным экспрессионным вектором DBNR46312C2-DBNR46312C4 методом теплового шока, и плазмиды в клетках выделяли щелочным способом.
Пример 6. Трансформация Agrobacterium рекомбинантными экспрессионными векторами
Agrobacterium LBA4404 (Invitrogen, Chicago, США, кат. №: 18313-015) трансформировали соответственно рекомбинантными экспрессионными векторами DBN46312C1-DBNR46312C4, которые были правильно сконструированы, посредством использования способа на основе жидкого азота со следующими условиями трансформации: помещение 100 мкл Agrobacterium LBA4404 и 3 мкл плазмидной ДНК (рекомбинантный экспрессионный вектор) в жидкий азот на 10 мин и выдерживание на теплой водяной бане при 37°С в течение 10 мин; инокуляция трансформированных Agrobacterium LBA4404 в пробирку с LB, культивирование в условиях температуры 28°С и скорости вращения 200 об/мин в течение 2 ч и затем распределение по чашке с LB, содержащей 50 мг/л рифампицина и 100 мг/л канамицина до тех пор, пока не вырастут позитивные одиночные клоны, отбор одиночных клонов для культивирования и выделения их плазмид и проведение проверки посредством ферментативного расщепления на рекомбинантных экспрессионных векторах DBNR46312C1-DBNR46312C4 эндонуклеазами рестрикции EcoR V и BamH I, причем результаты показали, то структуры рекомбинантных экспрессионных векторов DBNR46312C1-DBNR46312C4 были абсолютно правильными.
Пример 7. Получение трансгенных растений кукурузы
В соответствии с обычно используемым способом инфицирования Agrobacterium, молодые зародыши сорта кукурузы Zong31 (Z31), культивируемые в стерильных условиях, совместно культивировали с трансформированной Agrobacterium в Примере 6 таким образом, чтобы перенести Т-ДНК (содержащую нуклеотидную последовательность RX, последовательность промотора вируса мозаики цветной капусты 35S, ген Hpt и последовательность терминатора Nos) в рекомбинантных экспрессионных векторах DBNR46312C1-DBNR46312C4, сконструированных в Примере 5, в хромосому кукурузы, получая, таким образом, растения кукурузы с включенной нуклеотидной последовательностью RX (X равен 1-4); между тем, растения кукурузы дикого типа использовали в качестве контроля.
В отношении Agrobacterium-опосредованной трансформации кукурузы, кратко, незрелые молодые зародыши отделяли от кукурузы и приводили в контакт с суспензией Agrobacterium, где Agrobacterium может осуществлять перенос нуклеотидной последовательности RX в по меньшей мере одну клетку одного из молодых зародышей (стадия 1: стадия инфицирования). На данной стадии, молодые зародыши предпочтительно погружали в суспензию Agrobacterium (OD660 равна 0,4-0,6, культуральная среда для инфицирования (4,3 г/л солей MS, витаминов MS, 300 мг/л казеина, 68,5 г/л сахарозы, 36 г/л глюкозы, 40 мг/л ацетосирингона (AS - от англ. acetosyringone) и 1 мг/л 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4-D), рН 5,3)) для инициации инокуляции. Молодые зародыши совместно культивировали с Agrobacterium на протяжении периода времени (3 суток) (стадия 2: стадия совместного культивирования). Предпочтительно, молодые зародыши культивировали на твердой культуральной среде (4,3 г/л солей MS, витаминов MS, 300 мг/л казеина, 20 г/л сахарозы, 10 г/л глюкозы, 100 мг/л ацетосирингона (AS), 1 мг/л 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4-D) и 8 г/л агара, рН 5,8) после стадии инфицирования. После данной стадии совместного культивирования может иметь место возможная стадия «восстановления». На данной стадии «восстановления» может быть по меньшей мере один антибиотик (цефалоспорин), как известно, ингибирующий рост Agrobacterium в культуральной среде для восстановления (4,3 г/л солей MS, витаминов MS, 300 мг/л казеина, 30 г/л сахарозы, 1 мг/л 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4-D) и 3 г/л фитогеля, рН 5,8), без добавления селективного агента для растительного трансформанта (стадия 3: стадия восстановления). Предпочтительно, молодые зародыши культивировали на твердой культуральной среде с антибиотиком, но без селективного агента, для устранения Agrobacterium и обеспечения стадии восстановления для инфицированных клеток. Затем, инокулированные молодые зародыши культивировали в культуральной среде, содержащей селективный агент (гигромицин), и осуществляли селекцию растущих трансформированных каллусов (стадия 4: стадия селекции). Предпочтительно, молодые зародыши культивировали на твердой культуральной среде для осуществления скрининга (4,3 г/л солей MS, витаминов MS, 300 мг/л казеина, 30 г/л сахарозы, 50 мг/л гигромицина, 1 мг/л 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4-D) и 3 г/л фитогеля, рН 5,8) с селективным агентом, приводя к селективному росту трансформированных клеток. Затем, растения регенерировали из каллусов (стадия 5: стадия регенерации). Предпочтительно, куллусы, выращенные на культуральной среде, содержащей селективный агент, культивировали на твердых культуральных средах (культуральная среда MS для дифференцировки и культуральная среда MS для укоренения) для регенерации растений.
Устойчивые каллусы, полученные в результате скрининга, переносили на культуральную среду MS для дифференцировки (4,3 г/л солей MS, витаминов MS, 300 мг/л казеина, 30 г/л сахарозы, 2 мг/л 6-бензиладенина, 50 мг/л гигромицина и 3 г/л фитогеля, рН 5,8) и культивировали при 25°С для дифференцировки. Дифференцированные проростки переносили на культуральную среду MS для укоренения (2,15 г/л солей MS, витаминов MS, 300 мг/л казеина, 30 г/л сахарозы, 1 мг/л индол-3-уксусной кислоты и 3 г/л фитогеля, рН 5,8), культивировали при 25°С до достижения высоты примерно 10 см и переносили в теплицу для культивирования до плодоношения. В теплице растения культивировали при 28°С в течение 16 часов и затем культивировали при 20°С в течение 8 часов каждые сутки.
