Соль производного фенилпропионамида и способ ее получения

Группа изобретений относится к фармацевтической химии и включает фармацевтически приемлемую соль соединения формулы (I), способы ее получения, фармацевтическую композицию на ее основе и применение соли в изготовлении лекарственного средства. Фармацевтически приемлемая соль представляет собой ацетат, гидрохлорид, фосфат, цитрат, бензоат или фумарат соединения формулы (I). Технический результат - ацетат, гидрохлорид, фосфат, цитрат, бензоат или фумарат 4-амино-1-((2R,5R,8R,14R)-2-(4-аминобутил)-8-бензил-5-изобутил-4,7,10-триоксо-14-фенил-3,6,9,12-тетраазапентадекан-1-ацил)пиперидин-4-карбоновой кислоты, обладающие свойствами агониста κ-опиоидного рецептора. 5 н. и 7 з.п. ф-лы, 1 ил., 2 табл., 3 пр.

 

[1] Настоящая заявка испрашивает приоритет по заявке на патент Китая CN 201711272474.1, поданной 6 декабря 2017 г. Содержание заявки на патент Китая полностью включено в данный документ посредством ссылки.

Область техники, к которой относится изобретение

[2] Настоящее изобретение относится к соли 4-амино-1-((2R,5R,8R,14R)-2-(4-аминобутил)-8-бензил-5-изобутил-4,7,10-триоксо-14-фенил-3,6,9,12-тетраазапентадекан-1-ацил)пиперидин-4-карбоновой кислоты и способу ее получения, а также ее применению в качестве агониста κ-опиоидного рецептора (KOR-рецептора) и ее применению в изготовлении лекарственного препарата для лечения и/или предупреждения боли и связанных с болью заболеваний.

Уровень техники

[3] Опиоидный рецептор является разновидностью важного рецептора, сопряженного с G-белком, который является мишенью для комбинации эндогенных опиоидных пептидов и опиоидных медицинских препаратов, при этом активация опиоидного рецептора оказывает регулирующий эффект на возбужденный системный иммунитет и эндокринную систему, и опиоидные медицинские препараты в настоящее время являются наиболее сильными и широко применяемыми анальгетиками центрального действия. Эндогенные опиоидные пептиды являются естественно-образующимися опиоидными активными веществами у млекопитающих, в настоящее время хорошо известные эндогенные опиоидные пептиды условно подразделяют на энкефалин, эндорфин, динорфин и неоэндорфин, и в центральной нервной системе присутствуют соответствующие опиоидные рецепторы, а именно, μ-, δ-, κ-рецепторы и т.д.

[4] κ-Опиоидный рецептор (KOR) состоит из 380 аминокислот, и динорфин является его эндогенным лигандом. Он экспрессируется в сенсорных нейронах, ганглионарных клетках задних корешков и окончаниях первичных афферентных нейронов и участвует в типах важной физиологической активности, таких как болевые ощущения, нейроэндокринное, эмоциональное поведение, а также когнитивная деятельность и т.д. KOR также связан с калиевым каналом внутреннего выпрямления и кальциевым ионным каналом N-типа. Агонист KOR может ингибировать (в зависимости от ионов кальция) высвобождение субстанции Р из периферических чувствительных нервных окончаний до травмы и воспаления, что может являться причиной того, что агонист KOR характеризуется противоповреждающим и противовоспалительным эффектами. В дополнение к динорфину различные природные алкалоиды и синтетические лиганды также могут объединяться с KOR. KOR обеспечивает естественный механизм контроля зависимости, поэтому медицинские препараты как агонисты рецепторов имеют потенциал для лечения зависимости от медицинских препаратов.

[5] Медицинские препараты-агонисты KOR включают азимадолин, U-50488 и налоксон; патентные заявки, раскрывающие агонист KOR, включают WO 20071398, WO 2008060552, WO 09932510, WO 2013184794, WO 2014089019, WO 2014184356 и WO 2015065867.

[6] В WO 2017211272 (заявка № PCT/CN2017/087328, дата заявки 2017.06.06) раскрыто соединение-агонист KOR, которое характеризуется очевидным агонистическим эффектом в отношении рецептора h-KOR, хорошими фармакокинетическими свойствами и может облегчать боль, которое характеризуется более выраженными преимуществами, при этом его соединение характеризуется структурой, показанной с помощью формулы (I):

[7] Поскольку растворимость соединения, представленного формулой (I), является низкой, то для дальнейшего улучшения растворимости соединения авторы настоящего изобретения провели исследование образования соли соединения, представленного формулой (I), и при этом исследованные соли включают ацетат, гидрохлорид, фосфат, цитрат, бензоат или фумарат и т.д.; причем растворимость продукта значительно улучшается после образования соли, а также исследовали стабильность соли и другие вопросы, что имеет важное научное значение при лечении боли.

Содержание изобретения

[8] Техническая проблема, подлежащая решению с помощью настоящего изобретения, состоит в том, чтобы обеспечить получение соли 4-амино-1-((2R,5R,8R,14R)-2-(4-аминобутил)-8-бензил-5-изобутил-4,7,10-триоксо-14-фенил-3,6,9,12-тетраазапентадекан-1-ацил)пиперидин-4-карбоновой кислоты, при этом соль характеризуется хорошей стабильностью и может являться лучшей для применения в клинической практике.

[9] Техническое решение по настоящему изобретению заключается в следующем.

[10] Настоящее изобретение предусматривает фармацевтически приемлемую соль соединения 4-амино-1-((2R,5R,8R,14R)-2-(4-аминобутил)-8-бензил-5-изобутил-4,7,10-триоксо-14-фенил-3,6,9,12-тетраазапентадекан-1-ацил)пиперидин-4-карбоновой кислоты, которое представлено формулой (I),

[11] при этом фармацевтически приемлемая соль представляет собой неорганическую соль или органическую соль, предпочтительно ацетат, гидрохлорид, фосфат, цитрат, бензоат или фумарат.

[12] Предпочтительно, молярное соотношение соединения, представленного формулой (I), и кислоты (радикала) в фармацевтически приемлемой если составляет от 1:1 до 1:5, предпочтительно 1:1, 1:2 или 1:3.

[13] Более предпочтительно,

[14] молярное соотношение соединения, представленного формулой (I), и молекул хлорида водорода в фармацевтически приемлемой соли составляет предпочтительно 1:1, 1:2 или 1:3, более предпочтительно 1:3,

[15] молярное соотношение соединения, представленного формулой (I), и молекул фосфорной кислоты составляет предпочтительно 1:3,

[16] молярное соотношение соединения, представленного формулой (I), и молекул лимонной кислоты составляет предпочтительно 1:1, 1:2 или 1:3, более предпочтительно 1:1,

[17] молярное соотношение соединения, представленного формулой (I), и молекул бензойной кислоты составляет предпочтительно 1:2,

[18] молярное соотношение соединения, представленного формулой (I), и молекул фумаровой кислота составляет предпочтительно 1:2.

[19] Настоящее изобретение также предусматривает способ получения фармацевтически приемлемой соли, который включает стадию реакции солеобразования соединения, представленного формулой (I), с соответствующей кислотой.

[20] В способе реакцию солеобразования осуществляют в растворителе, и при этом растворитель предпочтительно представляет собой спиртовой растворитель, растворитель на основе галогенированного углеводорода, эфирный растворитель, растворитель на основе нитрила, смешанный растворитель из спиртового растворителя и эфирного растворителя или смешанный растворитель из растворителя на основе галогенированного углеводорода и эфирного растворителя; причем спиртовой растворитель предпочтительно представляет собой метанол, этанол, изопропанол или н-бутанол, эфирный растворитель предпочтительно представляет собой диэтиловый эфир, метил-трет-бутиловый эфир, изопропиловый эфир или диоксан, растворитель на основе нитрила предпочтительно представляет собой ацетонитрил, и растворитель на основе галогенированного углеводорода предпочтительно представляет собой дихлорметан.

[21] В альтернативном варианте осуществления смешанный растворитель из спиртового растворителя и эфирного растворителя предпочтительно представляет собой смешанный растворитель из этанола/изопропилового эфира или смешанный растворитель из этанола/изопропилового спирта/изопропилового эфира. В другом альтернативном варианте осуществления смешанный растворитель из растворителя на основе галогенированного углеводородного и эфирного растворителя предпочтительно представляет собой смешанный растворитель из дихлорметана/изопропилового эфира.

[22] Предпочтительно, в случае если реакция солеобразования завершена, дополнительно включают стадию добавления антирастворителя, выпаривания растворителя или охлаждения, где антирастворитель предпочтительно представляет собой эфирный растворитель, и эфирный растворитель предпочтительно представляет собой диэтиловый эфир, метил-трет-бутиловый эфир, изопропиловый эфир или диоксан.

[23] Настоящее изобретение также предусматривает способ получения фармацевтически приемлемой соли, где применяется способ превращения соли, предпочтительно превращение трифторацетата в ацетат. В альтернативном варианте осуществления способ превращения соли предусматривает подвергание трифторацетата соединения, представленного формулой (I), высокоэффективной жидкостной хроматографии и элюирование с помощью воды, содержащей уксусную кислоту в качестве элюента, концентрирование и высушивание с получением ацетата соединения, представленного формулой (I).

