Композиции и способы для борьбы с фузариозом

Группа изобретений относится к биотехнологии и сельскому хозяйству. Предложены выделенный штамм Bacillus amyloliquefaciens NRRL B-50760, обладающий подавляющей активностью в отношении фузариоза, композиции и способы с использованием указанного штамма. Способ предотвращения развития фузариоза включает выращивание микробного штамма или его культуры в среде для роста или почве растения или включает нанесение на растение или на окружающую его среду эффективного количества микробного штамма или его культуры. Также предложены композиции для подавления фузариоза, содержащие микробный штамм или его культуру, семя, резистентное к инфекции грибка Fusarium. Изобретения эффективны в борьбе с фузариозом злаковых растений, таких как пшеница и ячмень. 8 н. и 11 з.п. ф-лы, 7 табл., 11 пр.

 

[0001] Содержание прилагаемого Перечня последовательностей включено здесь во всей его полноте посредством ссылки. Прилагаемый файл под наименованием «SGI1520-lWO_ST25.txt» был создан 24 июля 2012 г. и имеет размер 55 Kб. Этот файл открыт для доступа с помощью Microsoft Word на компьютере с операционной системой Window OS.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

[0002] Настоящее изобретение относится к биологическим методам борьбы с фитопатогенными болезнями. В частности, изобретение относится к композициям и способам, которые могут использоваться в борьбе с фузариозом злаковых растений, таких как пшеница и ячмень.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[0003] Фузариоз, известный также как парша, плесневидная розовая гниль и фузариоз, является болезнью, опустошающей сельскохозяйственные угодья пшеницы, ячменя и многих других злаковых культур во всем мире и, особенно, в США, Европе и Китае. Эта болезнь может достигать эпидемических масштабов и наносить обширные уроны зерновым культурам, особенно пшенице и ячменю, во влажных и полувлажных ареалах выращивания хлебных злаков, включая Индию, Россию, Францию, Германию и Великобританию. В частности, фузариоз или фузариоз пшеницы является одной из наиболее убыточных болезней пшеницы в Соединенных Штатах. В общенациональных масштабах эта болезнь, развившаяся на Среднем Западе и на Высоких Равнинах, принесла производству пшеницы потери, достигающие миллионов долларов, и стала, таким образом, главным препятствием для успешного функционирования этой индустрии в последние годы. Фузариоз, помимо пшеницы, поражает также ячмень, овес, кукурузу и множество других зерновых культур, и репродуцируется на них.

[0004] Эта болезнь может вызываться множеством различных фитопатогенов и, в первую очередь, несколькими видами грибов рода Fusarium. В число вероятных возбудителей фузариоза пшеницы входит множество различных видов Fusarium, например, F. culmorum, F. graminearum (телеоморф, Gibberella zeae), F. avenaceum (телеоморф, G. avenacea), F. poae, а также патогены, не относящиеся к роду Fusarium, такие как Microdochium nivale (телеоморф, Monographella nivalis), и Microdochium majus. В Соединенных Штатах, Европе и других наиболее важных агрономических ареалах мира доминирующим возбудителем фузариоза выступает Fusarium graminearum (телеоморф, Gibberella zeae в буквальном смысле).

[0005] Эти патогены, как правило, выживают на растительных остатках. На колоски злаков они попадают и поражают их во время цветения, останавливая или частично задерживая развитие зерна в колосе злака. В результате, попавший на растение патоген может убить часть колоса либо весь колос. Некоторые инфицированные семена имеют настолько низкую энергию прорастания, что зачастую не могут прорасти. Проросшие инфицированные семена часто рано погибают в фазе прорастания вследствие пелликуляриоза или корневой гнили, вызывающих плохой хлебостой выросшего злака. Здоровые сеянцы могут инфицироваться также в фазе появления всходов. Помимо плохого, неэкономичного хлебостоя, потери урожая вследствие поражения патогеном могут быть довольно высокими, если условия благоприятствуют развитию болезни.

[0006] Грибные патогены рода Fusarium распространяются по ареалам культивирования злаков во всем мире и наносят особенно большой ущерб в местах выпадения больших осадков в период между цветением и наливом зерна. Если возбудителем заболевания является Fusarium graminearum, то данная болезнь требует первоочередного вмешательства, не только потому что она снижает коммерческие показатели пораженного зерна, вдобавок к прямым потерям урожая, но также потому, что заражение грибом Fusarium может приводить к накоплению микотоксинов, трихотеценов, в зернах, создавая, таким образом, угрозу здоровью людей и скота. Трихотецены представляют собой главное микотоксиновое загрязнение зерновых культур во всем мире, способное у нежвачных животных вызывать отказ от пищи, рвоту, диарею и потерю веса и создавать угрозу здоровью для других животных и людей в случаях высоких уровней воздействия этих токсинов. В Соединенных Штатах эта угроза возросла еще больше вследствие недавно произошедшего смещения в штаммах F. graminearum в сторону повышения выработки и силы токсинов. Микотоксинами, обнаруживаемыми чаще всего, являются дезоксиниваленол (DON, известный также как вомитоксин) и зеараленон (ZEA). Дезоксиниваленол является особенно опасным токсином, вызывающим желудочно-кишечные расстройства, которые сопровождаются кровотечениями и другими тяжелыми состояниями у людей и животных, принявших в пищу инфицированные зерна, и в некоторых случаях могут привести к смерти. Поскольку дезоксиниваленол в общем случае является стойким к изменениям pH и к высоким температурам, дезинтоксикация может проходить очень тяжело. Таким образом, зерна, загрязненные выше определенного уровня, не могут использоваться в пивоварении, переработке, корме для скота и, следовательно, должны удаляться в отходы.

[0007] На сегодняшний день разработано множество различных стратегий по борьбе с фузариозом у сельскохозяйственных культур. Наиболее перспективными среди них являются химические методы, разработка стойких сортов культур, а также традиционные методы севооборота и обработки полей. Среди этих направлений определенную эффективность в снижении заражения фузариозом можно получить от применения химических пестицидов, однако остатки фунгицидов, использованных на поздних стадиях роста культур, как правило, в периоды цветения, всего за несколько недель до сбора урожая, снижают привлекательность этих методов. С другой стороны, альтернативный подход в борьбе с этой болезнью представляют методы традиционной селекции и генной инженерии, благодаря которым происходит заметный прогресс в разработках стойких сортов агрокультур. Генная инженерия позволяет изменять продуцирование фитогормона и осуществлять манипуляции в его сигнальном пути. Достигнутый в последние годы прогресс в области традиционной селекции позволил значительно продвинуться в понимании генетических основ стойкости к фузариозу и получить сведения о множестве генов и локусах количественных признаков (QTL: quantitative trait loci), придающих этой стойкости. Однако прогресс в повышении стойкости агрокультур к фузариозу был медленным, что объясняется, в первую очередь, трудностью изучения данной болезни. Фактически о механизмах, определяющих стойкость или восприимчивость растений к фузариозу, в настоящее время известно сравнительно мало. Кроме того, генетическое разнообразие грибов вида Fusarium, которые являются преобладающими возбудителями болезни, часто создает проблемы в определении того, насколько длительной должна быть эффективность химических фунгицидов и насколько стойкими должны быть защищаемые агрокультуры. В результате, в настоящее время практически все сорта пшеницы в агропромышленном производстве остаются уязвимыми для инфицирования.

[0008] Кроме того, несмотря на определенный успех в борьбе с фузариозом, который могут давать традиционные методы пахотной обработки с закапыванием пожнивных остатков, инфицированных возбудителем, например, F. graminearum, обычная вспашка почвы после жнив является несовместимой с устоявшейся практикой охраны почв, то есть с условием минимальной пахотной обработки. Принимая во внимание вероятность разброса инокулята на большие расстояния и то, что различные культуры могут становиться альтернативными хозяевами патогенов, метод севооборота нередко оказывается неприемлемым. Помимо загрязнения окружающей среды пестицидами, их использование может порождать проблемы, связанные с пестицидостойкостью. Кроме того, с их использованием могут быть связаны также зарегистрированные случаи роста содержания DON в зернах. Помимо этого, расходы и растущие проблемы как в государственном, так и в частном секторах, связанные с загрязнением пестицидами окружающей среды и требованиями к безопасности пищевых продуктов, делают данный способ борьбы с такими болезнями менее привлекательным и заставляют в уходе за агрокультурами применять пестициды как можно меньше.

[0009] Подводя итог, можно сказать, что, несмотря на существенное продвижение в области разработок способов борьбы с фузариозом, уменьшение влияния этой губительной болезни на производство и качество зерна пока остается нерешенной проблемой. Следовательно, для повышения продуктивности производства и качества многих зерновых культур важно вести поиск и разработку новых способов борьбы с фузариозом. Эти проблемы требуют срочного решения не только в Соединенных Штатах, но и на всем земном шаре, включая Азию и Европу.

[0010] Борьба с фузариозом с помощью биологических агентов стала привлекать к себе внимание, начиная с середины 1990-х годов. Биологические агенты для такой борьбы (BCA: Biological control agents), несмотря на то что количество их в настоящее время весьма ограничено, могут, при своей невраждебности к окружающей среде, быть очень эффективными в снижении уровня заболеваемости, инициируемой патогенами рода Fusarium. Общественное признание, совместимость с другими средствами борьбы с болезнями агрокультур, долговечность и стойкость - все это, наряду с другими положительными факторами, говорит о необходимости разработок стратегий биологической борьбы с фузариозом. Средства такой биологической борьбы могут сыграть важную роль в органической зерновой индустрии. В обычном производстве зерна такие средства могут продлить защиту колосков на время после фазы цветения, когда химические фунгициды применяться больше не могут. На сегодняшний день, в области биологической борьбы уже достигнут значительный прогресс. Так, например, некоторые штаммы споро-продуцирующих бактерий (например, видов Bacillus и Pseudomonas) и дрожжей (например, вида Cryptococcus) демонстрируют качества, требующиеся для борьбы с фузариозом и для снижения микотоксинового загрязнения. Однако, несмотря на этот прогресс, остается неудовлетворенной потребность в улучшенных микроорганизмах для их использования в борьбе с фузариозом. Хотя сами по себе BCA-средства уже признаны более подходящим инструментом для борьбы с фитопатогенами, а BCA-продукты находят на рынке значительно более широкий сбыт, чем когда-либо ранее, все же на сегодняшний день было предпринято совсем мало попыток разработать стратегии и антагонистический микроорганизм для биологической борьбы с фузариозом. Кроме того, жизненный цикл рода Fusarium и других возбудителей фузариоза указывает на то, что эти патогены потенциально могут быть подходящими для использования их в методах биоборьбы с помощью антагонистических микроорганизмов на различных фазах роста и развития. Таким образом, существует потребность в поиске новых средств биологической борьбы, желательно с различными способами активности, а также способов биоборьбы, которые бы позволяли эффективно предотвращать или подавлять развитие фузариоза.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0011] Изобретение относится к композициям, содержащим микробиологические штаммы и культуры. Некоторые штаммы, культуры и их композиции могут использоваться для борьбы с фузариозом, например, различных сельскохозяйственных культур, включая пшеницу и другие зерновые. Изобретение также относится к композициям для биологической борьбы и способам использования этих композиций для предотвращения возникновения, подавления развития или лечения вызванной патогенами болезни и для сохранения урожая. Изобретение также относится к способам использования таких композиций в качестве средств биологической борьбы в комбинации с другими эффективными в сельском хозяйстве соединениями или композициями для борьбы с вредными фитопатогенами.

[0012] В одном из аспектов настоящее изобретение относится к выделенным микробным штаммам, обладающим супрессорной активностью по отношению к фузариозу. Микробные штаммы в соответствии с этим аспектом выбираются из группы, состоящей из видов Microbacterium, Bacillus, Mycosphaerella и Variovorax. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения микробные штаммы выбираются из группы, состоящей из вида Mycosphaerella штамм SGI-010-HI 1 (депозит NRRL 50471), вида Microbacterium штамм SGI-014-C06 (депозит NRRL B-50470), вида Variovorax штамм SGI-014-G01 (депозит NRRL B-50469), вида Bacillus штамм SGI-Q15-F03 (депозит NRRL B-50760), вида Bacillus штамм SGI-015-H06 (депозит NRRL B-50761) и их вариантов, обладающих пестицидной активностью. Микробный штамм в соответствии с другими предпочтительными вариантами осуществления может содержать последовательность ДНК, демонстрирующую по меньшей мере 85% идентичность любой из нуклеотидных последовательностей, приведенных в прилагаемом Перечне последовательностей. Изобретение также относится к биологически чистым культурам и обогащенным культурам описанных здесь микробных штаммов.

[0013] В соответствии с другим аспектом настоящее изобретение относится к композициям, содержащим микробный штамм по изобретению или его культуру и эффективное для сельскохозяйственного производства количество соединения или композиции, выбранных из группы, состоящей из акарицида, бактерицида, фунгицида, инсектицида, микробицида, нематицида, пестицида и удобрения. Указанные композиции в некоторых вариантах осуществления этого аспекта могут быть получены в форме препарата, выбранного из группы, состоящей из эмульсии, коллоида, пылевидного препарата, частицы, гранулы, порошка, спрея и раствора; в некоторых других вариантах осуществления указанные композиции могут содержать носитель. В одном из предпочтительных вариантов носитель является приемлемым для сельскохозяйственного производства. В одном из особенно предпочтительных вариантов осуществления изобретения носителем является семя растения. В других предпочтительных вариантах композицией является препарат покрытия семени. Кроме того, изобретение относится к семенам, покрытым композицией в соответствии с настоящим изобретением.

[0014] В другом аспекте настоящее изобретение относится к способам предотвращения, ингибирования или обработки против развития фитопатогена. Эти способы включают выращивание микробного штамма по изобретению или его культуры в питательной среде или почве растения-хозяина перед или одновременно с выращиванием растения-хозяина в питательной среде или почве, где в некоторых предпочтительных вариантах осуществления данного аспекта изобретения, фитопатоген вызывает фузариоз. В одном из особенно предпочтительных вариантов осуществления фитопатогеном является Fusarium graminearum.

[0015] В другом аспекте настоящее изобретение относится к способам предотвращения, ингибирования или обработки против развития фузариоза растения. Эти способы включают поставку к растению или к среде, окружающей растение, эффективного количества микробного штамма по изобретению или его культуры. В одном из вариантов осуществления изобретения такой фузариоз вызывается грибом Fusarium graminearum. В некоторых вариантах осуществления этого аспекта микробный штамм или его культуру поставляют к почве, семени, корням, цветку, листу, части растения или всему растению, где в предпочтительном варианте растение является восприимчивым к Fusarium graminearum. В некоторых других предпочтительных вариантах осуществления изобретения растением является пшеница, кукуруза, ячмень или овес, в другом предпочтительном варианте осуществления микробный штамм по изобретению или его культуру вводят в растение в качестве эндофита.

[0016] В следующем аспекте изобретение относится к растениям неприродного происхождения. Растения неприродного происхождения искусственно инфицируются микробным штаммом по изобретению или его культурой. Кроме того, в некоторых предпочтительных вариантах осуществления этого аспекта изобретение относится к семени, репродуктивной ткани, вегетативной ткани, частям растения и потомству растения неприродного происхождения.

[0017] В другом аспекте изобретение относится к способу получения сельскохозяйственной композиции. Этот способ включает инокуляцию микробного штамма в соответствии с настоящим изобретением или его культуры в субстрат или на субстрат и выращивание его при температуре 1-37°C до получения клеток или спор в количестве по меньшей мере 10²-10³ на миллилитр или на грамм.

[0018] Этим и другим целям и признакам данного изобретения дано более полное разъяснение в нижеследующем подробном описании и формуле изобретения.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Определения

[0019] Если не указано иного, то все используемые в настоящем описании термины, относящиеся к данной области техники, условные обозначения и другие научные термины несут общепринятые значения, известные специалистам в области техники, к которой относится настоящее изобретение. Некоторым терминам с общеизвестными значениями здесь даны определения в целях избегания разночтения и/или для облегчения ссылок, и включение здесь таких определений не должно рассматриваться как представляющее существенное отличие от значений, общепринятых среди специалистов. Многие способы и процедуры, которые здесь описаны или на которые делаются ссылки, должны быть специалистам хорошо известными и широко используемыми ими в соответствии с обычными методологиями.

[0020] Если из контекста данного описания ясно не вытекает иного, то единственное число существительных предполагает равным образом их значения во множественном числе. Например, термин «клетка» может означать как одну, так и множество клеток, включая их смеси.

[0021] Выражения «антагонистический микроорганизм» и «микробный антагонист» - оба означают микроорганизм, штамм которого показывает степень ингибирования фузариоза, которая на статистически значимом уровне превышает степень ингибирования от необработанного контроля.

[0022] Антибиотик: термин «антибиотик» в данном описании означает субстанцию, способную убить или ингибировать рост микроорганизма. Антибиотики могут продуцироваться по меньшей мере одним из таких источников: 1) микроорганизмом, 2) процессом синтеза и 3) процессом полусинтеза. Антибиотиком может быть микроорганизм, выделяющий летучее органическое соединение. Кроме того, антибиотиком может быть летучее органическое соединение, выделяемое микроорганизмом.

[0023] Бактерицидный: термин «бактерицидный» в данном описании означает способность композиции или субстанции повысить смертность бактерий или ингибировать скорость их роста. Ингибирование скорости роста бактерий в большинстве случаев может оцениваться по уменьшению количества жизнеспособных бактериальных клеток с течением времени.

[0024] Биологическая борьба: термин «биологическая борьба» и его сокращенная форма «биоборьба» в данном описании означают борьбу с патогенном, либо с насекомым, либо с любым другим нежелательным организмом с помощью по меньшей мере одного другого организма, не являющегося человеком. В качестве примера известного механизма биологической борьбы можно привести использование микроорганизмов, которые борются с корневой гнилью путем вытеснения грибов из конкуренции за пространство на поверхности корня, или микроорганизмов, которые либо ингибируют рост патогена, либо убивают его. «Растением-хозяином» в контексте биологической борьбы является растение, восприимчивое к болезни, вызываемой данным патогеном. «Растением-хозяином» в контексте отделения принадлежащего к виду грибов организма от его естественной среды является такое растение, которое поддерживает рост гриба, то есть, например, растение вида, для которого гриб является эндофитом.

[0025] Термин «зерновой» в данном описании означает любой зерновой вид, который может быть восприимчивым к фузариозу. К числу таких восприимчивых зерновых культур относятся пшеница, ячмень, овес и тритикале; при этом пшеница и ячмень являются двумя культурами, для которых данная болезнь представляет особенно значительную экономическую проблему.

[0026] Термин «эффективное количество» означает количество, достаточное для получения полезных или целевых результатов. В отношении борьбы с болезнью, к лечебной обработке, ингибированию болезни или защиты от нее, эффективным является количество, достаточное для подавления, стабилизации, поворота хода болезни вспять, замедления или задержания развития инфекции-мишени или болезненного состояния. Таким образом, выражение «эффективное количество» в данном описании означает такое количество антагонистической обработки, которое является необходимым для снижения уровня развития патогена и/или уровня вызванной патогеном болезни по сравнению с уровнем, который наблюдается у необработанного контроля. Как правило, эффективное количество данной антагонистической обработки дает снижение по меньшей мере на: 20%; как правило, от 30 до 40% и больше; как правило, от 50 до 60% и больше; как правило, от 70 до 80% и больше; или, как правило, от 90 до 95% по сравнению с уровнем болезни и/или уровнем развития патогена, наблюдаемым у необработанного контроля в соответствующих условиях лечебной обработки. Эффективное количество может поставляться за один или больше приемов. Фактическая скорость поставки жидкого препарата обычно лежит в пределах приблизительно от минимум 1×10³ до 1×10¹⁰ жизнеспособных клеток/мл и предпочтительно приблизительно от 1×10⁶ до 5×10⁹ жизнеспособных клеток/мл. В большинстве состояний антагонистические микробные штаммы по изобретению, описанные в Примерах ниже, будут оптимально эффективными при скорости поставки в интервале приблизительно от 1×10⁶ до 1×10⁹ жизнеспособных клеток/мл, если при поставке обеспечивается практически однородный контакт по меньшей мере приблизительно 50% тканей растения. Если антагонисты поставляются в форме твердого препарата, то скорость поставки должна регулироваться таким образом, чтобы обеспечивать количество жизнеспособных клеток на единицу площади поверхности ткани растения, сравнимое с получаемым при вышеупомянутых величинах скорости обработки жидкостью. Как правило, средства биологической борьбы согласно изобретению являются биологически эффективными, если они поставляются в концентрации выше 10⁶ КОЕ/г (колониеобразующих единиц на грамм), предпочтительно, если выше 10⁷ КОЕ/г, еще предпочтительнее, если выше 10⁸ КОЕ/г, и наиболее предпочтительно, если в концентрации 10⁹ КОЕ/г.

[0027] Далее, выражение «эффективный микробный антагонист», используемое по отношению к микроорганизму, означает, что данный микробный штамм демонстрирует степень ингибирования фузариоза, которая на статистически значимом уровне превышает степень ингибирования, наблюдаемую у необработанного контроля. Как правило, эффективный микробный антагонист обладает способностью давать снижение по меньшей мере на: 20% и больше; как правило, от 30 до 40% и больше; как правило, от 50 до 60% и больше; как правило, от 70 до 80% и больше; как правило, от 90 до 95% относительно уровня болезни и/или уровня развития патогена, имеющего место в необработанном контроле при соответствующих условиях лечебной обработки.

[0028] Композиция: термин «композиция» означает комбинацию активного агента по меньшей мере с другим соединением, носителем или композицией, инертным(-й) (например, детектируемым агентом или меткой, жидким носителем и т.п.) или активным, например, пестицидом.

[0029] Выделенный микробный штамм, выделенная культура, биологически чистая культура и обогащенная культура: используемый в данном описании термин «выделенный» в применении к микроорганизму (например, бактерии или микрогрибу) означает микроорганизм, который был отделен и/или очищен от среды, где он природно возникает. Аналогично этому, термин «выделенный штамм» микроба означает штамм, который был отделен и/или очищен от своей естественной среды. Таким образом, термин «выделенный микроорганизм» не включает в свое значение микроорганизм, пребывающий в среде, в которой он нормально возникает. Кроме того, термин «выделенный» не обязательно отражает степень, до которой данный микроб был очищен. Термин «по существу чистая культура» микробного штамма означает культуру, которая по существу не содержит других микробов, кроме целевого микробного штамма или штаммов. Другими словами, «по существу чистая культура» микробного штамма по существу не содержит загрязнений, которые могут включать микробные загрязнения, а также нежелательные химические загрязнения. Кроме того, используемый здесь термин «биологически чистый» штамм означает штамм, выделенный из материалов, с которыми он нормально ассоциируется в природных условиях. Следует заметить, что штамм, ассоциированный с другими штаммами или соединениями, или материалами, которые в природных условиях нормально не встречаются, также имеет определение «биологически чистый». Вполне понятно, что монокультура того или иного штамма является «биологически чистой». Используемый здесь термин «обогащенная культура» выделенного микробного штамма означает микробную культуру, содержащую более 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 95% выделенного штамма.

[0030] Используемый здесь термин «эндофит» означает эндосимбионт, живущий внутри растения на протяжении по меньшей мере части своей жизни, не вызывая очевидной болезни. Трансмиссия эндофитов может происходить либо по вертикали (непосредственно от родителя к потомству) либо по горизонтали (от индивида к неродственному индивиду). Переданные по вертикали грибные эндофиты являются, как правило, бесполыми и переносятся от материнского растения к потомству путем проникновения в семена хозяина через грибные гифы. Бактериальные эндофиты могут переноситься по вертикали также от семян к саженцам (Ferreira et al., 2008). В противоположность этому, горизонтально передаваемые эндофиты, как правило, имеют пол и переносятся спорами ветром и/или насекомыми-переносчиками. Эндофиты возделываемых зерновых привлекли к себе большое внимание в связи с их способностью бороться как с болезнью, так и с заражением насекомыми, а также активировать рост растений.

[0031] Функционально сравнимый протеин: используемый здесь термин «функционально сравнимый протеин» относится к протеинам, имеющим по меньшей мере одну общую характеристику. Такими характеристиками могут быть подобие друг другу последовательностей, биохимическая активность, подобие друг другу схем транскрипции и фенотипичная активность. Как правило, функционально сравнимые протеины имеют некоторое подобие между собой последовательностей или являются подобными по меньшей мере по одному биохимическому признаку. В рамках этого определения функционально сравнимыми считаются гомологи, ортологи, паралоги и аналоги. Кроме того, функционально сравнимые протеины, в общем случае, имеют схожую по меньшей мере одну биохимическую и/или фенотипичную активность. Функционально сравнимые протеины придают одной и той же характеристике подобие, но не обязательно в одинаковой степени. Как правило, функционально сравнимые протеины дают одни и те же характеристики, которые в количественном измерении у одного из сравниваемых протеинов, составляют по меньшей мере 20% от таковых у другого, чаще от 30 до 40%; еще чаще от 50 до 60%, еще чаще от 70 до 80%, еще чаще от 90 до 95% и, как правило, от 98 до 100% от таковых у другого.

