Способ исследования микробиоты толстого кишечника методом полимеразной цепной реакции с флуорисцентной детекцией в режиме реального времени и набор реагентов для его осуществления

Авторы патента:

Изобретение относится к биотехнологии. Описан способ для исследования микробиоты толстого кишечника путём определения ДНК микроорганизмов кишечника методом ПЦР, включающий взаимодействие образца микробиоты с набором олигонуклеотидных праймеров, определением для каждого олигонуклеотида в указанном наборе праймеров количества его нуклеотидных последовательностей-мишеней, которая присутствует в указанном образце, и получении профиля микробиоты из относительных количеств нуклеотидных последовательностей-мишеней, присутствующих в образце. Также описан соответствующий набор праймеров. Изобретение расширяет арсенал средств для исследования микробиоты кишечника. 2 н.п. ф-лы.

Изобретение относится к медицине, а именно к способам диагностирования заболеваний кишечника.

Известен патент РФ на изобретение №2605913 от 16.12.2011 в котором описана группа изобретений, представленная набором олигонуклеотидных зондов для профилирования микробиоты желудочно-кишечного тракта (ЖКТ), где указанный набор включает в частности (а) олигонуклеотид, состоящий из (ai) нуклеотидной последовательности, выбранной из (SEQ ID NO: 1) необязательно с не более тремя замещенными основаниями или (SEQ ID NO: 27) необязательно с не более тремя замещенными основаниями, и (aii) 0-5 нуклеотидов в дополнение к (ai), где олигонуклеотид согласно (а) способен гибридизоваться с SEQ ID NO: 27 или SEQ ID NO: 1, соответственно, в строгих условиях гибридизации. Также предоставлены способы профилирования микробиоты ЖКТ индивидуума и способы диагностики или мониторинга заболевания или состояния у индивидуума или прогнозирования или оценки риска развития у индивидуума заболевания или состояния, в которых используют набор олигонуклеотидных зондов.

Использование изобретений позволяет выявлять присутствие и количество определенных бактерий среди множества с высокой точностью благодаря комбинированному эффекту используемого набора зондов.

К недостаткам известного решения относится узкий спектр микроорганизмов, определяемый набором зондов.

Задача, на решение которой направлено заявляемое решение разработка способа исследования микробиоты и набора для его проведения более информативного за счет большего количества определяемых последовательностей мишеней, использования более точных олигонуклеотидных праймеров.

Поставленная задача решается путем применения способа исследования микробиоты толстого кишечника путем определения ДНК микроорганизмов кишечника методом полимеразной цепной реакции. Способ включает взаимодействие образца микробиоты с набором олигонуклеотидных праймеров, определением для каждого олигонуклеотида в указанном наборе праймеров количества его нуклеотидных последовательностей-мишеней, которая присутствует в указанном образце. На основании этого получение профиля микробиоты из относительных количеств нуклеотидных последовательностей-мишеней, присутствующих в образце. При этом в состав набора олигонуклеотидных праймеров входят стрипы со смесями олигонуклеатидных праймеров (указаны в порядке прямой праймер, обратный праймер, флуорисцентный зонд) для амплификации, запечатанные воском, раствор Taq-полимеразы, положительный контрольный образец, отрицательный контрольный образец, минеральное масло. В качестве смесей праймеров в наборе 1 используют олигонуклеотиды:

В качестве смесей праймеров в наборе 2 используют олигонуклеотиды:

В качестве смесей праймеров в наборе 3 используют олигонуклеотиды:

Для приготовления компонентов набора используются водные растворы реагентов, разбавителем в которых является вода деионизованная с удельной электропроводностью не более 4.3 мкСим/см. Далее по тексту под термином «водный раствор» подразумевается раствор реагента в деионизованной воде. Олигонуклеотидные праймеры представляют собой олигонуклеотиды, специфичные для определяемых микроорганизмов. То есть нуклеотидные последовательности праймеров и зондов комплементарны участкам ДНК соответствующих детектируемых микроорганизмов.