[24] В способе превращения соли элюент может дополнительно содержать ацетат аммония, ацетонитрил или смесь ацетат аммония/ацетонитрил.

[25] Предпочтительно, объемная доля уксусной кислоты в элюенте составляет 0,1%.

[26] Настоящее изобретение также предусматривает фармацевтическую композицию, содержащую вышеописанную фармацевтически приемлемую соль и, необязательно, фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или наполнитель.

[27] Настоящее изобретение также предусматривает применение соли или фармацевтической композиции в изготовлении лекарственного препарата для предупреждения и/или лечения сопутствующих заболеваний, опосредованных агонистом κ-опиоидного рецептора; при этом заболевание выбрано из группы, состоящей из боли, воспаления, зуда, отека, гипонатриемии, гипокалиемии, кишечной непроходимости, кашля и глаукомы, предпочтительно боли; причем боль предпочтительно выбрана из группы, состоящей из невропатической боли, боли в туловище, висцеральной боли, кожной боли, боли в суставах, боли при камнях в почках, спазма матки, дисменореи, эндометриоза, диспепсии, послеоперационной боли, боли после медицинского лечения, глазной боли, боли вследствие отита, взрывной боли при раке и боли, ассоциированной с расстройством GI-тракта.

Подробное описание предпочтительного варианта осуществления

[28] Если не указано иное, то научные и технические термины, используемые в данном документе в описании и формуле изобретения настоящей заявки, имеют значения, обычно понятные специалистам в данной области. Однако для лучшего понимания настоящего изобретения определения и объяснения некоторых соответствующих терминов приведены ниже. Кроме того, в случае если определение и истолкование терминов, представленных в данной заявке, не соответствуют значению, обычно понятному специалистам в данной области, то определение и истолкование терминов, представленных в данной заявке, будут иметь преимущественную силу.

[29] Термин «галоген», используемый в настоящем изобретении, относится к замещению «атомом галогена», и «атом галогена» относится к атому фтора, атому хлора, атому брома, атому йода и т.д.

[30] Термин «С_1-6алкил», используемый в настоящем изобретении, обозначает линейную или разветвленную алкильную группу, содержащую 1-6 атомов углерода, и конкретные примеры включают без ограничения метил, этил, н-пропил, изо-пропил, н-бутил, изо-бутил, втор-бутил, трет-бутил, н-пентил, изо-пентил, 2-метилбутил, неопентил, 1-этилпропил, н-гексил, изо-гексил, 3-метилпентил, 2-метилпентил, 1-метилпентил, 3,3-диметилбутил, 2,2-диметилбутил, 1,1-диметилбутил, 1,2-диметилбутил, 1,3-диметилбутил, 2,3-диметилбутил, 2-этилбутил, 1,2-диметилпропил и т.п.

[31] Термин «эфирный растворитель», используемый в настоящем изобретении, обозначает соединение с открытой цепью или циклическое соединение, содержащее эфирную связь -О- и 1-10 атомов углерода, при этом конкретные примеры включают без ограничения тетрагидрофуран, диэтиловый эфир, изо-пропиловый эфир, монометиловый эфир пропиленгликоля, метил-трет-бутиловый эфир или 1,4-диоксан.

[32] Термин «спиртовой растворитель», используемый в настоящем изобретении, относится к растворителю, полученному в результате замещения одного или более чем одного из атомов водорода на «С_1-6алкиле» одним или более «гидроксилами (-ОН)», «гидроксилом» и «С_1-6алкилом», которые определены выше, при этом конкретные примеры включают без ограничения метанол, этанол, изо-пропанол, н-пропанол, изо-пентанол или трифторэтанол.

[33] Термин «растворитель на основе нитрила», используемый в настоящем изобретении, относится к растворителю, полученному в результате замещения одного или более чем одного из атомов водорода на «С_1-6алкиле» одним или более «циано (-CN)», «циано» и «С_1-6алкилом», которые определены выше, и конкретные примеры включают без ограничения ацетонитрил или пропионитрил.

[34] Термин «растворитель на основе галогенированного углеводорода», используемый в настоящем изобретении, относится к растворителю, полученному в результате замены одного или более чем одного из атомов водорода на «С_1-6алкиле» одним или более «атомами галогена», «атомом галогена» и «С_1-6алкилом», которые определены выше, и конкретные примеры включают без ограничения метилхлорид, дихлорметан, хлороформ или тетрахлорид углерода.

[35] Термин «смешанный растворитель», используемый в настоящем изобретении, относится к растворителю, полученному путем смешивания одного или более чем одного из различных видов органических растворителей в определенном соотношении, или растворителю, полученному путем смешивания органического растворителя с водой в определенном соотношении; при этом смешанный растворитель предпочтительно представляет собой один или более чем один спирт, смешанный с одним или более чем одним эфиром, или один или более чем один растворитель на основе галогенированного углеводорода, смешанный с одним или более чем одним эфирным растворителем; причем спиртовой растворитель, эфирный растворитель и растворитель на основе галогенированного углеводорода являются такими, как определено выше; при этом определенное соотношение составляет 0,05:1-1:0,05, предпочтительно 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:8, 1:10 или 1:20.

[36] Настоящее изобретение также относится к фармацевтическому препарату, содержащему соль соединения, представленного формулой (I), и необязательно один или более чем один из фармацевтических носителей и/или разбавителей. Фармацевтический препарат может быть превращен в любую фармацевтически приемлемую лекарственную форму. Например, соль или фармацевтический препарат по настоящему изобретению могут быть составлены в виде таблеток, капсул, пилюль, гранул, растворов, суспензий, сиропов, инъекций (включая инъекцию, стерильный порошок для инъекции и концентрированный раствор для инъекции), суппозиториев, ингаляторов или спреев.

[37] Кроме того, фармацевтический препарат по настоящему изобретению также можно применять в отношении пациентов или субъектов, нуждающихся в таком лечении, любым подходящим способом введения, таким как пероральное, парентеральное, ректальное, легочное или местное введение и т.д. В случае перорального введения фармацевтическая композиция может быть составлена в виде препаратов для перорального применения, таких как пероральные твердые препараты, например таблетки, капсулы, пилюли, гранулы и т.д.; или пероральный жидкий препарат, такой как пероральный раствор, суспензия для перорального применения, сироп и т.д. В случае составления в препарат для перорального применения фармацевтический препарат также может содержать подходящие наполнители, связующие вещества, разрыхлители, смазывающие вещества и т.д. В случае использования для парентерального применения фармацевтический препарат может быть составлен в виде инъекций, включая жидкость для инъекции, стерильный порошок для инъекции и концентрированный раствор для инъекции. В случае составления в виде инъекций фармацевтическая композиция может быть получена с помощью общепринятых в уровне техники данной фармацевтической области способов. В случае составления в виде инъекций в фармацевтический препарат можно не добавлять какие-либо добавки, тогда как соответствующие добавки можно добавлять в соответствии с природой лекарственного препарата. В случае использования для ректального введения фармацевтический препарат может быть составлен в виде суппозитория и т.д. В случае использования для легочного введения фармацевтический препарат может быть составлен в виде ингалятора или спрея и т.д. В определенных предпочтительных вариантах осуществления терапевтически и/или профилактически эффективное количество соли по настоящему изобретению присутствует в фармацевтическом препарате или лекарственном препарате. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления соль по настоящему изобретению присутствует в форме однократной дозы в фармацевтическом препарате или лекарственном препарате.

Преимущественные эффекты настоящего изобретения

[38] По сравнению с уровнем техники техническое решение согласно настоящему изобретению обладает изложенными ниже преимуществами.

[39] Исследования показывают, что соль соединения, представленного формулой (I), полученная в соответствии с настоящим изобретением, характеризуется высокой чистотой, небольшим изменением чистоты согласно HPLC и высокой химической стабильностью в условиях освещения, высокой температуры и высокой влажности; соль соединения, представленного формулой (I), полученная с помощью технического решения по настоящему изобретению, может отвечать медицинским требованиям получения, транспортировки и хранения, характеризуется стабильным способом получения, может многократно контролироваться и может подходить для промышленного производства.

Краткое описание графических материалов

[40] На фиг. 1 показаны эффекты соединения, представленного формулой (I), в отношении индуцированной каррагенаном воспалительной боли у крыс.

Подробное описание предпочтительного варианта осуществления

[41] Настоящее изобретение будет дополнительно объяснено более подробно ниже со ссылкой на варианты осуществления, которые предназначены только для иллюстрации технического решения согласно настоящему изобретению и не ограничивают суть и объем настоящего изобретения.

[42] Условия проведения испытаний для устройства, используемого в экспериментах.

[43] Структуру соединения определяют с помощью ядерного магнитного резонанса (ЯМР) или/и масс-спектрометрии (MS). Сдвиг ЯМР (d) приведен в единицах, составляющих 10^-6 (ppm). ЯМР определяли с помощью прибора для ЯМР Bruker AVANCE-400, растворителем для определения являлся дейтерированный диметилсульфоксид (DMSO-d₆), дейтерированный хлороформ (CDCl₃), дейтерированный метанол (CD₃OD), а внутренним стандартом являлся тетраметилсилан (TMS).