[0032] Фунгицидный: используемый здесь термин «фунгицидный» означает способность композиции или субстанции снизить скорость роста грибов или повысить смертность грибов.

[0033] Гриб Fusarium: в контексте данного изобретения термин «гриб Fusarium» включает в себя как половую (телеоморфную) фазу этого организма, так и бесполую (анаморфную) его фазу, называемые также фазами, соответственно, совершенных и несовершенных грибов. Например, анаморфной фазой гриба Fusarium graminearum является Gibberella zeae, то есть возбудитель фузариоза. Эта болезнь, как правило, возникает, когда цветок или семенная шапка инокулируется конидиями, выпускаемыми несовершенной формой, или аскоспорами, выпускаемыми совершенной формой этого гриба.

[0034] Мутант: используемый здесь термин «мутант» или «вариант» по отношению к микроорганизму означает модификацию родительского штамма, в котором целевая биологическая активность является подобной активности, выражаемой родительским штаммом. Например, в случае Microbacterium «родительским штаммом» называется оригинальный штамм Microbacterium до мутагенеза. Мутанты или варианты могут возникать в природе без вмешательства человека. Они могут быть получены также путем обработки одним или множеством способов и составов, известных специалистам в данной отрасли. Например, родительский штамм может быть обработан химикатом, таким как N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанид, этилметансульфон, или же гамма-, рентгеновским либо ультрафиолетовым излучением, или любыми другими средствами, хорошо известными специалистам в данной отрасли.

[0035] Нематоцидный: термин «нематоцидный» в данном описании означает способность субстанции или композиции повысить смертность или ингибировать скорость роста нематодов.

[0036] Патоген: термин «патоген» в данном описании означает организм, такой как водоросль, паукообразное, бактерия, гриб, насекомое, нематод, растение-паразит, дрожжи, простейшее животное или вирус, способный продуцировать болезнь у растения или животного. Термин «фитопатоген» в данном описании означает патогенный организм, инфицирующий растение.

[0037] Процент идентичности: «процент идентичности последовательности», в соответствии с данным описанием, определяют путем локального сопоставления двух оптимально выровненных последовательностей на участке выравнивания, определяемом длиной локального выравнивания двух последовательностей. При оптимальном выравнивании двух последовательностей данная аминокислотная последовательность на участке выравнивания может содержать добавки или делеции (например, пробелы или оверхэнги) в сравнении с эталонной последовательностью (которая не содержит добавок или делеций). Локальное выравнивание двух последовательностей проводится только по тем сегментам каждой последовательности, которые предположительно являются достаточно подобными по определенному критерию, выбираемому в соответствии с алгоритмом, используемым для выравнивания (например, программой BLAST). Процент идентичности вычисляют путем определения количества совпадений позиций, в которых в обеих последовательностях размещаются идентичные основания нуклеиновых кислот или остатки аминокислот, деления полученной величины совпадений на общее количество позиций на данном участке выравнивания и умножения полученного результата на 100. Оптимальное выравнивание последовательностей может осуществляться с помощью алгоритма локальной гомологии Смита-Ватермана (Smith and Waterman, Add. APL. Math. 2:482, 1981) или алгоритма глобальной гомологии Нидлмана-Вунша (Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443, 1970), методом исследования подобия Пирсона-Липмана (Pearson and Lipman, Proc. Natl Acad. Sci. USA 85: 2444, 1988), эвристической имплементации этих алгоритмов (NCBI BLAST, WU-BLAST, BLAT, SIM, BLASTZ) или путем визуальных исследований. Если две последовательности были выбраны для выравнивания, то для проведения их оптимального выравнивания предпочтительно использовать алгоритмы GAP и BESTFIT. Как правило, по умолчанию задают величины 5.00 для веса пробелов и 0.30 для длины веса пробелов. Термин «существенная идентичность последовательностей» между полинуклеотидными или полипептидными последовательностями относится к полинуклеотиду или полипептиду, содержащему последовательность, которая имеет по меньшей мере 50% идентичность, предпочтительно по меньшей мере 70%, предпочтительно по меньшей мере 80%, более предпочтительно по меньшей мере 85%, более предпочтительно по меньшей мере 90%, еще более предпочтительно по меньшей мере 95%, и наиболее предпочтительно по меньшей мере 96%, 97%, 98% или 99% идентичность в сравнении с эталонной идентичностью, определенную с помощью компьютерной программы.

[0038] Анализ нуклеинокислотных и аминокислотных последовательностей может проводиться путем сопоставления их с соответствующими нуклеинокислотными или аминокислотными последовательностями, хранящимися в публичных или частных базах данных. Такие исследования могут проводиться с помощью программы NCBI BLAST v 2.18 Национального центра информации по биотехнологиями (National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool). Программа NCBI BLAST доступна в сети Интернет по адресу blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi (National Center for Biotechnology Information). В программе NCBI BLAST могут использоваться, как правило, следующие параметры: Опции фильтров устанавливают по умолчанию «default»; Матрицу выравнивания (Comparison Matrix) устанавливают на «BLOSUM62»; Издержки на пробелы (Gap Costs) устанавливают на «Existence: 11, Extension: 1», Размер слова (Word Size) устанавливают на 3, Порог ожидания Expect (E threshold) устанавливают на 1e-3, а минимальную длину локального выравнивания устанавливают на 50% длины анализируемой последовательности. Идентичность и сходство последовательности могут определяться также с помощью программы GenomeQuest™ (Gene-IT, Worcester Mass. USA).

[0039] Термин «пестицидный» в данном описании означает способность данной субстанции или композиции снизить скорость роста организма-вредителя, то есть нежелаемого организма, или повысить смертность организма-вредителя.

[0040] Под «супрессорной активностью» средства биологической борьбы с данным фитопатогеном понимают способность данного средства (агента) подавлять, ингибировать, стабилизировать, поворачивать ход болезни вспять, замедлять или задерживать развитие самого патогена или прогрессирование инфекции или болезненного состояния, вызванного данным патогеном.

[0041] Вариант: термин «вариант», используемый в данном описании по отношению к микроорганизму, означает штамм, имеющий идентифицирующие характеристики вида, к которому он принадлежит, и при этом по меньшей мере одну вариацию нуклеотидной последовательности или идентифицируемую отличительную особенность, относящуюся к родительскому штамму и являющуюся генетически (наследуемой). Например, штамм SGI-SGI-014-CQ6 вида Microbacterium, обладающий фунгицидной активностью и имеющий идентифицируемые особенности, включающие 1) способность подавлять рост гриба Fusarium graminearum и его телеоморфа Gibberella zeae, 2) способность подавлять развитие фузариоза, 3) наличие обязательных генов с идентичностью более 95%, более 96%, более 97%, более 98% или более 99% с обязательными генами SGI-014-C06 вида Microbacterium, может использоваться для подтверждения того, что анализируемый вариант является SGI-014-C06 вида Microbacterium.

[0042] В отношении нуклеиновых кислот и полипептидов термин «вариант» используется здесь для обозначения полипептидной, протеиновой или полинуклеотидной молекулы с некоторыми отличиями, созданными искусственно или природным путем, в их аминокислотных или нуклеинокислотных последовательностях от эталонных полипептидов или полинуклеотидов, соответственно. Этими отличиями могут быть, например, замены, инсерции, делеции или любые целевые комбинации таких изменений в эталонном полипептиде или полипептиде. Полипептидные и протеиновые варианты могут, кроме того, состоять из изменений в заряде и/или посттрансляционных модификаций (например, гликозилирования, метилирования, фосфорилирования и др.).

[0043] Все публикации и патентные заявки, упомянутые в данном описании, включены здесь посредством ссылки так, как если бы каждая из публикаций или патентных заявок была индивидуально включена посредством ссылки.

[0044] Ссылки не означают признания их известным уровнем техники или прототипом. Обсуждением ссылок констатируется, что их авторы декларируют, а заявители имеют право, оспаривать точность и релевантность цитированных документов. Вполне понятно, что, хотя здесь сделаны ссылки на множество публикаций известного уровня техники, эти ссылки не означают признания того, что любой из этих документов образует собой часть общеизвестных сведений в данной отрасли.

Методы таксономической идентификации

[0045] Микроорганизмы часто можно различать путем прямого микроскопического исследования (ведь все клетки в образце выглядят под микроскопом по-разному), по характеристикам окрашивания, путем простого молекулярного анализа (например, просто путем определения полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ) и т.д. В дополнение к иллюстративным примерам таких методов таксономического анализа, описанных ниже, в Примерах 2-3, в таксономической идентификации того или иного микроорганизма может использоваться до нескольких различных уровней анализа, и каждый анализ может основываться на отличающихся от других характеристиках данного организма. В число таких разновидностей таксономического анализа могут входить анализ на основе нуклеиновых кислот (например, анализ индивидуальных специфических генов по уровню их присутствия или по их точной последовательности, либо по экспрессии конкретного гена или семейства генов), протеиновый анализ (например, на функциональном уровне с помощью прямого или косвенного ферментного анализа или на структурном уровне с помощью методов иммунодетектирования) и т.д.

[0046] a. Анализ посредством нуклеиновых кислот. Специалистам в данной отрасли хорошо известно, что в таксономической идентификации данного микроорганизма могут использоваться самые различные методы нуклеинокислотного анализа. Эти методы могут использоваться для идентификации клеток по нуклеотидной последовательности гена или для идентификации клетки, имеющей конкретные гены или семейства генов. Подходящими для таксономических исследований общими семействами генов могут быть семейство генов 16S, семейство актиновых генов и семейство генов рекомбиназы A (recA). В число этих методов, как правило, входят амплификация и секвенирование генов из очень малых количеств клеток, что зачастую позволяет преодолеть проблемы, связанные с концентрированием клеток и их ДНК из разбавленных суспензий. Термин «амплификация нуклеиновых кислот», в общем случае, относится к методам увеличения количества копий нуклеинокислотной молекулы в образце или препарате. Техника амплификации нуклеиновых кислот хорошо известна. Амплификацию нуклеиновых кислот можно осуществлять, например, с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), в которой взятый у субъекта биологический образец приводят в контакт с парой олигонуклеотидных праймеров в условиях, позволяющих осуществлять гибридизацию праймеров c нуклеинокислотной матрицей в данном образце. Праймеры в подходящих условиях удлиняются, отделяются от матрицы и затем отжигаются, удлиняются и отделяются, увеличивая число копий нуклеиновых кислот. Амплификация in vitro может проводиться также методом смещения нитей, изотермическим методом без транскрипции, методом амплификации с реакцией репарации цепей, методом лигазной цепной реакции, методом лигазной цепной реакции с заполнением разрывов, спаренным методом лигазной детекции и ПЦР; и методом амплификации без транскрипции РНК.

[0047] Кроме праймеров, приведенных в иллюстративных Примерах 2-3 и прилагаемом Перечне последовательностей, авторами в ходе лабораторных экспериментов были сконструированы также другие праймеры и, кроме того, непрерывно продолжается конструирование новых праймеров для индивидуальных биологических видов и филогенетических групп микроорганизмов. Такие узконаправленные праймеры могут находить применение в описанных здесь способах для отбора и/или специфической идентификации конкретных, целевых микроорганизмов.

[0048] Методы приготовления и использования нуклеинокислотных праймеров описаны, например, в [Sambrook et al. (In Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSHL, New York, 1989], Ausubel et al. (ed.) (In Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 1998]. Пары праймеров для амплификации могут быть получены из известной последовательности, например, с помощью специальной компьютерной программы «Primer», разработанной Институтом фузариоза, г. Кембридж, шт. Массачусетс, США (Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge, Mass.). Специалисту в данной отрасли хорошо известно, что специфичность зонда или праймера возрастает с его длиной. Так, например, праймер, содержащий 30 последовательных нуклеотидов его рРНК-кодирующего нуклеотидного или фланкирующего участка, будет отжигаться до целевой последовательности с более высокой специфичностью, чем соответствующий праймер, состоящий только из 15 нуклеотидов. Таким образом, для получения большей специфичности можно отбирать зонды и праймеры, содержащие по меньшей мере 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 или больше последовательных нуклеотидов целевой нуклеотидной последовательности, такие как 16S рРНК.

[0049] Нуклеиновые кислоты, подходящие для нуклеинокислотных манипуляций (например, ПЦР), можно получать с помощью таких общеизвестных технологий, как экстрагирование фенол-хлороформом, или с помощью одного из множества продажных комплектов экстрагирования ДНК. Альтернативным путем амплификации ДНК может быть присаживание клеток непосредственно в реакционную смесь для амплификации нуклеиновых кислот и проведение всех остальных манипуляций на стадии денатурации с лизисом клеток и выделением ДНК.

[0050] Полученный продукт реакций амплификации нуклеиновых кислот анализируют с помощью стандартных методов, включая электрофорез, картины расщепления рестрикционной эндонуклеазой, гибридизацию или лигирование олигонуклеотидов и/или секвенирование нуклеиновых кислот. Если методы гибридизации используются для всех целей идентификации клеток, то подходящими для этого могут быть самые различные способы мечения зондов, включая флуоресцентное мечение, радиоактивное мечение и нерадиоактивное мечение. При использовании методов секвенирования нуклеиновых кислот может проводиться исследование гомологии нуклеотидных последовательностей амплифицированных нуклеинокислотных молекул с помощью различных баз данных известных последовательностей, включая, например, базы данных DDBJ/GenBank/EMBL.

[0051] b. Протеин-опосредованный анализ. В дополнение к анализу нуклеиновых кислот, микроорганизмы могут характеризоваться с помощью таксономии и идентифицироваться непосредственно по присутствию (или отсутствию) специфических протеинов. В таком анализе за основу может приниматься активность определенного протеина, например, в ферментном анализе, или ответ совместно культивируемых организмов, или просто присутствие специфицированного протеина (которое может определяться, например, с помощью иммунологических методов, таких как иммунофлуоресцентное окрашивание антителами in situ).

[0052] Ферментный анализ. Для проведения такого анализа, в питательную среду (например, культуры на микротитровальном планшете) включают флуоресцентные или хромогенные аналоги субстрата, а затем проводят инкубацию и скрининг по продуктам реакции, идентифицируя, таким образом, культуры по их ферментативной активности.

[0053] Ответ при совместной культивации. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения активность фермента, несомого микробным изолятом, можно определять по ответу (или степени ответа) совместно культивируемого организма (например, организма-репортера).

[0054] Для идентификации микроорганизмов, выбранных и выделенных из окружающей среды-источника путем связывания по меньшей мере одного антитела или одной молекулы, полученной из антитела, с определенной молекулой, а точнее - с эпитопом молекулы, микроорганизма, также могут применяться самые различные способы.

[0055] Антитела к белкам микроорганизмов могут быть получены с помощью стандартных методик, описанных во многих литературных источниках, например, (Harlow and Lane, (Antibodies, A Laboratory Manual, CSHL, New York, 1988). Определить то, связывается ли данный агент по существу только с протеином целевого микроорганизма, можно легко с помощью обычных или адаптированных методик. Одной из таких методик, подходящих для анализа in vitro, является процедура вестерн-блоттинга, описанная во многих известных работах, включая (Harlow and Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, CSHL, New York, 1988).

[0056] Более короткие фрагменты антител (молекул, полученных из антител, например, FAbs, Fvs и одноцепочечные Fvs (SCFvs)) также могут служить специфически связывающими агентами. Способы приготовления таких фрагментов широко известны.

[0057] Детекция антител, связывающихся с клетками в соответствии с изобретением, может осуществляться с помощью стандартных методов, например, иммуноферментного анализа (ИФА), позволяющих получать детектируемый, например, флуоресцентный или люминесцентный, сигнал.

Выделенные культуры в соответствии с изобретением

[0058] Как более подробно описано в разделе ПРИМЕРЫ, авторами было обнаружено несколько полезных для сельского хозяйства новых микроорганизмов, способных, например, эффективно подавлять фузариоз. Указанные новые антагонистические микроорганизмы, в частности, являются эффективным средством для уменьшения тяжести заболевания фузариозом и для ингибирования роста гриба Fusarium graminearum, главного возбудителя фузариоза в пшенице. Эти микробные антагонисты были идентифицированы из пула, составляющего приблизительно 5000 микробных штаммов, полученных из образцов диких растений, собранных в нескольких местах на территории Соединенных Штатов. Начальный отбор антагонистического микроорганизма производился по способности микроорганизмов подавлять развитие патогена F. graminearum и его телеоморфа Gibberella zeae в испытаниях на антагонизм in vitro. Отобранные микробные антагонисты подвергались затем биологическим испытаниям в теплице на сеянцах пшеницы, где проводилась инокуляция сеянцев микробными штаммами, а затем - повторные инокуляции спор F. graminearum, на способность этих микробных штаммов уменьшать тяжесть инфицирования грибом и на их способность сохранять выход семян. Отобранные таким образом антагонистические микроорганизмы продемонстрировали в тепличных испытаниях свою эффективность в уменьшении тяжести фузариоза.

[0059] Кроме того, таксономический анализ показал, что каждый из описанных здесь антагонистических микроорганизмов имеет близкое родство либо с бактериальным родом Microbacterium, бактериальным родом Bacillus, бактериальным родом Variovorax, либо с родом грибов Mycosphaerella.

[0060] Род Microbacterium, типичный род семейства Microbacteriaceae, в общем случае относится к приспосабливающимся, грамположительным, неспорообразующим, палочковидным бактериям, которые изначально, на ранних стадиях исследований, были выделены на бактериях, вырабатывающих молочную кислоту. Члены рода Microbacterium поначалу широко характеризовались своей заметной теплостойкостью, присутствием в молочных продуктах и продуцированием небольших количеств L(+) молочной кислоты из глюкозы. В противоположность этим родам семейства Microbacteriaceae, виды которого отличаются когерентным пептидогликановым типом, вид Microbacterium имеет орнитин или лизин либо во межпептидном мостике, либо в позиции 3 пептидогликана B-типа. В других хемотаксономических свойствах, таких как изопреноидные хиноны (MK-11, MK-12, MK-13), полярные липиды, жирные кислоты и основной состав ДНК, члены этого семейства демонстрируют обычный диапазон разнообразия, наблюдаемый в других родах Microbacteriaceae. По результатам некоторых таксономических исследований два бактериальных рода Microbacterium и Aureo бактерия могут быть объединены. На сегодняшний день род Microbacterium включает по меньшей мере 33 вида, которые были выделены из широкого диапазона мест обитания, включая почву, молочные продукты, растительные галлы, насекомых и клинические образцы. Различные аспекты их экологии, филогении, таксономии, культивирования и условий долговременного хранения недавно были подсумированы Евтушенко и Такэути (Evtushenko и Takeuchi, 2006). Вполне понятно, что микроорганизм рода Microbacterium может быть вполне надежно идентифицирован любыми таксономическими методами, описанными выше, включая хемотаксономический анализ пептидогликанов клеточной стенки и анализ последовательностей методом выравнивания с 16S рДНК, как описано (Evtushenko и Takeuchi, 2006) и цитированных ими ссылках, а также в ссылках, цитированных в Примерах 2-3 настоящего описания. Как более подробно рассмотрено ниже, ранее сообщалось об обнаружении антагонистической активности против фузариоза у нескольких микроорганизмов природного происхождения. Однако, о том, что такой антагонистической активностью обладает микроорганизм рода Mycobacterium, до настоящего изобретения сообщений не было. Кроме того, до настоящего изобретения его авторам не были известны способы и процессы использования бактериального штамма рода Mycobacterium как агента биоборьбы для предотвращения, ингибирования или обработки против развития патогена, вызывающего фузариоз.

[0061] Bacillus является родом грамположительных вариабельных, спорообразующих палочковидных бактерий. Подобно другим родам, ассоциирующимся с ранней историей развития микробиологии, таким как Pseudomonas или Vibrio, около 266 видовых членов рода Bacillus обнаруживаются повсюду, и он широко признан как один из родов с наибольшим многообразием 16S и окружающей среды. Виды Bacillus могут быть обязательными аэробами или факультативными анаэробами, и иметь положительный тест на каталазу. Убиквист по своей природе, род Bacillus включает в себя как свободноживущие, так и патогенные виды. В тяжелых окружающих условиях эти клетки продуцируют овальные эндоспоры, которые длительное время могут пребывать в состоянии покоя. Эти характеристики изначально определяли данный род, однако не все такие виды имеют близкое родство, и многие переместились к другим родам. Фактически было предпринято несколько попыток реконструировать филогению этого рода. Bacillus-специфические исследования с наибольшим многообразием были проведены в работе (Xu and Cote, Intl. J. of Syst. Evol. Microbiol. 53 (3): 695-704; 2003) с использованием 16S и участка ITS (внутреннего транскрибированного спейсера), где авторы разделили род на 10 групп, которые включают гнездовые роды Paenibacillus, Brevibacillus, Geobacillus, Marinibacillus и Virgibacillus. Однако, согласно более поздним исследованиям род Bacillus содержит очень большое число гнездовых таксонов и особенно как в 16S, так и в 23S, он считается парафилетическим к Lactobacillales (Lactobacillus, Streptococcus, Staphylococcus, Listeria и др.) благодаря Bacillus coahuilensis и др., например, (Yarda et al, Syst. Appl. Microbiol. 31 (4): 241-250, 2008; Yarda et al, Syst. Appl. Microbiol. 33 (6): 291-299, 2010). Одна из клад, образованная видами B. anthracis, B. cereus, B. mycoides, B. pseudomycoides, B. thuringiensis и B. weihenstephanensis в соответствии с современными стандартами классификации, должна быть единичного вида (с 97% 16S идентичностью), однако по медицинским соображениям, их считают отдельными видами. В дополнение к методам таксономического анализа, описанным в Примерах 2-3, филогенетический и таксономический анализы вида Bacillus могут проводиться с помощью ряда различных методов, включая подробно описанные в (Xu and Cote, 2003; Yarda et al., 2008; Yarda et al., 2010).

[0062] Род Variovorax изначально был создан реклассификацией рода Alcaligenes paradoxus на Variovoraxparadoxus (Willems et al., 1991), который считается типичным видом этого рода. V. paradoxus был широко исследован как модель для новых биодеградационных агентов, а также взаимодействий микроб-микроб и микроб-растение. Другими видами этого рода являются V. dokdonensis, V. soli (Kim et al., 2006), и V. boronicumulans (Miwa et al., 2008). Виды Variovorax в плане катаболизма очень разнятся и вступают во взаимовыгодные взаимодействия с другими бактериальными видами во многих процессах биологического разложения и, следовательно, являются экологически значимыми и имеют высокий потенциал практического применения. Например, почвенный метанотроф, только при совместном культивировании со штамом V. paradoxus демонстрирует высокую афинность к метану (мощному тепличному газу) - особенность, которая обычно не наблюдается у лабораторных культур. Подобным образом было обнаружено, что его близкий родственник Variovorax является центральным, нефотосинтетическим партнером в рамках фототрофной консорции «Chlorochromatium aggregatum». Некоторые виды рода Variovorax обладают также способностью вмешиваться в коммуникацию других бактерий. Кроме того, некоторые виды рода Variovorax могут тесно взаимодействовать с другой биотой (например, растениями) в различных экосистемах. Более того, некоторые виды Variovorax, находясь на площади за пределами корней растения и/или внутри растения, проявляли способность активировать рост растения путем снижения уровней этилена, репрессии патогенеза, регулируемого чувством кворума, и повышения стойкости к тяжелым металлам, что очень полезно для фиторемедиации. В дополнение к методам анализа таксономии, описанным в Примерах 2-3, филогенетический и таксономический анализы вида Variovorax могут проводиться всевозможными методами, включая подробно рассмотренные в настоящем описании.

[0063] Mycosphaerella является очень большим родом грибов с более чем 2000 наименованиями видов и по меньшей мере 500 видами, ассоциированными с более чем 40 анаморфными родами (в частности, Cercospora, Pseudocercospora, Septoria, Ramularia и др.). Кроме того, несколько тысяч анаморфов не имеют телеморфов. Род Mycosphaerella включает виды, которые являются патогенами, сапробами, эндофитами или мутуалистическими ассоциациями. Разнообразные аспекты их экологии, происхождения, таксономии, методов культивирования и условий долговременного хранения недавно были описаны в (Crous et al., Persoonia, 23:119-146, 2009). Таксономическая идентификация микроорганизмов рода Mycosphaerella может производиться любым из вышеописанных соответствующих методов или их комбинацией. Наиболее общими из таких методов являются анализ последовательностей путем выравнивания с последовательностями 16S рДНК и участков внутренних транскрибированных спейсеров, как описано, например, в (Crous et al., Studies in Mycology, 55:235-253,2006; Crous et al, 2009, supra; Goodwin et al, Phytopathology 91: 648-658, 2001), а также методы, описанные в Примерах 2-3 ниже.

