Способ диагностики лимфомы ходжкина

Изобретение относится к биотехнологии и диагностической медицине и может быть использовано для диагностики лимфомы Ходжкина (ЛХ). Выделяют тотальную популяцию внеклеточных нановезикул (ВНВ) из плазмы крови с помощью двухфазной полимерной системы. Формируют комплекс из наночастиц золота (НЧ-Au) размером 5-10 нм и ДНК-аптамеров ACTGGGCGAAACAAGTCTATTGACTATGAG (CD30-Apt), взятых в соотношении 10 мкл / 2,5 мкл. Инкубируют полученный комплекс с тотальной популяцией ВНВ, взятой в объеме 1 мкл. Добавляют 10 мкл субстрата тетраметилбензидина (ТМБ) в концентрации 100 пмоль/мл. Полученную смесь препарата ВНВ с тремя компонентами НЧ-Au, CD30-Apt и ТМБ инкубируют 18 мин при 37°С. Осуществляют количественную оценку фракции ВНВ, в состав мембраны которых входит белковый маркер CD30 (CD30 (+) ВНВ), путем цветной реакции окисления ТМБ и регистрации оптической плотности смеси с помощью спектрофотометрического анализа на длине волны 378 нм. Значение оптической плотности 1,8-2,2 считают нормой. При значении 6-11 диагностируют ЛХ. Способ позволяет осуществлять диагностику ЛХ с помощью новой технологии количественной оценки CD30(+)BHB, основанной на эффекте изменения фермент-миметических свойств НЧ-Au в результате адсорбции на их поверхности ДНК. Является безопасным и безвредным для пациентов, обладает низкой стоимостью процедуры. 6 ил., 2 пр.

 

Изобретение относится к области биотехнологии и диагностической медицины, и может быть использовано для диагностики и мониторинга эффективности лечения лимфомы Ходжкина (ЛХ).

Лимфома Ходжкина - (лимфогранулематоз, болезнь Ходжкина, злокачественная гранулема) злокачественное заболевание лимфоидной ткани. Патогномоничными признаками заболевания являются увеличение лимфоузлов и наличие гигантских клеток Ходжкина и Рида-Штернберга, обнаруживаемых при микроскопическом исследовании пораженных лимфатических узлов. Патологические клетки обычно составляют 0,1-3% клеток ткани пораженного лимфоузла, что может быть причиной отсутствия в циркулирующей плазме каких-либо специфических молекулярных маркеров заболевания.

Известен способ диагностики ЛХ с использованием набора маркеров (CD15, CD30, CD20, CD45), экспрессия которых оценивается в биопсийном материале методом иммуногистохимии (Федеральные клинические рекомендации для диагностики ЛХ).

Наиболее информативным методом мониторинга эффекта терапии является ПЭТ/КТ (позитронная эмиссионная томография, совмещенная с компьютерной томографией) с применением туморотропных радиофармпрепаратов.

Данный метод является дорогостоящим, сопряжен с лучевой нагрузкой, техническая возможность реализации есть не во всех медицинских учреждениях РФ, и, главное, интерпретация результатов требует нетривиальных подходов и не всегда достаточно адекватно отражает эффект проведенной терапии.

Известны способы диагностики и мониторинга эффекта терапии к ЛХ, основанные на вариантах использования технологии жидкостной биопсии. В целом, методы жидкостной биопсии можно разделить на 4 класса, на основе структуры (размера) детектируемых компонентов циркулирующей крови: 1) свободно циркулирующие молекулярные маркеры; 2) внеклеточная ДНК [Rossi D., Spina V., Bruscaggin A., Gaidano G. Liquid biopsy in lymphoma//Haematologica. Сер. 104. - 2019. - N4. - С. 648-652], 3) внеклеточные нановезикулы [Marrugo-Ramfrez J., Mir M., Samitier J. Blood-Based Cancer Biomarkers in Liquid Biopsy: A Promising Non-Invasive Alternative to Tissue Biopy//International Journal of Molecular Sciences. Сер. 19. - 2018. - N10. - С. 2877] и 4) циркулирующие опухолевые клетки. Последний вариант, вряд ли в принципе применим в случае ЛХ, т.к. при этом заболевании доля опухолевых клеток составляет незначительный процент от объема пораженных лимфоузлов и сложно предполагать возможность циркуляции клеток Ходжкина или клеток Рида-Штернберга. В категорию молекулярных маркеров могут быть формально отнесены показатели биохимического анализа (ЛДГ, мочевина, креатинин, общий белок, альбумин, билирубин, ACT, АЛТ, щелочная фосфатаза, калий, натрий), который должен выполнятся всем пациентам с ЛХ согласно федеральным клиническим рекомендациям (2020 г.). Но ни один из этих параметров не обладает диагностической специфичностью по отношению к ЛХ, их анализ позволяет лишь оценить общее состояние пациента перед или в ходе проведения терапии. Специфические для ЛХ молекулярные маркеры пока не известны.