[44] Определение MS осуществляли с помощью масс-спектрометра FINNIGAN LCQAd (ESI) (производитель: Thermo, модель: Finnigan LCQ advantage MAX).

[45] HPLC определяли с использованием Agilent 1200DAD для жидкостной хроматографии при высоком давлении (колонка Sunfire С18 150×4,6 мм) и Waters 2695-2996 для жидкостной хроматографии при высоком давлении (колонка Gimini С18 150×4,6 мм).

[46] Ионная хроматография (HPIC): устройство: Dionexis-5000+ для ионной хроматографии; разделительная колонка: IonPac AS11-НС, режим выявления: проводимость; промывочный раствор: NaOH 0,03 М; скорость потока: 1,5 мл/мин.

[47] Вариант осуществления 1

Получение ацетата соединения, представленного формулой (I)

[48] Соединение, представленное формулой (I) (71 мг, 0,1 ммоль), и изопропанол (0,25 мл) добавляли в реакционную колбу, нагревали до 50°С, перемешивали до полного растворения, добавляли по каплям уксусную кислоту (6 мг, 0,1 ммоль) при 50°С, затем изопропиловый эфир (0,25 мл), затем перемешивали в течение 2 часов при 50°С, естественным образом охлаждали до комнатной температуры, перемешивали в течение 16 часов, затем реакционную смесь фильтровали и осадок на фильтре высушивали под вакуумом с получением указанного в заголовке продукта (30 мг, выход 39%).

[49] ¹Н-ЯМР полученного продукта показан ниже, при этом данные ядерного магнитного анализа показывают, что молярное соотношение основного компонента и уксусной кислоты в соли составляет 1:1.

[50] ¹Н-ЯМР (400 МГц, CD₃OD) d 7,37-7,11 (m, 10Н), 4,88-4,80 (m, 1Н), 4,61 (dd, 1H), 4,40 (dd, 1H), 3,86 (brs., 1H), 3,83-3,58 (m, 3H), 3,24-3,03 (m, 3H), 2,96-2,72 (m, 4 H), 2,61 (dd, 1H), 2,52 (dd, 1H), 2,19 (brs., 2H), 1,90 (s, 3H), 1,83-1,53 (m, 9H), 1,44 (d, 2H), 1,19 (d, 3H), 1,01-0,87 (m, 6H).

[51] Вариант осуществления 2

Получение ацетата соединения, представленного формулой (I)

[52] Соединение, представленное формулой (I) (300 мг, 0,424 ммоль), добавляли в дихлорметан (3 мл), перемешивали и растворяли, добавляли предварительно полученный раствор уксусной кислоты (26,7 мг, 0,445 ммоль), растворенный в 0,5 мл дихлорметана, затем смесь нагревали до 50°С, перемешивали в течение 2 часов в слегка кипящем состоянии, затем добавляли изопропиловый эфир (3 мл), перемешивали в течение 2 часов при комнатной температуре, реакционную смесь фильтровали и осадок на фильтре промывали изопропиловым эфиром (5 мл * 2), осушали и высушивали под вакуумом с получением указанного в заголовке продукта (300 мг, выход 92%).

[53] ¹Н-ЯМР полученного продукта показан ниже, при этом данные ядерного магнитного анализа показывают, что молярное соотношение основного компонента и уксусной кислоты в соли составляет 1:1.

[54] ¹Н-ЯМР (400 МГц, CD₃OD) 8 7,40-7,12 (m, 10Н), 4,88-4,80 (m, 1Н), 4,61 (dd, 1Н), 4,39 (dd, 1Н), 3,97-3,69 (m, 4Н), 3,23-3,06 (m, 3Н), 2,98-2,73 (m, 4Н), 2,61 (dd, 1Н), 2,53 (dd, 1Н), 2,20 (d, 2Н), 1,91 (s, 3Н), 1,87-1,74 (m, 2Н), 1,74-1,51 (m, 7Н), 1,44 (d, 2Н), 1,19 (d, 3Н), 1,01-0,87 (m, 6Н).

[55] Вариант осуществления 3

Получение ацетата соединения, представленного формулой (I)

[56] Соединение, представленное формулой (I) (500 мг, 0,042 ммоль), и дихлорметан (5 мл) добавляли в реакционную колбу, перемешивали и полностью растворяли, затем добавляли по каплям уксусную кислоту (44,4 мг, 0,741 ммоль), реакционную смесь нагревали до 40°С и смесь перемешивали в течение 2 часов, затем добавляли диизопропиловый эфир (5 мл), медленно охлаждали до комнатной температуры и продолжали перемешивать в течение 1 часа, затем реакционную смесь фильтровали и осадок на фильтре высушивали под вакуумом с получением указанного в заголовке продукта (500 мг, выход: 92%).

[57] ¹Н-ЯМР полученного продукта показан ниже, при этом данные ядерного магнитного анализа показывают, что молярное соотношение основного компонента и уксусной кислоты в соли составляет 1:1.

[58] ¹Н-ЯМР (400 МГц, CD₃OD) δ 7,34-7,05 (m, 10Н), 4,83 (dd, 1Н), 4,61 (dd, 1Н), 4,40 (dd, 1Н), 3,93-3,64 (m, 4Н), 3,24-3,04 (m, 3Н), 2,97-2,76 (m, 4 Н), 2,68-2,47 (m, 2Н), 2,30-2,07 (m, 2Н), 1,91 (s, 3Н), 1,84-1,55 (m, 9Н), 1,44 (d, 2Н), 1,19 (d, 3Н), 1,06-0,79 (m, 6Н).

[59] Вариант осуществления 4

Получение ацетата соединения, представленного формулой (I)

[60] Соединение, представленное формулой (I) (300 мг, 0,42 ммоль), и дихлорметан (3 мл) добавляли в реакционную колбу, перемешивали и полностью растворяли, затем добавляли по каплям предварительно полученный раствор уксусной кислоты (76,3 мг, 1,27 ммоль) в дихлорметане (0,5 мл), температуру повышали до 50°С и смесь перемешивали в течение 2 часов, затем добавляли изопропиловый эфир (3 мл), затем температуру медленно понижали до комнатной температуры и смесь перемешивали в течение 72 часов при комнатной температуре, реакционную смесь фильтровали и осадок на фильтре промывали изопропиловым эфиром (5 мл × 2) и высушивали под вакуумом с получением указанного в заголовке продукта (300 мг, выход 92%).

[61] ¹Н-ЯМР полученного продукта показан ниже, при этом данные ядерного магнитного анализа показывают, что молярное соотношение основного компонента и уксусной кислоты в соли составляет 1:2.

[62] ¹Н-ЯМР (400 МГц, CD₃OD) δ 7,39-7,13 (m, 10Н), 4,83 (m, 1Н), 4,61 (dd, 1Н), 4,39 (dd, 1Н), 3,94-3,65 (m, 4Н), 3,27-3,12 (m, 3Н), 2,95-2,79 (m, 4Н), 2,70-2,52 (m, 2Н), 2,20 (dd, 2Н), 1,93 (s, 6Н), 1,84-1,55 (m, 9Н), 1,51-1,40 (d, 2Н), 1,20 (d, 3Н), 1,01-0,87 (m, 6Н).

[63] Вариант осуществления 5

Получение ацетата соединения, представленного формулой (I)

[64] SepHadex g25 (10 г) погружали в 20% водный раствор этанола на 30 минут, затем заполняли в колонку (диаметр:высота = 1:3, остальное было заполнено морским песком), добавляли в реакционную колбу соединение, представленное формулой (I) (2 г, неочищенный продукт), и воду (2 мл), добавляли по каплям водный раствор аммиака до тех пор, пока рН раствора не становился приблизительно 7, образец загружали влажным способом, промывали чистой водой, сбор проводили при пиках 214 нм и 210 нм, собранный раствор непосредственно лиофилизировали и остаток очищали с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (колонка WATERS 2767 Xbridge 30×150 мм, 5 мкм; подвижная фаза (А: вода (0,1% уксусная кислота), В: вода (10 ммоль/л ацетата аммония), С: ацетонитрил) с получением указанного в заголовке продукта (500 мг).

[65] Результаты выявления с помощью ионной хроматографии (HPIC) полученного продукта показали, что содержание ацетат-иона составляло 13,52%, что указывает на то, что молярное соотношение основного компонента и уксусной кислоты в соли составляло 1:2.

[66] Вариант осуществления 6

Получение гидрохлорида соединения, представленного формулой (I)

[67] Неочищенное соединение (2 г, 1,88 ммоль), представленное формулой (I), растворяли в хлористоводородной кислоте (16 мл, 4М), перемешивали для осуществления реакции в течение 2 часов, концентрировали при пониженном давлении с получением примерно 2 г неочищенного продукта, и неочищенный продукт очищали с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (хроматографическая колонка: Sharpsil-H 20250 мм; 5 мкм; С18; подвижная фаза (А: вода (0,05% HCl), В: ацетонитрил)) с получением указанного в заголовке продукта (80 мг, выход 70%).