Депозиты биологических материалов

[0064] Очищенные культуры микробных штаммов, которые согласно их идентификации обладают супрессорной активностью против фузариоза, были депонированы в коллекцию агрокультур для исследований (Agricultural Research Service Culture Collection, размещенную по адресу 1815 N. University Street, Peoria, IL 61604, USA (NRRL)) в соответствии с «Будапештским договором о международном признании депонирования микроорганизмов для целей патентной процедуры» и вытекающими из него нормативными положениями (Budapest Treaty). Эти депозиты размещены под следующими номерами:

Идентификация SGI штамма	Номер депозита	Предварительная таксономия видов
SGI-005-G08	NRRL -	Microbacterium
SGI-010-H11	NRRL 50471	Mycosphaerella
SGI-014-C06	NRRL B-50470	Microbacterium
SGI-014-G01	NRRL B-50469	Variovorax
SGI-015-F03	NRRL B-50760	Bacillus
SGI-015-H06	NRRL B-50761	Bacillus

[0065] Данные микробные штаммы были депонированы с условием обеспечения доступа к этой культуре в течение нахождения данной заявки в процессе рассмотрения и принятия решения по ней руководителем Патентного ведомства США согласно 37 C.F.R. §1.14 и 35 U.S.C. §122. Эти депозиты представляют по существу чистые культуры депонированных штаммов. Доступ к депозитам обеспечивается в соответствии с патентными законодательствами стран, где зарегистрированы противоположные стороны данной заявки или их наследники. Вполне понятно, что доступ к депозитам не означает разрешения на практическое применение предмета изобретения в нарушение патентных прав, гарантированных государством.

[0066] Предпочтительные микроорганизмы в соответствии с изобретением имеют все идентификационные характеристики депонированных штаммом и, в частности, идентификационные характеристики, касающиеся способности подавлять развитие фузариоза, как указано в данном описании, и способности подавлять развитие патогена Fusarium graminearum и его телеоморфа Gibberella zeae. В частности, предпочтительные микроорганизмы в соответствии с изобретением относятся к депонированным микроорганизмам, описанным выше, и их мутантам.

Микробиологические композиции

[0067] Микробиологические композиции в соответствии с изобретением, содержащие выделенные микробные штаммы или их культуры, могут иметь самые различные формы, включая, в том числе, формы стационарной культуры, цельной культуры, сохраняемого клеточного штамма, мицелия и/или гифы (особенно, исходных глицериновых растворов), агаровых полосок, агаровые комплексы в водно-глицериновой смеси, высушенных вымораживанием маточных растворов и высушенных маточных растворов, таких как лиофилизаты или мицелии, высушенные на фильтровальной бумаге или на посевном зерне. В соответствии с определением, данным в настоящем описании, термин «выделенная культура» или используемые здесь его грамматические эквиваленты означают, что данная культура представляет собой культуральную жидкость, гранулу, соскоб, высушенный образец, лиофилат или срез (например, гифа или мицелия); или подложку, контейнер или среду, например, планшет, бумагу, фильтр, матрицу, солому, пипетку или острие пипетки, волокно, иглу, гель, тампон, пробирку, флакончик, частицу и др., которая содержит один тип организма. В настоящем изобретении выделенной культурой микробного антагониста является культуральная жидкость или соскоб, гранула, высушенный препарат, лиофилат или срез микроорганизма, или подложка, контейнер, или среда, которая содержит микроорганизм в отсутствие других организмов.

[0068] Настоящим изобретением предлагаются также композиции, содержащие по меньшей мере один выделенный микробный штамм или его культуру в соответствии с изобретением и носитель. Носителем может быть любой один носитель или множество носителей, удовлетворяющий(-щие) разнообразным свойствам, таким как повышенная стойкость, смачиваемость, диспергируемость и др. Композиция согласно изобретению может включать в себя смачивающие агенты, такие как природные или искусственные поверхностно-активные вещества, которыми могут быть неионные или ионные поверхностно-активные вещества либо их комбинации. В состав композиции могут входить также эмульсии типа вода-в-масле, которые содержат по меньшей мере один выделенный микроорганизм в соответствии с изобретением (U.S. Patent No. 7485451), включенный здесь посредством ссылки. Требуемые препараты могут быть приготовлены из смачиваемых порошков, гранул, гелей, агаровые полосок или гранул, загустителей и т.п., заключенных в микрокапсулы частиц и т.п., жидкостей, таких как водные текучие среды, водные суспензии, эмульсии типа вода-в-масле и др. Препарат может содержать зерновые или бобовые продукты (например, дробленое зерно или бобы, бульон или муку, приготовленные из зерна или бобов), крахмал, сахар или растительное масло. Носителем может быть сельскохозяйственный носитель. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения носителем является семя, а композиция может наноситься на это семя или покрывать либо пропитывать его.

[0069] В некоторых вариантах осуществления изобретения сельскохозяйственным носителем может быть почва или среда для выращивания растений. Другими подходящими сельскохозяйственными носителями являются вода, удобрения, растительные масла, увлажнители и их комбинации. В альтернативном варианте сельскохозяйственным носителем может быть твердый материал, такой как инфузорная земля, суглинок, кремнезем, альгинат, глина, бентонит, вермикулит, семенные капсулы, другие растительные и животное продукты или их комбинации, включая гранулы, окатыши и суспензии. Носителями могут служить также смеси любых вышеуказанных ингредиентов, такие как, например, песта (pesta: мука и каолиновая глина), агаровые или мучные гранулы в суглинке, песке или глине и др. Препараты могут включать в себя пищевые источники для культивированных организмов, такие как ячмень, рис или другие биологические материалы, например, семена, части растений, багасса сахарного тростника, шелуха или черешки от обработки зерна, дробленый растительный материал (например «отходы складирования») или древесина из строительных отходов, опилки или мелкие волокна от повторной переработки бумаги, тканых материалов или древесины. Специалистам в данной отрасли могут быть известны также другие подходящие материалы для этой цели.

[0070] В жидкой форме, например, растворов или суспензий, микроорганизмы могут смешиваться или суспендироваться в воде или в водных растворах. Подходящими жидкими разбавителями или носителями при этом являются вода, водные растворы, нефтяные дистилляты и другие жидкие носители.

[0071] Твердые композиции могут готовиться путем диспергирования антагонистических микроорганизмов в или на соответствующим образом разделенном твердом носителе, таком как торф, пшеница, отруби, вермикулит, глина, тальк, бентонит, инфузорная земля, сукновальная глина, пастеризованная почва и т.п. Если такие препараты используются в качестве смачиваемых порошков, то могут применяться биологически совместимые диспергаторы, такие как неионные, анионные, амфотерные или катионные диспергаторы и эмульсификаторы.

[0072] В предпочтительном варианте осуществления изобретения рассматриваемые здесь композиции предотвращают поражение фузариозом растений и, особенно, зерновых, таких как пшеница, ячмень, овес и кукуруза, а при использовании их в достаточных количествах действуют как микробные антагонисты. Подобно другим средствам биологической борьбы, эти композиции имеют высокий порог безопасности, поскольку они, как правило, не обжигают и не повреждают растение.

[0073] Как подробно показано в настоящем описании, борьба с фузариозом может осуществляться путем нанесения одной или больше микробиологических композиций в соответствии с изобретением на растение-хозяина или на его части. Эти композиции могут наноситься в количестве, эффективном для понижения уровня фузариоза по сравнению с его уровнем в необработанном контроле. Активные компоненты при этом используются в концентрации, достаточной для ингибирования развития целевого фитопатогена, когда они приложены к зерновой культуре. Для специалиста должно быть очевидно, что эффективные концентрации могут быть различными и зависеть от следующих факторов: (a) типа растения или сельскохозяйственного продукта; (b) физиологического состояния растения или сельскохозяйственного продукта; (c) концентрации патогенов, поражающих растение или сельскохозяйственный продукт; (d) типа болезни, поражающей растение или сельскохозяйственный продукт; (e) погодных условий (например, температуры, влажности); и (f) стадии развития болезни растения. Согласно изобретению, типичные величины концентрации лежат выше уровня 1×10² КОЕ/мл носителя. Предпочтительные уровни концентрации лежат в интервале приблизительно от 1×10⁴ до 1×10⁹ КОЕ/мл, а еще лучше - в интервале от 1×10⁶ до 1×10⁸ КОЕ/мл. Более предпочтительным является интервал концентрации приблизительно от 35 до 150 мг сухой микробной массы на грамм носителя (сухой препарат) или на миллилитр носителя (жидкая композиция). У твердых препаратов скорость поставки должна регулироваться так, чтобы получать число жизнеспособных клеток на единицу площади поверхности ткани растения, сравнимое с получаемым от применения вышеуказанных концентраций жидкой обработки. Как правило, агенты биологического метода борьбы в соответствии с изобретением являются биологически эффективными, когда они поставляются в концентрации выше 10⁶ КОЕ/г (колониеобразующих единиц на грамм), предпочтительно - выше 10⁷ КОЕ/г, еще предпочтительнее - в концентрации 10⁸ КОЕ/г, и наиболее предпочтительно - в концентрации 10⁹ КОЕ/г.

[0074] В некоторых вариантах осуществления изобретения количество одного или больше агентов биологической борьбы в микробной композиции в соответствии с изобретением может варьировать в зависимости от конечного препарата, а также размеров и типа растения или используемых семян. В предпочтительном варианте один или больше агентов биологической борьбы в микробной композиции находится в количестве приблизительно от 2% (мас.) до 80% (мас.) от всего количества препарата. В предпочтительном варианте один или больше агентов биологической борьбы в микробной композиции находится в количестве приблизительно от 5% (мас.) до 65% (мас.), а в наиболее предпочтительном - приблизительно от 10% (мас.) до 60% (мас.) от всего количества препарата.

[0075] Микробиологические композиции согласно изобретению могут наноситься на пшеницу или другую зерновую культуру с помощью самых различных, хорошо известных специалистам способов, таких как опыление, создание покрытия, вливание, втирание, прикатывание, протравливание погружением, распыление, обтирка щеткой и другие подходящие способы, которые не вызывают существенных повреждений у пшеницы и других зерновых культур при их обработке. Особенно приемлемым является способ распыления.

[0076] Композиции в соответствии с изобретением, как правило, являются химически инертными; поэтому они являются совместимыми по существу с любыми другими компонентами схемы распыления. Они могут использоваться также в сочетании с биологически совместимыми пестицидными активными агентами, например, с гербицидами, нематицидами, фунгицидами, инсектицидами и т.п. Они могут использоваться также в сочетании с субстанциями регуляции роста растений, такими как удобрения, регуляторы роста растений и т.п., если только такие соединения или субстанции являются биологически совместимыми.

[0077] Если пестициды или фунгициды используются в их продажных препаратах и в формах, приготовленных из этих препаратов, то активные микробные антагонисты и композиции в соответствии с настоящим изобретением могут, тем более, использоваться вместе с ними в форме синергетической смеси. Компоненты такой смеси, являясь синергистами, повышают эффективность активной композиции без необходимости добавлять в смесь специальные синергисты.

[0078] Используемые в качестве пестицидов в их продажных препаратах и в формах, приготовленных из этих препаратов, активные микробные антагонисты и композиции в соответствии с настоящим изобретением могут, тем более, использоваться вместе с ними в форме смеси с ингибиторами, которые снижают деградацию активных композиций после их применения в месте произрастания растения, на поверхности частей растения или в его тканях.

[0079] Активные микробные антагонисты и композиции согласно изобретению, в своем исходном состоянии или в препаратах, могут использоваться также в форме смеси с известными акарицидами, бактерицидами, фунгицидами, инсектицидами, микробицидами, нематицидами, пестицидами или их комбинациями, например, с целью расширения их спектра действия или для предотвращения развития стойкости этим путем. Во многих случаях, синергетика дает положительный результат, то есть активность такой смеси может превышать активность ее индивидуальных компонентов. Смесь с другими известными активными соединениями, такими как удобрения, регуляторы роста, защитные агенты и/или химикалии сигнализации также охватываются объемом изобретения.

[0080] В предпочтительном варианте осуществления изобретения композиции могут содержать также по меньшей мере один химический или биологический пестицид. Количество по меньшей мере одного химического или биологического пестицида, используемого в данной композиции, может варьировать в зависимости от конечного препарата, а также размеров обрабатываемого растения и семени. В предпочтительном варианте количество по меньшей мере одного используемого химического или биологического пестицида составляет приблизительно от 0,1% (мас.) до 80% (мас.) от всего количества препарата. В более предпочтительном варианте, количество по меньшей мере одного используемого химического или биологического пестицида составляет приблизительно от 1% (мас.) до 60% (мас.), а в наиболее предпочтительном - приблизительно от 10% (мас.) до 50% (мас.).

[0081] В изобретении могут использоваться любые пестициды, известные специалистам в данной отрасли. Это могут быть, например, химические пестициды, принадлежащие к классам карбаматов, органофосфатов, хлорорганических соединений и пиретроидов. Изобретением предусмотрены также химические агенты биоборьбы, такие как, например: беномил; боракс; каптафол; каптан; хлорталонил; медьсодержащие препараты; препараты, содержащие дихлон, дихлоран, йод, цинк; фунгициды, ингибирующие биосинтез эргостерола, такие как, например, бластидидин, цимоксанил, фенаримол, флузилазол, фолпет, имазалил, ипордион, манеб, манокоцеб, металаксил, оксикарбоксин, миклобутанил, окситетрациклин, ПХНБ (пентахлорнитробензол), пентахлорфенол, прохлораз, пропиконазол, хинометионат, арсенит натрия, натрий DNOC (динитроокрезол), натрий гипохлорит, натрий фенилфенат, стрептомицин, сера, тебуконазол, тербутразол, тиабендозол, тиофанат-метил, триадимефон, трициклазол, трифорин, валидимицин, винклозолин, цинеб и цирам. В композициях согласно изобретению могут использоваться самые различные инсектицидные соединения, включая, например, указанные в заявке (U.S. Pat. Appl. No. 20110033432A1).

[0082] Микробиологические композиции в соответствии с изобретением в предпочтительном варианте содержат по меньшей мере один биологический пестицид. Типовыми биологическими пестицидами, которые являются подходящими для использования в соответствии с изобретением и могут входить в микробиологическую композицию в соответствии с изобретением для предотвращения фитопатогенной болезни, являются микробы, животные, бактерии, грибы, генетический материал, растение и природные продукты живых организмов. В этих композициях микроорганизм в соответствии с изобретением выделяется перед приготовлением препарата дополнительным организмом. В композиции с антагонистическими микроорганизмами согласно изобретению могут использоваться микробы, например, видов Ampelomyces, Aureobasidium, Bacillus, Beauveria, Candida, Chaetomium, Cordyceps, Cryptococcus, Dabaryomyces, Erwinia, Exophilia, Gliocladium, Mariannaea, Paecilomyces, Paenibacillus, Pantoea, Pichia, Pseudomonas, Sporobolomyces, Talaromyces и Trichoderma, где особенно предпочтительными являются грибные штаммы рода Muscodor. Особенно предпочтительным является также использование микробиологических композиций в соответствии с настоящим изобретением в комбинации с микробными антагонистами, описанными в (US Patent No. 7518040; US Patent No. 7601346; US Patent No. 6312940).

[0083] В качестве примеров грибов, которые могут использоваться в комбинациях с микробными антагонистами и композициями в соответствии с изобретением, можно назвать виды Muscodor, Aschersonia aleyrodis, Beauveria bassiana («белый мускарин»), Beauveria brongniartii, Chladosporium herbarum, Cordyceps clavulata, Cordyceps entomorrhiza, Cordyceps fads, Cordyceps gracilis, Cordyceps melolanthae, Cordyceps militaris, Cordyceps myrmecophila, Cordyceps ravenelii, Cordyceps sinensis, Cordycepshecocephala, Cordyceps subsessilis, Cordyceps unilateralis, Cordyceps variabilis, Cordyceps washingtonensis, Culicinomyces clavosporus, Entomophaga grylli, Entomophaga maimaiga, Entomophaga muscae, Entomophaga praxibulli, Entomophthora plutettae, Fusarium lateritium, Hirsutella citriformis, Hirsutella thompsoni, Metarhizium anisopliae («зеленый мускарин»), Metarhizium flaviride, Muscodor albus, Neozygitesfloridana, Nomuraea rileyi, Paecilomyces farinosus, Paecilomyces fumosoroseus, Pandora neoaphidis, Tolypocladium cylindrosporum, Verticillium lecanii, Zoophthora radicans, и микоризные виды грибов, например, Laccaria bicolor. Подходящими могут быть также другие микопестицидные виды, известные специалистам в данной отрасли.

[0084] Настоящим изобретением предлагаются также способы лечебной обработки растения путем нанесения любого из множества обычных препаратов в эффективном количестве либо на почву (то есть, в борозды), на части растения (то есть опрыскиванием), либо на семена до их посадки (то есть нанесением покрытия или протравливанием). Обычными препаратами могут быть растворы, эмульсифицируемый концентрат, смачиваемые порошки, суспензионный концентрат, растворимые порошки, гранулы, суспензионно-эмульсионный концентрат, природные и искусственные материалы, пропитанные активным соединением, и очень мелкие полимерные капсулы с управляемым высвобождением. В некоторых вариантах осуществления изобретения композиции для биологической борьбы готовят в порошках, которые поступают в продажу либо в препаратах, готовых к употреблению, либо смешиваются друг с другом во время их употребления. В обоих случаях порошок может добавляться в почву перед посадкой или во время посадки. В альтернативном варианте агент биоборьбы и агент борьбы с насекомыми могут быть оба, или один из них, жидкими препаратами и смешиваться друг с другом во время лечебной обработки. Для специалиста понятно, что эффективное количество композиции согласно изобретению зависит от конечного препарата композиции, а также от размеров обрабатываемых растений или семян.

[0085] В зависимости от конечного препарата и способа его нанесения, композиция согласно изобретению может включать в себя одну или больше подходящих добавок. Такими добавками в данные композиции могут быть, например, адгезивы, такие как карбоксиметилцеллюлоза и природные либо искусственные полимеры в форме порошков, гранул или латексов, такие как гуммиарабик, хитин, поливиниловый спирт и поливинилацетат, а также природные фосфолипиды, такие как цефалины и лектицины, и искусственные фосфолипиды.

[0086] В одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения микробиологические композиции готовят в едином стабильном растворе, эмульсии или суспензии. Для изготовления растворов активные химические соединения (то есть агенты биоборьбы с вредителями) перед добавлением агента биоборьбы, как правило, растворяют в растворителях. Подходящими жидкими растворителями могут быть, например, ароматические вещества из нефти, такие как ксилол, толуол или алкилнафталины, алифатические углеводороды, такие как циклогексан или парафины, например, нефтяные фракции, минеральные и растительные масла, спирты, такие как бутанол или гликоль, а также их простые и сложные эфиры, кетоны, такие как метилэтилкетон, метилизобутилкетон или циклогексанон, сильные полярные растворителями, такие как диметилформамид и диметилсульфоксид. Жидкой средой для эмульсии или суспензии является вода. В одном из вариантов осуществления изобретения агент химической борьбы и агент биологической борьбы суспендируются в жидкостях отдельно друг от друга и смешиваются во время употребления. В предпочтительном варианте приготовления суспензии агент борьбы с насекомыми и биологический агент объединяются в препарате, готовом к употреблению, имеющем срок хранения по меньшей мере два года. При употреблении жидкость может распыляться или наносится в форме пленки с помощью распылителя, либо в борозду во время посева культуры. Жидкая композиция может вводиться в почву перед прорастанием семян или непосредственно в почву в контакте с корнями с помощью разнообразных средств и методов, хорошо известных в данной отрасли, включая, например, капельное орошение, разбрызгиватели, инжекцию в почву или пропитывание почвы.

[0087] При необходимости могут добавляться стабилизаторы и буферы, включая соли щелочных и щелочноземельных металлов и органические кислоты, такие как лимонная кислота и аскорбиновая кислота, неорганические кислоты, такие как соляная кислота или серная кислота. Могут добавляться также биоциды, например, формальдегиды или формальдегид-выделяющие агенты, и производные бензойной кислоты, такие как p-гидроксибензойная кислота

Препараты для нанесения покрытий на семена

[0088] В некоторых, особенно предпочтительных вариантах осуществления изобретения, композиции для биоборьбы в соответствии с изобретением составляются для лечебной обработки семян. Композиция для лечебной обработки семян содержит по меньшей мере один агент борьбы с насекомыми и по меньшей мере один агент биологической борьбы. Предполагается, что семена могут по существу равномерно покрываться одним или больше слоями описанных здесь композиций для биоборьбы, используя для этого обычные методы смешивания и распыления или их комбинации и специально сконструированные и изготовленные устройства для создания покрытий, обеспечивающие требуемые точность, безопасность и эффективность нанесения на семена продуктов обработки. В таких устройствах используются различные технологии создания покрытий, например, роторного типа, барабанного типа, методы псевдоожиженного шара, фонтанирующего шара, роторного распыления или их комбинации. Жидкая обработка семян в соответствии с изобретением может осуществляться с помощью либо центрифужного дискового «распылителя», либо спрея, обеспечивающего равномерное распределение покрытия на семенах при их движении через профиль распыления. После этого семена в предпочтительном варианте перемешивают или ворошат в течение некоторого времени с целью дополнительного выравнивания распределения и сушат. Перед нанесением покрытия композицией согласно изобретению семена могут быть подвергнуты праймированию (стимуляции прорастания) для повышения равномерности прорастания и выпускания всходов. В альтернативном варианте сухой порошковый препарат может подаваться в определенных дозах на перемешиваемые семена и перемешиваться с ними до получения однородного распределения.

[0089] В другом аспекте согласно изобретению предлагаются семена, обработанные микробиологическими композициями в соответствии с изобретением. В одном из вариантов по меньшей мере часть поверхности семян является покрытой микробиологической композицией по изобретению. В одном из специфических вариантов осуществления обработанные микроорганизмами семена имеют концентрацию спор или микробных клеток приблизительно от 10⁶ до 10⁹ на одно семя. Семена могут иметь также большее количество спор или микробных клеток, например, 10¹⁰, 10¹¹ или 10¹² спор на семя. Микробные споры и/или клетки могут покрывать семена в свободном состоянии или, предпочтительно, наносится на них в предварительно приготовленной жидкой или твердой композиции. Твердая композиция, содержащая микроорганизмы, может готовиться путем перемешивания твердого носителя с суспензией спор до тех пор, пока твердые носители не будут пропитаны этой споровой или клеточной суспензией. После этого смесь просушивают, получая в результате требуемые частицы.

[0090] В некоторых других вариантах осуществления предполагается, что твердые или жидкие композиции для биоборьбы в соответствии с изобретением, кроме того, содержат функциональные агенты, способные защищать семена от вредного воздействия селективных гербицидов, такие как активированный уголь, питательные вещества (удобрения) и другие агенты, способные улучшать прорастание и качество продукции.

[0091] Известные способы и композиции для нанесения покрытий на семена могут быть особенно полезными, когда они модифицируются путем добавления одного из вариантов осуществления данного изобретения. Такие подходящие для применения способы и устройства для нанесения покрытий описаны, например, в (U.S. Pat Nos. 5918413; 5554445; 5389399; 4759945; 4465017). Всевозможные композиции для создания покрытий на семенах описаны, например, в (U.S. Pat. Appl. Nos. US20110033432, US20100154299, U.S. Pat. Nos. 5939356; 5876739, 5849320; 5791084, 5661103; 5580544, 5328942; 4735015; 4634587; 4372080, 4339456; и 4245432).

[0092] В препараты для обработки семян, содержащие композиции согласно изобретению, могут вводиться самые различные добавки. Такими добавками могут быть, например, связующие, состоящие предпочтительно адгезивного полимера, который может быть природным или искусственным и не должен оказывать фитотоксического воздействия на покрываемые семена. Связующее может выбираться среди следующих материалов: поливинилацетатов; coполимеров поливинилацетатов; coполимеров этиленвинилацетата (ЭВА); поливинилового спирта; coполимеров поливинилового спирта; целлюлоз, включая этилцеллюлозу, метилцеллюлозу, гидроксиметилцеллюлозу, гидроксипропилцеллюлозу и карбоксиметилцеллюлозу; поливинилпиролидонов; полисахаридов, включая крахмал, модифицированный крахмал, декстрины, мальтодекстрины, альгинат и хитозаны; жиров; растительных масел; протеинов, включая желатин и зеины; гуммиарабиков; шеллаков; винилиденхлорида и сополимеров винилиденхлорида; лигносульфонатов кальция; акриловых coполимеров; поливинилакрилатов; полиэтиленоксида; акриламидных полимеров и coполимеров; полигидроксиэтилакрилата, метилакриламидных мономеров; и полихлоропрена.