В качестве потенциального аналога разработанной технологии можно рассмотреть метод детекции свободно циркулирующей ДНК (цДНК), который в настоящее время активно разрабатывается [Cirillo М., Craig A.F.M., Borchmann S., Kurtz D.M. Liquid biopsy in lymphoma: Molecular methods and clinical applications // Cancer Treatment Reviews. Сер. 91. - 2020. - С. 102106.19]. Основным преимуществом технологии анализа цДНК по сравнению с заявляемым способом является относительная простота исполнения: метод предполагает этап выделения ДНК из плазмы и ПНР для специфичной детекции мутантных последовательностей ДНК.

Основной недостаток технологии анализа цДНК в применении к задаче диагностики или мониторинга ЛХ заключается в отсутствии характерных для клеток Ходжкина мутаций. Эта проблема имеет принципиальный характер, так как ее решение требует анализа ДНК из изолированных клеток, что технически трудно из-за низкой представленности специфических клеток в составе пораженных лимфоузлов. До настоящего времени проведено лишь несколько исследований с целью анализа ДНК клеток Ходжкина, и их результаты не позволяют идентифицировать характерные для ЛХ генетические маркеры. В этой ситуации технология детекции цДНК имеет сомнительные перспективы как метод диагностики и/или мониторинга терапии ЛХ.

В ряде исследований было показано, что развитие лимфомы Ходжкина ассоциировано с «появлением» в плазме внеклеточных нановезикул (ВНВ), в состав мембраны которых входит маркер клеток Ходжкина CD30 [Caivano A., Laurenzana I., De Luca L., La Rocca F., Simeon V., Trino S., D'Auria F., Traficante A., Maietti M., Izzo Т., D'Arena G., Mansueto G., Pietrantuono G., Laurenti L., Musto P., Del Vecchio L. High serum levels of extracellular vesicles expressing malignancy-related markers are released in patients with various types of hematological neoplastic disorders // Tumor Biology. Сер. 36. - 2015. - N12. - С. 9739-9752].

Теоретическая возможность количественной оценки таких CD30(+)BHB с целью диагностики или мониторинга эффекта терапии пациентов с ЛХ предполагалась относительно давно [Kuppers R. New insights in the biology of Hodgkin lymphoma // Hematology / the Education Program of the American Society of Hematology. American Society of Hematology. Education Program], но прецедентов практической реализации такой возможности пока не было.

Внеклеточные нановезикулы (ВНВ) - это мембранные образования диаметром 30-150 нм, присутствующие почти во всех биологических жидкостях. Они секретируются большинством типов клеток во внеклеточное пространство и обеспечивают межклеточный транспорт сигнальных и структурных молекул. Основными компонентами мембраны ВНВ являются липиды и белки [Zhang J., Li S., Li L., Li M., Guo C, Yao J., Mi S. Exosome and exosomal microRNA: Trafficking, sorting, and function//Genomics, Proteomics and Bioinformatics.]. Состав ВНВ напрямую зависит от «родительских» клеток и их состояния [Zhang Y., Liu Y., Liu H., Tang W. H. Exosomes: biogenesis, biologic function and clinical potentiall // Cell & Bioscience. Сер. 9. - 2019. - N1.- С. 19]. При возникновении и развитии онкологических заболеваний, злокачественные клетки так же секретируют ВНВ, которые попадают в физиологические жидкости (плазму, лимфу, ликвор и т.д.), искажая нормальный состав ВНВ. Таким образом, ВНВ, секретируемые злокачественными клетками, являются перспективными онкомаркерами, на основе методов анализа ВНВ могут быть созданы системы ранней диагностики. Такие методы основаны на анализе изменений белкового профиля или нуклеиновых кислот в составе циркулирующих везикул, всех или отдельных фракций [Malek A.V., Samsonov R.B., Chiesi А. Development of cancer diagnostics and monitoring methods based on analysis of tumor-derived exosomes // Russian Journal of Biotherapy. Сер. 14. - 2015. - N4. - С. 9-18; Whiteside Т. L. The potential of tumor-derived exosomes for noninvasive cancer monitoring//Expert Review of Molecular Diagnostics. Сер. 15. - 2015. - N10. - С. 1293-1310]. Например, для оценки белкового состава ВНВ, в теории, могут быть использованы стандартные технологии, такие как: проточная цитометрия, иммуно-ферментный анализ, иммуно-химический анализ и вестерн-блоттинг.