Олигонуклеотидные праймеры получают путем химического синтеза на ДНК-синтезаторе (Applied Biosystems ABI 3900 и другие приборы со сходными техническими характеристиками) и подвергают очистке методом электрофореза в полиакриламидном геле или методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии. Олигонуклеотидные праймеры поставляются в лиофилизированном виде.

Олигонуклеотидные праймеры получают путем химического синтеза на ДНК-синтезаторе с химической модификацией и подвергают двухэтапной очистке: методом электрофореза в полиакриламидном геле с последующей очисткой методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии. Химическая модификация заключается во введении молекулы флуорофора и молекулы гасителя флуоресценции.

В качестве флуорофора для канала флуоресценции FAM используют следующие красители: FAM [485 нм (возбуждение), 520 нм (эмиссия)]; для канала HEX используется краситель HEX [530 нм (возбуждение), 556 нм (эмиссия)]; допускается использование красителей VIC или R6G со сходными спектральными характеристиками. В качестве гасителя флуоресценции для канала FAM используют гаситель BHQ-1, для канала HEX используют гаситель BHQ-1 или BHQ-2.

Для приготовления водного раствора дезоксинуклеозидтрифосфатов (дНТФ) используют хроматографически чистые (99%) дезоксинуклеозидтрифосфаты (2'-дезоксиаденозин-5'-трифосфат 2'-дезоксигуанозин-5'-трифосфат 2'-дезокситимидин-5'-трифосфат 2'-дезоксицитидин-5'-трифосфат), свободные от примесей эндонуклеаз, экзонуклеаз и никаз, следовых количеств ДНК и нуклеотидов, поставляемые в концентрации не менее 100 mM.

Для приготовления раствора Taq-полимеразы используют термостабильную ДНК-полимеразу, полученную из бактерий Thermus aquaticus YT1, свободную от нуклеаз, с удельной активностью 5 ед/мкл.

Материалом для изготовления положительного контрольного образца являются образцы плазмидной ДНК, полученные методом генной инженерии с использованием продуктов специфической амплификации участка генома детектируемых микроорганизмов. Амплифицированные фрагменты встраивают в плазмиды путем лигирования, полученные конструкции используют для трансформации E.coli. Культуру E.coli выращивают на селективных средах; плазмидную ДНК со встроенными фрагментами очищают с помощью набора для очистки плазмидной ДНК.

Реагенты и смеси реагентов помещают в пробирки и стрипованные пробирки (стрипы) из полипропилена, предназначенные для ПЦР, сертифицированные на отсутствие следовых количеств ДНК, ДНК-аз, РНК-аз и ингибиторов ПЦР. Пробирки должны быть изготовлены из высококачественного полипропилена.

Для запечатывания смесей для амплификации в пробирках и стрипах используют воск для ПЦР с температурой плавления 37°С.

Для количественной оценки результатов анализа используют ЭВМ с программным обеспечением, которое преобразует полученные для каждого выявляемого показателя значения порогового цикла Ct в количество копий на мл. Пересчет проводится на основе метода Пфаффла с поправкой на эффективность амплификации. Полученные значения (копий/мл) преобразуются в КОЕ/мл с учетом копийности гена, используемого для амплификации и являются окончательным результатом теста.

В один стрип с олигонуклеатидным праймером входит:

- олигонуклеотидный праймер, представляющий водный раствор полученных на ДНК-синтезаторе двух олигонуклеотидных праймеров, специфичных для генома исследуемых микроорганизмов. Концентрация каждого праймера в реакционной смеси - 4,0 пмоль/мкл;

- водный раствор дезоксинуклеозидтрифосфатов (дНТФ); концентрация каждого дНТФ - 2,5 мМ;

- 10-кратный буферный раствор, содержащий 300 mM Трис-HCl, 166 mM аммония сульфат, 25 mM магния хлорид, рН 8,6;

- флуоресцентный зонд для специфического фрагмента. Содержат флуорофор FAM [485 нм (возбуждение), 520 нм (эмиссия)] или флуорофор HEX [530 нм (возбуждение), 556 нм (эмиссия)]. Концентрация каждого зонда в реакционной смеси - 0,5 пмоль/мкл;

- вода дистиллированная (ГОСТ 6709-72).