[0093] Могут использоваться любые красители, включая органические хромофоры, относящиеся к классу нитрозо; нитро; азо, включая моназо, бизазо и полиазо; акридин, антрахинон, азин, дифенилметан, индамин, индофенол, метин, оксазин, фталоцианин, тиазин, тиазол, триарилметан, ксантен. Среди других допустимых добавок можно назвать следовые питательные добавки, такие как соли железа, марганца, бора, меди, кобальта, молибдена и цинка. Для удержания этих веществ на поверхности семян могут добавлять полимерные или другие пылевидные средства.

[0094] В некоторых специфических вариантах осуществления изобретения нанесенные покрытия, помимо микробных клеток или спор, могут содержать также слой адгезива. Адгезив должен быть нетоксичным, биоразлагаемым и клейким. Подходящими для него материалами являются, например: поливинилацетаты; coполимеры поливинилацетатов; поливиниловые спирты; coполимеры поливиниловых спиртов; целлюлозы, такие как метилцеллюлоза, гидроксиметилцеллюлоза и гидроксиметилпропилцеллюлоза; декстрины; альгинаты; сахара; меляссы; поливинилпирролидоны; полисахариды; протеины; жиры; растительные масла; гуммиарабики; желатины; сиропы; и крахмалы. Подходящими могут быть также материалы, описанные в (U.S. Pat. No. 7213367 и U.S. Pat. Appln. No. US20100189693).

[0095] В препарат для обработки семян также могут входить различные добавки, такие как адгезивы, диспергаторы, поверхностно-активные вещества, питательные и буферные ингредиенты. Обычными добавками в препарат для обработки семян являются, например, агенты для нанесения покрытия, смачивающие агенты, буферные агенты и полисахариды, а также по меньшей мере один подходящий для сельского хозяйства носитель, такой как вода, твердые тела или сухие порошки. Сухие порошки можно готовить из самых различных материалов, таких как карбонат кальция, гипс, вермикулит, тальк, гумус, активированный уголь и всевозможные соединения фосфора.

[0096] В одном из вариантов осуществления изобретения композиция для нанесение покрытия на семена может содержать по меньшей мере один наполнитель, являющийся органическим или неорганическим, природным или искусственным компонентом, с которым объединяются активные компоненты для облегчения их нанесения на семена. Желательно, чтобы наполнитель был инертным, твердым материалом, таким как глина, природный или искусственный силикат, кремнезем, смола, воск, твердое удобрение (например, соль аммония), природным почвенным минералом, таким как каолин, глина, тальк, известь, кварц, аттапульгит, монтмориллонит, бентонит или инфузорная земля, или искусственным минералом, таким как кремнезем, глинозем или силикат, из которых особенно подходящими являются силикаты алюминия или магния.

[0097] Препарат для обработки семян может содержать, кроме того, один или больше следующих ингредиентов: другие пестициды, включая соединения, действующие только под землей; фунгициды, такие как каптан, тирам, метаксил, флудиоксонил, оксадилил и изомеры каждого из этих материалов, и т.п.; гербициды, включая соединения, выбранные среди глифосфата, карбаматов, тиокарбаматов, ацетамидов, триазинов, динитроанилинов, глицериновых эфиров, пиридазинонов, урацилов, фенокси, мочевин и бензойных кислот; гербицидные защитные агенты, такие как бензоксазин, производные бензгидрила, N,N-диаллилдихлорацетамид, различные соединения дигалоацилов, оксазолидинилов и тиазолидинилов, этанон, соединения нафталевых ангидридов, и производные оксимов; удобрения; и агенты биоборьбы, такие как другие природные или рекомбинантные бактерии и грибы родов Rhizobium, Bacillus, Pseudomonas, Serratia, Trichoderma, Glomus, Gliocladium и микоризные грибы. Эти ингредиенты могут добавляться в форме отдельного слоя на семенах или, в альтернативном варианте, в качестве части композиции для покрытия семян согласно изобретению.

[0098] В предпочтительном варианте, количество новой композиции или других ингредиентов, используемых для обработки семян, не должно ингибировать прорастание семян или вызывать у них фитотоксические повреждения.

[0099] Обработанные микроорганизмами семена могут быть далее покрыты пленкой поверх нанесенного на них покрытия для защиты последнего. Такие поверхностные покрытия являются хорошо известными и могут наноситься методами псевдоожиженного слоя и во вращающемся барабане.

[0100] В принципе, любые семена растений, способные прорастать и образовывать растение, восприимчивое к воздействию нематодов и/или патогенных грибов, могут обрабатываться в соответствии с изобретением. Подходящими для этого являются семена зерновых культур, кофе, капустных культур, волокнистых культур, цветов, фруктов, бобовых, масличных культур, деревьев, клубнеплодных культур, овощей, а также других растений однодольных и двудольных видов. Предпочтительными для покрытия являются семена, например, бобовых, моркови, кукурузы, хлопка, трав, салата, арахиса, перца, картофеля, рапса, риса, ржи, сорго, сои, сахарной свеклы, подсолнуха, табака и томатов. В наиболее предпочтительными для покрытия композициями согласно изобретению являются семена ячменя или пшеницы (яровой пшеницы или озимой пшеницы).

[0101] В другом аспекте настоящего изобретения предлагается новое зерновое растение, созданное путем искусственного введения микробного эндофита по изобретению в зерновое растение, не содержащее эндофитных микроорганизмов. В некоторых вариантах осуществления данного аспекта микробным эндофитом, введенным в зерновое растение, может быть эндофитный антагонист, обладающий супрессорной активностью против фузариоза или возбудителя фузариоза. Кроме того, эндофитным антагонистом, введенным в зерновое растение, может быть грибной штамм SGI-010-H11. Известно множество способов, продемонстрировавших свою эффективность для введения микробного эндофита в зерновые травы. Примеры таких способов можно найти в (U.S. Pat. Appl. No. 20030195117A1, U.S. Pat. Appl. No. 20010032343A1, U.S. Pat. No. 7084331). Для специалиста в данной отрасли должно быть вполне понятным, что многие из вышеупомянутых способов могут использоваться в культивировании нового зернового растения согласно изобретению.

[0102] После искусственной инфикации желательно ДНК выделенного эндофитного антагониста амплифицировать с помощью ПЦР реакции, и подтвердить его антагонистичность путем проведения исследований гомологии для амплифицированной ДНК. Далее, желательно в вышеупомянутый эндофитный антагонист ввести инородный ген, экспрессирующий идентифицируемое средство, и подтвердить наличие колонизации данного эндофитного антагониста, инфицирующего растение, вышеупомянутым идентифицирующим средством с помощью этого инородного гена.

Получение композиции для биоборьбы в соответствии с настоящим изобретением

[0103] Культуры микробных антагонистов могут быть получены для использования в композициях биоборьбы согласно изобретению с помощью известных методов стандартной статической сушки и жидкой ферментации. Культивирование, как обычно, проводят в биореакторе.

[0104] Биореактором называется любое устройство, обеспечивающее условия биологически активной окружающей среды. В контексте данного описания биореактором является сосуд, в котором можно выращивать микроорганизмы, включая микробные антагонисты, согласно изобретению. Биореактор может иметь любую форму и размеры, подходящие для культивирования микроорганизмов. Биореактор может иметь размеры от 10 мл до литров и кубических метров. Он может быть изготовлен из нержавеющей стали или любого другого подходящего материала. Биореактор может быть периодического действия или непрерывного действия (например, с непрерывным перемешиванием). По своему типу биореактор может относиться к хемостатам, какие используются в микробиологии для выращивания и сбора бактерий. Среди поступающих в продажу подходящих биореакторов можно назвать, например, аппараты, выпускаемые фирмой Bioreactor System Design, Asenjo & Merchuk, CRC Press, 1995.

[0105] Для маломасштабных нужд, например, для тестирования и разработки новых процессов и процессов, которые не могут быть преобразованы в непрерывные, можно использовать биореактор периодического действия.

[0106] Микроорганизмы, культивируемые в биореакторе, могут суспендироваться или иммобилизироваться. Культивация в биореакторе в общем случае осуществляется в аэробных условиях при соответствующих температурах и pH. Для получения организмов согласно изобретению культивация клеток осуществляется при температурах в интервале 5-37°C, в котором предпочтительными являются температуры в интервалах 15-30°C, 15-28°C, 20-30°C и 15-25°C. Величина pH питательной среды может варьировать от 4,0 до 9,0, однако предпочтительным является рабочий интервал от немного кисловатого до нейтрального с pH 4,0-7,0, или 4,5-6,5, или pH 5,0-6,0. Как правило, максимальный клеточный выход получают в период 20-72 часов после инокуляция.

[0107] Вполне понятно, что оптимальные условия культивации антагонистов согласно изобретению зависят от конкретного штамма. Однако главные ингредиенты и условия питания можно будет определить, исходя из условий, применяемых в процессе селекции, и общих требований для большинства микроорганизмов. Микробные антагонисты, как правило, должны выращиваться в аэробных жидких культурах на среде, содержащей источники углерода, азота и неорганических солей, которые могут ассимилироваться микроорганизмом и содействовать эффективному росту клеток. Предпочтительными источниками углерода являются гексозы, такие как глюкоза. Однако их могут заменить другие, легкоассимилируемые источники, такие как аминокислоты. Источниками азота в процессе выращивания могут служить многие неорганические и белковые материалы. Предпочтительными источниками азота являются аминокислоты и мочевины, однако могут использоваться также газообразный аммиак, неорганические соли нитрата и аммония, витамины, чистые питательные вещества, пиримидины, дрожжевой экстракт, мясной экстракт, протеоз пептона, соевая мука, гидролизаты казеина, фильтрат барды и т.п. Среди неорганических минералов, которые могут вводиться в питательную среду, можно назвать обычные соли, способные поставлять ионы кальция, цинка, железа, марганца, магния, меди, кобальта, калия, натрия, молибдата, фосфата, сульфата, хлорида, бората и др. Предпочтительной питательной средой для грибных антагонистов является жидкая картофельная декстроза, а для бактериальных штаммов - бульон премикс R2A.

[0108] В настоящем описании указаны и включены посредством ссылок различные источники информации, среди которых, например, статьи из научных журналов, патентные документы, учебные пособия и адреса интернет-страниц. Ссылки на эти источники служат исключительно для целей показать общее состояние уровня техники на время подачи заявки. В то время как содержание и идеи, изложенные во всех и каждом из этих источников, могут послужить основой и использоваться для реализации и применения вариантов осуществления изобретения на практике, ни одно из обсуждений и ни один из комментариев в конкретном источнике информации не может считаться признанием того, что такой комментарий был в широком смысле принят в качестве общего мнения в данной отрасли.

[0109] Приведенное здесь описание общих способов имеет исключительно иллюстративные цели. Вполне очевидными могут быть вытекающие из этого описания другие альтернативные способы и варианты осуществления изобретения, которые также лежат в рамках идеи и сферы применения настоящей заявки.

[0110] Ниже приведены примеры, которые служат также исключительно для иллюстрации данного изобретения и не предполагают каких бы то ни было его ограничений.

ПРИМЕРЫ

ПРИМЕР 1. Описание антагонистических микроорганизмов, способных подавлять развитие Fusarium graminaerum и Gibberella zeae, являющихся возбудителями фузариоза

[0111] В данном примере описан высокопроизводительный процесс сбора и скрининга микроорганизмов-кандидатов, разработанный фирмой Synthetic Genomics, Inc. для выделения штаммов микроорганизмов, обладающих супрессорной активностью против возбудителей фузариоза и, в частности, против Fusarium graminearum. Новые микробные антагонистические штаммы были выделены из образцов растительной ткани, собранных в нескольких местах на территории Соединенных Штатов. Из тканей корней растений, собранных в заповеднике Eagle Peak Preserve вблизи Julian, CA, были выделены бактериальные штаммы SGI-014-C06, SGI-014-G01, SGI-015-F03 и SGI-015-H06. Из тканей стеблей двух образцов различных растений, собранных в San Elijo Lagoon, Encinitas, CA, были выделены грибной штамм SGI-010-H11 и бактериальный штамм SGI-005-G08.

[0112] Выделение этих микроорганизмов производили следующим образом. Для выделения бактериального штамма ткани корней растений облучали ультразвуком и последовательно разбавляли на планшетах с 2xYT (дрожжевым экстрактом с триптоном) и с безазотистой агаровой средой. После этого по морфологическим характеристикам были отобраны индивидуальные колонии, которые индивидуально культивировали в жидкой бульонной среде. Для выделения грибов растительную ткань сначала подвергали поверхностной стерилизации погружением в 70% этанол и кратковременной обработкой в пламени. Затем ткань рассекали и помещали на картофельно-декстрозный агар (ПДА), после чего ее инкубировали при комнатной температуре. Когда начинал наблюдаться рост мицелия, сегмент мицелиальной культуры переносили на другой ПДА планшет. Штаммы микроорганизмов выделяли, очищали и хранили при -80°C в 15% глицероле для бактериальных штаммов и на высушенных семенах ячменя для грибных штаммов.

[0113] У выделенных штаммов микроорганизмов определяли способность подавлять рост мицелия F. graminearum в испытаниях на антагонизм in vitro, которые проводили на агаровых планшетах с картофельно-декстрозной агаровой (ПДА) питательной средой в соответствии с методикой высокоэффективного скрининга с небольшими модификациями, описанной в заявке (U.S. Pat. Appl. No. US20120107915A1), включенной здесь посредством ссылки. Вкратце, выделенные штаммы микроорганизмов выращивали на трипсин-соевом бульоновом агаре (ТСБА/5) с одной пятой нормальной концентрации в течение 24 ч перед употреблением. Конидиальный инокулят F. graminearum NRRL-5883 продуцировали путем гифального прищипывания активно растущей колонии гриба и переноса гифальных нитей в ПДА агаровую среду. После инкубирования планшетов в течение 7 дней при 25°C с 12 ч/день фотопериодом, конидии отмывали от ПДА планшетов с помощью слабого фосфатного буфера (0,004% фосфатный буфер, pH 7,2 с 0,019% MgCl₂). Затем суспензию конидий F. graminearum в слабом фосфатном буфере (1×10⁵ конидий/мл) сразу же распределяли по поверхности агара, и затем планшеты инкубировали при 25°C в течение 48-72 ч. Для инициации теста на антагонизм, клетки выделенных микробных штаммов точечно инокулировали на равных расстояниях внутри периметра планшета. Через пять дней штаммы отмечали как антибиоз-положительные, когда по периметру микробных колоний визуально наблюдалась светлая площадь, на которой отсутствовал мицелиальный рост.

[0114] По вышеописанной методике было выделено и проанализировано более 4000 микробных штаммов. Среди них шесть штаммов проявляли способность существенно подавлять мицелиальный рост F. graminearum NRRL-5883 на ПДА среде. Эти новые микробные антагонисты получили следующие наименования: SGI-005-G08, SGI-010-H11, SGI-014-C06, SGI-014-G01, SGI-015-F03 и SGI-015-H06.

[0115] Вышеуказанные новые микробные антагонисты подвергались также тестированию на антагонизм по их способности подавлять рост грибного патогена Gibberella zeae, который является телеоморфным видом гриба Fusarium graminearum. Все используемые при этом методики были идентичными вышеописанным, за исключением того, что тестированным таким способом патогенным штаммом был патогенный штамм гриба Gibberella zeae. Среди этих шести микробных антагонистов четыре штамма SGI-010-H11, SGI-014-C06, SGI-015-F03 и SGI-015-H06 продемонстрировали способность существенно подавлять мицелиальный рост гриба Gibberella zeae.

ПРИМЕР 2. Экстрагирование ДНК. Секвенирование и таксономия

Лизис грибных клеток и получение информации о последовательности ITS-5.8S рДНК

[0116] Грибную биомассу переносили на 96-луночный ПЦР микропланшет, содержащий 50 мкл 2× буфера для лизиса (100 мM Tris HCL, pH 8,0, 2 мM EDTA, pH 8,0, 1% SDS, 400 мкг/мл протеиназы K). Лизис проводили в следующих условиях: 55°C в течение 60 минут, 94°C в течение 4 минут. Аликвоту лизисного продукта использовали в качестве источника матричной ДНК для ПЦР амплификации. Последовательность ITS-5.8S рДНК амплифицировали с помощью ПЦР реакции с двумя праймерами M13-ITS1 (SEQ ID NO: 15) и ITS4 M13-хвост (SEQ ID NO: 16).

[0117] Для амплификации участка ITS-5.8S рДНК каждую ПЦР смесь готовили в реакционной смеси с конечным объемом 20 мкл, содержащей 4 мкл из реакционной смеси грибного лизиса, 0,2 мкM каждого праймера (ITS1/ITS4), 6% Tween-20 и 10 мкл 2× ImmoMix (Bioline USA Inc, Taunton, MA). ПЦР проводили в следующих условиях: 94°C в течение 10 минут; 94°C в течение 30 секунд, 52°C в течение 30 секунд, 72°C в течение 75 секунд в течение 30 циклов; 72°C в течение 10 минут. 2-мкл аликвоту ПЦР продукта помещали на 1,0% агарозный гель для подтверждения одинарной полосы ожидаемого размера. Положительные полосы направляли на секвенирование по Сэнгеру в прямом и обратном направлениях с помощью M13 праймеров. Последовательность 5.8S межгенного участка (ITS) грибного штамма SGI-010-H11 представлена в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO: 11. Исследование гомологии для определенной нуклеотидной последовательности 5.8 S межгенного участка (ITS) проводили с помощью базы данных DDBJ/GenBank/EMBL. После этого была проанализирована филогенетическая взаимосвязь нуклеотидной последовательности 5.8S межгенного участка (ITS) среди описанного здесь выделенного грибного антагониста SGI-010-H11, микроорганизмов родов и видов, демонстрирующих высокие гомологии последовательностей с выделенным грибным антагонистом SGI-010-H11, и другими разнообразными родами и видами микроорганизмов с помощью программы ClustalW строительства филогенетического дерева. Грибной штамм SGI-010-H11 считается родственным семейству Mycosphaerellaceae, если судить по ~97% сходству его последовательности ITS-5.8S рДНК с таковой у Mycosphaerellapunctiformis (GenBank EU343182) и Ramulariapratensis (GenBank EUO19284), 5.8S ITS последовательности которых демонстрируют явное родство с Mycosphaerellaceae.

Лизис бактериальных клеток и получение информации о последовательности 16S рРНК

[0118] 20 мкл аликвоту клеточной суспензия перенесли на 96-луночный ПЦР планшет, содержащей 20 мкл 2х буфера для лизиса (100 мM Tris HCL, pH 8,0,2 мM EDTA, pH 8,0,1% SDS, 400 мкг/мл Протеиназы K). Лизис проводили в следующих условиях: 55°C в течение 30 минут, 94°C в течение 4 минут. Аликвоту лизисного продукта использовали в качестве источника матричной ДНК для ПЦР амплификации. Последовательность 16S рРНК амплифицировали с помощью ПЦР реакции с праймерами M13-27F (SEQ ID NO: 17) и 1492R M13-хвост (SEQ ID NO: 18).

[0119] Для амплификации участка 16S рРНК каждую ПЦР смесь готовили в реакционной смеси с конечным объемом 20 мкл, содержащей 4 мкл из реакционной смеси бактериального лизиса, 2 мкM каждого праймера (27F/1492R), 6% Tween-20 и 10 мкл 2x ImmoMix (Bioline USA Inc, Taunton, MA). ПЦР реакцию проводили в следующих условиях: 94°C в течение 10 минут; 94°C в течение 30 секунд, 52°C в течение 30 секунд, 72°C в течение 75 секунд в течение 30 циклов; 72°C в течение 10 минут. 2-мкл аликвоту ПЦР продукта поместили на 1,0% агарозный гель для подтверждения одиночной полосы ожидаемого размера. Положительные полосы направляли на секвенирование по Сэнгеру в прямом и обратном направлениях с Ml3 праймерами. Последовательности 16S рРНК бактериальных штаммов SGI-014-C06, SG1-005-G08, SGI-014-G01, SGI-015-F03 и SGI-015-H06 имели длину приблизительно 1,4 Kb и представлены в Перечне последовательностей под номерами SEQ ID NO: 1, 10, 12, 13 и 14, соответственно. Исследование гомологии для определенных нуклеотидных последовательностей проводили с помощью базы данных DDBJ/GenBank/EMBL. После этого анализировали филогенетическую взаимосвязь нуклеотидной последовательности 16 рРНК генов среди описанных здесь выделенных бактериальных антагонистов, бактерий родов и видов, проявляющих высокие гомологии последовательностей с выделенными бактериальными антагонистами, и других разнообразных бактериальных родов и видов с помощью программы ClustalW строительства филогенетического дерева. Идентичность последовательностей и сходство определяли также с помощью программы GenomeQuest™ (Gene-IT, Worcester Mass. USA). Результаты анализа последовательностей показали, что бактериальный изолят SGI-014-G01 может считаться родственным роду Variovorax на основании ~99% сходства его 16S рРНК последовательности с таковыми у нескольких видов Variovorax, включая Variovorax. R-21938 (GenBank AJ786799) и Variovoraxparadoxus (GenBank GUI 86109), 16S рРНК последовательности которых демонстрируют явную родственность с видом Variovorax. Кроме того, результаты анализа последовательностей показали, что два бактериальных изолята SGI-015-F03 и SGI-015-H06 могут считаться родственными семейству Bacillaceae на основании >99% сходства их соответствующих 16S последовательностей таковым у нескольких видов Bacillus.

[0120] Результаты анализа последовательностей показали, что два бактериальных изолята SGI-014-C06 и SGI-055-G08 могут считаться родственными семейству Microbacteriaceae на основании >99% сходства их соответствующих 16S последовательностей таковым у нескольких видов Microbacterium. А именно, 1430 нт последовательность 16S рРНК гена SGI-014-C06 (SEQ ID NO: 1) является идентичной 16S рРНК гена штамма DSM 20578 Microbacterium oxydans и нескольких других штаммов Microbacterium (например, последовательностям Y17227.1, FJ200406, EU086800 и EU714335 из GenBank) на всей 1430 нт длине.

[0121] В частности, среди тысяч микробных штаммов, которые были выделены и протестированы на способность подавлять развитие Fusarium в анализе на антагонизм, как описано в Примере 1, восемьдесят восемь штаммов были вслед за этим идентифицированы как вид Microbacterium на основании подобия их 16S последовательностей таковым у известных видов Microbacterium. Однако, авторами было установлено, что супрессорной активностью против Fusarium graminearum обладали только два штамма - SGI-014-C06 и SGI-055-G08 Microbacterium. Как указывалось выше, на сегодняшний день сообщалось о нескольких микробах природного происхождения, обладающих антагонистической активностью против фузариоза. Однако до настоящего изобретения не было сообщений о микроорганизме рода Mycobacterium, обладающем антагонистической активностью. Кроме того, до настоящего изобретения его авторам не были известны способы или процессы, в которых бы использовался бактериальный штамм рода Mycobacterium в качестве агента биоборьбы по предотвращению, ингибированию или лечебной обработке по отношению к развитию патогена, являющегося возбудителем фузариоза.

ПРИМЕР 3. Анализ последовательностей обязательных генов из изолята SGI-014-C06

[0122] Недавно в работе (Richert et al. Syst. Appl. Microbiol. 30:102-108, 2007) сообщалось о филогенетических исследованиях нескольких обязательных генов из 27 видов рода Microbacterium. В этих исследованиях было сделано заключение, что хотя достоинства анализа 16S рРНК последовательностей для систематической таксономии являются непревзойденными, фокусирование внимания только на единственном таксономическом параметре не приведет к систематическим выводам. Как указывалось выше, нуклеотидная последовательность 16S рРНК гена штамма SGI-014-C06 (SEQ ID NO: 1) является идентичной 16S рРНК гена нескольких штаммов Microbacterium, включая нуклеотидную последовательность 16S рРНК гена штамма DSM 20578 Microbacterium oxydans, который был включен в исследования (Richert et al. (2007) (GenBank Accession Y17227.1)). Авторы изобретения распространили далее филогенетический анализ на четыре обязательные гена изолята SGI-014-C06, которыми являются субъединица B ДНК-гиразы (gyrB), субъединица B РНК-полимеразы (rpoE), рекомбиназа A (recA), и полифосфат-киназа (ppk). В направлении этого конца весь геном изолята SGI-014-C06 был секвенирован методом «шотган», собран и аннотирован в соответствии с методиками, описанными в (PCT Patent Application No. WO2010115156A2). Геномная ДНК была приготовлена из свежей культуры SGI-014-C06. Для экстрагирования высокомолекулярной ДНК использовались клеточная гранула и комплект для выделения ДНК UltraClean® Mega Soil DNA Isolation Kit (Cat. No 12900-10), выпускаемый MO BIO Laboratories, Inc., согласно протоколу, рекомендованному изготовителем. После этого была приготовлена геномная ДНК из SGI-014-C06 для «шотган» 454-пиросеквенирования. Геномная ДНК (7,5 мкг) использовалась для конструирования библиотеки в соответствии с рекомендованным протоколом (454 Life Sciences) для одиночных длинных ридов. Последовательности были генерированы двумя последовательными проходами секвенирования GS FLX Titanium.