[68] Результаты выявления с помощью ионной хроматографии (HPIC) полученного продукта показывают, что содержание хлорид-иона составляло 9,73%, что указывает на то, что молярное соотношение основного компонента в соли и хлористоводородной кислоты составляло 1:2.

[69] Вариант осуществления 7

Получение гидрохлорида соединения, представленного формулой (I)

[70] Соединение, представленное формулой (I) (100 мг, 0,141 ммоль), растворяли в этаноле (2 мл), добавляли по каплям раствор хлорида водорода в изопропиловом спирте (0,176 мл, 4М), смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 16 часов без осаждения твердого вещества, добавляли диизопропиловый эфир (2 мл), полученный продукт перемешивали в течение 4 часов, реакционную смесь фильтровали и осадок на фильтре промывали диизопропиловым эфиром (1 мл), осадок на фильтре собирали и высушивали под вакуумом с получением указанного в заголовке продукта (80 мг, выход 70%).

[71] Результаты выявления с помощью ионной хроматографии (HPIC) полученного продукта показывают, что содержание хлорид-иона составляло 12,57%, что указывает на то, что молярное соотношение основного компонента в соли и хлористоводородной кислоты составляло 1:3.

[72] Вариант осуществления 8

Получение гидрохлорида соединения, представленного формулой (I)

[73] Соединение, представленное формулой (I) (350 мг, 0,494 ммоль), растворяли в изопропаноле (5 мл), перемешивали и полностью растворяли, добавляли по каплям раствор хлорида водорода в изопропаноле (0,494 мл, 4 М), твердое вещество осаждали, смесь перемешивали в течение 5 минут, а затем полностью растворяли, дополнительно перемешивали при комнатной температуре в течение 16 часов, никакого твердого вещества не выпадало в осадок, добавляли диизопропиловый эфир (2 мл), полученный продукт перемешивали при комнатной температуре в течение 6 часов, реакционную смесь фильтровали, осадок на фильтре собирали и высушивали под вакуумом с получением указанного в заголовке продукта (250 мг, выход 62%).

[74] Результаты выявления с помощью ионной хроматографии (HPIC) полученного продукта показывают, что содержание хлорид-иона составляло 12,38%, что указывает на то, что молярное соотношение основного компонента в соли и хлористоводородной кислоты составляло 1:3.

[75] Вариант осуществления 9

Получение гидрохлорида соединения, представленного формулой (I)

[76] Неочищенное соединение, представленное формулой (I) (4,08 г, неочищенный продукт), добавляли к хлористоводородной кислоте (40 мл, 4 М) при 0°С, смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов, концентрировали при пониженном давлении и полученный остаток очищали с помощью препаративной хроматографии с получением указанного в заголовке продукта (710 мг, выход 17%).

[77] Результаты выявления с помощью ионной хроматографии (HPIC) полученного продукта показывают, что содержание хлорид-иона составляло 12,38%, что указывает на то, что молярное соотношение основного компонента в соли и хлористоводородной кислоты составляло 1:3.

[78] Вариант осуществления 10

Получение цитрата соединения, представленного формулой (I)

[79] Соединение, представленное формулой (I) (71 мг, 0,1 ммоль), растворяли в изопропаноле (0,3 мл), нагревали до 60°С, добавляли раствор моногидрата лимонной кислоты (22 мг, 0,105 ммоль) в изопропаноле (0,8 мл), смесь перемешивали при 60°С в течение 2 часов, охлаждали до комнатной температуры и перемешивали в течение 16 часов, реакционную смесь фильтровали и осадок на фильтре промывали изопропанолом (0,6 мл), осадок на фильтре собирали и высушивали под вакуумом с получением указанного в заголовке продукта (60 мг, выход 78%).

[80] ¹Н-ЯМР полученного продукта показан ниже. Данные ядерного магнитного анализа показали, что молярное соотношение основного компонента и лимонной кислоты в соли составляло 1:1.

[81] ¹Н-ЯМР (400 МГц, CD₃OD) δ 7,40-7,11 (m, 10Н), 4,86-4,79 (m, 1Н), 4,58 (m, 1Н), 4,43-4,29 (m, 1Н), 3,96-3,81 (m, 3Н), 3,76 (d, 2Н), 3,69-3,51 (m, 2Н), 3,22-3,06 (m, 2Н), 3,05-2,90 (m, 4Н), 2,79 (dd, 2Н), 2,70 (s, 2Н), 2,33-2,03 (m, 2Н), 1,92-1,65 (m, 7Н), 1,65-1,49 (m, 2Н), 1,42 (brs., 2Н), 1,34-1,25 (m, 3Н), 1,02-0,84 (m, 6Н).

[82] Вариант осуществления 11

Получение цитрата соединения, представленного формулой (I)

[83] Соединение, представленное формулой (I) (500 мг, 0,706 ммоль), растворяли в изопропаноле (10 мл), смесь перемешивали и растворяли, нагревали до 40°С и добавляли по каплям предварительно полученный раствор моногидрата лимонной кислоты (156 мг, 0,741 ммоль) в изопропаноле (10 мл), при этом появлялась белая твердая взвесь, смесь перемешивали при 40°С в течение 2 часов, охлаждали на ледяной бане и перемешивали в течение 0,5 часа. Реакционную смесь фильтровали, осадок на фильтре промывали изопропиловым спиртом, затем осадок на фильтре собирали и высушивали под вакуумом с получением указанного в заголовке продукта (600 мг, выход 94%).

[84] ¹Н-ЯМР полученного продукта показан ниже. Данные ядерного магнитного анализа показывают, что молярное соотношение основного компонента и лимонной кислоты в соли составляло 1:1.

[85] ¹Н-ЯМР (400 МГц, CD₃OD) δ 7,48-7,29 (m, 2Н), 7,29-7,04 (m, 8Н), 4,87-4,81 (m, 1Н), 4,56 (dd, 1Н), 4,35 (dt, 1Н), 3,98-3,75 (m, 4Н), 3,75-3,57 (m, 2Н), 3,57-3,50 (m, 2Н), 3,21-3,14 (m, 1Н), 3,13-2,89 (m, 5Н), 2,79 (dd, 2Н), 2,69 (dd, 2Н), 2,30-2,01 (m, 2Н), 1,88-1,61 (m, 8Н), 1,61-1,49 (m, 1Н), 1,49-1,33 (m, 2Н), 1,33-1,24 (m, 3Н), 1,06-0,76 (m, 6Н).

[86] Вариант осуществления 12

Получение цитрата соединения, представленного формулой (I)

[87] Соединение, представленное формулой (I) (300 мг, 0,424 ммоль), растворяли в изопропаноле (4 мл), добавляли раствор моногидрата лимонной кислоты (187 мг, 0,89 ммоль) в растворе изопропанола (4 мл) при 80°С, растворенного при 80°С, смесь перемешивали в течение 2 часов, дополнительно перемешивали при комнатной температуре в течение 72 часов, твердое вещество отфильтровывали, промывали изопропанолом (5 мл × 3) и собирали осадок на фильтре, затем высушивали под вакуумом с получением указанного в заголовке продукта (300 мг, выход 77%).

[88] ¹Н-ЯМР полученного продукта показан ниже. Данные ядерного магнитного анализа показывают, что молярное соотношение основного компонента и лимонной кислоты в соли составляло 1:2.

[89] ¹Н-ЯМР (400 МГц, CD₃OD) d 7,43-7,20 (m, 9Н), 7,15 (t, 1Н), 4,85 (d, 1H), 4,58 (dd, 1H), 4,41-4,26 (m, 1H), 3,92-3,78 (m, 4H), 3,70-3,55 (m, 3H), 3,27-3,00 (m, 4H), 2,99-2,86 (m, 2H), 2,82 (dd, 4H), 2,72 (dd, 4H), 2,32-2,08 (m, 2H), 1,88-1,62 (m, 8H), 1,62-1,48 (m, 2H), 1,48-1,37 (m, 2H), 1,33-1,25 (m, 3H), 1,02-0,88 (m, 6H).

[90] Вариант осуществления 13

Получение цитрата соединения, представленного формулой (I)

[91] Соединение, представленное формулой (I) (300 мг, 0,423 ммоль), растворяли в изопропаноле (5 мл), добавляли моногидрат лимонной кислоты (356,2 мг, 1,69 ммоль), и температуру повышали до 60°С, и смесь перемешивали в течение 2 часов. Реакционную смесь медленно охлаждали до комнатной температуры, фильтровали, осадок на фильтре собирали и высушивали под вакуумом с получением указанного в заголовке продукта (260 мг, выход 66%).

[92] ¹Н-ЯМР полученного продукта показан ниже. Данные ядерного магнитного анализа показывают, что молярное соотношение основного компонента и лимонной кислоты в соли составляло 1:3.