Однако чувствительность этих методов недостаточна для детекции малых концентраций объектов исследования, что определяет востребованность новых аналитических технологий.

Ферментативная (фермент-миметическая) активность нано-материалов - это свойство, которое приобретают твердофазные материалы, для которых в обычном состоянии не характерна ферментативная активность. В виде суспензии нано-частиц (НЧ), т.е. частиц сфероидной формы с размерами 1-100 нм, твердофазные материалы, например, металлы или оксиды металлов, приобретают ферментативную активность. Этот феномен особенно характерен для НЧ, размер которых варьирует в диапазоне 3-30 нм. Феномен фермент-миметической активности НЧ металлов привлекает значительный интерес в области промышленного катализа и биомедицины [Tsekhmistrenko S.I., Bityutskyy V.S., Tsekhmistrenko O.S., Polishchuk V.M., Polishchuk S.A., Ponomarenko N.V., Melnychenko Y.O., Spivak M.Y. Enzyme-like activity of nanomaterials//Regulatory Mechanisms in Biosystems. Сер. 9. - 2018.- N3.- С. 469-476; Liu L., Hao Y., Deng D., Xia N. Nanomaterials-Based Colorimetric Immunoassays//Nanomaterials. Сер. 9. - 2019.- N3.- С.316]. Это свойство открывает возможность применения НЧ в качестве биосенсоров к различным органическим молекулам [Liu X., Huang D., Lai С, Qin L., Zeng G., Xu P., Li В., Yi H., Zhang M. Peroxidase Like Activity of Smart Nanomaterials and Their Advanced Application in Colorimetric Glucose Biosensors // Small. Сер. 15.-2019. - N17. - С. 1900133]. Модификация поверхности НЧ приводит к изменению фермент-миметической активности. Например, НЧ золота способны катализировать окисление тетраметилбензидин (ТМБ) [Li R.S., Liu Н., Chen В. Bin, Zhang H.Z., Huang C.Z., Wang J. Stable gold nanoparticles as a novel peroxidase mimic for colorimetric detection of cysteine//Analytical Methods. Сер. 8. - 2016. - N11.- С. 2494-2501], а модификация поверхности НЧ изменяет это свойство. В качестве «модификаторов» могут быть использованы анионные полимеры, например, нуклеиновые кислоты, которые способны не специфически адсорбироваться на поверхности НЧ.

Аптамеры это короткие (~ 20-70 оснований) одноцепочечные нуклеотиды, способные связывать различные молекулы с высокой аффинностью и специфичностью [Lakhin A.V., Tarantul V.Z., Gening L.V. Aptamers: Problems, solutions and prospects//Acta Naturae. Russian Federation Agency for Science and Innovation].

Связывание аптамера с мишенью определяется его третичной структурой, гидрофобными взаимодействиями, укладкой оснований и интеркаляцией [Adachi, Nakamura. Aptamers: A Review of Their Chemical Properties and Modifications for Therapeutic Application // Molecules. Сер. 24. - 2019. - N23.- С. 4229]. В свою очередь третичная структура аптамера определяется первичной структурой (последовательностью нуклеотидов в составе ДНК или РНК цепи) и условиями формирования внутримолекулярных связей. При этом пространственная организация молекулы аптамера характеризуется высокой специфичностью и стабильностью, что обеспечивает возможность специфического взаимодействия с другими молекулами. Природным прототипом аптамеров являются молекулы РНК, пространственная организация которых обеспечивает их взаимодействие с ядерными белками. Высокая специфичность аптамеров к мишеням позволила использовать их в качестве терапевтических агентов в области онкологии и вирусологии. Аптамеры, взаимодействующие с мембранным рецептором фактора некроза опухоли CD30 (также известный как TNFRDF8), были описаны относительно недавно [Parekh P., Kamble S., Zhao N., Zeng Z., Portier B.P., Zu Y. Immunotherapy of CD30-expressing lymphoma using a highly stable ssDNA aptamer // Biomaterials. Сер. 34. - 2013. - N35. - С. 8909-8917].