[0123] Получены последовательности четырех обязательных генов gyrB, rpoB, recA, andppk изолята SGI-014-C06, приведенные в Перечне последовательностей. Исследования гомологии для определенных нуклеотидных последовательностей проводились с помощью базы данных DDBJ/GenBank/EMBL. Идентичность последовательностей и сходство также определялись с помощью программы GenomeQuest™ (Gene-IT, Worcester Mass. USA). Ниже более подробно показано, что результат секвенирования обязательных генов выявил новизну описанного здесь изолята SGI-014-C06, который является новым бактериальным штаммом и может считаться родственным семейству Microbacteriaceae.

[0124] Полинуклеотидная последовательность гена gyrB штамма SGI-014-C06 имеет наибольшую идентичность с последовательностью гена gyrB штамма Microbacterium testaceum с номером доступа AP012052 в GenBank (82,69% по выравниванию 936/2172 нуклеотидов). По сравнению с геном gyrB штамма DSM 20578 Microbacterium oxydans (GenBank AMI 81493; Richert et al., 2007), гомологии последовательностей между этими двумя генами были на ~62% идентичными на нуклеотидном уровне и на ~37% идентичными на аминокислотном уровне.

[0125] Полинуклеотидная последовательность гена rpoB штамма SGI-014-C06 имеет наибольшую идентичность с последовательностью гена rpoB штамма Microbacterium maritypicum с номером доступа AM181582 в GeneBank (96,98% по выравниванию 1093/3504 нуклеотидов). По сравнению с геном rpoB штамма DSM 20578 Microbacterium oxydans (GenBank AM181583; Richert et al., 2007), гомологии последовательностей между этими двумя генами были на ~96% идентичными на нуклеотидном уровне и на 99% идентичными на аминокислотном уровне.

[0126] Полинуклеотидная последовательность гена recA штамма SGI-014-C06 имеет наибольшую идентичность с последовательностью гена recA штамма Microbacterium testaceum с номером доступа AP012052 в GeneBank (85,45% по выравниванию 962/1188 нуклеотидов). По сравнению с геном recA штамма DSM 20578 Microbacterium oxydans (GenBank AMI 81527; Richert et al., 2007), гомологии последовательностей между этими двумя генами были на ~92% идентичными на нуклеотидном уровне и на 100% идентичными на аминокислотном уровне.

[0127] Полинуклеотидная последовательность гена ppk штамма SGI-014-C06 имеет наибольшую идентичность с последовательностью гена ppk штамма Microbacterium luteolum с номером доступа AM181554 в GenBank (91,38% по выравниванию 1380/2175 нуклеотидов). По сравнению с геном ppk штамма DSM 20578 Microbacterium oxydans (GenBank AMI 81556; Richert et al., 2007), гомологии последовательностей между этими двумя генами были на ~91% идентичными на нуклеотидном уровне и на ~98% идентичными на аминокислотном уровне.

ПРИМЕР 4. Защита пшеницы от инфекции Fusarium graminearum с помощью микробных антагонистов Microbacterium. (NRRL B-50470) Mycophaerella. fNRRL 50471) и Variovorax. (NRRL B-50469)

[0128] Описанные в Примере 1 микробные штаммы, продемонстрировавшие положительную пробу на антибиоз в скрининге по антагонизму, далее были подвергнуты биоиспытаниям на растениях, в которых клетки микробных штаммов наносились непосредственно на семена восприимчивого зернового культивара с последующей инокуляцией конидиальными спорами гриба F. graminearum. Микробные штаммы выращивались до достаточной мутности и разбавлялись в воде. Два грамма семян пшеницы восприимчивого сорта (Hank; WestBred LLC, Bozeman, MT) высеивали в однолитровые горшки с пастеризованной почвенной средой. После высеивания, поверх семян распределяли 20 мл раствора микробной культуры. Семена пшеницы выдерживали в тепличных условиях для проращивания под флуоресцентным освещением в течение 14 ч фотопериода. В начале цветения колос пшеницы подвергали заражению путем распыления конидиальных спор NRRL 5883 F. graminearum. Конидиальные споры собирали с ПДА планшетов пятидневного возраста путем выливания на планшеты воды с 0,01% Tween 20 и соскабливания спор в суспензию. После распыления спор пшеничные растения переносили в туманную камеру с 100% влажностью и выдерживали в ней в течение трех дней для инфицирования. Таким образом готовили следующие образцы:

[0129] 1. Необработанные образцы: без обработки микробным или химическим фунгицидом + заражение Fusarium.

[0130] 2. Неинфицированные образцы: без обработки микробным или химическим фунгицидом, без заражения Fusarium.

[0131] 3. SGI-010-H11: грибная обработка + заражение Fusarium.

[0132] 4. SGI-014-GO1: бактериальная обработка + заражение Fusarium.

[0133] 5. SGI-014-C06: бактериальная обработка + заражение Fusarium.

[0134] Через двадцать дней после инфицирования орошение прекращали, и пшеничным растениям давали высохнуть в течение трех недель перед сбором урожая. Затем каждый колос пшеницы срезали и собирали индивидуально. Тяжесть болезни определяли для каждого колоса, имевшего симптомы фузариоза. Численно тяжесть болезни определяли путем деления числа пораженных колосков на общее число колосков, приходившееся на один колос. Полученные результаты (таблица 2) показали, что пшеница, обработанная любым из трех микробных антагонистов SGI-014-C06 (NRRL B-50470), SGI-010-H11 (NRRL 50471) и SGI-014-G01 (NRRL B-50469), имела значительно меньшие тяжесть болезни и количество заражений Fusarium graminearum, чем «необработанный» контроль, выращиваемый в тех же самых условиях (P<0,05).

[0135] Семена с каждого колоса собирали вручную и взвешивали. Определяли средний вес семян на горшок и в каждом режиме обработки. Как показано в таблице 3, все микробные антагонисты дали значительное снижение потерь урожая, обусловленных инфицированием фузариозом.

Таблица 2 Эффективность микробных антагонистов в снижении количества заболеваний пшеницы фузариозом
Обработка	Тяжесть заболевания, %	Стандартное отклонение	Величина P
Неинфицированный	1,30	0,0025	<0,0001
Необработанный	15,46	0,0364	Не определена
SGI-010-H11	7,42	0,0219	0,0005
SGI-014-G01	6,59	0,0315	0,0001
SGI-014-C06	7,21	0,0225	0,0004

Таблица 3 Эффективность микробных антагонистов в сохранении выхода семян в пшенице, зараженной фузариозом
Обработка	Масса семени, г	Величина P
Неинфицированный	0,8438±0,1633	0,0191
Необработанный	0,4669±0,1209	Не определена
SGI-010-H11	0,6200±0,1 844	0,7025
SGI-014-G01	0,7963±0,2032	0,5277
SGI-014-C06	0,6744±0,0948	0,0551

ПРИМЕР 5. Ингибирование роста Fusarium graminearum микробными антагонистами на сеянцах пшеницы

[0136] Микробные штаммы, продемонстрировавшие супрессорную активность против F. graminearum в лабораторном тесте на антагонизм, были исследованы также на их способность снижать заболеваемость фузариозом семян пшеницы. Семена восприимчивого сорта пшеницы (Hank; WestBred LLC, Bozeman, MT) высеивали в 1-литровые пластмассовые горшки диметром 20 см с пастеризованной почвенной средой. Микробные клеточные суспензии готовили следующим образом. 2YT или другую подобную питательную среду инокулировали бульонными культурами из матричных глицериновых растворов изолятов или штриховых планшетов. Как правило, культуры инициировались за 48-72 ч до помещения их в камеру для культивирования, теплицу или на поле, где они достигали поздней экспоненциальной фазы роста. Изоляты с более длительным временем удвоения инициировались, кроме того, заранее. Культуры инкубировали при 30°C на роторном шейкере при 200 об./мин. После культивирования клетки формировались в гранулы 10000×г в течение 15 мин. при 4°C и ресуспендировались в 10 мM MgSO₄ буфере (pH 7,0). Плотность клеток нормировали для каждого изолята в единицах КОЕ/мл (клеткообразующих единицах на миллилитр). Как правило, готовили ~10⁹ КОЕ/мл суспензии для каждого изолята, которую доставляли к месту инокуляция на льду. Инокуляцию проводили путем разбавления этих клеточных суспензий в отношении 1/20 в ирригационной воде до конечной плотности 5×10⁷ КОЕ/мл. Для опытов в 1 литровых горшках 20 мл этой разбавленной клеточной суспензии равномерно распределяли по культивационной поверхности каждого горшка. Для экспериментов в микрогоршках клеточные суспензии не разбавлялись, и 1 мл каждой 10⁹ КОЕ/мл суспензии помещали пипеткой на культивационную поверхность каждого горшка подобно опрыскиванию по верху погруженных семян. Семена и растения выдерживались в теплице при комнатной температуре с 14-ти часовым фотопериодом освещения.

[0137] Мицелий штамма NRRL-5883 вида Fusarium graminearum выращивали на ПДА планшетах в течение 5 дней при непрерывном освещении. Гифы и конидии собирали путем выливания нескольких миллилитров стерильной воды (0,01% Tween 20) на планшеты и соскабливания поверхности агара стерильным шпателем. Концентрация спор в инокуляте составляла приблизительно 2×10⁵ спор/мл, однако концентрация гифального фрагмента не определялась.

[0138] Инокуляцию видом F. graminearum начинали после выхода коротких ростков из семян и повторяли каждый второй вечер на протяжении 10 дней. Инокулят F. graminearum наносили путем разбрызгивания в количестве приблизительно 30 мл на горшок. Сразу после инокуляции, всякий раз растения опрыскивали сверху с помощью туманообразователя. При использовании химического фунгицида его готовили путем разбавления 2 мл фунгицидного исходного раствора (Banner Maxx, Syngenta) в 1 л дистиллированной воды и наносили с помощью разбрызгивателя в количестве приблизительно 30 мл на горшок.

[0139] Фузариозное поражение оценивали по степени Fusarium инфицирования, определяя ее числом Fusarium колониеобразующих единиц на грамм (КОЕ/г) растительных тканей. Все операции обработки выполнялись в четырех блоках по четыре горшка в каждом. Проводились следующие виды обработки:

[0140] 1. Необработанный: без обработки микробным или химическим фунгицидом + заражение Fusarium.

[0141] 2. Неинфицированный: без обработки микробным или химическим фунгицидом и без заражения Fusarium.

[0142] 3. Фунгицид: обработка химическим фунгицидом + заражение Fusarium.

[0143] 4. SGI-010-H11: грибная обработка + заражение Fusarium.

[0144] 5. SGI-014-G01: бактериальная обработка + заражение Fusarium.

[0145] 6. SGI-014-C06: бактериальная обработка + заражение Fusarium.

[0146] Полученные результаты, которые приведены в таблице 4, показали, что все три микробные обработки дали значительное снижение тяжести фузариоза по сравнению с неинфицированным контролем. В частности, два микробных антагониста, SGI-014-C06 и SGI-010-H11, значительно снизили инфицирование пшеницы видом Fusarium graminearum по сравнению с необработанным контролем, выращиваемым в таких же самых условиях. Защита пшеницы от Fusarium-инфицирования, осуществляемая любым из двух микроорганизмов - SGI-014-C06 или SGI-010-H11, была статистически сравнимой с защитой продажным химическим фунгицидом. При использовании микроорганизма SGI-014-G01 наблюдаемая защита пшеницы от Fusarium-инфицирования была намного менее заметной, а ее эффективность существенно изменялась от одного культивационного горшка к другому.

Таблица 4 Действие микробных антагонистов на инфицирование грибом Fusarium
Обработка	КОЕ/г	Величина P
Необработанный	1487±600	Не определена
Неинфицированный	0±0	<0,0001
Химический фунгицид	290±146	<0,0001
SGI-010-H11	671±450	0,0077
SGI-014-G01	1246±465	0,8387
SGI-014-C06	367±234	0,0001

ПРИМЕР 6. Культивирование и хранение микробных антагонистов

[0147] Вид Mycosphaerella. Для хранения выделенного гриба в качестве чистой культуры использовали несколько способов, в одном из которых применяли фильтровальную бумагу. В другом случае, после культивирования гриба на ПДА его разрезали на маленькие квадраты, которые помещали во флакончики с 15% раствором глицерола и сохраняли в них при -70°C. В аналогичном опыте этот гриб хранили при 4°C, но не в глицероле, а в дистиллированной воде. Однако одним из предпочтительных способов было хранение на инфицированных стерильных семенах ячменя при -80°C.

[0148] Виды Bacillus, Microbacterium и Variovorax. Выделенные бактерии сохранялись как чистая культура. Бактериальную колонию переносили в флакончик с жидкой бульонной средой R2A (Tecknova) и культивировали в нем при 30°C на шейкере при скорости 250 об./мин. в течение двух дней. После этого культуру переносили во флакончики с 15% раствором глицерола и сохраняли в них при -80°C.

ПРИМЕР 7. Обработка для продуцирования спор и нанесения покрытия на семена

[0149] Продуцирование спор. В соответствии с типовой методикой продуцирования спор, один литр питательной среды 2xYT (16 г/л триптона, 10 г/л дрожжевого экстракта, 5 г/л NaCl) инокулировали стартерной культурой в количестве 5 мл или соскобом чашки Петри и инкубировали в течение ночи при 30°C в ротационном шейкере со скоростью 225 об./мин. Бактериальные клетки гранулировали путем центрифугирования и промывали 1x ЗФР буфером (8 г/л NaCl; 0,2 г/л KC1; 1,44 г/л Na₂HPO₄; 0,24 г KH₂PO₄; pH 7,4). Клетки ресуспендировали в среде CDSM (Hageman et al, J. Bacterial., 438-441, 1984), и культивировали еще в течение четырех ночей при 30°C в ротационном шейкере. Споруляцию в бактериальной культуре контролировали ежедневно с помощью фазоконтрастного микроскопа до тех пор, пока не образовалась вся культура из свободно плавающих спор. Продолжительность такого инкубирования, как правило, не превышает четырех дней или же длится более шести дней, в зависимости от культивируемого вида. Под фазоконтрастным микроскопом эндоспоры видны внутри клеток в виде ярко-белых сплющенных сфероидов. Бактериальные споры гранулировали путем центрифугирования в режиме 10000 X г в течение 15 минут, дважды промывали стерильной dH₂О и, при необходимости, концентрировали до 50 мл, и могли либо сразу использоваться, либо охлаждаться для использования в будущем. Концентрацию спор измеряли по методике OD₆₀₀. Эта методика, как правило, давала по меньшей мере 2000 OD бактериальных спор.

[0150] В частности, несколько бактериальных штаммов в соответствии с изобретением, например, SGI-015-F03 вида Bacillus, могут продуцировать большие количества спор после 4 дней инкубации с простой инокуляцией большой, росшей в течение ночи стартерной культурой (~15 мл) в 1 л 2хSG питательной среды с последующей 4-дневной инкубацией при соответствующей температуре в ротационном шейкере в режиме 225 об./мин. Использовалась питательная среда 2хSG следующего состава: 16 г/л питательный бульон; 0,25 г/л MgSO₄; 2,0 г/л KCl; 0,15 г/л CaCl₂.2H₂O; 0,025 г/л MnCl₂.2H₂O; 0,28 мг/л FeSO₄-7H₂O; 1,0 г/л декстрозы.

[0151] Нанесение покрытия на семена пшеницы и кукурузы. Проводили маломасштабный эксперимент по обработке семян в соответствии с минимально модифицированной методикой, описанной в (Sudisha et al., 2009). Как правило, готовили маточный раствор биополимера путем добавления 6 г порошка гуммиарабика (MP Biomedical) в 36 мл воды в 50 мл пробирке Falcon и последующего перемешивания до гомогенности с помощью колесного миксера. Для перемешивания больших количеств покрываемых семян, где необходимо, использовали смесительную плиту.

[0152] Если использовали растительные клетки, то мутные культуры активно растущих микробных клеток промывали ЗФР (забуференным фосфатом физиологическим раствором) и доводили до OD₆₀₀~5,0. В альтернативном варианте микробные споровые суспензии готовили так, как описано выше. Бактериальные споры и/или растительные клетки тщательно ресуспендировали в ~32 мл гуммиарабик-биoполимерного маточного раствора, приготовленного так, как описано выше, и полученную суспензию тщательно перемешивали в 1 л бутыли. В бутыль добавляли приблизительно 400 г семян (пшеницы или кукурузы) и интенсивно перемешивали на шейкере или вихревом встряхивателе до достижения равномерного распределения гумми/клеточной суспензии. Затем покрытые семена распределяли по пластмассовым блюдцам для сушки в ламинарном потоке до устранения липкости, в общем случае в течение 3-6 ч с периодическим перемешиванием. В некоторых случаях, покрытые спорами семена можно сушить в течение ночи. Однако, семена, покрытые растительными культурами, как правило, отправлялись на хранение до того, как они полностью обезвоживались. Тест на жизнеспособность, которому периодически подвергались микробы, используемые в препаратах покрытий на семенах, показал, что эти микробы сохраняли жизнеспособность в течение по меньшей мере трех месяцев. Скорость прорастания покрытых семян была практически идентичной таковой у непокрытых контрольных семян.

ПРИМЕР 8. Влияние микробной обработки семян на развитие фузариоза в пшенице

[0153] Семена восприимчивого к фузариозу сорта (RB07) пшеницы покрывались микроорганизмами SGI-014-C06 или SGI-015-F03, или SGI-015-H06 в соответствии с методикой, описанной в Примере 8. Покрытые семена высевали в 1 л горшки с пастеризованной почвенной средой [(Metromix-Mix 200; Scotts-Sierra Horticultural Products, Marysville, OH; и 3 грамма удобрения 14-14-14 (N-P-K)]. Горшки засеменялись по 7-8 растений в каждом, после чего, в фазу роста 3-го листа, их засеменение уменьшали до 5 растений на горшок. Горшки объединяли в рандомизированные блоки по 5 горшков на обработку. Далее, покрытые семена ставили для прорастания в тепличные условия с флуоресцентным освещением в течение 16 ч в сутки. Когда началось цветение пшеницы, ее путем разбрызгивания на колос заражали макроконидиальными спорами штамма NRRL 5883 вида F. graminearum в концентрации 100000 спор/мл. После разбрызгивания спор пшеницу помещали в климатическую камеру с 100% влажностью и образованием росы, и выдерживали в этих благоприятных для инфицирования условиях в течение трех дней. Проводили такие виды обработки образцов:

[0154] 1. Необработанный: без микробной или химической фунгицидной обработки + заражение Fusarium.

[0155] 2. SGI-014-C06: бактериальная обработка семян + заражение Fusarium.

[0156] 3. SGI-015-F03: бактериальная обработка семян + заражение Fusarium.

[0157] 4. SGI-015-H06: бактериальная обработка семян + заражение Fusarium.

[0158] Тяжесть фузариоза оценивали визуально на десятый день и двадцать первый день после инфицирования. Степень инфицирования определяли для каждого колоска, проявляющего симптомы фузариоза, и вычисляли процент симптоматических колосков, то есть умноженное на 100 число колосков, демонстрирующих симптомы фузариоза, делили на общее число колосков. Полученные результаты (таблица 5) показали, что семена пшеницы, покрытые любым из трех тестируемых микробных антагонистов - SGI-014-C06, SGI-015-F03, SGI-015-H06, имели значительно пониженную степень инфицирования грибом Fusarium graminearum по сравнению с «необработанным» контролем, выращиваемым в таких же самых условиях (P<0,05).

Таблица 5 Развитие симптомов фузариоза в пшенице после обработки семян антагонистическими микроорганизмами
Обработка	Степень инфицирования, %
	На 10 день после инфицирования	На 21 день после инфицирования
Необработанный контроль	49,31	66,10
SGI-014-C06	2,08	7,74
SGI-015-F03	23,12	31,53
SGI-015-H06	9,42	19,81

ПРИМЕР 9. Биоборьба с фузариозом пшеницы в тепличных испытаниях

[0159] Каждый из микроорганизмов SGI-014-C06, SGI-015-F03 и SGI-015-H06 тестировали в тепличных испытаниях большего масштаба. Испытания проводили в «теплице для культивирования растений» (PGCR: plant growth containment room) при фирме Synthetic Genomics, Inc., и включали такие виды лечебной обработки: инфицированный контроль, неинфицированный контроль, а также обработку промышленными фунгицидами четырех марок. Среди них были: химические фунгициды марок Banner MAXX® (Syngenta) с концентрацией 2 мл/л и Prosaro® (Bayer CropScience) с концентрацией 3 мл/л, которые наносились путем распыления на листья в соответствии с рекомендациями изготовителя, и биологические фунгициды марок Actinovate® (Natural Industries) и RhizoVital® (ABiTEP GmbH), которые наносились путем опрыскивания почвы также в соответствии с рекомендациями изготовителя.

[0160] Препарат для микробной обработки наносили либо путем опрыскивания почвы, либо путем покрытия семени. Когда микробную обработку проводили путем опрыскивания почвы, клеточные суспензии каждого микроорганизма индивидуально наносили на семена перед покрытием их большим количеством питательной среды. Для этого, свежеприготовленные культуры гранулировали, удаляя с них питательные вещества, и повторно суспендировали в 10 мM сульфат-магниевого (MgSO₄) буфера. После этого клеточные суспензии добавляли путем пипетирования и равномерного распределения 20 миллилитров суспензии по семенам при общем количестве ~10⁹ клеток на горшок. В случае микробной обработки путем нанесения покрытий на семена, микроорганизмы (клетки/споры) готовили по существу так, как описано выше, в Примере 8. Покрытые семена получали путем введения в клеточную суспензию раствора гуммиарабика и, таким образом, создания липкой смеси для последующего нанесения ее на семена. После этого микробное покрытие семян просушивали, в результате чего образовывался твердый, но водорастворимый, биополимер захватывающий микроорганизмы (клетки/споры). Цель этих манипуляций состояла в том чтобы обеспечить титр клеток по меньшей мере 10⁶-10⁷ жизнеспособных клеток/семя. В этом тепличном эксперименте покрытие на семена наносили за день до посева.

[0161] Для каждого вида обработки было предусмотрено четыре одинаковых комплекта образцов, размещенных по рандомизированной полнооблочной схеме проведения эксперимента (RCBD: Randomized Complete Block Design) на трехуровневых полках, расположенных в два ряда вдоль боковых сторон теплицы. Полки были оборудованы флуоресцентной системой освещения (Agrosun, 5850K), которая обеспечивала освещенность в среднем 800 мкмоль, измеренную на поверхности горшка. Каждый комплект образцов состоял из четырех неподвижно установленных 1 л горшков. Горшки наполняли искусственной питательной средой, состоящей из питательной среды на основе резуховидки Arabidopsis Growth Medium AIS (от фирмы Lehle Seeds) и крупного промытого песка в объемном соотношении 3:1. Во всех горшках по поверхности питательной среды распределяли по два грамма семян яровой пшеницы (Hank, WestBred). Горшки имели донную подачу воды с поддержанием ~2 см уровня воды и визуально контролировались на прорастание и рост.

[0162] В фазу цветения (по системе идентификации роста и развития зерновых культур Feekes 10.5.1) колос пшеницы инфицировали распылением суспензии конидиальных спор Fusarium graminearum. Для этого тепличного эксперимента споры грибов готовили путем посадки гомогенизированного мицелия штамма NRRL 5883 F. graminearum на большие ПДА планшеты и последующей пятидневной инкубации в условиях непрерывного освещения при комнатной температуре. После этого грибные споры собирали путем заливки планшетов магний-сульфатным буфером (10 мM MgSО₄; 0,01% Tween 20) и соскабливания поверхности агара стерильным шпателем. После регулирования концентрации спор, их в количестве приблизительно 50000 конидиальных спор на один колос наносили на растения с помощью ручного распылителя. Относительную влажность в теплице повышали до 90% и выдерживали в течение трех дней для инфицирования, а затем возвращали на нормальный уровень. После того как семена пшеницы завязались, подачу воды прекратили и колоскам дали возможность полностью высохнуть. Затем колосья пшеницы собирали каждый индивидуально. Тяжесть заболевания определяли для каждого колоса, имевшего симптомы фузариоза, путем подсчета числа пораженных колосков и деления его на общее число колосков, приходящееся на один колос. Полученные результаты (таблица 6) показали, что пшеница, обработанная любым из трех тестируемых микробных антагонистов, SGI-014-C06, SGI-015-F03, SGI-015-H06, имела значительно меньшую тяжесть и количество инфикаций Fusarium graminearum по сравнению с «необработанным» контролем, выращиваемым в таких же самых условиях (P<0,05).