[93] ¹Н-ЯМР (400 МГц, CD₃OD) δ 7,39-7,32 (m, 2Н), 7,32-7,19 (m, 7Н), 7,15 (t, 1Н), 4,89-4,84 (m, 1Н), 4,75-4,57 (m, 1Н), 4,40-4,30 (m, 1Н), 3,98-3,78 (m, 5Н), 3,76-3,58 (m, 2Н), 3,25-3,00 (m, 4Н), 2,98-2,88 (m, 3Н), 2,85 (dd, 5Н), 2,77 (s, 3Н), 2,73 (s, 3Н), 2,32-2,06 (m, 2Н), 1,87-1,65 (m, 7Н), 1,65-1,47 (m, 2Н), 1,43 (brs., 2Н), 1,35-1,26 (m, 3Н), 1,01-0,81 (m, 6Н).

[94] Вариант осуществления 14

Получение фосфата соединения, представленного формулой (I)

[95] Соединение, представленное формулой (I) (308 мг, 0,436 ммоль), растворяли в изопропаноле (5 мл), добавляли фосфорную кислоту (200 мг, 1,73 ммоль, чистота 85%), повышали температуру до 60°С, реакционную смесь перемешивали в течение 2 часов, температуру медленно понижали до комнатной температуры и перемешивание осуществляли в течение еще 16 часов. Реакционную смесь фильтровали, осадок на фильтре собирали и высушивали под вакуумом с получением указанного в заголовке продукта (520 мг, выход 51,9%).

[96] Результаты выявления с помощью ионной хроматографии (HPIC) в полученном продукте показывают, что содержание фосфат-ионов составляло 31,43%, что указывает на то, что молярное соотношение основного компонента и фосфорной кислоты в соли составляло 1:3.

[97] Вариант осуществления 15

Получение фосфата соединения, представленного формулой (I)

[98] Соединение, представленное формулой (I) (500 мг, 0,706 ммоль), растворяли в изопропиловом спирте (40 мл), повышали температуру до 40°С, добавляли предварительно полученный раствор фосфорной кислоты (369 мг, 3,2 ммоль, чистота 85%) в изопропиловом спирте (10 мл) и смесь перемешивали при 40°С в течение 2 часов и при 0°С в течение 30 минут. Реакционную смесь фильтровали, осадок на фильтре промывали изопропиловым спиртом (1 мл × 3), затем осадок на фильтре собирали и высушивали под вакуумом с получением указанного в заголовке продукта (660 мг, выход 90%).

[99] Результаты выявления с помощью ионной хроматографии (HPIC) в полученном продукте показывают, что содержание фосфат-ионов составляло 29,08%, что указывает на то, что молярное соотношение основного компонента и фосфорной кислоты в соли составляло 1:3.

[100] Вариант осуществления 16

Получение бензоата соединения, представленного формулой (I)

[101] Соединение, представленное формулой (I) (55 мг, 0,077 ммоль), растворяли в изопропаноле (1 мл), смесь нагревали до 50°С и перемешивали до полного растворения, добавляли предварительно полученный раствор бензойной кислоты (38 мг, 0,31 ммоль) в изопропаноле (0,3 мл), смесь перемешивали при 50° в течение 2 часов, медленно охлаждали до комнатной температуры и продолжали перемешивать в течение 16 часов, реакционную смесь фильтровали, осадок на фильтре собирали и высушивали под вакуумом с получением указанного в заголовке продукта (35 мг, выход 54%).

[102] ¹Н-ЯМР полученного продукта показан ниже. Данные ядерного магнитного анализа показывают, что молярное соотношение основного компонента и бензойной кислоты в соли составляло 1:2.

[103] ¹Н-ЯМР (400 МГц, CD3OD) δ 8,21-7,96 (m, 10Н), 7,44-7,21 (m, 10Н), 4,84 (d, 1Н), 4,69-4,57 (m, 1Н), 4,38 (s., 1Н), 4,00-3,83 (m, 3Н), 3,77 (brs, 2Н), 3,31-3,24 (m, 3Н), 3,20 (s, 1Н), 2,97-2,81 (m, 4Н), 2,76-2,60 (m., 2Н), 1,83-1,53 (m, 9Н), 1,43 (brs, 2Н), 1,28-1,18 (m, 3Н), 0,95 (d, 3Н), 0,91 (d, 3Н).

[104] Вариант осуществления 17

Получение фумарата соединения, представленного формулой (I)

[105] Соединение, представленное формулой (I) (50 мг, 0,0706 ммоль), растворяли в изопропаноле (0,5 мл), затем добавляли фумаровую кислоту (33 мг, 0,28 ммоль), температуру повышали до 60°С и смесь перемешивали в течение 2 часов, охлаждали до комнатной температуры, фильтровали, осадок на фильтре собирали и высушивали под вакуумом с получением указанного в заголовке продукта (26 мг, выход 44,6%).

[106] ¹Н-ЯМР полученного продукта показан ниже. Данные ядерного магнитного анализа показывают, что молярное соотношение основного компонента и фумаровой кислоты в соли составляло 1:2.

[107] ¹Н-ЯМР (400 МГц, CD₃OD) δ 7,41-7,31 (m, 2Н), 7,31-7,20 (m, 7Н), 7,20-7,10 (m, 1Н), 6,69 (s, 4Н), 4,84 (dd, 1Н), 4,73-4,60 (m, 1Н), 4,37 (dd, 1Н), 3,96-3,78 (m, 3Н), 3,78-3,63 (m, 2Н), 3,60-3,51 (m, 1Н), 3,26-3,15 (m, 1Н), 3,13-2,96 (m, 3Н), 2,96-2,79 (m, 3Н), 2,31-2,08 (m, 2Н), 1,83-1,54 (m, 8Н), 1,49-1,38 (m, 2Н), 1,33-1,26 (m, 3Н), 1,00-0,82 (m, 6Н).

[108] Вариант осуществления 18

Эксперимент в отношении влияния факторов кристаллической формы по настоящему изобретению

[109] Образцы соединения, представленного формулой (I), и ацетата, гидрохлорида, цитрата и фосфата соединения, представленного формулой (I), были соответственно размещены на открытом пространстве и равномерно распределены с тем, чтобы исследовать стабильность образцов в условиях комнатной температуры, нагрева (40°С, 60°С), освещения (4500 люкс) и высокой влажности (относительная влажность 75% и относительная влажность 90%). Период для выборки составлял 20 дней.

[110] Результаты экспериментов.

[111] Примечание: символ «/» указывает на то, что значение не было определено.

[112] Заключение в результате экспериментов

[113] Результаты экспериментов с влияющими факторами показали следующее.

[114] Свободное основание в значительной степени подвергалось деградации в условиях освещения и высокой температуры на протяжении 20 дней, и высокая температура оказывала большое влияние на стабильность свободного основания.

[115] Ацетат (1:1 или 1:2) в различной степени подвергался деградации при освещении, 40°С, 60°С. Ацетат (1:2) характеризовался плохой стабильностью при высокой температуре. После завершения 20-дневного эксперимента результаты ионной хроматографии при высокой температуре показали, что содержание ацетата (радикала) значительно уменьшилось.

[116] Гидрохлорид (1:2) незначительно подвергался деградации в условиях освещения и высокой температуры; гидрохлорид (1:3) незначительно подвергался деградации в условиях освещения и был стабильным при других условиях.

[117] Цитрат (1:2 или 1:3) в значительной степени подвергался деградации при высокой температуре, составляющей 60°С.

[118] Фосфат (1:3) был относительно стабильным или незначительно подвергался деградации в условиях освещения и высоких температур.

[119] Предполагается, что все образцы соли должны храниться в тени, в закрытом состоянии и вдали от освещения.

[120] Вариант осуществления 19. Ускоренный эксперимент в отношении долговременной стабильности различных типов солей соединения, представленного формулой (I), по настоящему изобретению

[121] Образцы ацетата, гидрохлорида, цитрата и фосфата соединения, представленного формулой (I), подвергали ускоренному исследованию на долговременную стабильность в течение 6 месяцев при условиях темноты и герметичности (внутренняя упаковка представляла собой медицинскую композитную пленку из полиэтилена низкой плотности и наружная упаковка представляла собой алюминиевую фольгу), влажности (относительная влажность 60%), температуре (4°С, 25°С) и с защитой с помощью азота/без нее.

[122] Результаты экспериментов

[123] Заключение в результате экспериментов

[124] Результаты ускоренного испытания на долговременную стабильность показали, что аморфные образцы ацетата (1:1), гидрохлорида (1:3), цитрата (1:1) и фосфата (1:3) соединения, представленного формулой (I), были стабильными в течение 6 месяцев в условиях 4°С, 25°С, относительная влажность 60%, с защитой с помощью азота/без нее.

[125] Вариант осуществления 20. Получение соединения, представленного формулой (I), может относиться к способу в WO 2017211272 (заявка № PCT/CN2017/087328, дата подачи: 6^-ое июня 2017 г.).