Пример 8. Получение трансгенных растений сои
Согласно обычно используемому способу инфицирования Agrobacterium, ткани семядольного узла сорта сои Zhonghuang13, культивированные в стерильных условиях, совместно культивировали с трансформированной Agrobacterium в Примере 6, таким образом, чтобы перенести Т-ДНК (содержащую нуклеотидную последовательность RX, последовательность промотора гена вируса мозаики цветной капусты 35S, ген Hpt и последовательность терминатора Nos) в рекомбинантных экспрессионных векторах DBNR46312C1-DBNR46312C4, сконструированных в Примере 5, в хромосому сои, получая, таким образом, растения сои с включенной нуклеотидной последовательностью RX (X равен 1-4); между тем, растения сои дикого типа использовали в качестве контроля.
В отношении Agrobacterium-опосредованной трансформации сои, кратко, зрелые семена сои проращивали в культуральной среде для прорастания сои (3,1 г/л солей В5, витаминов В5, 20 г/л сахарозы и 8 г/л агара, рН 5,6), и семена инокулировали на культуральной среде для прорастания и культивировали в условиях температуры 25±1°С; и фотопериода (свет/темнота) 16 ч/8 ч. Спустя 4-6 суток прорастания, брали стерильные проростки сои, набухающие на уровне ярко зеленых семядольных узлов, гипокотили отрезали на уровне 3-4 мм ниже семядольных узлов, семядоли продольно разрезали, и удаляли апикальные почки, латеральные почки и зародышевые корешки. Рану наносили на уровне семядольного узла, используя тупую сторону скальпеля, пораненные ткани семядольного узла приводили в контакт с суспензией Agrobacterium, где Agrobacterium может осуществлять перенос нуклеотидной последовательности RX в пораненные ткани семядольного узла (стадия 1: стадия инфицирования). На данной стадии, ткани семядольного узла предпочтительно погружали в суспензию Agrobacterium (OD660 равна 0,5-0,8, культуральная среда для инфицирования (2,15 г/л солей MS, витаминов В5, 20 г/л сахарозы, 10 г/л глюкозы, 40 мг/л ацетосирингона (AS), 4 г/л 2-морфолиноэтансульфоновой кислоты (MES - от англ. morpholine ethanesulfonic acid) и 2 мг/л зеатина (ZT), рН 5,3)) для инициации инокуляции. Ткани семядольного узла совместно культивировали с Agrobacterium на протяжении периода времени (3 суток) (стадия 2: стадия совместного культивирования). Предпочтительно, ткани семядольного узла культивировали на твердой культуральной среде (4,3 г/л солей MS, витаминов В5, 20 г/л сахарозы, 10 г/л глюкозы, 4 г/л 2-морфолиноэтансульфоновой кислоты (MES), 2 мг/л зеатина и 8 г/л агара, рН 5,6) после стадии инфицирования. После данной стадии совместной культивации может иметь место возможная стадия «восстановления». На данной стадии «восстановления» может быть по меньшей мере один антибиотик (цефалоспорин), который, как известно, ингибирует рост Agrobacterium в культуральной среде для восстановления (3,1 г/л солей В5, витаминов В5, 1 г/л 2-морфолиноэтансульфоновой кислоты (MES), 30 г/л сахарозы, 2 мг/л зеатина (ZT), 8 г/л агара, 150 мг/л цефалоспорина, 100 мг/л глутаминовой кислоты и 100 мг/л аспарагиновой кислоты, рН 5,6), без добавления селективного агента для растительного трансформанта (стадия 3: стадия восстановления). Предпочтительно, тканевые блоки, регенерированные из семядольных узлов, культивировали на твердой культуральной среде с антибиотиком, но без селективного агента, для устранения Agrobacterium и обеспечения стадии восстановления для инфицированных клеток. Затем, тканевые блоки, регенерированные из семядольных узлов, культивировали в культуральной среде, содержащей селективный агент (гигромицин), и проводили селекцию растущих трансформированных каллусов (стадия 4: стадия селекции). Предпочтительно, тканевые блоки, регенерированные из семядольных узлов, культивировали на твердой культуральной среде для осуществления скрининга (3,1 г/л солей В5, витаминов В5, 1 г/л 2-морфолиноэтансульфоновой кислоты (MES), 30 г/л сахарозы, 1 мг/л 6-бензиладенина (6-ВАР), 8 г/л агара, 150 мг/л цефалоспорина, 100 мг/л глутаминовой кислоты, 100 мг/л аспарагиновой кислоты и 50 мг/л гигромицина, рН 5,6) с селективным агентом, что приводило к селективному росту трансформированных клеток. Затем, растения регенерировали из трансформированных клеток (стадия 5: стадия регенерации). Предпочтительно, тканевые блоки, регенерированные из семядольных узлов, выросшие на культуральной среде, содержащей селективный агент, культивировали в твердых культуральных средах (культуральная среда В5 для дифференцировки и культуральная среда В5 для укоренения) для регенерации растений.
Устойчивые тканевые блоки, полученные в результате скрининга, переносили на культуральную среду В5 для дифференцировки (3,1 г/л солей В5, витаминов В5, 1 г/л 2-морфолиноэтансульфоновой кислоты (MES), 30 г/л сахарозы, 1 мг/л зеатина (ZT), 8 г/л агара, 150 мг/л цефалоспорина, 50 мг/л глутаминовой кислоты, 50 мг/л аспарагиновой кислоты, 1 мг/л гиббереллина, 1 мг/л ауксина и 50 мг/л гигромицина, рН 5,6), и культивировали при 25°С для дифференцировки. Дифференцированные проростки переносили на культуральную среду В5 для укоренения (3,1 г/л солей В5, витаминов В5, 1 г/л 2-морфолиноэтансульфоновой кислоты (MES), 30 г/л сахарозы, 8 г/л агара, 150 мг/л цефалоспорина и 1 мг/л индол-3-масляной кислоты (IBA - от англ. indole-3-butyric acid)), культивировали на культуральной среде для укоренения при 25°С до достижения высоты примерно 10 см и переносили в теплицу для культивирования до плодоношения. В теплице растения культивировали при 26°С в течение 16 часов и затем культивировали при 20°С в течение 8 часов каждый день.