Таблица 6 Эффективность микробных антагонистов в уменьшении заболеваемости пшеницы фузариозом
Обработка	Степень инфицирования, %	Защита от инфекции, %
Неинфицированный	2,1±2,9	Не определена
Инфицированный	37,2±9,8	0,00
Prosario®	4,6±2,8	93,00
Banner-MAXX®	12,5±5,8	70,00
Actinovate®	38,9±12,1	-5,00
Rhizo Vital®	28,0±5,4	26,00
SGI-014-C06	18,4±9,1	30,00
SGI-015-F03	25,4±6,9	54,00
SGI-015-H06	26,6±7,4	34,00

[0163] Для определения выхода семян, каждый колос пшеницы срезали вручную, семена собирали и очищали от шелухи и других детритов, посчитывали и взвешивали. Общий выход семян определяли как общую массу семян, полученных от растений в 16 горшках для каждого вида обработки. Как показано в таблице 7, все три тестированных микробных антагониста продемонстрировали существенное сохранение выхода семян, то есть потери семян, обусловленные фузариозной инфикацией, были значительно снижены.

Таблица 7 Эффективность микробных антагонистов в сохранении выхода семян пшеницы, пораженной фузариозом
Обработка	Общий выход семян, г	Защита выхода семян, %
Неинфицированный	14,36	Не определено
Необработанный	11,05	0,00
Prosario®	13,44	72,00
Banner-MAXX®	14,41	102,00
Actinovate®	11,99	28,00
RhizoVital®	12,65	48,00
SGI-014-C06	14,70	110,00
SGI-015-F03	15,03	120,00
SGI-015-H06	14,14	93,00

[0164] Таким образом, обработка пшеницы любым из рассмотренных микроорганизмов позволила заметно предохранить выход семян от потерь, вызываемых Fusarium инфицированием. В частности, пшеница, обработанная любым из штаммов SGI-014-C06 или SGI-015-F03, продемонстрировала существенное улучшение общего выхода семян, то есть 110% и 120%, соответственно, по сравнению с неинфицированным контролем. В противоположность этому, продажные фунгициды марок Actinovate®, RhizoVital® и Prosario® не продемонстрировали существенной защиты урожая обработанной ими пшеницы от потерь, вызываемых инфикацией Fusarium.

ПРИМЕР 10. Биоборьба с фузариозом пшеницы в полевых условиях

[0165] Антагонистические микроорганизмы, проявившие свою супрессорную активность против патогена F. graminearum и фузариоза в анализе на антагонизм in vitro и в тепличных исследованиях, описанных в Примерах 4-9, продолжают исследоваться далее, в серии полевых испытаний в различных географических ареалах на территории Соединенных Штатов. Некоторые эксперименты проводятся на сельскохозяйственных площадях, которые используются для микробиологической борьбы с фузариозом пшеницы, где происходит природное инфицирование этим заболеванием. В этих испытаниях используются сорта пшеницы, чувствительные к заражению грибом F. graminearum. В этих испытаниях, пшеницу, обработанную различными методами, высевают на небольших участках из 12 рядов, длиной около 3 метров. Промежуток между рядами равен приблизительно 20 см. Обработанные участки в каждом эксперименте вносятся в рандомизированную блочную схему. Оценивается также эффективность различных композиций из смачиваемых порошков, содержащих микробные антагонисты в соответствии с изобретением, в снижении тяжести и количества случаев инфицирования фузариозом. В этих экспериментах, микробные антагонисты оцениваются как индивидуально, так и в комбинациях.

[0166] В этих испытаниях антагонистические микроорганизмы оцениваются в различных покрытиях на семенах и/или в полевых условиях, где микробные суспензии наносят непосредственно на цветущие пшеничные колосья. В каждом из этих экспериментов микроорганизмы оцениваются на идентичных участках. В экспериментах могут использоваться антагонисты, патогены и методы аграрного производства, описанные в Примерах 4-9.

[0167] Нанесение покрытия на семена. Помимо способов нанесения покрытий на семена, описанных выше, в Примере 7, могут приспосабливаться самые различные известные технологии и препараты для обработки семян пшеницы микробными антагонистами, например, описанные в работах (Fernando et al, 2002; Bello et al., 2002; Kim et al, 1997). В общем случае, семена пшеницы вначале увлажняют и выдерживают при комнатной температуре для инициации прорастания. Перед высеванием проросшие семена можно погружать в микробные суспензии. Патогенные споры можно инокулировать либо до бактериальной инокуляции либо после нее. Способы приготовления антагонистов, патогенов и растений для такой обработки семян могут быть такими, как описано в Примерах 4 и 5.

[0168] Оценка тяжести заболевания и выхода семян.

Антагонисты поддаются дальнейшим оценкам в тепличных условиях на их супрессорную активность против фузариоза на пшенице и ячмене в фазе цветения с помощью самых различных способов и методик, включая описанные, например, в (Schisler, Plant Disease, Vol 86(12), 1350-1356, 2002; Schisler et al. Biological Control, 39:497-506,2006; and Khan and Doohan, Biological Control, 48:42-47,2009). В одном из таких экспериментов инокуляты штамма G. zeae готовят на стерильной, желтозерновой кукурузе, как описано в (Khan et al. Biological Control, 29:245-255, 2004). Полностью колонизированные липидные культуры (48-часовая культивация) микробных штаммов разбавляют до одной четвертой концентрации фосфатным буфером. Конечное число КОЕ на мл для антагонистической обработки составляет от 1×10⁹ КОЕ/мл до 6×10⁹ КОЕ/мл. После этого к колосьям цветущей пшеницы применяется обработка суспензиями с помощью CO₂ ручного распылителя. Обработку, как правило, производят после захода солнца для снижения до минимума возможную УФ деградацию антагонистических клеток. Готовят 5 репликатов (групп образцов-копий) на одну обработку, вносимых в рандомизированную блок-схему. Первым контролем обработки являются растения, обработанные буферным раствором. Вторым контролем обработки являются необработанные растения. Оценка тяжести инфицирования и заболеваемости фузариозом в полевых условиях производится путем подсчета 60 колосьев на репликат (то есть 300 колосьев/обработку), где развитие растения происходит от фазы средней молочной спелости и до фазы мягкой восковой спелости. Когда зерна достигают полной зрелости, колосья пшеницы собирают вручную и обмолачивают с помощью молотилки марки Almaco для единичных растений и колосьев (Almaco, IA). Образцы зерен, полученные из каждого ряда репликатов, оцениваются по весу 100 зерновок. Данные по тяжести заболевания, заболеваемости и весу 100 зерновок анализируют методом однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA).

[0169] Композиции, содержащие микробные антагонисты согласно изобретению, индивидуально или в комбинации, демонстрируют значительное снижение заболеваемости. Эти результаты являются свидетельством того, что биологический метод борьбы с помощью данных активных микробных агентов может играть важную роль в борьбе с паршой зерновых растений, таких как пшеница.

ПРИМЕР 11. Разработка культиваров неприродного происхождения и программ по их селекционированию

[0170] Эндофитные микроорганизмы в соответствии с изобретением вводятся в культурные растения, включая зерновые культуры, различных генотипов и географического происхождения. Однако подобные им эндофитные микроорганизмы, с которыми бы можно было создавать растение-эндофитных комбинации с улучшенными агрономическими характеристиками с помощью методик, аналогичных известным в данной отрасли методикам, включая, среди прочих, методики, описанные в (U.S. Pat Appl. No. 20030195117A1; U.S. Pat. Appl. No. 20010032343A1; и U.S. Pat. No. 7084331), отсутствуют. Таким образом, требуемые искусственные растение-эндофитные комбинации могут создаваться и селектироваться по программе селекции и разработке культиваров на базе их способности образовывать и поддерживать мутуалистическую комбинацию, дающую в итоге агрономический эффект. В такой селекционной программе может использоваться также рейтинг агрономических характеристик данной комбинации. В число этих характеристик могут входить, например, засухоустойчивость, аккумулирование биомассы, стойкость к инфицированию насекомыми, поедаемость скотом (например, травоядными), легкость репродукции, выход семян и др. Такие комбинации могут различаться по уровню аккумулирования микробных метаболитов, являющихся токсичными к сельскохозяйственным вредителям и сорнякам, включая уровни эргот-алкалоидов, уровни лолина, уровни перамина или уровни лолитрема, и демонстрировать при этом требуемые агрономические характеристики возделываемых растений, включая стойкость к инфицированию или поеданию насекомыми, стойкость к абиотическому стрессу, поедаемость скотом, аккумулирование биомассы, легкость размножения и выход семян и др.

[0171] Здесь дано описание множества вариантов осуществления изобретения. Тем не менее, вполне понятно, что элементы описанных здесь вариантов осуществления изобретения могут объединяться в комбинации, образовывая новые варианты осуществления изобретения и его различные модификации, которые не выходят за рамки идеи и объема настоящего изобретения. Следовательно, все другие варианты осуществления изобретения, альтернативы и эквиваленты охватываются объемом изобретения в соответствии с данным описанием изобретения и его формулой.

[0172] Заглавие в настоящей заявке дано исключительно для облегчения восприятия читателем и никоим образом не ограничивает объема изобретения или вариантов его осуществления.

[0173] Все публикации и патентные заявки, упомянутые в настоящем описании, включены здесь посредством ссылки в такой же мере, как если бы каждая публикация или патентная заявка индивидуально указывалась как включенная посредством ссылки.

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> SYNTHETIC GENOMICS, INC.

GRANDLIC, CHRISTOPHER J.

GREEN, WAYNE A.

KEROVUO, JANNE S.

MCCANN, RYAN T.

<120> КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ДЛЯ БОРЬБЫ С ФУЗАРИОЗОМ

<130> SGI1520-1WO

<150> US 61/511,467

<151> 2011-07-25

<160> 18

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1430

<212> ДНК

<213> Microbacterium sp.

<220>

<221> разнообразные признаки

<223> SGI бактериальный изолят SGI-014-C06

<220>

<221> разнообразные признаки

<223> кодирует 16S рибосомную РНК

<400> 1

acgctggcgg cgtgcttaac acatgcaagt cgaacggtga acacggagct tgctctgtgg60

gatcagtggc gaacgggtga gtaacacgtg agcaacctgc ccctgactct gggataagcg 120

ctggaaacgg cgtctaatac tggatatgtg acgtgaccgc atggtctgcg tctggaaaga 180

atttcggttg gggatgggct cgcggcctat cagcttgttg gtgaggtaat ggctcaccaa 240

ggcgtcgacg ggtagccggc ctgagagggt gaccggccac actgggactg agacacggcc 300

cagactccta cgggaggcag cagtggggaa tattgcacaa tgggcgcaag cctgatgcag 360

caacgccgcg tgagggacga cggccttcgg gttgtaaacc tcttttagca gggaagaagc 420

gaaagtgacg gtacctgcag aaaaagcgcc ggctaactac gtgccagcag ccgcggtaat 480

acgtagggcg caagcgttat ccggaattat tgggcgtaaa gagctcgtag gcggtttgtc 540

gcgtctgctg tgaaatccgg aggctcaacc tccggcctgc agtgggtacg ggcagactag 600

agtgcggtag gggagattgg aattcctggt gtagcggtgg aatgcgcaga tatcaggagg 660

aacaccgatg gcgaaggcag atctctgggc cgtaactgac gctgaggagc gaaagggtgg 720

ggagcaaaca ggcttagata ccctggtagt ccaccccgta aacgttggga actagttgtg 780

gggtccattc cacggattcc gtgacgcagc taacgcatta agttccccgc ctggggagta 840

cggccgcaag gctaaaactc aaaggaattg acggggaccc gcacaagcgg cggagcatgc 900

ggattaattc gatgcaacgc gaagaacctt accaaggctt gacatatacg agaacgggcc 960

agaaatggtc aactctttgg acactcgtaa acaggtggtg catggttgtc gtcagctcgt 1020

gtcgtgagat gttgggttaa gtcccgcaac gagcgcaacc ctcgttctat gttgccagca 1080

cgtaatggtg ggaactcatg ggatactgcc ggggtcaact cggaggaagg tggggatgac 1140

gtcaaatcat catgcccctt atgtcttggg cttcacgcat gctacaatgg ccggtacaaa 1200

gggctgcaat accgcgaggt ggagcgaatc ccaaaaagcc ggtcccagtt cggattgagg 1260

tctgcaactc gacctcatga agtcggagtc gctagtaatc gcagatcagc aacgctgcgg 1320

tgaatacgtt cccgggtctt gtacacaccg cccgtcaagt catgaaagtc ggtaacacct 1380

gaagccggtg gcctaaccct tgtggaggga gccgtcgaag gtgggatcgg 1430

<210> 2

<211> 2172

<212> ДНК

<213> Microbacterium sp.

<220>

<221> разнообразные признаки

<223> SGI бактериальный изолят SGI-014-C06

<220>

<221> разнообразные признаки

<223> SGI Ген ID SG1MICG850682

<220>

<221> разнообразные признаки

<223> кодирует пептидную последовательность SED ID NO 3

<400> 2

gtgtctgcgg ccggagagcg gctgtcgaga atagactcgg agattgtgaa tgccgagtat60

tccgcccatc atctccaggt gcttgagggg ctcgaagctg tccgcaagcg cccgggcatg 120

tacatcgggt cgaacggctc gccgggcctc atgcactgcc tttgggagat catcgacaac 180

tctgtcgacg aggcggtggc aggcaacggc acgaagatcg acatcatcct gcactccgac 240

ggcagcgtcg aggtgcacga ccgcggtcgc ggcatccctg tcgacgtcga gccgcgcacc 300

ggtctcaccg gtgtcgaggt cgtctacacc aagctgcacg ccggaggaaa gttcggcggc 360

ggctcgtacg cggcatccgg tggactgcac ggtgtcggcg cctccgtcgt gaacgcgctc 420

tccgagcgcc tcgacgtcga ggtcgaccgc gggggcaaga cctacgcgat gtcgttccat 480

cgcggtgagc ccggcatctt cacggactcc ggcgagaagc ggccggacgc cccgttcacg 540

ccgttcgagg agaacagcga gctgcgcgtc atcggcaagg cgccgcgtgg cgtgaccggc 600

acccgggtgc gctactgggc cgaccggcag atcttcacca aggatgcggc gttccagctc 660

tcggagctcg agacccgcgc acgccagacg gcgttcctcg ttcccggtct cgagatcgtc 720

gtcaaggacg cacgggcggc cggtcaggtc atccccgtcc cggactccga cggcgagacg 780

accgtcgtcg ggaccgatga gacctcgtac ctctacgagg gcggcatctc cgagttcgtc 840

gagtacctcg ccatcgaccc tcccgtgacc gacacctggc gtatccaggg cgagggcatg 900

ttcaaggaga ccgtgcccgt cctgcaggca gacggccaca tggtcgccac cgaggtggag 960

cgtgtgtgcg ccgtcgacat cgcgctgcgc tgggggaccg gctacgacac ccgtgtgcgc 1020

tccttcgtga acatcatcgc gacgcccaag ggcggaaccc accagcaggg cttcgagcag 1080

gagctcctga aggtgctgcg ctcccaggtc gagcagaacg cccgccgtct gaaggtcggc 1140

aacgacaagc tggagaagga cgacgtcctc gccggcctca ccgccgtgct cacggtcaac 1200

gtgccggagc cgcagttcga gggccagacc aaggaagtgc tcggcacccc cgcggtgcgg 1260

cagatcgtgg cgcaggtgat ccgtaaggat ctggcgcagc gcttcagctc gaccaagcgc 1320

gacgacaaga accaggccac acagctgctc gacaagatcg tctccgagat gaaggcccgt 1380

gtctcggcgc gcgcccacaa ggagacgcag cgccgcaaga acgcgctgga gtcgtcgacg 1440

ctgccgacca agctcgtcga ctgccgcacg aacgaggtcg agcgcagcga gctcttcatc 1500

gtggagggcg actcggctct cggcaccgcc aagaacgcgc gcaacagcga gttccaggcg 1560

ctgctcccga tccgagggaa gatcctcaac gtgcagaagg cctctgtcgg cgacatgctg 1620

tcgaacaccg agtgcgcgtc gatcatccag gtgatcggcg ccggatccgg acgcaccttc 1680

gacatcgatg cggcgcgcta cggcaaggtg atcctgatga gcgacgccga tgtcgacggc 1740

gcgcacatcc gtaccctgct gctcacgctg ttcttccgct acatgcgacc gctgatcgag 1800

cacgggcgtg tgttcgccgc ggtgccgccg ttgcaccggg tgatcgtgat gaacccgggg 1860

tccaagccga acgagacgat ctacacctac agcgagcagg agatgcacgc gctgctggcg 1920

aagctccgca aggccggcaa gcgctggcac gagccgatcc agcgctacaa gggtctcggt 1980

gagatggacg cggaacagct cgcgaacacc accatggacc gctccggccg tctgctgcgc 2040

cgtgtgcgca tggaagacgc cgaggccgcc ggtcgcgtgt tcgagctgct gatgggcaac 2100

gaggtcgcgc cgcgccgcga gttcatcatc gactcctccg accggttgtc gcgcgagtcc 2160

atcgacgcct ga 2172

<210> 3

<211> 723

<212> ПРОТЕИН

<213> Microbacterium sp.

<220>

<221> разнообразные признаки

<223> SGI бактериальный изолят SGI-014-C06

<220>

<221> разнообразные признаки

<223> SGI пептид ID SG1MICT850682

<220>

<221> разнообразные признаки

<223> субъединица гиразы B

<400> 3

Met Ser Ala Ala Gly Glu Arg Leu Ser Arg Ile Asp Ser Glu Ile Val

1 5 10 15

Asn Ala Glu Tyr Ser Ala His His Leu Gln Val Leu Glu Gly Leu Glu

20 25 30

Ala Val Arg Lys Arg Pro Gly Met Tyr Ile Gly Ser Asn Gly Ser Pro

35 40 45

Gly Leu Met His Cys Leu Trp Glu Ile Ile Asp Asn Ser Val Asp Glu

50 55 60

Ala Val Ala Gly Asn Gly Thr Lys Ile Asp Ile Ile Leu His Ser Asp

65 70 75 80

Gly Ser Val Glu Val His Asp Arg Gly Arg Gly Ile Pro Val Asp Val

85 90 95

Glu Pro Arg Thr Gly Leu Thr Gly Val Glu Val Val Tyr Thr Lys Leu

100 105 110

His Ala Gly Gly Lys Phe Gly Gly Gly Ser Tyr Ala Ala Ser Gly Gly

115 120 125

Leu His Gly Val Gly Ala Ser Val Val Asn Ala Leu Ser Glu Arg Leu

130 135 140

Asp Val Glu Val Asp Arg Gly Gly Lys Thr Tyr Ala Met Ser Phe His

145 150 155 160

Arg Gly Glu Pro Gly Ile Phe Thr Asp Ser Gly Glu Lys Arg Pro Asp

165 170 175

Ala Pro Phe Thr Pro Phe Glu Glu Asn Ser Glu Leu Arg Val Ile Gly

180 185 190

Lys Ala Pro Arg Gly Val Thr Gly Thr Arg Val Arg Tyr Trp Ala Asp

195 200 205

Arg Gln Ile Phe Thr Lys Asp Ala Ala Phe Gln Leu Ser Glu Leu Glu

210 215 220

Thr Arg Ala Arg Gln Thr Ala Phe Leu Val Pro Gly Leu Glu Ile Val

225 230 235 240

Val Lys Asp Ala Arg Ala Ala Gly Gln Val Ile Pro Val Pro Asp Ser

245 250 255

Asp Gly Glu Thr Thr Val Val Gly Thr Asp Glu Thr Ser Tyr Leu Tyr

260 265 270

Glu Gly Gly Ile Ser Glu Phe Val Glu Tyr Leu Ala Ile Asp Pro Pro

275 280 285

Val Thr Asp Thr Trp Arg Ile Gln Gly Glu Gly Met Phe Lys Glu Thr

290 295 300

Val Pro Val Leu Gln Ala Asp Gly His Met Val Ala Thr Glu Val Glu

305 310 315 320

Arg Val Cys Ala Val Asp Ile Ala Leu Arg Trp Gly Thr Gly Tyr Asp

325 330 335

Thr Arg Val Arg Ser Phe Val Asn Ile Ile Ala Thr Pro Lys Gly Gly

340 345 350

Thr His Gln Gln Gly Phe Glu Gln Glu Leu Leu Lys Val Leu Arg Ser

355 360 365

Gln Val Glu Gln Asn Ala Arg Arg Leu Lys Val Gly Asn Asp Lys Leu

370 375 380

Glu Lys Asp Asp Val Leu Ala Gly Leu Thr Ala Val Leu Thr Val Asn

385 390 395 400

Val Pro Glu Pro Gln Phe Glu Gly Gln Thr Lys Glu Val Leu Gly Thr

405 410 415

Pro Ala Val Arg Gln Ile Val Ala Gln Val Ile Arg Lys Asp Leu Ala

420 425 430

Gln Arg Phe Ser Ser Thr Lys Arg Asp Asp Lys Asn Gln Ala Thr Gln

435 440 445

Leu Leu Asp Lys Ile Val Ser Glu Met Lys Ala Arg Val Ser Ala Arg

450 455 460

Ala His Lys Glu Thr Gln Arg Arg Lys Asn Ala Leu Glu Ser Ser Thr

465 470 475 480

Leu Pro Thr Lys Leu Val Asp Cys Arg Thr Asn Glu Val Glu Arg Ser

485 490 495

Glu Leu Phe Ile Val Glu Gly Asp Ser Ala Leu Gly Thr Ala Lys Asn

500 505 510

Ala Arg Asn Ser Glu Phe Gln Ala Leu Leu Pro Ile Arg Gly Lys Ile

515 520 525

Leu Asn Val Gln Lys Ala Ser Val Gly Asp Met Leu Ser Asn Thr Glu

530 535 540

Cys Ala Ser Ile Ile Gln Val Ile Gly Ala Gly Ser Gly Arg Thr Phe

545 550 555 560

Asp Ile Asp Ala Ala Arg Tyr Gly Lys Val Ile Leu Met Ser Asp Ala

565 570 575

Asp Val Asp Gly Ala His Ile Arg Thr Leu Leu Leu Thr Leu Phe Phe

580 585 590

Arg Tyr Met Arg Pro Leu Ile Glu His Gly Arg Val Phe Ala Ala Val

595 600 605

Pro Pro Leu His Arg Val Ile Val Met Asn Pro Gly Ser Lys Pro Asn

610 615 620

Glu Thr Ile Tyr Thr Tyr Ser Glu Gln Glu Met His Ala Leu Leu Ala

625 630 635 640

Lys Leu Arg Lys Ala Gly Lys Arg Trp His Glu Pro Ile Gln Arg Tyr

645 650 655

Lys Gly Leu Gly Glu Met Asp Ala Glu Gln Leu Ala Asn Thr Thr Met

660 665 670

Asp Arg Ser Gly Arg Leu Leu Arg Arg Val Arg Met Glu Asp Ala Glu

675 680 685

Ala Ala Gly Arg Val Phe Glu Leu Leu Met Gly Asn Glu Val Ala Pro

690 695 700

Arg Arg Glu Phe Ile Ile Asp Ser Ser Asp Arg Leu Ser Arg Glu Ser

705 710 715 720

Ile Asp Ala

<210> 4

<211> 3504

<212> ДНК

<213> Microbacterium sp.

