Штамм бактерий lactococcus lactis subsp. cremoris 36 rcam 05396, используемый при производстве кисломолочных диетических продуктов
Владельцы патента RU 2780155:
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Пензенский государственный университет" (RU)
Изобретение относится к микробиологической и пищевой отраслям промышленности и касается молочнокислых бактерий (МКБ). Предложен штамм бактерий L. lactis subsp. cremoris 36, депонированный в Ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения (ВКСМ) ГНУ ВНИИСХМ под номером RCAM 05396 – компонент бактериальной закваски для производства кисломолочных продуктов диетического питания. Штамм имеет повышенную жизнеспособность в условиях дефицита питательных компонентов среды, высокий уровень накопления биомассы (больше 109 кл/мл) через 24 ч инкубирования в молоке, оптимальные показатели вязкости к моменту максимального логарифмического роста. Заявленный штамм не образует аммиак из аргинина, не растет в средах с 4% NaCl и рН 9.5 и обладает высокой биохимической активностью как компонент бактериальной закваски для приготовления диетических продуктов. 3 табл., 2 пр.
Изобретение относится к микробиологической и пищевой промышленности и касается молочнокислых бактерий (МКБ), в частности Lactoсcoccus lactis subsp. сremoris 36, которые используют при получении пробиотических бакпрепаратов медицинского назначения и кисломолочных продуктов лечебно-диетического питания. Высокая антагонистическая активность Lactoсcoccus lactis subsp. cremoris 36, способность синтезировать полисахариды играет ведущую роль для использования его в производстве пробиотических поликомпонентных заквасок [1].
Наиболее близким к заявленному изобретению по техническому решению и производственным показателям является штамм Streptococcus lactis ВКПМ В-6795 [2]. Недостатками его использования в производстве является низкая антагонистическая активность, невысокая способность сбраживания углеводов, отличных от лактозы.
Наиболее близким к изобретению по технической сущности и достигаемому положительному эффекту является производственный штамм Streptococcus lactis ВКПМ В-7430 [3]. Продуцент пищевого полипептидного консерванта низина обеспечивающий биосинтез целевого продукта и способность сбраживать различные углеводы и спирты.
В отличие от прототипа бактериальный штамм L. lactis subsp. cremoris 36, имеет повышенную жизнеспособность в условиях дефицита питательных компонентов среды, высокий уровень накопления биомассы (больше 109 кл/мл) через 24 часа инкубирования в молоке, оптимальные показатели вязкости к моменту максимального логарифмического роста. Заявленный штамм не образует аммиак из аргинина, не растет в средах с 4% NaCl и рН 9.5 и обладает высокой биохимической активностью как компонент бактериальной закваски для приготовления лечебно-диетических продуктов.
Штамм выделен из коллекционных образцов способом прямого посева на жидкие питательные среды с последующим высевом на агаризованные среды и депонирован в Ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения (ВКСМ) ГНУ ВНИИСХМ под номером RCAM 05396. Идентификацию штамма проводили согласно определителю Берджи [4].
Штамм L. lactis subsp. cremoris 36 имеет следующие характеристики:
Морфология: грамположительные бактерии, форма клеток шарообразная, располагаются в виде цепочек, диаметр клеток 1-2 мкм.
Культуральные: на поверхности агара с гидролизованным молоком образуются круглые колонии, глубинные или чечевицеобразные, белые, блестящие размером 1-2 мм.
Физиолого-биохимические свойства: оптимальная температура развития при 30-32°С, продолжительность 10-12 часов, при этом кислотность достигается 75-80°Т, через 5-7 суток предельная кислотность 100-115°Т (табл.1).
Условия культивирования:
а) состав питательных сред - стерильное молоко
б) рН среды - 6,3 - 6,7
в) температура и продолжительность выращивания: при 30-32°С 10-12 часов
г) срок хранения штамма при периодическом пересеве - 20 дней (жидкая среда).
Хранение штамма в холодильнике при 8-10°С при пересеве через 20 дней.
Рекомендуемые способы и условия хранения:
Среды хранения: агар MRS, обезжиренное молоко, гидролизованное молоко. Методы хранения: в жидкой питательной среде и на агаре при 5-6°С, лиофилизированная культура в гидролизованном молоке при -18-24°С.
Лиофилизация:
а) продолжительность выращивания на питательной среде (возраст культуры) - 18 часов,
б) состав защитной среды,
в) титр клеточной суспензии - 1*109 КОЕ/см3.
г) режим сублимационного высушивания - +30°С - 9 часов,
д) температура хранения - -18°С,
е) срок хранения - 6 месяцев.
При посеве в стерильное молоко количество клеток культуры должно быть не менее 1*109 КОЕ/см3.
Таблица 1.
Характеристика штамма L. lactis subsp. cremoris 36
| № | Числовые показатели | ||||
| 1 сутки | 3 сутки | 7 сутки | 10 сутки | ||
| 1 | рН, °Т | 5,32 | 5,32 | 5,26 | 4,92 |
| 2 | Кислотность, °Т | 78 | 96 | 113 | 115 |
| 3 | Плотность, кг/м3 | 1,026 | 1,026 | 1,026 | 1,026 |
| 4 | Сухой остаток, г | 7,20 | 7,34 | 8,98 | 10,15 |
| 5 | Среднее время истечения, с | 360 | 361 | 349 | 410 |
| 6 | Динамическая вязкость, мПа⋅с | 1,059 | 1,06 | 1,024 | 1,204 |
| 7 | Относительная вязкость | 0,865 | 0,865 | 0,836 | 0,982 |
Пример 1. Определение жизнеспособности заявляемого штамма в процессе длительного культивирования.
Бактерии заявляемого штамма L. lactis subsp. cremoris 36 и контрольного штамма из коллекционных образцов МИ ПГУ выращивали в течение 24 часов при 33°С после посева штрихом на чашки Петри с обогащенной агаризованной средой МА20 (табл. 2). Из выросшей биомассы каждого штамма готовили бактериальную суспензию и разводили ее таким образом, чтобы при высеве на поверхность минимальной агаризованной среды МА4 можно было наблюдать сопоставимое количество отдельных колоний сравниваемых штаммов на одной чашке.
Таблица 2.
Состав питательных сред (мас. %)
| Название питательных компонентов | Название питательных сред | |
| МА4 | МА20 | |
| Пептон из казеина | 0,4 | |
| Пептон из мяса | 0,4 | |
| Дрожжевой экстракт | 0,4 | |
| Мясной экстракт | 0,4 | |
| Лактоза | 0,4 | 0,5 |
| Агар | 1,55 | 1,55 |
| Na2HPO4 | 0,85 | 0,85 |
| KH2PO4 | 0,2 | 0,2 |
| Вода | остальное |
После длительного (в течение 96 часов) инкубирования при 33°С средняя площадь колоний заявляемого штамма превосходила таковую у контрольного штамма (2.5 и 1,5 мм2, соответственно). Это подтверждает способность заявляемого штамма L. lactis subsp. cremoris 36 накапливать большее количество биомассы в условиях минимального состава питательной среды и длительного инкубирования.
Антагонистическая активность штаммов молочнокислых бактерий играет ведущую роль при их отборе в состав поликомпонентных пробиотических продуктов. Механизм осуществления данного свойства связан с продукцией этими бактериями бактериоцинов, органических кислот, витаминов и микроэлементов.
Пример 2. Антагонистическая активность и совместимость культур были определены методом перпендикулярных штрихов. Зоны отсутствия, взаимного ингибирования или стимуляции роста измерялись линейкой. Об интенсивности ростовых показателей культуры судили по ширине штриха в динамике роста и развития. Учеты проводились ежедневно в течение 3 суток на различных агаризованных средах: АГВ, молочном и питательном агаре, лактобакагаре.
Полученные результаты представлены в таблице 3.
Таблица 3
Характеристика антагонистической активности молочнокислых бактерий-компонентов пробиотического консорциума в динамике роста и развития на различных питательных средах
| Вариант/ номер культуры (вида бактерии) |
Среда | |||||||||||
| АГВ | Лактобакагар | Молочный агар | Питательный агар | |||||||||
| Диаметр зоны ингибирования (стимуляции) роста, мм | ||||||||||||
| 2 | 3 | 4 | 2 | 3 | 4 | 1 | 3 | 4 | 1 | 3 | 4 | |
| Lc.l.l./Sc.t./ Sc.cr./Lb.a. |
0,5/1,75 | 0,5/0,75 | 0,5/1,00 | 0/0 | 1,25/1,25 | 0/0 | 0/0 | 2,75/3,00 | 0/0 | 1,00/2,00 | 0,5/1,00 | 0/0 |
| Sc.t./Lb.a./ Sc.cr./Lc.l.l. |
0/0 | 0,5/0,75 | 0/0 | 0/0 | 0,5/1,00 | 0,5/1,00 | 0/0 | 0/0 | 0/0 | 0/0 | 0/0 | 0/0 |
| Sc.cr./Sc.t./ Lb.a./Lc.l.l |
0,25/0,25 | 0/0 | 0/0 | 0/0 | 0,75/1,75 | 1,00/1,00 | 0/0 | 2,00/2,5 | 0/0 | 0/0 | 3,00/3,5 | 3,50/3,5 |
| Lb.a./Sc.cr./ Sc.t./Lc.l.l. |
0/0 | 0/0 | 0/0 | 0/0 | 0/0 | 0/0 | 2,5/2,75 | 0/0 | 0/0 | 0/0 | 0/0 | 0/0 |
Примечание: 1. Lb.a. - Lactobacillus acidophilus; Lc.l.l. - Lactococcus lactis ssp. lactis; Sc.t. - Streptococcus thermophiles, Sc.сr- Streptococcus cremoris. 2.в числителе - значения через 1 сутки, в знаменателе - через 3 суток после посева.
Проведенный анализ совместимости парных сочетаний компонентов бактериальной ассоциации дает основание утверждать, что отобранные штаммы не имеют ярко выраженной антагонистической активности по отношению друг к другу. Свойства заявляемого штамма свидетельствуют о целесообразности его использования в составе поликомпонентного пробиотического консорциума так как при неблагоприятных условиях (понижении рН среды, повышении температуры, а также постепенного обеднения состава питательной среды по мере протекания технологического процесса) он способен осуществлять сквашивание молока. Повышенная жизнеспособность бактерий позволяет повысить содержание живых клеток в получаемом пробиотическом продукте.
Источники информации
1. Красникова Л.В., Гунькова П.И., Маркелова В.В. Микробиология молока и молочных продуктов: Лабораторный практикум: Учеб.-метод. пособие. СПб.: НИУ ИТМО; ИХиБТ, 2013. 85 с.
2. Патент № 2059716 Штамм Streptococcus lactis-продуцент бактериоцина низина / Литвинова М.Н., Красникова Л.В. и др. (РФ) // Заявл. 08.07.1994; опубл. 10.05.1996. Бюл. №13.
3. Патент №2115724 Штамм бактерий Streptococcus lactis-продуцент низина/ Минаева Л.П., Бирюков В.В. и др (РФ) // Заявл. 04.07.97; опубл. 20.07.98 Бюл. №20.
4. Определитель бактерий Берджи : Справ.изд.: пер.с англ.: в 2 т. Т.2 / под ред. Дж.Хоулта и др. - 9-е изд. - м. : мир, 1997. - С.565.
Штамм бактерий L. lactis subsp. cremoris 36, депонированный в Ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения (ВКСМ) ГНУ ВНИИСХМ под номером RCAM 05396 – компонент бактериальной закваски для производства кисломолочных продуктов диетического питания.