Пример 9. Проверка трансгенных растений кукурузы и трансгенных растений сои с использованием TaqMan
Примерно 100 мг листьев из растений кукурузы, в которые вводили нуклеотидную последовательность RX (X равен 1-4), отбирали в качестве образцов. Их геномную ДНК выделяли посредством набора DNeasy Plant Maxi Kit от Qiagen, соответственно, и число копий гена Hpt выявляли методом флуоресцентной количественной ПЦР с зондом Taqman таким образом, чтобы определить число копий нуклеотидной последовательности RX. В то же время, растения кукурузы дикого типа использовали в качестве контроля и выявляли и анализировали в соответствии с упомянутым выше методом. Для данных экспериментов устанавливали три повторности и усредняли.
Конкретный способ выявления числа копий гена Hpt выглядел следующим образом:
Стадия 901. 100 мг листьев от растений кукурузы, в которые включали нуклеотидную последовательность RX, и растений кукурузы дикого типа, соответственно, брали, измельчали в гомогенат в ступке с жидким азотом, и брали три повторности для каждого образца;
Стадия 902. Геномную ДНК упомянутых выше образцов выделяли, используя набор DNeasy Plant Mini Kit от Qiagen, и конкретный способ может относиться к его инструкции по применению;
Стадия 903. Концентрации геномной ДНК упомянутых выше образцов выявляли с использованием NanoDrop 2000 (Thermo Scientific);
Стадия 904. Концентрации геномных ДНК упомянутых выше образцов доводили до единообразного значения концентрации, которое находится в интервале от 80 до 100 нг/мкл;
Стадия 905. Числа копий образцов идентифицировали, используя метод флуоресцентной количественной ПЦР с зондом Taqman, где образцы, для которых было идентифицировано и известно число копий, брали в качестве стандартов, образцы растений кукурузы дикого типа брали в качестве контроля, и три повторности брали для каждого образца и усредняли; последовательности праймеров и зонда для флуоресцентной количественной ПЦР, соответственно, выглядели следующим образом:
Следующие праймеры и зонд использовали для выявления нуклеотидной последовательности Hpt:
Праймер 1: cagggtgtcacgttgcaaga, как показано в SEQ ID NO: 12 перечня последовательностей;
Праймер 2: ccgctcgtctggctaagatc, как показано в SEQ ID NO: 13 перечня последовательностей;
Зонд 1: tgcctgaaaccgaactgcccgctg, как показано в SEQ ID NO: 14 перечня последовательностей;
Реакционная система ПЦР:
| JumpStart ™TaqReadyMix ™ (Sigma) | 10 мкл |
| 50х смесь праймеров/зонда | 1 мкл |
| геномная ДНК | 3 мкл |
| вода (ddH2O) | 6 мкл |
50х смесь праймеров/зонда содержит 45 мкл каждого праймера в концентрации 1 мМ, 50 мкл зонда в концентрации 100 мкМ и 860 мкл буфера 1хТЕ, и хранилась при 4°С в центрифужной пробирке.
Условия реакции ПЦР:
Данные анализировали, используя программное обеспечение SDS2. 3 (Applied Biosystems).
Посредством анализа результатов экспериментов числа копий гена Hpt, было дополнительно продемонстрировано то, была ли нуклеотидная последовательность RX, соответственно, включена в хромосому выявляемых растений кукурузы, и приводили ли растения кукурузы, в которые была включена нуклеотидная последовательность RX (X равен 1-4), к получению трансгенных растений кукурузы с одной копией.
Согласно упомянутому выше способу проверки трансгенных растений кукурузы с использованием TaqMan, трансгенные растений сои выявляли и анализировали. Было дополнительно продемонстрировано, посредством анализа результатов экспериментов по числу копий гена Hpt, что нуклеотидная последовательность RX была включена в хромосомы выявляемых растений сои, и данные растения сои, в которые была включена нуклеотидная последовательность RX (X равен 1-4), приводили к получению трансгенных растений сои с одной копией.
Пример 10. Идентификация инсектицидного действия трансгенной кукурузы на Monolepta hieroglyphica (Motschulsky)
Выявляли инсектицидное действие против Monolepta hieroglyphica (Motschulsky) растений кукурузы, в которые была включена нуклеотидная последовательность RX (X равен 1-4).
Стадия 1001. Выбирали десять линий событий трансформации кукурузы (RX-М) DBNR46312C1-DBNR46312C4, каждую из которых идентифицировали как позитивную одиночную копию посредством taqman, и три линии событий трансформации кукурузы (NGM1), которых идентифицировали как негативные посредством taqman; при этом, растений кукурузы дикого типа использовали в качестве контроля (CK1); и растения выращивали в теплице до стадии третьего листа;
Стадия 1002. Брали материалы стадии 1001, и с каждого проростка брали третий молодой лист и нарезали до размера 1×2 см листа, в котором удаляли главную жилку, и укладывали и помещали в чашку для культивирования с уложенной на ней влажной фильтровальной бумагой;
Стадия 1003. 10 свежевыведенных личинок Monolepta hieroglyphica (Motschulsky) с периодом выведения не больше чем 24 ч, помещали в каждую чашку, крышки чашек плотно покрывали содержимое, чашки для культивирования помещали в бокс для биологических анализов с влажным кусочком марли, уложенным на его дне, и данный бокс для биологических анализов помещали в камеру для биологических анализов при температуре 24±2°С, Т/С (темнота/свет) 24/0 и влажности 70%-80%;
Стадия 1004. С учетом того, что свежевыведенные личинки Monolepta hieroglyphica (Motschulsky) являются маленькими и слабыми, и, безусловно, страдают от механических повреждений, чашки для культивирования лучше было хранить неподвижными в те сутки, когда насекомые инкубировались, и 1 сутки после инкубации;
Стадия 1005. Начиная с суток 2 после инкубации насекомых, число выживших Monolepta hieroglyphica (Motschulsky) подсчитывали снаружи чашек для культивирования каждые сутки до конца суток 16; насекомых Monolepta hieroglyphica (Motschulsky), выживших в чашках для культивирования, переносили в чашки для культивирования, наполненные свежими листьями каждые двое суток, и результаты экспериментов показаны в Таблице 4.
Результаты экспериментов в Таблице 4 показали, что растения кукурузы, в которые включали нуклеотидную последовательность RX (X равен 1-4), оказывали хорошее ингибирующее действие на Monolepta hieroglyphica (Motschulsky), и коэффициент выживаемости (коэффициент выживаемости = число выживших/анализируемое число) Monolepta hieroglyphica (Motschulsky) составлял примерно 40% в сутки 16.
Пример 11. Идентификация инсектицидного действия трансгенной сои на Monolepta hieroglyphica (Motschulsky)
Выявляли инсектицидное действие против Monolepta hieroglyphica растений сои, в которые включали нуклеотидную последовательность RX (X равен 1-4).
Стадия 1101. Выбирали десять линий событий трансформации сои DBNR46312C1-DBNR46312C4 (RX-S), каждую из которых идентифицировали как позитивную одиночную копию посредством taqman, и три линии событий трансформации сои (NGM2), которые идентифицировали как негативные посредством taqman; при этом, растения сои дикого типа использовали в качестве контроля (CK2); и растения выращивали в теплице до тех пор, пока не вырастут тройчатосложные листья;
Стадия 1102. Брали материалы стадии 1101, и с каждого проростка брали кусочек тройчатосложного листа размером примерно 2×2 см и укладывали и помешали в чашку для культивирования с уложенной на ней влажной фильтровальной бумагой;
Стадия 1103. В каждую чашку помещали 15 свежевыведенных личинок Monolepta hieroglyphica (Motschulsky) со временем выведения не больше чем 24 ч, крышки чашек плотно покрывали содержимое, чашки для культуры помещали в бокс для биологических анализов с влажным кусочком марли, уложенным на его дне, и бокс для биологических анализов помещали в камеру для биологических анализов при температуре 24±2°С, Т/С 24/0 и влажности 70%-80%;
Стадия 1104. С учетом того, что свежевыведенные личинки Monolepta hieroglyphica (Motschulsky) являются маленькими и слабыми и, безусловно, страдают от механических повреждений, чашки для культуры было лучше держать неподвижными в сутки, когда насекомых инкубировали, и 1 сутки после инкубации;
Стадия 1105. Начиная с суток 2 после инкубации насекомых, число выживших Monolepta hieroglyphica (Motschulsky) подсчитывали снаружи чашек для культивирования каждые сутки до конца суток 16; насекомых Monolepta hieroglyphica (Motschulsky), выживших в чашках для культивирования, переносили в чашки для культивирования, наполненные свежими листьями, каждые двое суток, и результаты экспериментов показаны в Таблице 5.
Результаты экспериментов в Таблице 5 показали, что растения сои, в которые включали нуклеотидную последовательность RX (X равен 1-4), оказывали хорошее ингибирующее действие на Monolepta hieroglyphica (Motschulsky), и коэффициент выживаемости (коэффициент выживаемости = число выживших/анализируемое число) Monolepta hieroglyphica (Motschulsky) составлял вплоть до 50% в сутки 16.
Пример 12. Композиция
Формула приемлемого в области сельского хозяйства вектора-носителя для дцРНК (система 1 л): 50 мМ NaHPO4 (рН 7,0), 10 мМ β-меркаптоэтанола, 10 мМ ЭДТА, гексадецилсульфонат натрия с массовой долей 0,1% и полиэтиленгликоля октилфениловый эфир с массовой долей 0,1%, довести до 1 л с помощью H2O.
Упомянутая выше формула представляла собой формулу на основе буфера, при условии, что любую очищенную дцРНК непосредственно добавляют к буферу таким образом, чтобы конечная концентрация удовлетворяла требованиям, таким как 50 мг/л. Формула может также быть приготовлена в виде концентрированного препарата, при желании.
В заключение, в настоящем изобретении впервые раскрыт ген-мишень с46312 и его последовательность-мишень для осуществления контроля над насекомым-вредителем Coleoptera, Monolepta hieroglyphica (Motschulsky), и трансгенные растения (кукуруза и соя), полученные посредством использования технологии РНКи. Трансгенные растения контролируют нашествие Monolepta hieroglyphica (Motschulsky) эффективно и специфично за счет введения последовательностей дцРНК, образованных из последовательностей-мишеней, и Monolepta hieroglyphica (Motschulsky) может лишиться возможности аналогичного риска развития устойчивости к белковым Bt-токсинам, с преимуществами, заключающимися в хорошей совместимости с окружающей средой, удобстве и низкой стоимости.
Наконец, следует отметить, что приведенные выше примеры используются только для иллюстрации, а не ограничения технического решения настоящего изобретения; и, несмотря на то, что настоящее изобретение подробно проиллюстрировано со ссылкой на предпочтительные примеры, специалист в данной области должен понимать, что модификации или эквивалентные замены могут быть сделаны в отношении технического решения настоящего изобретения без отступления от сущности и объема технического решения настоящего изобретения.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> BEIJING DABEINONG BIOTECHNOLOGY CO., LTD.