<220>

<221> разнообразные признаки

<223> SGI бактериальный изолят SGI-014-C06

<220>

<221> разнообразные признаки

<223> SGI Ген ID SG1MICG850290

<220>

<221> разнообразные признаки

<223> кодирует пептидную последовательность SEQ ID NO 5

<400> 4

ttggctgctg ctcgcaacgc atccacatcc accaccacca agaacggacg cggagcttcc60

cgtctttcgt tcgccaagat ctccgacacg ctgacggtcc ctgaccttct cgccctgcag 120

accgaatcct tcggttggct ggtcggcaac gacgcctgga aggcgcgcgt ggccgaggcc 180

aagaagcagg ggcgcaccga cgtcaacgag aacagcggtc tgggcgagat cttcgaggag 240

atctctccga tcgaggacct cggcgagacg atgcagctgt cgttcacgaa cccctacctc 300

gagccggaga agtactccat cgaggagtgc aaggagcgtg gcaagaccta cgccgctccg 360

ctgtacgtcg aggccgagtt catgaaccac ctcacgggtg agatcaagac ccagacggtc 420

ttcatgggcg acttcccgct gcagaccgac aagggaacgt tcatcatcaa cggctccgag 480

cgcgtcgtcg tctcgcagct ggtgcgttcg cccggtgtct acttcgacaa gacccccgac 540

aagacgtccg acaaggacat cgtctcggca cgcgtcatcc cgagccgtgg tgcctggctc 600

gagttcgaga tcgacaagcg cgaccaggtc ggcgtgcgcg tcgaccgcaa gcgcaagcag 660

tcggtcacgg tcttcctcaa ggcgctgggc atgaccagcg aggagatcct cgccgagttc 720

gccggctaca cctcgatcga ggagacgctc gcgaaggaca cgatcgtcac gaaggaagat 780

gcgctccgcg acatctaccg caagctccgt ccgggcgagc aggtcgccgc cgaggccgcc 840

cgcgcgctcc tggacaactt ctacttcaac ccgaagcgct acgacctggc caaggtcggt 900

cgctacaaga tcaaccacaa gctgggcctg gaccagccgc tgaactcgtc ggtcctgacc 960

gtcgaagaca tcgtggccac gatcaagtac ctggtgcgtc tgcacgccgg caccgaggag 1020

accttcacgg gcatccgcgg tggtaagaag gccgagatcc gtctcgcgac cgacgacatc 1080

gacaacttcg gcaaccgtcg catccgcgcg gtcggcgagc tgatccagaa ccaggtccgc 1140

accggtctct cccgcatgga gcgcgtcgtc cgcgagcgca tgaccacgca ggacatcgag 1200

gcgatcacgc cgcagaccct gatcaacgtg cgccccgtcg tcgccgcgat caaggagttc 1260

ttcggaacgt cgcagctgtc gcagttcatg gaccagaaca acccgctcgc gggtctgacg 1320

aacaagcgtc gtctgtctgc gctcggcccc ggtggtctct cgcgagaccg cgccggcgtc 1380

gaggtccgtg acgtccaccc ctcgcactac ggccgcatgt gcccgatcga gactccggaa 1440

ggcccgaaca tcggtctgat cggtgctctc gcgaccttcg cgcgcatcaa ctcgttcgga 1500

ttcatcgaga ccccgtaccg caaggtcgtc gacggtgtcg tgaccgacca gatcgactac 1560

ctgacggctt ccgaagaggt cgacttcaac atcgcgcagg ccaacgcccc gctcgatgcc 1620

aagggtcgct tccgcgagag ccacgtcctg gcccgcccca agggtggcag cggcgaggtc 1680

gacctgttcg tccccgagga gatcggctac atcgacgtct ccccgcgcca gatggtgtcg 1740

gtcgcgacct cgctcgtgcc cttcctcgag cacgacgacg cacagcgcgc cctcatgggt 1800

gccaacatgc agcgtcaggc tgtgccgctg ctgcgcagcg actcgccgct cgtcggaacc 1860

ggtatggagg gctacacggc catcgacgcc ggtgacgtgc tcaccgccga gaaggccggt 1920

gtcgtctccg aggtctccgc agaccgcgtc gtcgtcatgc tcgacgaggg cggaacgcag 1980

gagtaccacc tgcgcaagtt cgaccgctcc aaccagggca cgtcgtacaa ccagaaggtc 2040

gtcgtcaccg ccggtgagcg cgtcgaggtc ggagaggtca tcgccgatgg ccccgccacc 2100

gagaacggcg agctggccct cggaaagaac ctcctcgtcg cgttcatgac gtgggagggc 2160

tacaacttcg aggacgcgat catcctgagc caggacctgg tgaaggacga caccctctcc 2220

tcgatccaca tcgaggagta cgaggtcgat gctcgcgaca ccaagctcgg caaggaggag 2280

atcacgcgtg acctccccaa cgtcagcccg gagctgctga aggacctcga cgagcgcggc 2340

atcatccgca tcggtgccga ggtccgccct ggcgacatcc tcgtcggcaa ggtcacgccg 2400

aagggtgaga ccgagctgtc ggccgaggag cgcctgctcc gcgcgatctt caacgagaag 2460

agccgcgaag tccgtgacac ctcgctgaag gtgccccacg gtgagcaggg cacgatcatc 2520

gccgtcaagg agttcaacgc tgaggacggc gacgacgagc tcggctccgg cgtcaaccgc 2580

cgcgtcgtgg tctacatcgc ccagaagcgc aagatcaccg agggtgacaa gctcgccggc 2640

cgtcacggca acaagggtgt catcgcgaag atcctcccga tcgaggacat gccgttcctt 2700

tcggacggta ccccggtcga catcgtgctg aacccgctcg gtatccccgg tcgaatgaac 2760

ttcggtcagg tcctggagac ccacctcggg tggatcgcga agcagggctg gaaggtcgag 2820

ggcaacccgg agtgggctgt gaagctcccg aaggacgcat tcgaggccgc ccccggcacg 2880

aaggtcgcca ccccggtgtt cgacggtgcg agcgaggagg agatcgctgg tctcctcgac 2940

gcgaccaccc cgacccgtga cggcgtccgc ctgatcgact cgagcggcaa gacgcagctg 3000

ttcgacggtc gttcgggtga gccgttcccg gcgccgatct ccgtgggcta catgtacatc 3060

ctgaagctgc accacctggt cgacgacaag atccacgcac gttccacggg tccgtactcg 3120

atgatcaccc agcagccgct cggtggtaag gcgcagttcg gtggacagcg cttcggtgag 3180

atggaggtgt gggccctcga ggcctacggc gccgcatacg cgctccagga gctcctcacg 3240

atcaagtccg acgacatcct cggccgcgtc aaggtgtacg aggcgatcgt caagggcgag 3300

aacatccagg agcccggcat ccccgagtcg ttcaaggtgc tcatgaagga gatgcagtcg 3360

ctctgcctga acgtcgaggt cctctcggcc gacggcacgc tggtcaacct ccgcgacacc 3420

gacgacgagg cgttccgcgc cgcggaagag ctcggtatca acatctccag ccgcttcgag 3480

gccgcctcga tcgacgagat ctaa 3504

<210> 5

<211> 1167

<212> ПРОТЕИН

<213> Microbacterium sp.

<220>

<221> разнообразные признаки

<223> SGI бактериальный изолят SGI-014-C06

<220>

<221> разнообразные признаки

<223> SGI пептид ID SG1MICT850290

<220>

<221> разнообразные признаки

<223> Субъединица В РНК-полимеразы

<400> 5

Met Ala Ala Ala Arg Asn Ala Ser Thr Ser Thr Thr Thr Lys Asn Gly

1 5 10 15

Arg Gly Ala Ser Arg Leu Ser Phe Ala Lys Ile Ser Asp Thr Leu Thr

20 25 30

Val Pro Asp Leu Leu Ala Leu Gln Thr Glu Ser Phe Gly Trp Leu Val

35 40 45

Gly Asn Asp Ala Trp Lys Ala Arg Val Ala Glu Ala Lys Lys Gln Gly

50 55 60

Arg Thr Asp Val Asn Glu Asn Ser Gly Leu Gly Glu Ile Phe Glu Glu

65 70 75 80

Ile Ser Pro Ile Glu Asp Leu Gly Glu Thr Met Gln Leu Ser Phe Thr

85 90 95

Asn Pro Tyr Leu Glu Pro Glu Lys Tyr Ser Ile Glu Glu Cys Lys Glu

100 105 110

Arg Gly Lys Thr Tyr Ala Ala Pro Leu Tyr Val Glu Ala Glu Phe Met

115 120 125

Asn His Leu Thr Gly Glu Ile Lys Thr Gln Thr Val Phe Met Gly Asp

130 135 140

Phe Pro Leu Gln Thr Asp Lys Gly Thr Phe Ile Ile Asn Gly Ser Glu

145 150 155 160

Arg Val Val Val Ser Gln Leu Val Arg Ser Pro Gly Val Tyr Phe Asp

165 170 175

Lys Thr Pro Asp Lys Thr Ser Asp Lys Asp Ile Val Ser Ala Arg Val

180 185 190

Ile Pro Ser Arg Gly Ala Trp Leu Glu Phe Glu Ile Asp Lys Arg Asp

195 200 205

Gln Val Gly Val Arg Val Asp Arg Lys Arg Lys Gln Ser Val Thr Val

210 215 220

Phe Leu Lys Ala Leu Gly Met Thr Ser Glu Glu Ile Leu Ala Glu Phe

225 230 235 240

Ala Gly Tyr Thr Ser Ile Glu Glu Thr Leu Ala Lys Asp Thr Ile Val

245 250 255

Thr Lys Glu Asp Ala Leu Arg Asp Ile Tyr Arg Lys Leu Arg Pro Gly

260 265 270

Glu Gln Val Ala Ala Glu Ala Ala Arg Ala Leu Leu Asp Asn Phe Tyr

275 280 285

Phe Asn Pro Lys Arg Tyr Asp Leu Ala Lys Val Gly Arg Tyr Lys Ile

290 295 300

Asn His Lys Leu Gly Leu Asp Gln Pro Leu Asn Ser Ser Val Leu Thr

305 310 315 320

Val Glu Asp Ile Val Ala Thr Ile Lys Tyr Leu Val Arg Leu His Ala

325 330 335

Gly Thr Glu Glu Thr Phe Thr Gly Ile Arg Gly Gly Lys Lys Ala Glu

340 345 350

Ile Arg Leu Ala Thr Asp Asp Ile Asp Asn Phe Gly Asn Arg Arg Ile

355 360 365

Arg Ala Val Gly Glu Leu Ile Gln Asn Gln Val Arg Thr Gly Leu Ser

370 375 380

Arg Met Glu Arg Val Val Arg Glu Arg Met Thr Thr Gln Asp Ile Glu

385 390 395 400

Ala Ile Thr Pro Gln Thr Leu Ile Asn Val Arg Pro Val Val Ala Ala

405 410 415

Ile Lys Glu Phe Phe Gly Thr Ser Gln Leu Ser Gln Phe Met Asp Gln

420 425 430

Asn Asn Pro Leu Ala Gly Leu Thr Asn Lys Arg Arg Leu Ser Ala Leu

435 440 445

Gly Pro Gly Gly Leu Ser Arg Asp Arg Ala Gly Val Glu Val Arg Asp

450 455 460

Val His Pro Ser His Tyr Gly Arg Met Cys Pro Ile Glu Thr Pro Glu

465 470 475 480

Gly Pro Asn Ile Gly Leu Ile Gly Ala Leu Ala Thr Phe Ala Arg Ile

485 490 495

Asn Ser Phe Gly Phe Ile Glu Thr Pro Tyr Arg Lys Val Val Asp Gly

500 505 510

Val Val Thr Asp Gln Ile Asp Tyr Leu Thr Ala Ser Glu Glu Val Asp

515 520 525

Phe Asn Ile Ala Gln Ala Asn Ala Pro Leu Asp Ala Lys Gly Arg Phe

530 535 540

Arg Glu Ser His Val Leu Ala Arg Pro Lys Gly Gly Ser Gly Glu Val

545 550 555 560

Asp Leu Phe Val Pro Glu Glu Ile Gly Tyr Ile Asp Val Ser Pro Arg

565 570 575

Gln Met Val Ser Val Ala Thr Ser Leu Val Pro Phe Leu Glu His Asp

580 585 590

Asp Ala Gln Arg Ala Leu Met Gly Ala Asn Met Gln Arg Gln Ala Val

595 600 605

Pro Leu Leu Arg Ser Asp Ser Pro Leu Val Gly Thr Gly Met Glu Gly

610 615 620

Tyr Thr Ala Ile Asp Ala Gly Asp Val Leu Thr Ala Glu Lys Ala Gly

625 630 635 640

Val Val Ser Glu Val Ser Ala Asp Arg Val Val Val Met Leu Asp Glu

645 650 655

Gly Gly Thr Gln Glu Tyr His Leu Arg Lys Phe Asp Arg Ser Asn Gln

660 665 670

Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Val Val Val Thr Ala Gly Glu Arg Val

675 680 685

Glu Val Gly Glu Val Ile Ala Asp Gly Pro Ala Thr Glu Asn Gly Glu

690 695 700

Leu Ala Leu Gly Lys Asn Leu Leu Val Ala Phe Met Thr Trp Glu Gly

705 710 715 720

Tyr Asn Phe Glu Asp Ala Ile Ile Leu Ser Gln Asp Leu Val Lys Asp

725 730 735

Asp Thr Leu Ser Ser Ile His Ile Glu Glu Tyr Glu Val Asp Ala Arg

740 745 750

Asp Thr Lys Leu Gly Lys Glu Glu Ile Thr Arg Asp Leu Pro Asn Val

755 760 765

Ser Pro Glu Leu Leu Lys Asp Leu Asp Glu Arg Gly Ile Ile Arg Ile

770 775 780

Gly Ala Glu Val Arg Pro Gly Asp Ile Leu Val Gly Lys Val Thr Pro

785 790 795 800

Lys Gly Glu Thr Glu Leu Ser Ala Glu Glu Arg Leu Leu Arg Ala Ile

805 810 815

Phe Asn Glu Lys Ser Arg Glu Val Arg Asp Thr Ser Leu Lys Val Pro

820 825 830

His Gly Glu Gln Gly Thr Ile Ile Ala Val Lys Glu Phe Asn Ala Glu

835 840 845

Asp Gly Asp Asp Glu Leu Gly Ser Gly Val Asn Arg Arg Val Val Val

850 855 860

Tyr Ile Ala Gln Lys Arg Lys Ile Thr Glu Gly Asp Lys Leu Ala Gly

865 870 875 880

Arg His Gly Asn Lys Gly Val Ile Ala Lys Ile Leu Pro Ile Glu Asp

885 890 895

Met Pro Phe Leu Ser Asp Gly Thr Pro Val Asp Ile Val Leu Asn Pro

900 905 910

Leu Gly Ile Pro Gly Arg Met Asn Phe Gly Gln Val Leu Glu Thr His

915 920 925

Leu Gly Trp Ile Ala Lys Gln Gly Trp Lys Val Glu Gly Asn Pro Glu

930 935 940

Trp Ala Val Lys Leu Pro Lys Asp Ala Phe Glu Ala Ala Pro Gly Thr

945 950 955 960

Lys Val Ala Thr Pro Val Phe Asp Gly Ala Ser Glu Glu Glu Ile Ala

965 970 975

Gly Leu Leu Asp Ala Thr Thr Pro Thr Arg Asp Gly Val Arg Leu Ile

980 985 990

Asp Ser Ser Gly Lys Thr Gln Leu Phe Asp Gly Arg Ser Gly Glu Pro

995 1000 1005

Phe Pro Ala Pro Ile Ser Val Gly Tyr Met Tyr Ile Leu Lys Leu

1010 1015 1020

His His Leu Val Asp Asp Lys Ile His Ala Arg Ser Thr Gly Pro

1025 1030 1035

Tyr Ser Met Ile Thr Gln Gln Pro Leu Gly Gly Lys Ala Gln Phe

1040 1045 1050

Gly Gly Gln Arg Phe Gly Glu Met Glu Val Trp Ala Leu Glu Ala

1055 1060 1065

Tyr Gly Ala Ala Tyr Ala Leu Gln Glu Leu Leu Thr Ile Lys Ser

1070 1075 1080

Asp Asp Ile Leu Gly Arg Val Lys Val Tyr Glu Ala Ile Val Lys

1085 1090 1095

Gly Glu Asn Ile Gln Glu Pro Gly Ile Pro Glu Ser Phe Lys Val

1100 1105 1110

Leu Met Lys Glu Met Gln Ser Leu Cys Leu Asn Val Glu Val Leu

1115 1120 1125

Ser Ala Asp Gly Thr Leu Val Asn Leu Arg Asp Thr Asp Asp Glu

1130 1135 1140

Ala Phe Arg Ala Ala Glu Glu Leu Gly Ile Asn Ile Ser Ser Arg

1145 1150 1155

Phe Glu Ala Ala Ser Ile Asp Glu Ile

1160 1165

<210> 6

<211> 1188

<212> ДНК

<213> Microbacterium sp.

<220>

<221> разнообразные признаки

<223> SGI бактериальный изолят SGI-014-C06

<220>

<221> разнообразные признаки

<223> SGI Ген ID SG1MICG851004

<220>

<221> разнообразные признаки

<223> кодирует пептидную последовательность SEQ ID NO 7

<400> 6

ttgccgactc gatgtcggtg gcctctccta cggtggaaaa caagccgaag agccattacg60

ccttgtcgga gagttgctcc caaccgggag cgccgcgaca gcctacaggc ggcaccacgc 120

gcgcagaagg agcacatcat gccatcaccc gccgaccgcg agaagtccct cgagaccgcc 180

ctcgcccaga tcgaccgcca gttcggaaag ggctcggtca tgcggctggg cagcgatgag 240

cgcgcccccg tggccgtcat ccccaccggc tccatcgccc tcgacgtcgc cctcggcgtc 300

ggaggactcc cgcgtggtcg catcgtcgag atctacggac cggagtcctc cggtaagacg 360

acgctcaccc tgcacgcgat cgcgaacgca cagcgtgccg gtggcatcgc ggcgttcatc 420

gacgccgagc acgcgctcga ccccgactac gccgccaagc tcggcgtcga catcgatgcg 480

ctcctggtct cgcagcccga cacgggtgag caggcgctcg agatcgccga catgctcgtg 540

cgctccggtg cgatcgacct catcgtcatc gactccgtcg cggccctcgt gccgcgcgcc 600

gagatcgagg gcgagatggg tgactcgcac gtcggtctgc aggctcgcct catgtcgcag 660

gcgctgcgaa agctcaccgg tggtctgaac cagacgaaca ccacgatgat cttcatcaac 720

cagctccgcg agaagatcgg tgtcttcttc ggttcgccgg agaccactgc cggcggtaag 780

gcgctcaagt tctacgcctc ggtccgcatg gacatccgtc gtatcgagac gctcaaggac 840

ggtactgacg ctgtcggtaa ccgcaccagg gtcaaggtcg tcaagaacaa gatggctccg 900

cctttcaagc aggccgagtt cgacatcctc tacggcgtcg gcatctcgcg cgagggaagc 960

ctgatcgact tcggtgtcga gcatgcgatc gtcaagaagt ccggttcctg gtatacgtac 1020

gacggtgacc agctgggtca gggcaaggag aacgcgcgga cgttcctgct caacaacccc 1080

gacatcgcgc tggcgatcga gacgcagatc aagcagaagc tcggcatcgg cggtcccgcc 1140

gcggcgcctg ctgcggcaga cgagctcgct gagcgtcgtc cggcctga 1188

<210> 7

<211> 395

<212> ПРОТЕИН

<213> Microbacterium sp.

<220>

<221> разнообразные признаки

<223> SGI бактериальный изолят SGI-014-C06

<220>

<221> разнообразные признаки

<223> SGI пептид ID SG1MICT851004

<220>

<221> разнообразные признаки

<223> рекомбиназа A

<400> 7

Met Pro Thr Arg Cys Arg Trp Pro Leu Leu Arg Trp Lys Thr Ser Arg

1 5 10 15

Arg Ala Ile Thr Pro Cys Arg Arg Val Ala Pro Asn Arg Glu Arg Arg

20 25 30

Asp Ser Leu Gln Ala Ala Pro Arg Ala Gln Lys Glu His Ile Met Pro

35 40 45

Ser Pro Ala Asp Arg Glu Lys Ser Leu Glu Thr Ala Leu Ala Gln Ile

50 55 60

Asp Arg Gln Phe Gly Lys Gly Ser Val Met Arg Leu Gly Ser Asp Glu

65 70 75 80

Arg Ala Pro Val Ala Val Ile Pro Thr Gly Ser Ile Ala Leu Asp Val

85 90 95

Ala Leu Gly Val Gly Gly Leu Pro Arg Gly Arg Ile Val Glu Ile Tyr

100 105 110

Gly Pro Glu Ser Ser Gly Lys Thr Thr Leu Thr Leu His Ala Ile Ala

115 120 125

Asn Ala Gln Arg Ala Gly Gly Ile Ala Ala Phe Ile Asp Ala Glu His

130 135 140

Ala Leu Asp Pro Asp Tyr Ala Ala Lys Leu Gly Val Asp Ile Asp Ala

145 150 155 160

Leu Leu Val Ser Gln Pro Asp Thr Gly Glu Gln Ala Leu Glu Ile Ala

165 170 175

Asp Met Leu Val Arg Ser Gly Ala Ile Asp Leu Ile Val Ile Asp Ser

180 185 190

Val Ala Ala Leu Val Pro Arg Ala Glu Ile Glu Gly Glu Met Gly Asp

195 200 205

Ser His Val Gly Leu Gln Ala Arg Leu Met Ser Gln Ala Leu Arg Lys

210 215 220

Leu Thr Gly Gly Leu Asn Gln Thr Asn Thr Thr Met Ile Phe Ile Asn

225 230 235 240

Gln Leu Arg Glu Lys Ile Gly Val Phe Phe Gly Ser Pro Glu Thr Thr

245 250 255

Ala Gly Gly Lys Ala Leu Lys Phe Tyr Ala Ser Val Arg Met Asp Ile

260 265 270

Arg Arg Ile Glu Thr Leu Lys Asp Gly Thr Asp Ala Val Gly Asn Arg

275 280 285

Thr Arg Val Lys Val Val Lys Asn Lys Met Ala Pro Pro Phe Lys Gln

290 295 300

Ala Glu Phe Asp Ile Leu Tyr Gly Val Gly Ile Ser Arg Glu Gly Ser

305 310 315 320

Leu Ile Asp Phe Gly Val Glu His Ala Ile Val Lys Lys Ser Gly Ser

325 330 335

Trp Tyr Thr Tyr Asp Gly Asp Gln Leu Gly Gln Gly Lys Glu Asn Ala

340 345 350

Arg Thr Phe Leu Leu Asn Asn Pro Asp Ile Ala Leu Ala Ile Glu Thr

355 360 365

Gln Ile Lys Gln Lys Leu Gly Ile Gly Gly Pro Ala Ala Ala Pro Ala

370 375 380

Ala Ala Asp Glu Leu Ala Glu Arg Arg Pro Ala

385 390 395

<210> 8

<211> 2175

<212> ДНК

<213> Microbacterium sp.

<220>

<221> разнообразные признаки

<223> SGI бактериальный изолят SGI-014-C06

<220>

<221> разнообразные признаки

<223> SGI Ген ID SG1MICG849768

<220>

<221> разнообразные признаки

<223> кодирует пептидную последовательность SEQ ID NO 9

<400> 8

atgtacccca tgatcgatcc cgcactcgcc gacgccggcc tcggtgacgc cgaagacgac60

gacttcgacg ccatcgagtc tcccgactcc cagctcccgg accaccgcta cctggatcgc 120

gagctgagct ggctcgcctt caaccagcgc gtaatggagc tcgccgagga tccgtcactg 180

cccgaactcg agcgggcgaa cttcctggcg atcttcgcca gcaacctcga cgagttcttc 240

atggtgcgcg tcgccggcct caagcgccgc atcatgaccg gcctggccgt gccgacgaac 300

atcggccgct cccccgtcga cgcgctcgcc gacatctccc gcgaagcgca cgccctgcag 360

ctgcgtcacg ccgaggcctg gacctcgctc gtgcgccccg ccctggccga ctccggcatc 420

gagatcacgg actggtccga gctgaccgac gacgagcgct ccggattgtc cgagtacttc 480

cagctccagg tcttcccggt gctgatgccg ctcgcggtcg acccggcgca tccgttcccc 540

tacatctccg gcctgtcgct gaacctcgcg atccgcatcc gcaatgcccg caccgggcgc 600

caggagttcg cgcgcctcaa ggtgccgccc atgctccccc gcttcgtgga ggtgccgggc 660

ggcggcgaga tcaagcgctt cctgcgcctg gaggaactga tcgcgaacca cctcggcgac 720

ctgttccccg gcatggaggt gctcgaccac cacgcgttcc gcctcacccg caacgaagac 780

gtggagatcg aggaagacga gagcgagaac ctcatccagg cgctcgaggc cgagctgctg 840

cgccgtcgat tcggcccgcc gatccgcctc gagatcacgg acgacatgga cgaggtcacg 900

atggacctgc tcgtccgcga gctcgacatc accgacctgg aggtctaccg cctccccggt 960

ccgctcgacc tgcgcggact gttcgatctg tcccgcatcg accgtcccga cctgcgctac 1020

ccgccgcacc tgcccaccac ggccgtggcc ttccagcccg caggatcgag caaccgcgcc 1080

gacatcttca aagcgatccg caagtcggat gtgctcgtgc accacccgta cgagtcgttc 1140

acgaccagcg tgcaggcgtt cctcgaacag gccgcccgcg acccgcacgt gctcgccatc 1200

aagcagaccc tgtaccgcac ctcgggcgac agcccggtcg tgcaggcgct gatcgacgcg 1260

gccgaagccg gcaagcaggt gctggccctc gtcgaggtga aggcccgttt cgacgaggcc 1320

aacaacatcg tctgggcacg caagctcgag aaggccggcg tgcacgtggt ctacggtctc 1380

gtcggactca agacccactg caagctcgcc ctcgtcatcc gcgaggaaga ggggatgctg 1440

cgccactact cgcacgtcgg caccggcaac tacaacccca agaccagccg catctacgag 1500

gacttcggtc tgttcaccgc agacgcgcag gtcggcaaag acctgacacg cctgttcaac 1560

gagctcagcg gctacgcgat cgagaagaag ttcaagcgcc tgctggtcgc cccgctgcac 1620

ctgcgcaagg gcctcatccg ccagatcgac gccgagcgca ggaacgccga ggcggggatc 1680

cccgcgcaca tccgcatcaa ggtgaactcg atggtcgatg aggagatcat cgacgcgctc 1740

taccgcgcga gcgcggccgg ggtgaaggtc gacgtgtggg tgcgcggcat ctgcagcctg 1800

cgcaccgacc tcgacggcat cagtgacaac atcacggtgc gcagcatcct cggccgctac 1860

ctcgagcact cccgcatctt cgcgttcgag aacgccggcg acccgcaggt gtacatcggc 1920

agcgccgaca tgatgcaccg caacctcgac cgtcgtgtgg aggcgctggt gcgcgtcacc 1980

gacgccgacc acctcaagga actgcaggcg ttcttcgacc tcgcgatgga cgacggaacc 2040

tcgtcgtggc atctcggcgc cggcggcgtc tgggagcgcc acgccgtgaa cgccgacggc 2100

aagccgctga tcgacctgca ggataagacc atggggttga tccagcggcg ccgccgcgcg 2160

cgggcggttc gatga 2175

<210> 9

<211> 724

<212> ПРОТЕИН

<213> Microbacterium sp.