4-амино-1-((2R,5R,8R,14R)-2-(4-аминобутил)-8-бензил-5-изобутил-4,7,10-триоксо-14-фенил-3,6,9,12-тетраазапентадекан-1-ацил)пиперидин-4-карбоновая кислота, формула (I):

Стадия 1

4-Бензил-1-трет-бутил 4-(((бензилокси)карбонил)амино)пиперидин-1,4-дикарбоновая кислота 1b

[126] 4-(((Бензилокси)карбонил)амино)-1-(трет-бутоксикарбонил)пиперидин-4-карбоновую кислоту 1а (1,2 г, 0,0032 моль, полученную посредством хорошо известного способа согласно «Bioorganic Medicinal Chemistry Letters, 2007, 7(9), 2448-2451»), бензилбромид (0,65 г, 0,0038 моль), карбонат цезия (2,1 г, 0,0064 моль) растворяли в 20 мл N,N-диметилформамида и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 12 часов. Реакционную смесь выливали в воду, экстрагировали с помощью этилацетата (30 мл × 3), органические фазы объединяли, высушивали над безводным сульфатом натрия, фильтровали, и фильтрат концентрировали при пониженном давлении, и полученный остаток очищали с помощью тонкослойной хроматографии (н-гексан и этилацетат в качестве элюентов) с получением указанного в заголовке продукта 1b (800 мг, выход: 53%).

Стадия 2

Бензил-4-(((бензилокси)карбонил)амино)пиперидин-4-карбоксилата гидрохлорид 1с

[127] Соединение 1b (800 мг, 1,71 ммоль) растворяли в 2 мл дихлорметана, затем добавляли 2 мл 4M хлорида водорода в растворе 1,4-диоксана и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 4 часов. Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении с получением неочищенного указанного в заголовке продукта 1с (800 мг) и продукт непосредственно подвергали следующей реакции без очистки.

Стадия 3

Бензил-(R)-1-(2-(((9Н-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-6-((трет-бутоксикарбонил)амино)гексаноил)-4-(((бензилокси)карбонил)амино)пиперидин-4-карбоксилат 1е

[128] Неочищенный продукт 1с (800 мг, 1,97 ммоль) и (R)-2-((((9Н-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-6-((трет-бутоксикарбонил)амино)гексановую кислоту 1d (926 мг, 1,97 ммоль) растворяли в 20 мл N,N-диметилформамида с применением способа, хорошо известного из «ChemMedChem, 2015, 10(7), 1232-1239», затем добавляли 2-(7-азабензотриазол)-N,N,N',N-тетраметилмочевины гексафторфосфат (1,12 г, 3,0 ммоль) и N,N-диизопропилэтиламин (0,7 мл, 3,94 ммоль) и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 12 часов. Затем реакционную смесь выливали в 2 н. лимонную кислоту, экстрагировали с помощью этилацетата (30 мл × 3), органические фазы объединяли, промывали насыщенным раствором бикарбоната натрия, высушивали над безводным сульфатом натрия, фильтровали и фильтрат концентрировали при пониженном давлении с получением неочищенного указанного в заголовке продукта 1е (1,6 г). Продукт непосредственно подвергали следующей реакции без очистки.

Стадия 4

Бензил-(R)-1-(2-амино-6-((трет-бутоксикарбонил)амино)гексаноил)-4-(((бензилокси)карбонил)амино)пиперидин-4-карбоксилат 1f

[129] Неочищенный продукт 1е (1,6 г, 0,002 моль) растворяли в 10 мл дихлорметана, добавляли 10 мл пиперидина и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов. После этого реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении, полученный в результате остаток очищали с помощью тонкослойной хроматографии (дихлорметан и метанол в качестве элюентов) с получением указанного в заголовке продукта 1f (900 мг, выход: 77%).

Стадия 5

Бензил-(R)-2-((R)-2-(2-хлорацетамидо)-3-фенилпропанамид)-4-метилпентаноат 1i

[130] Бензил-(R)-2-((R)-2-(2-амино-3-фенилпропанамид)-4-метилпентаноат 1g (500 мг, 1,36 ммоль, полученный посредством способа, раскрытого в заявке на патент «US 20110212882 A1») и триэтиламин (275 мг, 2,72 ммоль) растворяли в 10 мл дихлорметана, затем добавляли по каплям хлорацетилхлорид (230 мг, 2 ммоль) и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 12 часов. Реакционную смесь выливали в воду, промывали с помощью насыщенного раствора хлорида аммония, органическую фазу высушивали над сульфатом натрия, фильтровали и фильтрат концентрировали при пониженном давлении с получением неочищенного указанного в заголовке продукта 1i (500 мг). Продукт непосредственно подвергали следующей реакции без очистки.

Стадия 6

Бензил-(R)-4-метил-2-((R)-3-фенил-2-(2-(((R)-2-фенилпропил)амино)ацетамидо)пропионамидо)пентаноат 1k

[131] Неочищенный продукт, представляющий собой соединение 1i (500 мг, 1,12 ммоль), и (R)-2-фенилпропан-1-амин 1j (228 мг, 1,68 ммоль, полученный посредством хорошо известного способа согласно «Angewandte chemie, international edition, 2003, 42 (39), 4793-4795») растворяли в 10 мл N,N-диметилформамида, затем добавляли йодид калия (372 мг, 2,24 ммоль) и карбонат калия (309 мг, 2,24 ммоль) и смесь нагревали до 60°С и перемешивали в течение 12 часов. Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры, добавляли воду, затем экстрагировали дихлорметаном (30 мл × 3), органические фазы объединяли, высушивали над безводным сульфатом натрия, фильтровали и фильтрат концентрировали при пониженном давлении с получением неочищенного продукта, указанного в заголовке соединения 1k (600 мг). Продукт непосредственно подвергали следующей реакции без очистки.

Стадия 7

Бензил-(9R,12R)-9-бензил-12-изобутил-2,2-диметил-4,7,10-триокси-5-((R)-2-фенилпропил)-3-окса-5,8,11-триаза-13-тридеканоат 1l

[132] Неочищенный продукт, представляющий собой соединение 1k (600 мг, 1,1 ммоль), растворяли в 20 мл дихлорметана, добавляли ди-трет-бутилдикарбонат (361 мг, 1,66 ммоль) и триэтиламин (222 мг, 2,2 ммоль) и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 12 часов. Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении и полученный остаток очищали с помощью тонкослойной хроматографии (дихлорметан и метанол в качестве элюентов) с получением указанного в заголовке продукта 11 (580 мг, выход: 82%).

Стадия 8

(9R,12R)-9-бензил-12-изобутил-2,2-диметил-4,7,10-триокси-5-((R)-2-фенилпропил)-3-окса-5,8,11-триаза-13-тридекановая кислота 1m

[133] Соединение 1l (580 мг, 0,9 ммоль) растворяли в 10 мл метанола, затем добавляли палладий на угле (60 мг, каталитическое количество), после добавления смесь трижды продували водородом и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 12 часов. Реакционную смесь фильтровали с помощью диатомита и фильтрат концентрировали при пониженном давлении с получением неочищенного указанного в заголовке продукта 1m (500 мг). Продукт непосредственно подвергали следующей реакции без очистки.

Стадия 9

Бензил-1-((9R,12R,15R)-9-бензил-15-(4-((трет-бутоксикарбонил)амино)бутил)-12-изобутил-2,2-диметил-4,7,10,13-тетраокси-5-((R)-2-фенилпропил)-3-окса-5,8,11,14-тетраазагексадецил- 16-ацил)-4-(((бензилокси)карбонил)амино)пиперидин-4-карбоксилат 1n

[134] Неочищенный продукт, представляющий собой соединение 1m (365 мг, 0,66 ммоль), 1f (393 мг, 0,66 ммоль), 2-(7-азобензотриазол)-N, N,N',N'-тетраметилмочевины гексафторфосфат (376 мг, 0,99 ммоль) и N,N-диизопропилэтиламин (0,16 мл, 0,99 ммоль) растворяли в 10 мл N,N-диметилформамида и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов. Затем реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении и полученный остаток очищали с помощью тонкослойной хроматографии (дихлорметан и метанол в качестве элюентов) с получением указанного в заголовке продукта 1n (170 мг, выход: 23%).

Стадия 10

4-Амино-1-((9R,12R,15R)-9-бензил-15-(4-((трет-бутоксикарбонил)амино)бутил)-12-изобутил-2,2-диметил-4,7,10,13-тетраоксо-5-((R)-2-фенилпропил)-3-окса-5,8,11,14-тетраазацетил-16-ацил)пиперидин-4-карбоновая кислота 1о

[135] Соединение 1n (80 мг, 0,0706 ммоль) растворяли в 10 мл метанола, добавляли палладий на угле (10 мг, каталитическое количество), после добавления смесь трижды продували водородом и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 12 часов. Реакционную смесь фильтровали с помощью диатомита и фильтрат концентрировали при пониженном давлении с получением неочищенного указанного в заголовке продукта 1о (60 мг). Продукт непосредственно подвергали следующей реакции без очистки.

Стадия 11

4-Амино-1-((2R,5R,8R,14R)-2-(4-аминобутил)-8-бензил-5-изобутил-4,7,10-триокси-14-фенил-3,6,9,12-тетраазапентадецил-1-ацил)пиперидин-4-карбоновой кислоты трифторацетат 1р

[136] Неочищенное соединение, представляющее собой 1о (60 мг, 0,066 ммоль), растворяли в 2 мл дихлорметана, затем добавляли 1 мл раствора 4 M хлорида водорода в 1,4-диоксане и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов. Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении и остаток очищали с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с получением указанного в заголовке продукта 1р (30 мг, выход: 55,6%).