Раствор Taq-полимеразы представляет собой 2 пробирки по 200 мкл [термостабильная ДНК-полимераза, полученная из бактерий Thermus aquaticus YT1, свободная от нуклеаз, в буферном растворе с рН 8.6, состоящем из 700 mM Трис-HCl, 60% глицерина; 1 мМ дитиотрейтола; 166 mM аммония сульфата, 25 mM магния хлорида, удельная активность фермента - 1 ед/мкл.

Отрицательный контрольный образец 1 пробирка (150 мкл) - вода дистиллированная (ГОСТ 6709-72). Положительный результат в этом образце свидетельствует о необходимости заменить реагенты и переставить эксперимент.

При осуществлении способа по заявляемому изобретению из биологического материала (кал человека) выделяется бактериальная ДНК с помощью набора реагентов, предназначенных для этих целей. На одно определение генетических маркеров заболевания для одного образца используется 6 пробирок с подготовленной реакционной смесью, содержащей специфические синтетические олигонуклеотидные праймеры и интеркалирующий краситель. Во все подготовленные пробирки, не повреждая слой парафина, добавляется раствор Taq-полимеразы.

В каждую пробирку, кроме пробирок с отрицательным контрольным образцом и положительным контрольным образцом, при постановке реакции амплификации добавляется образец бактериальной ДНК, выделенной из образца кала человека. Все пробирки устанавливаются в блок амплификатора, амплификация проводится согласно стандартным режимам. Детекция результатов осуществляется детектирующим амплификатором автоматически во время амплификации. Анализ результатов проводится в соответствии с инструкцией к прибору. В случае наличия в ДНК специфических маркеров, комплементарных праймерам, происходит наработка ПЦР-продукта и возрастание уровня флуоресценции. Интенсивность флуоресценции свидетельствует о количестве образующегося продукта. Для количественной оценки результатов анализа используют ЭВМ с программным обеспечением, которое преобразует полученные для каждого выявляемого показателя значения порогового цикла Ct в количество копий на мл. Пересчет проводится на основе метода Пфаффла с поправкой на эффективность амплификации. Выявляемое изменение титра 10^4 коп/мл.

Разработанный способ исследования микробиоты толстого кишечника и варианты наборов для его осуществления позволяют выявить присутствие патогенных микроорганизмов или значительное увеличение отдельных представителей микрофлоры кишечника, например, снижение содержания бифидобактерий и/или лактобацилл, изменение количества сапрофитной, грибов или условно-патогенной микрофлоры, изменение соотношения субпопуляций анаэробных бактерий, осуществляющих различные виды брожения (например, продуцентов бутирата и продуцентов пропионата).

Разработанный способ и набор для его осуществления, за счет комбинации показателей используемых праймеров позволяет диагностировать дисбактериозы кишечника, кандидомикозный сепсис, антибиотик-ассоцированную диарею, иммунодефицитные состояния, гастроэнтерит, энтерит, энтероколит, стафилококковый дисбактериоз, антибиотик-ассоциированный колит, псевдомембранозный колит, пищевые токсикоинфекции, некротический энтерит, неспецефический язвенный колит, острые кишечные инфекционные заболевания, гастрит, неопластические процессы в толстом кишечнике, канцерогенез, генерализованный тифопаратифозный инфекционный процесс, дизентерию, дисбиоз, болезнь Крона, неспецифический язвенный колит, диабеты 1-го и 2-го типа, цирроз печени, избыточный бактериальный рост, анаэробный дисбаланс, различные аутоиммунные патологии, синдром раздраженной толстой кишки, аллергию, патологии желчевыводящих путей, полипоз тостого кишечника, колоректальный рак.