Описанные особенности НЧ и аптамеров дают почву для создания технологии, в основе которой лежит конкурентное связывание ДНК-аптамеров либо золотом (слабо и неспецифично) - либо молекулярными лигандами (эффективно и специфично). Если молекулярный лиганд входит в состав мембраны внеклеточной нановезикулы (ВНВ), то возможно создание динамической системы из трех компонентов НЧ - аптамеры - ВНВ. При этом ДНК-аптамеры распределяются между НЧ и ВНВ, мембрана которых содержит лиганды. Принцип способа показан на Фиг. 1. Чем больше в такой системе везикул, несущих специфические лиганды, тем большее число молекул аптамеров будет связано с ВНВ и меньшее - с НЧ, при этом НЧ начинают проявлять свою фермент-миметическую активность. Эта активность проявляется в виде цветной реакции при добавлении субстрата и может быть оценена методом колориметрии.

В качестве ближайших аналогов, близких по технологии заявляемому способу могут, быть рассмотрены два метода, представленных в научных публикациях.

В первом случае авторами технологии решалась задача количественной оценки концентрации специфических белков, представленных на поверхности ВНВ; были использованы нано-частицы золота (13 нм) и аптамеры, специфично связывающие различные везикулярные маркеры [Jiang Y., Shi М., Liu Y., Wan S., Cui C, Zhang L., Tan W. Aptamer/AuNP Biosensor for Colorimetric Profiling of Exosomal Proteins // Angewandte Chemie International Edition. Сер. 56. - 2017. - N39. - С. 11916-11920]. Авторы статьи оценивали изменение спектральных характеристик золотых НЧ (НЧ-Au) при добавлении аптамера, а также последующего добавления ВНВ, но эти изменения возникали по причине феномена агрегации-дезагрегации НЧ, а не в результате проявления их фермент-миметических характеристик. Точнее, в солевых растворах золотые НЧ-Au склонны к сильному агрегированию, модификация аптамером стабилизируют частицы в солевом растворе. Добавление ВНВ влечет за собой переход молекул аптамера с НЧ-Au на поверхность добавляемых ВНВ. Отсутствие «стабилизатора» на поверхности золотых НЧ приводит к обратному их агрегированию и изменению спектра поглощения раствора. В зависимости от концентрации детектируемого везикулярного маркера в суспензии ВНВ, раствор НЧ-Au агрегирует с большей или меньшей степенью, что пропорционально оптической плотности частиц. Параметром оценки концентрации везикулярного маркера в пробе было отношение коэффициентов экстинции при 650 нм и 520 нм.

Во втором случае авторами решалась аналогичная задача количественной оценки специфических популяций PSA(+)BHB или EpCam(+)BHB [Chen J., Xu Y., Lu Y., Xing W. Isolation and Visible Detection of Tumor-Derived Exosomes from Plasma // Analytical Chemistry - 2018), были использованы наночастицы оксида желез (Fe304) и аптамеры; измерялось изменение фермент-миметической активности оксида железа в присутствии ВНВ, имеющих специфический маркер. Но авторы этой технологии наблюдали обратный эффект адсорбции ДНК-аптамеров на поверхности нано-частиц: адсорбция ДНК вызывала активацию фермент-миметических свойств частиц оксида металла. Поэтому принцип метода количественной оценки специфических нано-везикул заключался в оценке степени угнетения цветной реакции ферментативного окисления ТМБ в присутствии ВНВ.

Таким образом, известная методика имеет сходство с разработанной нами технологией, но основана на обратной зависимости между фермент миметической активностью наночастиц и степенью адсорбции к их поверхности ДНК-аптамеров.

Техническим результатом изобретения является создание технологии количественной оценки CD30(+)BHB, основанной на эффекте изменения фермент-миметических свойств наночастиц золота (НЧ-Au) в результате адсорбции на их поверхности ДНК, для диагностики и мониторинга эффективности терапии ЛХ, безопасность и безвредность исследования для пациентов, низкая стоимость процедуры, технологичность.