<120> ПОЛИНУКЛЕОТИД И СПОСОБ ДЛЯ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ КОНТРОЛЯ НАД ПОРАЖЕНИЕМ
НАСЕКОМЫМИ
<130> FP1190318P
<160> 17
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1009
<212> ДНК
<213> Monolepta hieroglyphica
<400> 1
atgtcgtcaa acatacaaaa agcccagcaa ctaatggctg aggcagaaaa gaaggtttct 60
tcaagaggat tctttggctc tttgtttggt ggctcaagtc gaattgaaga tgctgtagaa 120
tgttaccaaa gggctgcaaa cctcttcaaa atggccaaga gttgggatgc tgcaggaaag 180
gcattctgtg aagcagccaa cctgcatgct agaagtggtg ctcgtcatga tgctgccaca 240
aactatgttg atgcagcaaa ttgttataaa aaggctgata taagtgaggc tgtaaactgt 300
ttgataaaag ccatagacat ttacactgag atgggtcgct tcactatggc tgcaaaacat 360
caccaaacta ttgcagaaat gtatgagact gatgctgtcg acctagagag agctgtgcaa 420
cactatgagc aagctgctga ctacttcaga ggggaggaaa gcaattcctc cgctaataaa 480
tgccttctga aagtggccca atatgcagcc caacttgaaa attatgaaaa agcaatacag 540
atctaccaag aagtggctta ttccgccctc gaaagctccc tcttgaagta cagtgctaaa 600
gaatatttgt ttagagctgc cctttgtcac ctttgtgttg atgtactcaa tgcccaacat 660
gccatagaaa gttatatcca aaggtatccg gcatttcaag attctcgtga atataaactt 720
ttgaaaacgc ttatagaaca cattgaggaa caaaatgtcg atggctacac agatgcagtg 780
aaagactatg attccatttc tcgcctggat caatggtata caacaattct tttacgtatt 840
aaaaaacaac tcaacgagag ccccgacttg cgctaaattg tatttattgg aattccttat 900
tgttcatatt tgttacgtgt tataataaaa gacccatagt ttatttattg ttgaattatt 960
agttaaattt tttatgtctt atgcataaaa gttatttggt ctggagata 1009
<210> 2
<211> 291
<212> ПРТ
<213> Monolepta hieroglyphica
<400> 2
Met Ser Ser Asn Ile Gln Lys Ala Gln Gln Leu Met Ala Glu Ala Glu
1 5 10 15
Lys Lys Val Ser Ser Arg Gly Phe Phe Gly Ser Leu Phe Gly Gly Ser
20 25 30
Ser Arg Ile Glu Asp Ala Val Glu Cys Tyr Gln Arg Ala Ala Asn Leu
35 40 45
Phe Lys Met Ala Lys Ser Trp Asp Ala Ala Gly Lys Ala Phe Cys Glu
50 55 60
Ala Ala Asn Leu His Ala Arg Ser Gly Ala Arg His Asp Ala Ala Thr
65 70 75 80
Asn Tyr Val Asp Ala Ala Asn Cys Tyr Lys Lys Ala Asp Ile Ser Glu
85 90 95
Ala Val Asn Cys Leu Ile Lys Ala Ile Asp Ile Tyr Thr Glu Met Gly
100 105 110
Arg Phe Thr Met Ala Ala Lys His His Gln Thr Ile Ala Glu Met Tyr
115 120 125
Glu Thr Asp Ala Val Asp Leu Glu Arg Ala Val Gln His Tyr Glu Gln
130 135 140
Ala Ala Asp Tyr Phe Arg Gly Glu Glu Ser Asn Ser Ser Ala Asn Lys
145 150 155 160
Cys Leu Leu Lys Val Ala Gln Tyr Ala Ala Gln Leu Glu Asn Tyr Glu
165 170 175
Lys Ala Ile Gln Ile Tyr Gln Glu Val Ala Tyr Ser Ala Leu Glu Ser
180 185 190
Ser Leu Leu Lys Tyr Ser Ala Lys Glu Tyr Leu Phe Arg Ala Ala Leu
195 200 205
Cys His Leu Cys Val Asp Val Leu Asn Ala Gln His Ala Ile Glu Ser
210 215 220
Tyr Ile Gln Arg Tyr Pro Ala Phe Gln Asp Ser Arg Glu Tyr Lys Leu
225 230 235 240
Leu Lys Thr Leu Ile Glu His Ile Glu Glu Gln Asn Val Asp Gly Tyr
245 250 255
Thr Asp Ala Val Lys Asp Tyr Asp Ser Ile Ser Arg Leu Asp Gln Trp
260 265 270
Tyr Thr Thr Ile Leu Leu Arg Ile Lys Lys Gln Leu Asn Glu Ser Pro
275 280 285
Asp Leu Arg
290
<210> 3
<211> 541
<212> ДНК
<213> Monolepta hieroglyphica
<400> 3
gatgggtcgc ttcactatgg ctgcaaaaca tcaccaaact attgcagaaa tgtatgagac 60
tgatgctgtc gacctagaga gagctgtgca acactatgag caagctgctg actacttcag 120
aggggaggaa agcaattcct ccgctaataa atgccttctg aaagtggccc aatatgcagc 180
ccaacttgaa aattatgaaa aagcaataca gatctaccaa gaagtggctt attccgccct 240
cgaaagctcc ctcttgaagt acagtgctaa agaatatttg tttagagctg ccctttgtca 300
cctttgtgtt gatgtactca atgcccaaca tgccatagaa agttatatcc aaaggtatcc 360
ggcatttcaa gattctcgtg aatataaact tttgaaaacg cttatagaac acattgagga 420
acaaaatgtc gatggctaca cagatgcagt gaaagactat gattccattt ctcgcctgga 480
tcaatggtat acaacaattc ttttacgtat taaaaaacaa ctcaacgaga gccccgactt 540
g 541
<210> 4
<211> 308
<212> ДНК
<213> Monolepta hieroglyphica
<400> 4
gcccagcaac taatggctga ggcagaaaag aaggtttctt caagaggatt ctttggctct 60
ttgtttggtg gctcaagtcg aattgaagat gctgtagaat gttaccaaag ggctgcaaac 120
ctcttcaaaa tggccaagag ttgggatgct gcaggaaagg cattctgtga agcagccaac 180