[137] MS, масса/заряд (ESI): 708,6 [М+1]

Стадия 12

4-Амино-1-((2R,5R,8R,14R)-2-(4-аминобутил)-8-бензил-5-изобутил-4,7,10-триокси-14-фенил-3,6,9,12-тетраазапентадецил-1-ацил)пиперидин-4-карбоновая кислота формулы (I)

[138] Соединение 1р (1 г, 0,95 ммоль) растворяли в 10 мл воды, охлаждали на ледяной бане, затем добавляли по каплям водный аммиак до рН=7-8, реакционную смесь перемешивали в течение 0,5 часа, концентрировали при пониженном давлении, и получали, и очищали с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с получением указанного в заголовке продукта (600 мг, выход: 89%).

[139] MS, масса/заряд (ESI): 708,6 [М+1]

[140] ¹Н-ЯМР (400 МГц, CD₃OD) 7,32-7,18 (m, 10Н), 4,86-4,84 (m, 1Н), 4,61 (dd, 1Н), 4,40 (dd, 1Н), 3,86 (brs, 1Н), 3,83-3,58 (m, 3Н), 3,24-3,03 (m, 3Н), 2,96-2,72 (m, 4Н), 2,61 (dd, 1Н), 2,52 (dd, 1Н), 2,19 (brs, 2Н), 1,83-1,53 (m, 9Н), 1,44 (d, 2Н), 1,18 (d, 3Н), 0,96-0,90 (m, 6H).

Тестовый пример 1

[141] 1. Цель эксперимента

[142] Целью данного эксперимента являлись испытание агонистического эффекта соединения, представленного формулой (I), в отношении рецептора KOR человека (h-KOR) и оценка активности in vitro соединения в соответствии со значением EC₅₀.

[143] 2. Испытание активности в отношении h-KOR

[144] 2.1. Цель эксперимента

[145] Соединение по настоящему изобретению может активировать рецептор h-KOR, снижая тем самым уровень внутриклеточного сАМР; вторичный мессенджер сАМР входит в ядро и объединяется с CRE ДНК для инициирования экспрессии люциферазы ниже по ходу, при этом люцифераза реагирует со своим субстратом, излучая флуоресценцию, и активность возбуждения соединения отображается с помощью измерения сигнала флуоресценции.

[146] 2.2. Экспериментальные способы

[147] Активность соединения, представленного формулой (I), активирующего h-KOR, влияющего тем самым на уровень последующего сАМР, испытывали посредством следующего способа.

[148] 2.2.1 Экспериментальные материалы и устройство

[149] 1) Экспериментальное устройство

[150] 1. Считывающее устройство для микропланшетов (РЕ, Vector3)

[151] 2) Экспериментальные материалы

[152] 2.2.2. Экспериментальные стадии

[153] 1. Получение моноклональных клеточных линий HEK293/KOR/CRE

[154] KOR/pcDNA3.1(+) и CRE/pGL4.29 человека переносили в клеточные линии HEK293 путем добавления G418 и гигромицина к культуральной среде и моноклональные клеточные линии HEK293/KOR/CRE отбирали из 96-луночного планшета.

[155] 2. Эксперимент в отношении активации эффектов соединения, представленного формулой (I), в отношении h-KOR

[156] Моноклональные клеточные линии HEK293/h-KOR/CRE инкубировали в среде DMEM/c высоким содержанием глюкозы (10% FBS, 1 мг/мл G418, 200 мкг/мл гигромицина, равномерно смешанных) и пассировали каждые 3 дня. В день эксперимента получали клеточную суспензию со свежей средой для клеточной культуры, инкубировали 96-луночный планшет (BD, № 356692) с 20000 клеток/лунка и осуществляли инкубацию при 37°C с 5% диоксида углерода. На следующий день соединение, представленное формулой (I), растворяли в чистом DMSO в концентрации 20 мМ, а затем получали первую концентрацию 200 нМ с DMSO, затем соединение последовательно разбавляли в 3 раза до 8 концентраций и добавляли 90 мкл DMSO в пустые и контрольные лунки; затем культуральную среду разбавляли в 20 раз с помощью DMEM/c высоким содержанием глюкозы (SH30243.01B, Hyclone), содержащей 10 мкМ форсколина. Планшет для культивирования клеток, инокулированный в первый день, вынимали, затем в каждую лунку добавляли по 10 мкл разбавленного лекарственного средства или контроля (0,5% DMSO), осторожно встряхивали, и перемешивали, и помещали при 37°С на 4 часа. В каждую лунку 96-луночного планшета добавляли по 100 мкл раствора для выявления люциферазы (Promega, № Е6110) и планшет оставляли при комнатной температуре на 5 минут, значение хемилюминесценции измеряли с помощью Victor3.0. Значение EC₅₀ для соединения рассчитывали с помощью программного обеспечения Graphpad Prism в соответствии с концентрацией соединения и соответствующим значением сигнала.

[157] 2.3. Результаты испытаний

[158] Соединение, представленное формулой (I), характеризуется ЕС50=1 пМ при активации рецептора h-KOR для воздействия на уровень сАМР, и при этом соединение характеризуется очевидным активирующим эффектом в отношении рецептора h-KOR.

Фармакокинетическая оценка

Тестовый пример 2

Фармакокинетическое испытание на собаках

[159] 1. Краткое описание

[160] В качестве подопытных животных использовали собак породы бигль, и для определения концентрации лекарственного средства в плазме крови собак породы бигль в разные моменты времени после внутривенного введения соединения, представленного формулой (I), применяли способы LC/MS/MS. Исследовать фармакокинетическое поведение соединения по настоящему изобретению у собак породы бигль и оценить его фармакокинетические характеристики.

[161] 2. План испытаний

[162] 2.1. Испытуемые лекарственные средства

[163] Соединение, представленное формулой (I)

[164] 2.2. Экспериментальные животные

[165] 3 самца собак породы бигль, предоставленные Medicilon Pharmaceutical Technology Со, Ltd (Шанхай), в каждой группе.

[166] 2.3. Получение лекарственного средства

[167] Подходящее количество образца взвешивали и добавляли 100% физиологический раствор для растворения.

[168] 2.4. Введение

[169] 3 самца собак породы бигль для одной группы; внутривенное введение в объеме 2 мл/кг после голодания в течение одной ночи.

[170] 3. Осуществление испытания

[171] Для группы внутривенного введения отбирали 1,0 мл крови из яремной вены до введения и через 5 мин., 15 мин., 0,5, 1,0, 2,0, 4,0, 8,0, 12,0, 24,0 ч. после введения, затем помещали в тестовую пробирку с гепарином, центрифугировали при 3500 об./мин. в течение 10 минут для отделения плазмы крови и хранили при -80°С.

[172] Способ LC/MS/MS применяли для определения содержания соединения в плазме крови собаки породы бигль после внутривенного введения.

[173] 4. Фармакокинетические параметры в отношении собак породы бигль

[174] Фармакокинетические параметры соединения, представленного формулой (I), у собак породы бигль были такими, как представлены ниже.

[175] Вывод: соединение характеризовалось хорошими фармакокинетическими свойствами у собак породы бигль.

Тестовый пример 3. Экспериментальный отчет по агонистам KOR при лечении воспалительной боли, вызванной каррагенаном у крыс

[176] 1. Цель эксперимента

[177] Создание модели воспалительной боли от каррагенана у крыс и оценка терапевтического эффект агониста KOR в отношении воспалительной боли у крыс.

[178] 2. Экспериментальные способы и материалы

[179] 2.1. Лабораторные животные и условия кормления

[180] Самцов крыс Wistar для эксперимента приобретали у Shanghai Slack Experimental Animal Co, Ltd. (Шанхай, Китай, сертификат №2015000513408, лицензия SCXK (Шанхай) 2012-0002, 150-180 г на момент покупки, 5 крыс/клетка, настройка цикла свет/темнота 12/12 часов, постоянная температура 23±1°С, влажность 50-60%, свободное потребление воды. После того, как животных приобретали, их растили в течение более чем 7 дней, чтобы начать эксперимент.

[181] 2.2. Экспериментальные лекарственные средства

[182] Соединения, представленные формулой (I);

[183] λ-каррагенан: номер партии BCBP8978V, сигма-продукт;

[184] 0,9% раствор хлорида натрия (500 мл: 4,5 г).

[185] 1% λ-каррагенан смешивали с физиологическим раствором и перемешивали в течение ночи с образованием желеобразной суспензии.

[186] Дозу лекарственного средства рассчитывали в пересчете на основание.

[187] 2.3. Схема эксперимента и способы

[188] 2.3.1. Группировка животных

[189] После выращивания крыс разделяли на следующие группы

[190] Примечание: NS: физиологический раствор для получения раствора каррагенана; i.v.: внутривенная инъекция; s.c: подкожная инъекция.