<220>

<221> разнообразные признаки

<223> SGI бактериальный изолят SGI-014-C06

<220>

<221> разнообразные признаки

<223> SGI пептид ID SG1MICT849768

<220>

<221> разнообразные признаки

<223> полифосфат киназа

<400> 9

Met Tyr Pro Met Ile Asp Pro Ala Leu Ala Asp Ala Gly Leu Gly Asp

1 5 10 15

Ala Glu Asp Asp Asp Phe Asp Ala Ile Glu Ser Pro Asp Ser Gln Leu

20 25 30

Pro Asp His Arg Tyr Leu Asp Arg Glu Leu Ser Trp Leu Ala Phe Asn

35 40 45

Gln Arg Val Met Glu Leu Ala Glu Asp Pro Ser Leu Pro Glu Leu Glu

50 55 60

Arg Ala Asn Phe Leu Ala Ile Phe Ala Ser Asn Leu Asp Glu Phe Phe

65 70 75 80

Met Val Arg Val Ala Gly Leu Lys Arg Arg Ile Met Thr Gly Leu Ala

85 90 95

Val Pro Thr Asn Ile Gly Arg Ser Pro Val Asp Ala Leu Ala Asp Ile

100 105 110

Ser Arg Glu Ala His Ala Leu Gln Leu Arg His Ala Glu Ala Trp Thr

115 120 125

Ser Leu Val Arg Pro Ala Leu Ala Asp Ser Gly Ile Glu Ile Thr Asp

130 135 140

Trp Ser Glu Leu Thr Asp Asp Glu Arg Ser Gly Leu Ser Glu Tyr Phe

145 150 155 160

Gln Leu Gln Val Phe Pro Val Leu Met Pro Leu Ala Val Asp Pro Ala

165 170 175

His Pro Phe Pro Tyr Ile Ser Gly Leu Ser Leu Asn Leu Ala Ile Arg

180 185 190

Ile Arg Asn Ala Arg Thr Gly Arg Gln Glu Phe Ala Arg Leu Lys Val

195 200 205

Pro Pro Met Leu Pro Arg Phe Val Glu Val Pro Gly Gly Gly Glu Ile

210 215 220

Lys Arg Phe Leu Arg Leu Glu Glu Leu Ile Ala Asn His Leu Gly Asp

225 230 235 240

Leu Phe Pro Gly Met Glu Val Leu Asp His His Ala Phe Arg Leu Thr

245 250 255

Arg Asn Glu Asp Val Glu Ile Glu Glu Asp Glu Ser Glu Asn Leu Ile

260 265 270

Gln Ala Leu Glu Ala Glu Leu Leu Arg Arg Arg Phe Gly Pro Pro Ile

275 280 285

Arg Leu Glu Ile Thr Asp Asp Met Asp Glu Val Thr Met Asp Leu Leu

290 295 300

Val Arg Glu Leu Asp Ile Thr Asp Leu Glu Val Tyr Arg Leu Pro Gly

305 310 315 320

Pro Leu Asp Leu Arg Gly Leu Phe Asp Leu Ser Arg Ile Asp Arg Pro

325 330 335

Asp Leu Arg Tyr Pro Pro His Leu Pro Thr Thr Ala Val Ala Phe Gln

340 345 350

Pro Ala Gly Ser Ser Asn Arg Ala Asp Ile Phe Lys Ala Ile Arg Lys

355 360 365

Ser Asp Val Leu Val His His Pro Tyr Glu Ser Phe Thr Thr Ser Val

370 375 380

Gln Ala Phe Leu Glu Gln Ala Ala Arg Asp Pro His Val Leu Ala Ile

385 390 395 400

Lys Gln Thr Leu Tyr Arg Thr Ser Gly Asp Ser Pro Val Val Gln Ala

405 410 415

Leu Ile Asp Ala Ala Glu Ala Gly Lys Gln Val Leu Ala Leu Val Glu

420 425 430

Val Lys Ala Arg Phe Asp Glu Ala Asn Asn Ile Val Trp Ala Arg Lys

435 440 445

Leu Glu Lys Ala Gly Val His Val Val Tyr Gly Leu Val Gly Leu Lys

450 455 460

Thr His Cys Lys Leu Ala Leu Val Ile Arg Glu Glu Glu Gly Met Leu

465 470 475 480

Arg His Tyr Ser His Val Gly Thr Gly Asn Tyr Asn Pro Lys Thr Ser

485 490 495

Arg Ile Tyr Glu Asp Phe Gly Leu Phe Thr Ala Asp Ala Gln Val Gly

500 505 510

Lys Asp Leu Thr Arg Leu Phe Asn Glu Leu Ser Gly Tyr Ala Ile Glu

515 520 525

Lys Lys Phe Lys Arg Leu Leu Val Ala Pro Leu His Leu Arg Lys Gly

530 535 540

Leu Ile Arg Gln Ile Asp Ala Glu Arg Arg Asn Ala Glu Ala Gly Ile

545 550 555 560

Pro Ala His Ile Arg Ile Lys Val Asn Ser Met Val Asp Glu Glu Ile

565 570 575

Ile Asp Ala Leu Tyr Arg Ala Ser Ala Ala Gly Val Lys Val Asp Val

580 585 590

Trp Val Arg Gly Ile Cys Ser Leu Arg Thr Asp Leu Asp Gly Ile Ser

595 600 605

Asp Asn Ile Thr Val Arg Ser Ile Leu Gly Arg Tyr Leu Glu His Ser

610 615 620

Arg Ile Phe Ala Phe Glu Asn Ala Gly Asp Pro Gln Val Tyr Ile Gly

625 630 635 640

Ser Ala Asp Met Met His Arg Asn Leu Asp Arg Arg Val Glu Ala Leu

645 650 655

Val Arg Val Thr Asp Ala Asp His Leu Lys Glu Leu Gln Ala Phe Phe

660 665 670

Asp Leu Ala Met Asp Asp Gly Thr Ser Ser Trp His Leu Gly Ala Gly

675 680 685

Gly Val Trp Glu Arg His Ala Val Asn Ala Asp Gly Lys Pro Leu Ile

690 695 700

Asp Leu Gln Asp Lys Thr Met Gly Leu Ile Gln Arg Arg Arg Arg Ala

705 710 715 720

Arg Ala Val Arg

<210> 10

<211> 1390

<212> ДНК

<213> Microbacterium sp.

<220>

<221> разнообразные признаки

<223> SGI бактериальный изолят SGI-005-G08

<220>

<221> разнообразные признаки

<223> кодирует 16S рибосомную РНК

<220>

<221> разнообразные признаки

<222> (29)..(36)

<223> n есть a, c, g, t и другие

<220>

<221> разнообразные признаки

<222> (38)..(41)

<223> n есть a, c, g, t и другие

<400> 10

aacggtgaac acggagcttg ctctgtggnn nnnnnngnnn ncgggtgagt aacacgtgag60

caacctgccc ctgactctgg gataagcgct ggaaacggcg tctaatactg gatacgagta 120

gcgatcgcat ggtcagctac tggaaagatt ttttggttgg ggatgggctc gcggcctatc 180

agcttgttgg tgaggtaatg gctcaccaag gcgtcgacgg gtagccggcc tgagagggtg 240

accggccaca ctgggactga gacacggccc agactcctac gggaggcagc agtggggaat 300

attgcacaat gggcggaagc ctgatgcagc aacgccgcgt gagggatgac ggccttcggg 360

ttgtaaacct cttttagcag ggaagaagcg aaagtgacgg tacctgcaga aaaagcgccg 420

gctaactacg tgccagcagc cgcggtaata cgtagggcgc aagcgttatc cggaattatt 480

gggcgtaaag agctcgtagg cggtttgtcg cgtctgctgt gaaatcccga ggctcaacct 540

cgggcctgca gtgggtacgg gcagactaga gtgcggtagg ggagattgga attcctggtg 600

tagcggtgga atgcgcagat atcaggagga acaccgatgg cgaaggcaga tctctgggcc 660

gtaactgacg ctgaggagcg aaagggtggg gagcaaacag gcttagatac cctggtagtc 720

caccccgtaa acgttgggaa ctagttgtgg ggtccattcc acggattccg tgacgcagct 780

aacgcattaa gttccccgcc tggggagtac ggccgcaagg ctaaaactca aaggaattga 840

cggggacccg cacaagcggc ggagcatgcg gattaattcg atgcaacgcg aagaacctta 900

ccaaggcttg acatatacga gaacgggcca gaaatggtca actctttgga cactcgtaaa 960

caggtggtgc atggttgtcg tcagctcgtg tcgtgagatg ttgggttaag tcccgcaacg 1020

agcgcaaccc tcgttctatg ttgccagcac gtaatggtgg gaactcatgg gatactgccg 1080

gggtcaactc ggaggaaggt ggggatgacg tcaaatcatc atgcccctta tgtcttgggc 1140

ttcacgcatg ctacaatggc cggtacaaag ggctgcaata ccgtgaggtg gagcgaatcc 1200

caaaaagccg gtcccagttc ggattgaggt ctgcaactcg acctcatgaa gtcggagtcg 1260

ctagtaatcg cagatcagca acgctgcggt gaatacgttc ccgggtcttg tacacaccgc 1320

ccgtcaagtc atgaaagtcg gtaacacctg aagccggtgg cctaaccctt gtggagggag 1380

ccgtcgaagg 1390

<210> 11

<211> 532

<212> ДНК

<213> Mycosphaerella sp.

<220>

<221> разнообразные признаки

<223> SGI бактериальный изолят SGI-010-H11

<220>

<221> разнообразные признаки

<223> Внутренний транскрибированный спейсер 1_5.8S рибосомная ДНК

<220>

<221> разнообразные признаки

<222> (43)..(43)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> разнообразные признаки

<222> (526)..(526)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<400> 11

cggagggatc attaatgagt gagggggcca cccccaacct ccnacccttt gtgaacgcat60

catgttgctt cgggggcgac cctgccgttc gcggcattcc ccccggaggt catcaaaaca 120

ctgcattctt acgtcggagt aaaaagttaa tttaataaaa ctttcaacaa cggatctctt 180

ggttctggca tcgatgaaga acgcagcgaa atgcgataag taatgtgaat tgcagaattc 240

agtgaatcat cgaatctttg aacgcacatt gcgccccctg gtattccggg gggcatgcct 300

gttcgagcgt catttcacca ctcaagcctc gcttggtatt gggcgtcgcg agtctctcgc 360

gcgcctcaaa gtctccggct gttcggttcg tctcccagcg ttgtggcaac tatttcgcag 420

tggagtacga gtcgtggcgg ccgttaaatc tttcaaaggt tgacctcgga tcaggtaggg 480

atacccgctg aacttaagca tatcaataag cggaggaggt catagntgtt tc532

<210> 12

<211> 1431

<212> ДНК

<213> Variovorax sp.

<220>

<221> разнообразные признаки

<223> SGI бактериальный изолят SGI-014-G01

<220>

<221> разнообразные признаки

<223> кодирует 16S рибосомную РНК

<400> 12

tgccttacac atgcaagtcg aacggcagcg cgggagcaat cctggcggcg agtggcgaac60

gggtgagtaa tacatcggaa cgtgcccaat cgtgggggat aacgcagcga aagctgtgct 120

aataccgcat acgatctacg gatgaaagca ggggatcgca agaccttgcg cgaatggagc 180

ggccgatggc agattaggta gttggtgagg taaaggctca ccaagccttc gatctgtagc 240

tggtctgaga ggacgaccag ccacactggg actgagacac ggcccagact cctacgggag 300

gcagcagtgg ggaattttgg acaatgggcg aaagcctgat ccagccatgc cgcgtgcagg 360

atgaaggcct tcgggttgta aactgctttt gtacggaacg aaacggcctt ttctaataaa 420

gagggctaat gacggtaccg taagaataag caccggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg 480

taatacgtag ggtgcaagcg ttaatcggaa ttactgggcg taaagcgtgc gcaggcggtt 540

atgtaagaca gttgtgaaat ccccgggctc aacctgggaa ctgcatctgt gactgcatag 600

ctagagtacg gtagaggggg atggaattcc gcgtgtagca gtgaaatgcg tagatatgcg 660

gaggaacacc gatggcgaag gcaatcccct ggacctgtac tgacgctcat gcacgaaagc 720

gtggggagca aacaggatta gataccctgg tagtccacgc cctaaacgat gtcaactggt 780

tgttgggtct tcactgactc agtaacgaag ctaacgcgtg aagttgaccg cctggggagt 840

acggccgcaa ggttgaaact caaaggaatt gacggggacc cgcacaagcg gtggatgatg 900

tggtttaatt cgatgcaacg cgaaaaacct tacccacctt tgacatgtac ggaattcgcc 960

agagatggct tagtgctcga aagagaaccg taacacaggt gctgcatggc tgtcgtcagc 1020

tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc aacccttgtc attagttgct 1080

acattcagtt gggcactcta atgagactgc cggtgacaaa ccggaggaag gtggggatga 1140

cgtcaagtcc tcatggccct tataggtggg gctacacacg tcatacaatg gctggtacaa 1200

agggttgcca acccgcgagg gggagctaat cccataaaac cagtcgtagt ccggatcgca 1260

gtctgcaact cgactgcgtg aagtcggaat cgctagtaat cgtggatcag aatgtcacgg 1320

tgaatacgtt cccgggtctt gtacacaccg cccgtcacac catgggagcg ggttctgcca 1380

gaagtagtta gcttaaccgc aaggagggcg attaccacgg cagggttcgt g1431

<210> 13

<211> 1424

<212> ДНК

<213> Bacillus amyloliquefaciens

<220>

<221> разнообразные признаки

<223> SGI бактериальный изолят SGI-015-F03

<220>

<221> разнообразные признаки

<223> кодирует 16S рибосомную РНК

<400> 13

ctggcggcgt gcctaataca tgcaagtcga gcggacagat gggagcttgc tccctgatgt60

tagcggcgga cgggtgagta acacgtgggt aacctgcctg taagactggg ataactccgg 120

gaaaccgggg ctaataccgg atggttgtct gaaccgcatg gttcagacat aaaaggtggc 180

ttcggctacc acttacagat ggacccgcgg cgcattagct agttggtgag gtaacggctc 240

accaaggcga cgatgcgtag ccgacctgag agggtgatcg gccacactgg gactgagaca 300

cggcccagac tcctacggga ggcagcagta gggaatcttc cgcaatggac gaaagtctga 360

cggagcaacg ccgcgtgagt gatgaaggtt ttcggatcgt aaagctctgt tgttagggaa 420

gaacaagtgc cgttcaaata gggcggcacc ttgacggtac ctaaccagaa agccacggct 480

aactacgtgc cagcagccgc ggtaatacgt aggtggcaag cgttgtccgg aattattggg 540

cgtaaagggc tcgcaggcgg tttcttaagt ctgatgtgaa agcccccggc tcaaccgggg 600

agggtcattg gaaactgggg aacttgagtg cagaagagga gagtggaatt ccacgtgtag 660

cggtgaaatg cgtagagatg tggaggaaca ccagtggcga aggcgactct ctggtctgta 720

actgacgctg aggagcgaaa gcgtggggag cgaacaggat tagataccct ggtagtccac 780

gccgtaaacg atgagtgcta agtgttaggg ggtttccgcc ccttagtgct gcagctaacg 840

cattaagcac tccgcctggg gagtacggtc gcaagactga aactcaaagg aattgacggg 900

ggcccgcaca agcggtggag catgtggttt aattcgaagc aacgcgaaga accttaccag 960

gtcttgacat cctctgacaa tcctagagat aggacgtccc cttcgggggc agagtgacag 1020

gtggtgcatg gttgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc 1080

gcaacccttg atcttagttg ccagcattca gttgggcact ctaaggtgac tgccggtgac 1140

aaaccggagg aaggtgggga tgacgtcaaa tcatcatgcc ccttatgacc tgggctacac 1200

acgtgctaca atggacagaa caaagggcag cgaaaccgcg aggttaagcc aatcccacaa 1260

atctgttctc agttcggatc gcagtctgca actcgactgc gtgaagctgg aatcgctagt 1320

aatcgcggat cagcatgccg cggtgaatac gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca 1380

caccacgaga gtttgtaaca cccgaagtcg gtgaggtaac cttt 1424

<210> 14

<211> 1425

<212> ДНК

<213> Bacillus subtilis

<220>

<221> разнообразные признаки

<223> SGI бактериальный изолят SGI-015-H06

<220>

<221> разнообразные признаки

<223> кодирует 16S рибосомную РНК

<400> 14

gctggcggcg tgcctaatac atgcaagtcg agcggacaga tgggagcttg ctccctgatg60

ttagcggcgg acgggtgagt aacacgtggg taacctgcct gtaagactgg gataactccg 120

ggaaaccggg gctaataccg gatggttgtt tgaaccgcat ggttcagaca taaaaggtgg 180

cttcggctac cacttacaga tggacccgcg gcgcattagc tagttggtga ggtaacggct 240

caccaaggca acgatgcgta gccgacctga gagggtgatc ggccacactg ggactgagac 300

acggcccaga ctcctacggg aggcagcagt agggaatctt ccgcaatgga cgaaagtctg 360

acggagcaac gccgcgtgag tgatgaaggt tttcggatcg taaagctctg ttgttaggga 420

agaacaagtg ccgttcaaat agggcggcac cttgacggta cctaaccaga aagccacggc 480

taactacgtg ccagcagccg cggtaatacg taggtggcaa gcgttgtccg gaattattgg 540

gcgtaaaggg ctcgcaggcg gtttcttaag tctgatgtga aagcccccgg ctcaaccggg 600

gagggtcatt ggaaactggg gaacttgagt gcagaagagg agagtggaat tccacgtgta 660

gcggtgaaat gcgtagagat gtggaggaac accagtggcg aaggcgactc tctggtctgt 720

aactgacgct gaggagcgaa agcgtgggga gcgaacagga ttagataccc tggtagtcca 780

cgccgtaaac gatgagtgct aagtgttagg gggtttccgc cccttagtgc tgcagctaac 840

gcattaagca ctccgcctgg ggagtacggt cgcaagactg aaactcaaag gaattgacgg 900

gggcccgcac aagcggtgga gcatgtggtt taattcgaag caacgcgaag aaccttacca 960

ggtcttgaca tcctctgaca atcctagaga taggacgtcc ccttcggggg cagagtgaca 1020

ggtggtgcat ggttgtcgtc agctcgtgtc gtgagatgtt gggttaagtc ccgcaacgag 1080

cgcaaccctt gatcttagtt gccagcattc agttgggcac tctaaggtga ctgccggtga 1140

caaaccggag gaaggtgggg atgacgtcaa atcatcatgc cccttatgac ctgggctaca 1200

cacgtgctac aatggacaga acaaagggca gcgaaaccgc gaggttaagc caatcccaca 1260

aatctgttct cagttcggat cgcagtctgc aactcgactg cgtgaagctg gaatcgctag 1320

taatcgcgga tcagcatgcc gcggtgaata cgttcccggg ccttgtacac accgcccgtc 1380

acaccacgag agtttgtaac acccgaagtc ggtgaggtaa ccttt1425

<210> 15

<211> 37

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> ПЦР праймер M13-ITS1

<400> 15

tgtaaaacga cggccagttt cgtaggtgaa cctgcgg 37

<210> 16

<211> 38

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> ПЦР праймер ITS4-M13

<400> 16

caggaaacag ctatgacctc ctccgcttat tgatatgc 38

<210> 17

<211> 39

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> ПЦР праймер M13-27F Bac

<400> 17

tgtaaaacga cggccagtta gagtttgatc ctggctcag 39

<210> 18

<211> 37

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> ПЦР праймер 1492R-M13 Bac

<400> 18

caggaaacag ctatgaccgg ttaccttgtt acgactt 37

<---

1. Выделенный микробный штамм, представляющий собой штамм Bacillus amyloliquefaciens, для которого репрезентативный образец депонирован как NRRL B-50760, причем выделенный микробный штамм имеет подавляющую активность против фузариоза.

2. Выделенный микробный штамм по п.1, причем указанный микробный штамм содержит последовательность ДНК, демонстрирующую по меньшей мере 99% идентичности последовательности с SEQ ID NO: 13.

3. Обогащенная культура микробного штамма по п.1 для подавления фузариоза, содержащая по меньшей мере 50% выделенного микробного штамма.

4. Композиция для подавления фузариоза, содержащая микробный штамм или его культуру по любому из пп.1-3 и эффективное для сельскохозяйственного производства количество соединения или композиции, выбранных из группы, состоящей из акарицида, бактерицида, фунгицида, инсектицида, микробицида, нематицида, пестицида и удобрения.

5. Композиция для подавления фузариоза, содержащая микробный штамм или его культуру по любому из пп.1-3 и носитель.

6. Композиция по п.5, в которой указанный носитель представляет собой сельскохозяйственно приемлемый носитель.

7. Композиция по п.5, в которой указанный носитель представляет собой семена растения.

8. Композиция по п.5, где указанную композицию получают в форме состава, выбранного из группы, состоящей из эмульсии, коллоида, пыли, гранулы, шарика, порошка, спрея, эмульсии и раствора.

9. Композиция по п.5, где указанная композиция представляет собой состав для покрытия семян.

10. Семя, резистентное к грибковой инфекции Fusarium, причем семя покрыто составом для покрытия семян, содержащим композицию по п.5.

11. Способ предотвращения развития патогена растений Fusarium, где указанный способ включает выращивание микробного штамма или его культуры по любому из пп.1-3 в среде для роста или почве растения-хозяина перед выращиванием или одновременно с выращиванием растения-хозяина в указанной среде для роста или почве.

12. Способ по п.11, в котором указанный патоген растений вызывает фузариоз.

13. Способ по п.12, в котором указанным патогеном растений является Fusarium graminearum.

14. Способ предотвращения развития фузариоза растения, где указанный способ включает нанесение на растение или на окружающую среду растения эффективного количества микробного штамма или его культуры по любому из пп.1-3.

15. Способ по п.14, в котором указанный микробный штамм или его культуру наносят на почву, семя, корень, цветок, лист, часть растения или все растение.

16. Способ по п.14, в котором указанное растение чувствительно к Fusarium graminearum.

17. Способ по п.14, в котором указанное растение представляет собой растение пшеницы, растение кукурузы, растение ячменя или растение овса.

18. Способ по п.14, в котором указанный микробный штамм или его культура является установленным(ой) как эндофит к указанному растению.

19. Способ получения сельскохозяйственной композиции для подавления фузариоза, где указанный способ включает инокуляцию микробного штамма или его культуры по любому из пп.1-3 в субстрат или на него и обеспечение роста указанного микробного штамма или его культуры при температуре 1-37°C до получения количества клеток или спор по меньшей мере 10² -10³ на миллилитр или на грамм.