Указанный технический результат достигается в способе диагностики лимфомы Ходжкина, в котором выделяют тотальную популяцию внеклеточных нановезикул (ВНВ) из плазмы крови с помощью двухфазной полимерной системы, формируют комплекс из наночастиц золота (НЧ-Au) размером 5-10 нм и ДНК-аптамеров ACTGGGCGAAACAAGTCTATTGACTATGAG (CD30-Apt), взятых в соотношении 10 мкл /2,5 мкл, инкубируют полученный комплекс с тотальной популяцией ВНВ, взятой в объеме 1 мкл, добавляют 10 мкл субстрата тетраметилбензидиина (ТМБ) в концентрации 100 пмоль/мл, полученную смесь препарата ВНВ с тремя компонентами НЧ-Au, CD30-Apt и ТМБ инкубируют 18 мин при 37°С, осуществляют количественную оценку фракции ВНВ, в состав мембраны которых входит белковый маркер CD30 (CD30 (+) ВНВ), путем цветной реакции окисления ТМБ и регистрации оптической плотности смеси с помощью спектрофотометрического анализа на длине волны 378 нм, значение оптической плотности 1.8 - 2,2 считают нормой, а при значении 6-11 диагностируют лимфому Ходжкина.

Количественная оценка CD30(+)BHB, основанная на эффекте изменения фермент-миметических свойств наночастиц золота (НЧ-Аи) в результате адсорбции на их поверхности ДНК, является способом диагностики лимфомы Ходжкина, так как концентрация CD30(+)BHB отражает активность заболевания ЛХ.

В качестве ДНК были использованы ДНК-аптамеры, специфично взаимодействующие с маркером CD30. В ходе работы было показано, НЧ-Аи способны катализировать цветную реакцию окисления ТМБ, эта способность доза-зависимо и обратимо угнетается в результате адсорбции ДНК на поверхности НЧ-Аи.

В случае использования ДНК-аптамеров к маркеру CD30, появление в реакционной смеси CD30(+)BHB приводило к перераспределению молекул аптамера от НЧ-Au к CD30(+)BHB.

В ходе работы над созданием технологии были оптимизированы условия проведения данной реакции, включая детали процедуры, концентрации компонентов, время / температура инкубаций, длина волны при оценке степени поглощения раствором света видимого спектра.

В рамках разработки технологии, была проведена серия экспериментов с использованием аптамера другой последовательности, который специфично связывает известный маркер CD63, присутствующий на мембране всех ВНВ - экзосомальной природы.

Результаты исследования представлены на фиг.2-6.

Способ иллюстрируется фиг.1-6, где:

На фиг. 1 - показан принцип способа.

На фиг. 2 - Внешний вид пробирок с реакционной смесью, содержащей аптамер к общему маркеру ВНВ - белку CD63 (Apt-CD63), НЧ-Au, субстрат ТМБ и различное количество ВНВ, который отражает степень окраски раствора в зависимости от активации фермент-миметической активности НЧ-Au.

На фиг. 3 - Спектральные линии анализируемого раствора, содержащего аптамеры к общему маркеру ВНВ - белку CD63 (Apt-CD63) и НЧ-Au, в присутствии различного количества экзосом, выраженного в условных единицах, и ТМБ.

На фиг. 4 - График зависимости коэффициента экстинции при анализе смеси аптамера к общему маркеру ВНВ - белку CD63 (Apt-CD63), НЧ-Au, ВНВ и субстрата ТМБ от количества ВНВ в составе смеси (при 378 нм).

На фиг. 5,6 - Результаты исследования к примерам 1,2 соответственно.

Способ осуществляют, например, следующим образом.

Плазму помещают в пробирку объемом 2 мл. Центрифугируют последовательно 200g 10 мин, 800g 10 мин, 1500g 10 мин. Далее плазма проходит через гидрофильный фильтр 0,22 мкм. Из подготовленной плазмы выделяют экзосомы (CD30(+)BHB с помощью двухфазной полимерной системы [Slyusarenko М., Nikiforova N., Sidina Е., Nazarova I., Egorov V., Garmay Y., Merdalimova A., Yevlampieva N., Gorin D., Malek A. Formation and Evaluation of a Two-Phase Polymer System in Human Plasma as a Method for Extracellular Nanovesicle Isolation // Polymers. Сер. 13. - 2021. - N3.- С. 458. - 17]. Далее в центрифужную пробирку объемом 200 мкл добавляют 10 мкл золотых наночастиц, к ним добавляют 2,5 мкл аптамера (концентрация 100 пмоль/мл), перемешивают аккуратным пипетированием 8-10 раз. Полученную смесь перемешивают в течение 30 мин при +4°С. К смеси добавляют 1 мкл экзосом (образец с концентрацией (2±1)*10¹¹ частиц/мл), перемешивают аккуратным пипетированием 8-10 раз. Полученный раствор инкубируют при +4°С при постоянном перемешивании в течение 30 минут.Далее к суспензии наночастиц и везикул добавляют 10 мкл субстрата пероксидазы хрена (ТМБ).

Ферментативная реакция протекает в темноте при +37°С 18 минут. Образовавшиеся конгломераты осаждают путем центрифугирования при 6000g 3 минуты. Далее происходит регистрация оптической плотности раствора при 378 нм. У здоровых доноров это значение изменяется в диапазоне значений 1,8-2,2. У пациентов с ЛХ до начала лечения это значение изменяется в диапазоне 6-11, в процессе лечения снижается, иногда до нормальных значений.

Способ подтверждается следующими клиническими примерами.

Пример 1. Сравнение образцов здоровых доноров и пациентов с впервые установленным диагнозом ЛХ: диагностика

Образцы венозной крови были получены от 5 здоровых доноров и 5 пациентов с вновь поставленным диагнозом ЛХ были собраны в вакутейнеры с ЭДТА. Все диагнозы были верифицированы морфологическим и ИГХ исследованием биоптатов пораженных лимфоузлов. После отделения плазмы путем центрифугирования (1500g 3 мин), 2 мл плазмы были использованы для анализа, который проведен согласно протоколу, представленному выше. Измерение поглощения света на длине волны 378 нм проведено на планшетном ридере Varioskan Flash. Проведен подсчет средних для групп образцов значений (доноры 2,6 vs. пациенты 7,1) и показателей стандартных отклонений. Результаты представлены на фиг. 5.

Пример 2. Сравнение образцов пациентов, с впервые установленным диагнозом ЛХ, до начала лечения, после проведения двух циклов полихимиотерапии (ABDV): мониторинг терапии

Образцы венозной крови были получены от 5 пациентов, с вновь поставленным диагнозом ЛХ, до начала лечения и после проведения двух циклов полихимиотерапии. Образцы крови были собраны в вакутейнеры с ЭДТА. После отделения плазмы путем центрифугирования (1500g 3 мин), 2 мл плазмы были использованы для анализа, который проведен согласно протоколу, представленному выше. Измерение поглощения света на длине волны 378 нм проведено на планшетном ридере Varioskan Flash. Проведен подсчет средних для групп образцов значений (пациенты до лечения -7,1 vs. пациенты после лечения 2,3), и показателей стандартных отклонений. Результаты представлены на фиг. 6.

Заявляемый способ позволяет осуществлять диагностику и мониторинг эффективности терапии лимфомы Ходжкина с помощью новой технологии количественной оценки CD30(+)BHB, основанной на эффекте изменения фермент-миметических свойств нано-частиц золота (НЧ-Au) в результате адсорбции на их поверхности ДНК. Является безопасным и безвредным для пациентов, обладает низкой стоимостью процедуры.

Способ диагностики лимфомы Ходжкина, характеризующийся тем, что выделяют тотальную популяцию внеклеточных нановезикул (ВНВ) из плазмы крови с помощью двухфазной полимерной системы, формируют комплекс из наночастиц золота (НЧ-Au) размером 5-10 нм и ДНК-аптамеров ACTGGGCGAAACAAGTCTATTGACTATGAG (CD30-Apt), взятых в соотношении 10 мкл / 2,5 мкл, инкубируют полученный комплекс с тотальной популяцией ВНВ, взятой в объеме 1 мкл, добавляют 10 мкл субстрата тетраметилбензидина (ТМБ) в концентрации 100 пмоль/мл, полученную смесь препарата ВНВ с тремя компонентами НЧ-Au, CD30-Apt и ТМБ инкубируют 18 мин при 37°С, осуществляют количественную оценку фракции ВНВ, в состав мембраны которых входит белковый маркер CD30 (CD30 (+) ВНВ), путем цветной реакции окисления ТМБ и регистрации оптической плотности смеси с помощью спектрофотометрического анализа на длине волны 378 нм, значение оптической плотности 1,8-2,2 считают нормой, а при значении 6-11 диагностируют лимфому Ходжкина.