[191] 2.3.2. Экспериментальные способы^[1]

[192] Экспериментальный способ был улучшен в соответствии со способом в документе 1 (Kazunari Nakao et al.). Перед экспериментом с воспалительной болью крыс случайным образом разделяли на следующие группы в соответствии с весом тела: холостая контрольная группа, модельная группа, группа 0,1 мг/кг и группа 0,3 мг/кг. В каждой группе было 8 крыс. Модель воспалительной боли создавали с помощью подкожной инъекции 1% каррагенана (100 мкл) в подушечку стопы крыс линии Wistar. Через 4 часа крыс проверяли на подошвенную чувствительность для оценки их порога механической боли, крысам однократно вводили в хвостовую вену (1 мл/кг) за 30 мин. до испытания и контрольной группе и модельной группе давали соответствующие растворители.

[193] Примечание: ссылка 1, CJ-023423, a Novel, Potent and Selective Prostaglandin KOR Receptor Antagonist with Anti-hyperalgesic Properties [J]. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 2007, 322(2):686-694.

[194] 2.4. Экспериментальное устройство

[195] Electronic Von Frey: UGO BASILE, тип 38450.

[196] 2.5. Выражение данных и статистическая обработка

[197] Экспериментальные данные выражали с помощью среднего значения ± стандартное отклонение (S.D.). Статистическое сравнение проводили с помощью т-теста в программном обеспечении Excel. Данные модельной группы и холостой контрольной группы анализировали и сравнивали, чтобы увидеть, было ли какое-либо значимое статистическое значение. *Р<0,05 указывает на то, что между модельными группами и контрольной группой были значительные различия, **Р<0,01 указывает на то, что между модельными группами и контрольной группой были весьма значительные различия. # Р<0,05 указывает на то, что между модельными группами и группами введения были значительные различия, и ##Р<0,01 указывает на то, что между модельными группами и группами введения были весьма значительные различия.

[198] 3. Результаты: порог чувствительности у крыс в холостой контрольной группе составлял около 20 г, а в группе сравнения составлял 7,6 г, по сравнению с холостой контрольной группой порог чувствительности у крыс в модельной группе значительно снижался (р<0,01); по сравнению с модельной группой все лекарственные средства могут значительно повышать порог чувствительности у крыс с воспалением (Р<0,01), значения порога чувствительности при 0,1 мг/кг и 0,3 мг/кг составляли соответственно 13,7 г и 23,2 г, а диапазоны увеличения составляли соответственно 79,5% и 204,5% с очевидной зависимостью от дозы (фиг. 1).

[199] 4. Обсуждение

[200] λ-Каррагенан представлял собой коллоидное вещество, экстрагированное из водного растения каррагенан, которое обладает аллергическим стимулирующим эффектом. Один только каррагенан в эксперименте может вызывать воспаление и причинять боль. В настоящем эксперименте модель воспалительной боли, вызванной каррагенаном, создавали для наблюдения за изменением порога чувствительности после введения агониста KOR крысам и для оценки обезболивающего эффекта лекарственных средств в отношении подострой воспалительной боли и интенсивности его действия. В эксперименте реакцию крыс на болезненность измеряли с помощью Electronic Von Frey, при этом Electronic Von Frey (e-VF) был первоначально разработан Ugo Basile для оценки аллергии и боли, вызванной прикосновением, у мышей и крыс. Прибор может автоматически регистрировать время стимуляции и интенсивность стимуляции животных. Уникальная конструкция треугольной призмы дает возможность очень легко наблюдать подошвенную область испытуемого животного во время эксперимента. Во время испытания оборудование способно автоматически определять, как испытуемое животное отводит испытуемый коготь, а также возможно ручное определение с помощью ножного переключателя. Локализация является более концентрированной и больше подходит для измерения локальной боли и невропатической боли.

[201] 5. Заключение

[202] Испытанные лекарственные средства способны облегчить воспалительную боль у крыс и являются дозозависимыми.

1. Фармацевтически приемлемая соль соединения 4-амино-1-((2R,5R,8R,14R)-2-(4-аминобутил)-8-бензил-5-изобутил-4,7,10-триоксо-14-фенил-3,6,9,12-тетраазапентадекан-1-ацил)пиперидин-4-карбоновой кислоты, представленного формулой (I),

где фармацевтически приемлемая соль представляет собой ацетат, гидрохлорид, фосфат, цитрат, бензоат или фумарат.

2. Фармацевтически приемлемая соль по п. 1, где молярное соотношение соединения, представленного формулой (I), и кислоты (радикала) составляет от 1:1 до 1:5.

3. Фармацевтически приемлемая соль по п. 2, где молярное соотношение соединения, представленного формулой (I), и кислоты (радикала) составляет 1:1, 1:2 или 1:3.

4. Фармацевтически приемлемая соль по п. 2, где

молярное соотношение соединения, представленного формулой (I), и молекулы хлорида водорода составляет 1:1, 1:2 или 1:3;

молярное соотношение соединения, представленного формулой (I), и молекулы фосфорной кислоты составляет 1:3;

молярное соотношение соединения, представленного формулой (I), и молекулы лимонной кислоты составляет 1:1, 1:2 или 1:3;

молярное соотношение соединения, представленного формулой (I), и молекулы бензойной кислоты составляет 1:2;

молярное соотношение соединения, представленного формулой (I), и молекулы фумаровой кислоты составляет 1:2.

5. Фармацевтически приемлемая соль по п. 4, где

молярное соотношение соединения, представленного формулой (I), и молекулы хлорида водорода составляет 1:3;

молярное соотношение соединения, представленного формулой (I), и молекулы лимонной кислоты составляет 1:1.

6. Способ получения фармацевтически приемлемой соли по п. 3, где способ включает стадию осуществления реакции солеобразования соединения, представленного формулой (I), с кислотой, при этом кислота выбрана из хлорида водорода, фосфорной кислоты, лимонной кислоты, бензойной кислоты и фумаровой кислоты.

7. Способ по п. 6, где реакцию солеобразования осуществляют в растворителе, и при этом растворитель представляет собой спиртовой растворитель, растворитель на основе галогенированного углеводорода, эфирный растворитель, растворитель на основе нитрила, смешанный растворитель из спиртового растворителя и эфирного растворителя или смешанный растворитель из растворителя на основе галогенированного углеводорода и эфирного растворителя; причем спиртовой растворитель представляет собой метанол, этанол, изопропанол или н-бутанол, эфирный растворитель представляет собой диэтиловый эфир, метил-трет-бутиловый эфир, изопропиловый эфир или диоксан, растворитель на основе нитрила представляет собой ацетонитрил, и растворитель на основе галогенированного углеводорода представляет собой дихлорметан,

смешанный растворитель из спиртового растворителя и эфирного растворителя представляет собой смешанный растворитель из этанола/изопропилового эфира или смешанный растворитель из этанола/изопропанола/изопропилового эфира,

смешанный растворитель из растворителя на основе галогенированного углеводорода и эфирного растворителя представляет собой смешанный растворитель из дихлорметана/изопропилового эфира.

8. Способ по п. 7, где в случае, если реакция солеобразования завершена, дополнительно включают стадию добавления антирастворителя, выпаривания растворителя или охлаждения, где антирастворитель представляет собой эфирный растворитель, и эфирный растворитель представляет собой диэтиловый эфир, метил-трет-бутиловый эфир, изопропиловый эфир или диоксан.

9. Способ получения фармацевтически приемлемой соли по п. 4, где способ предусматривает способ превращения соли, включающий превращение трифторацетата в ацетат, и также предусматривает подвергание трифторацетата соединения, представленного формулой (I), высокоэффективной жидкостной хроматографии и элюирование с помощью воды, содержащей уксусную кислоту в качестве элюента, концентрирование и высушивание с получением ацетата соединения, представленного формулой (I), при этом элюент дополнительно содержит ацетат аммония, ацетонитрил или смесь ацетат аммония/ацетонитрил.

10. Способ по п. 9, где объемная доля уксусной кислоты в элюенте составляет 0,1%.

11. Фармацевтическая композиция для лечения сопутствующего заболевания, опосредованного агонистом κ-опиоидного рецептора, содержащая терапевтически эффективное количество фармацевтически приемлемой соли по любому из пп. 1-3 и необязательно фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или наполнитель.

12. Применение фармацевтически приемлемой соли по любому из пп. 1-3 или фармацевтической композиции по п. 11 в изготовлении лекарственного средства для предупреждения и/или лечения сопутствующего заболевания, опосредованного агонистом κ-опиоидного рецептора; при этом заболевание выбрано из группы, состоящей из боли, воспаления, зуда, отека, гипонатриемии, гипокалиемии, кишечной непроходимости, кашля и глаукомы; причем боль выбрана из группы, состоящей из невропатической боли, боли в туловище, висцеральной боли, кожной боли, боли в суставах, боли при камнях в почках, спазма матки, дисменореи, эндометриоза, диспепсии, послеоперационной боли, боли после медицинского лечения, глазной боли, боли вследствие отита, взрывной боли при раке и боли, ассоциированной с расстройством GI-тракта.