ctgcatgcta gaagtggtgc tcgtcatgat gctgccacaa actatgttga tgcagcaaat 240
tgttataaaa aggctgatat aagtgaggct gtaaactgtt tgataaaagc catagacatt 300
tacactga 308
<210> 5
<211> 123
<212> ДНК
<213> Monolepta hieroglyphica
<400> 5
catgatgctg ccacaaacta tgttgatgca gcaaattgtt ataaaaaggc tgatataagt 60
gaggctgtaa actgtttgat aaaagccata gacatttaca ctgagatggg tcgcttcact 120
atg 123
<210> 6
<211> 373
<212> ДНК
<213> Monolepta hieroglyphica
<400> 6
ctattgcaga aatgtatgag actgatgctg tcgacctaga gagagctgtg caacactatg 60
agcaagctgc tgactacttc agaggggagg aaagcaattc ctccgctaat aaatgccttc 120
tgaaagtggc ccaatatgca gcccaacttg aaaattatga aaaagcaata cagatctacc 180
aagaagtggc ttattccgcc ctcgaaagct ccctcttgaa gtacagtgct aaagaatatt 240
tgtttagagc tgccctttgt cacctttgtg ttgatgtact caatgcccaa catgccatag 300
aaagttatat ccaaaggtat ccggcatttc aagattctcg tgaatataaa cttttgaaaa 360
cgcttataga aca 373
<210> 7
<211> 328
<212> ДНК
<213> Вирус мозаики цветной капусты
<400> 7
ccattgccca gctatctgtc actttattgt gaagatagtg gaaaaggaag gtggctccta 60
caaatgccat cattgcgata aaggaaaggc catcgttgaa gatgcctctg ccgacagtgg 120
tcccaaagat ggacccccac ccacgaggag catcgtggaa aaagaagacg ttccaaccac 180
gtcttcaaag caagtggatt gatgtgatat ctccactgac gtaagggatg acgcacaatc 240
ccactatcct tcgcaagacc cttcctctat ataaggaagt tcatttcatt tggagaggac 300
acgctgacaa gctgactcta gcagatct 328
<210> 8
<211> 1232
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность - нуклеотидная последовательность R1
<400> 8
gatgggtcgc ttcactatgg ctgcaaaaca tcaccaaact attgcagaaa tgtatgagac 60
tgatgctgtc gacctagaga gagctgtgca acactatgag caagctgctg actacttcag 120
aggggaggaa agcaattcct ccgctaataa atgccttctg aaagtggccc aatatgcagc 180
ccaacttgaa aattatgaaa aagcaataca gatctaccaa gaagtggctt attccgccct 240
cgaaagctcc ctcttgaagt acagtgctaa agaatatttg tttagagctg ccctttgtca 300
cctttgtgtt gatgtactca atgcccaaca tgccatagaa agttatatcc aaaggtatcc 360
ggcatttcaa gattctcgtg aatataaact tttgaaaacg cttatagaac acattgagga 420
acaaaatgtc gatggctaca cagatgcagt gaaagactat gattccattt ctcgcctgga 480
tcaatggtat acaacaattc ttttacgtat taaaaaacaa ctcaacgaga gccccgactt 540
gaagtactgc gatcgcgtta acgctttatc acgatacctt ctaccacata tcactaacaa 600
catcaacact catcactctc gacgacatcc actcgatcac tactctcaca cgaccgatta 660
actcctcatc cacgcggccg cctgcaggag ccaagtcggg gctctcgttg agttgttttt 720
taatacgtaa aagaattgtt gtataccatt gatccaggcg agaaatggaa tcatagtctt 780
tcactgcatc tgtgtagcca tcgacatttt gttcctcaat gtgttctata agcgttttca 840
aaagtttata ttcacgagaa tcttgaaatg ccggatacct ttggatataa ctttctatgg 900
catgttgggc attgagtaca tcaacacaaa ggtgacaaag ggcagctcta aacaaatatt 960
ctttagcact gtacttcaag agggagcttt cgagggcgga ataagccact tcttggtaga 1020
tctgtattgc tttttcataa ttttcaagtt gggctgcata ttgggccact ttcagaaggc 1080
atttattagc ggaggaattg ctttcctccc ctctgaagta gtcagcagct tgctcatagt 1140
gttgcacagc tctctctagg tcgacagcat cagtctcata catttctgca atagtttggt 1200
gatgttttgc agccatagtg aagcgaccca tc 1232
<210> 9
<211> 150
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность - спейсерная последовательность
<400> 9
aagtactgcg atcgcgttaa cgctttatca cgataccttc taccacatat cactaacaac 60
atcaacactc atcactctcg acgacatcca ctcgatcact actctcacac gaccgattaa 120
ctcctcatcc acgcggccgc ctgcaggagc 150
<210> 10
<211> 253
<212> ДНК
<213> Agrobacterium tumefaciens
<400> 10
gatcgttcaa acatttggca ataaagtttc ttaagattga atcctgttgc cggtcttgcg 60
atgattatca tataatttct gttgaattac gttaagcatg taataattaa catgtaatgc 120
atgacgttat ttatgagatg ggtttttatg attagagtcc cgcaattata catttaatac 180
gcgatagaaa acaaaatata gcgcgcaaac taggataaat tatcgcgcgc ggtgtcatct 240
atgttactag atc 253
<210> 11
<211> 1026
<212> ДНК
<213> Salmonella enterica
<400> 11
atgaaaaagc ctgaactcac cgcgacgtct gtcgagaagt ttctgatcga aaagttcgac 60
agcgtctccg acctgatgca gctctcggag ggcgaagaat ctcgtgcttt cagcttcgat 120
gtaggagggc gtggatatgt cctgcgggta aatagctgcg ccgatggttt ctacaaagat 180
cgttatgttt atcggcactt tgcatcggcc gcgctcccga ttccggaagt gcttgacatt 240
ggggaattca gcgagagcct gacctattgc atctcccgcc gtgcacaggg tgtcacgttg 300
caagacctgc ctgaaaccga actgcccgct gttctgcagc cggtcgcgga ggccatggat 360
gcgatcgctg cggccgatct tagccagacg agcgggttcg gcccattcgg accgcaagga 420
atcggtcaat acactacatg gcgtgatttc atatgcgcga ttgctgatcc ccatgtgtat 480
cactggcaaa ctgtgatgga cgacaccgtc agtgcgtccg tcgcgcaggc tctcgatgag 540
ctgatgcttt gggccgagga ctgccccgaa gtccggcacc tcgtgcacgc ggatttcggc 600
tccaacaatg tcctgacgga caatggccgc ataacagcgg tcattgactg gagcgaggcg 660
atgttcgggg attcccaata cgaggtcgcc aacatcttct tctggaggcc gtggttggct 720
tgtatggagc agcagacgcg ctacttcgag cggaggcatc cggagcttgc aggatcgccg 780
cggctccggg cgtatatgct ccgcattggt cttgaccaac tctatcagag cttggttgac 840
ggcaatttcg atgatgcagc ttgggcgcag ggtcgatgcg acgcaatcgt ccgatccgga 900
gccgggactg tcgggcgtac acaaatcgcc cgcagaagcg cggccgtctg gaccgatggc 960
tgtgtagaag tactcgccga tagtggaaac cgacgcccca gcactcgtcc gagggcaaag 1020
gaatag 1026
<210> 12
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность - праймер 1
<400> 12
cagggtgtca cgttgcaaga 20
<210> 13
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность - праймер 2
<400> 13
ccgctcgtct ggctaagatc 20
<210> 14
<211> 24
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность - зонд
<400> 14
tgcctgaaac cgaactgccc gctg 24
<210> 15
<211> 334
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность - нерелевантная дцРНК
<400> 15
ggaaatcgcc actgctaaga aaaatggaca gaaaaataag agagcggcac ttcaagcact 60
caagcggaag aagcggtatg agaaacagtt gcagcagatt gatggaacat tatcaactat 120
tgaaatgcag agagaagctt tagagggtgc caacactaat acagctgttc tcacaacaat 180
gaaagatgct gcggacgccc tcaaagctgc tcacaaacac atggatgtcg atcaagttca 240
tgatatgatg gatgacattg ccgaacagca agatgtagct agagaaattt ctgatgccat 300
atccaaccca gttgcatttg gtcatgatat tgat 334
<210> 16
<211> 541
<212> ДНК
<213> Monolepta hieroglyphica
<400> 16
atttgttgat actagtggta gacataaaca agaagaatca ctatttgaag aaatgttggc 60
agtttctaat gctgtgagac cagataatat tattttcgtt atggatgcaa ctattggtca 120
agcttgtgag tctcaggcta aagctttcaa agaaaaggta gatgtaggct ctgtaattat 180
aacaaaatta gatggacatg caaaaggagg tggtgcactc agtgctgtgg cagccactaa 240
cagtcctatt atattcattg gtacaggaga acatatagat gacttagaac cttttaaaac 300
aaaacctttc attagtaaat tattaggaat gggtgatata gaaggtttaa ttgataaagt 360
aaacgaatta aagttagagg ataatgaaga attgttagaa aaaattaaac atgggcaatt 420
cacactcaga gacatgtatg aacagttcca aaatattatg aaaatgggac ctttctcaca 480
aataatggga atgatccctg gatttagcca agatttcatg tcaaaaggaa gtgaacaaga 540
a 541
<210> 17
<211> 394
<212> ДНК
<213> Monolepta hieroglyphica
<400> 17
aataatggac agtatgaatg attatgaatt agataaccga gatggtgcaa aattatttac 60
aaagcaaaat ggtagagtta ttagagttgc acaagggtct ggtgttacag aaagagaagt 120
aaaagatttg atcacgcaat acacgaagtt tgccgccgta gtaaagaaaa tgggcggcat 180
aaagggtctt tttaaaggcg gcgatatggc taaaaatgtc aatcacaacc aaatggccaa 240
acttaatcaa caaatggcca agatgatgga tcctcgagtg cttcagcaaa tgggcggcat 300
ggctggatta cagaacatga tgagacagct acaagcgggc gcggcaggag gcttgggagg 360
tttgggtaac cttatgggtg gttttggagg gaaa 394
1
<---
1. Выделенный полинуклеотид для ингибирования роста насекомого-вредителя Monolepta hieroglyphica, содержащий полинуклеотидную последовательность, выбранную из:
(a) полинуклеотидной последовательности, как показано в SEQ ID NO: 1; или
(b) полинуклеотидной последовательности из по меньшей мере 123 последовательных нуклеотидов SEQ ID NO: 1, где двухцепочечная РНК, содержащая по меньшей мере одну цепь, комплементарную полинуклеотидной последовательности, при поглощении насекомым-вредителем Monolepta hieroglyphica, ингибирует рост данного насекомого-вредителя Monolepta hieroglyphica; или
(с) любой из полинуклеотидных последовательностей, как показано в SEQ ID NO: 3 - SEQ ID NO: 6; или
(d) полинуклеотидной последовательности, которая гибридизуется с полинуклеотидной последовательностью, как определено в любом из упомянутых выше (a)-(с), в жестких условиях.
2. Полинуклеотид по п. 1, отличающийся тем, что указанный полинуклеотид дополнительно содержит комплементарную последовательность полинуклеотидной последовательности, как определено в любом из (a)-(с) в п. 1.
3. Экспрессионная кассета, содержащая полинуклеотид по любому из пп. 1, 2.
4. Экспрессионный вектор, содержащий полинуклеотид по любому из пп. 1, 2.
5. Применение полинуклеотида по любому из пп. 1, 2 для препятствования экспрессии последовательности-мишени в насекомом-вредителе Monolepta hieroglyphica или ингибирования роста насекомого-вредителя Monolepta hieroglyphica.
6. Рибонуклеиновая кислота, отличающаяся тем, что указанная рибонуклеиновая кислота действует, осуществляя понижающую регуляцию экспрессии по меньшей мере одного гена-мишени в насекомом-вредителе Monolepta hieroglyphica после поглощения насекомым-вредителем, причем указанная рибонуклеиновая кислота содержит по меньшей мере один сайленсирующий элемент, где указанный сайленсирующий элемент представляет собой область двухцепочечной РНК, содержащую комплементарные цепи, которые отожжены и из которых одна цепь содержит или состоит из последовательности по меньшей мере 15, 17, 19 или 21 последовательных нуклеотидов, комплементарной или по меньшей мере частично комплементарной последовательности-мишени в гене-мишени, при этом указанный ген-мишень представляет собой полинуклеотидную последовательность как показано в SEQ ID NO: 1, где указанная последовательность-мишень выбрана из:
(а) полинуклеотидной последовательности из по меньшей мере 123 последовательных нуклеотидов SEQ ID NO: 1; и
(b) любой из полинуклеотидных последовательностей, как показано в SEQ ID NO: 3 -SEQ ID NO: 6.
7. Рибонуклеиновая кислота по п. 6, отличающаяся тем, что указанная рибонуклеиновая кислота содержит по меньшей мере два сайленсирующих элемента, каждый из которых содержит или состоит из нуклеотидной последовательности, по меньшей мере частично комплементарной последовательности-мишени в гене-мишени;
предпочтительно, отличающаяся тем, что каждый из сайленсирующих элементов содержит или состоит из отличной нуклеотидной последовательности, комплементарной отличной последовательности-мишени;
предпочтительно, отличающаяся тем, что указанная отличная последовательность-мишень происходит из одного гена-мишени или из гена-мишени, отличного от указанного гена-мишени;
предпочтительно, отличающаяся тем, что ген-мишень, отличный от гена-мишени, происходит из того же насекомого-вредителя отряда Coleoptera или отличного насекомого-вредителя отряда Coleoptera;
предпочтительно, отличающаяся тем, что насекомое-вредитель отряда Coleoptera представляет собой Monolepta hieroglyphica (Motschulsky).
8. Рибонуклеиновая кислота по п. 6 или 7, отличающаяся тем, что указанная рибонуклеиновая кислота дополнительно содержит спейсерную последовательность; предпочтительно, отличающаяся тем, что указанная спейсерная последовательность представляет собой SEQ ID NO: 9.
9. Композиция для подавления нашествия насекомого-вредителя Monolepta hieroglyphica, отличающаяся тем, что содержит по меньшей мере одну из рибонуклеиновых кислот по любому из пп. 6-8 или клетку-хозяина, экспрессирующую или способную экспрессировать рибонуклеиновую кислоту по любому из пп. 6-8, и по меньшей мере один подходящий носитель, вспомогательное вещество или разбавитель;
предпочтительно, отличающаяся тем, что указанная клетка-хозяин представляет собой бактериальную клетку.
10. Композиция для подавления нашествия насекомого-вредителя Monolepta hieroglyphica по п. 9, отличающаяся тем, что указанная композиция представляет собой твердое вещество, жидкость или гель;
предпочтительно, отличающаяся тем, что указанная композиция представляет собой инсектицидный спрей.
11. Композиция для подавления нашествия насекомого-вредителя Monolepta hieroglyphica по п. 9 или 10, отличающаяся тем, что указанная композиция дополнительно содержит по меньшей мере один пестицид, причем указанный пестицид представляет собой химический пестицид, белок, специфичный к клубню картофеля, инсектицидный белок Bacillus thuringiensis, инсектицидный белок Xenorhabdus ehlersii, инсектицидный белок Photorhabdus, инсектицидный белок Bacillus laterosporus или инсектицидный белок Bacillus sphaericus.
12. Применение композиции для подавления нашествия насекомого-вредителя Monolepta hieroglyphica (Motschulsky) по любому из пп. 9-11 для предотвращения нашествия насекомого-вредителя Monolepta hieroglyphica (Motschulsky).
13. Способ подавления нашествия насекомого-вредителя Monolepta hieroglyphica, отличающийся тем, что указанный способ включает приведение насекомого-вредителя Monolepta hieroglyphica в контакт с эффективным количеством по меньшей мере одной из рибонуклеиновых кислот по любому из пп. 6-8.
14. Способ повышения устойчивости растения к насекомому Monolepta hieroglyphica, получения растения, способного осуществлять контроль над насекомым-вредителем Monolepta hieroglyphica, или защиты растения от повреждения, вызываемого насекомым-вредителем Monolepta hieroglyphica, отличающийся тем, что указанный способ включает введение полинуклеотида по любому из пп. 1, 2, экспрессионной кассеты по п. 3 или экспрессионного вектора по п. 4 или рибонуклеиновой кислоты по любому из пп. 6-8, в растение, причем растение, в которое осуществляют указанное введение, оказывает ингибирующее воздействие на рост насекомого-вредителя Monolepta hieroglyphica при поглощении указанного растения насекомым-вредителем Monolepta hieroglyphica.
15. Способ по п. 13 или 14, отличающийся тем, что растение представляет собой сою, пшеницу, ячмень, кукурузу, табак, рис, рапс, хлопок или подсолнечники.