1. Способ исследования микробиоты толстого кишечника путём определения ДНК микроорганизмов кишечника методом полимеразной цепной реакции, включающий взаимодействие образца микробиоты с набором олигонуклеотидных праймеров, определением для каждого олигонуклеотида в указанном наборе праймеров количества его нуклеотидных последовательностей-мишеней, которая присутствует в указанном образце, и получении профиля микробиоты из относительных количеств нуклеотидных последовательностей-мишеней, присутствующих в образце, отличающийся тем, что в качестве набора олигонуклеотидных праймеров используют набор праймеров со следующими олигонуклеотидами:

- Ca_its_F 5’CAGCGAAATGCGATACGTAATATG 3’

Ca_its_R 5’GTCTTTCAAGCAAACCCAAGTC 3’

Ca_its_Z 5’ - FAM- CCTGTTTGAGCGTCGTTTCTCCCT - BHQ-1;

- SaAROE_F 5’AAAGGATTGCACAGCGTTTATC 3’

SaAROE_R 5’CGCAACAGTTAATTTGGGCTTTA 3’

SaAROE_z1 5' (R6G) TACCTTTACTTGCACCACCTGCGC (BHQ1);

- Kspp_F 5’GTTAACGCCCTGTCGCAGAAGC 3’

Kspp_R 5’TTC(G/A) T(A/G) GCTCGGCCAGAA(G/A) CGCAC 3’;

- Clodif_F 5’TTGAGCGATTTACTTCGGTAAAGA 3’

Clodif_R 5’TGTACTGGCTCACCTTTGATATTCA 3’

Clo_Taqman 5’ FAM CCACGCGTTACTCACCCGTCCG BHQ1 3’;

- Fprau_F 5’CCATGAATTGCCTTCAAAACTGTT3’

Fprau_R 5’GAGCCTCAGCGTCAGTTGGT3’

Fprau_Z 6'FAM-AATTCCCGGTGTAGCGGTGGAA-BHQ-1;

- Bac_frag_F 5’CGGAGGATCCGAGCGTTA 3’

Bac_frag_R 5’CCGCAAACTTTCACAACTGACTTA 3’

Bac_frag_Z 6'FAM-CGCTCCCTTTAAACCCAATAAATCCGG-BHQ-1;

- eaeRT_F 5’CAGGCTGATGTATGAGCAGTAT 3’

eaeRT_R 5’TGCTGAGACCACGGTTTATC 3’

eae_z 5’FAM-TATAGTTTACACCAACGGTCGCCGC-BHQ-1;

- Bif_F 5’GCGTGCTTAACACATGCAAGTC3’

Bif_R 5’CACCCGTTTCCAGGAGCTATT3’

Bif_Z 6'FAM-TCACGCATTACTCACCCGTTCGCC-BHQ-1;

- Lacto_1 5’TCGGCTATCACTTCTGGATGGA3’

Lacto_2 5’CCATTGTGGAAGATTCCCTACTGC3’

Lacto_Z 6'FAM-ATCGGCCACATTGGGACTGAGAC-BHQ-1;

- Tot_F 5’TCCTACGGGAGGCAGCAGT3’

Tot_R 5’GGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTT3’

Tot_Z 6'FAM-CGTATTACCGCGGCTGCTGGCAC-BHQ-1.

2. Набор для проведения способа по п. 1, включающий стрипы со смесями олигонуклеатидных праймеров для амплификации, запечатанные воском, раствор Taq-полимеразы, положительный контрольный образец, отрицательный контрольный образец, минеральное масло, отличающийся тем, что в качестве смесей праймеров используют следующие олигонуклеотиды: