Новый пептид и его применение
Изобретение относится к пептиду, состоящему из аминокислотной последовательности YGAGAGAGY (SEQ ID NO: 1), или его фармацевтически приемлемой соли, которые могут быть использованы для лечения или предупреждения инсулита или диабета 1 типа. 3 н. и 3 з.п. ф-лы, 6 ил., 3 табл., 2 пр.
Область техники
[1] Настоящее изобретение относится к новому пептиду и, более конкретно, к новому пептиду и его применению.
Уровень техники
[2] Лимфоцитарная инфильтрация панкреатического островка называется инсулитом. Инсулит, в конечном счете, разрушает панкреатические β-клетки, которые секретируют инсулин, что приводит к диабету 1 типа (T1D) {Lennon GP, Bettini M, Burton AR, Vincent E, Arnold PY, Santamaria P, Vignali DA. "T cell islet accumulation in type 1 diabetes is a tightly regulated, cell-autonomous event". Immunity. 2009 Oct 16;31(4):643-53 и т. д.}. Кроме того, сообщалось о том, что диабет 1 типа можно облегчить путем защиты поджелудочной железы от инсулита {Norman Ende, Ruifeng Chen, Alluru S. Reddi. "Effect of human umbilical cord blood cells on glycemia and insulitis in type 1 diabetic mice". Biochemical and Biophysical Research Communications 325 (2004) 665-669 и т. д.}.
[3] Известно, что различные цитокины, такие как IFN-γ (гамма-интерферон), TNF-α (фактор некроза опухолей альфа) и TGF-β1 (трансформирующий ростовой фактор бета 1) участвуют в развитии и супрессии инсулита. Известно, что инсулит вызывается IFN-γ {von Herrath MG, Oldstone MB. "Interferon-γ is Essential for Destruction of β Cells and Development of Insulin-dependent Diabetes Mellitus". J. Exp Med. 1997 Feb 3;185(3):531-9 и т. д.}, а также известно, что вызывается TNF-α {Kyoungho Suk, Sunshin Kim, Yun-Hee Kim, Kyoung-Ah Kim, Inik Chang, Hi deo Yagita, Minho Shong, Myung-Shik Lee. "IFN-γ/TNF-α Synergism as the Final Effector in Autoimmune Diabetes: A Key Role for STAT1/IFN Regulatory Factor-1 Pathway in Pancreatic β Cell Death". J. Immunol April 1, 2001, 166 (7) 4481-4489 и т. д.}. В то же время сообщалось о том, что повышенная экспрессия TGF-β1 защищает диабетических мышей, не страдающих ожирением (NOD), от инсулита {Piccirillo CA, Chang Y, Prud'homme GJ. "TGF-β1 Somatic Gene Therapy Prevents Autoimmune Disease in Nonobese Diabetic Mice" J. Immunol. 1998 Oct 15;161(8):3950-6 и т. д.}.
[4] Следовательно, необходимо разработать материал, который характеризуется эффектом в отношении инсулита.
[5] [Перечень ссылок]
[6] [Непатентная литература]
[7] (Непатентный документ 1) Lennon GP, Bettini M, Burton AR, Vincent E, Arnold PY, Santamaria P, Vignali DA. "T cell islet accumulation in type 1 diabetes is a tightly regulated, cell-autonomous event". Immunity. 2009 Oct 16;31(4):643-53.
[8] (Непатентный документ 2) Norman Ende, Ruifeng Chen, Alluru S. Reddi. "Effect of human umbilical cord blood cells on glycemia and insulitis in type 1 diabetic mice". Biochemical and Biophysical Research Communications 325 (2004) 665-669.
[9] (Непатентный документ 3) von Herrath MG, Oldstone MB. "Interferon-γ is Essential for Destruction of β Cells and Development of Insulin-dependent Diabetes Mellitus". J. Exp. Med. 1997 Feb 3;185(3):531-9.
[10] (Непатентный документ 4) Kyoungho Suk, Sunshin Kim, Yun-Hee Kim, Kyoung-Ah Kim, Inik Chang, Hi deo Yagita, Minho Shong, Myung-Shik Lee. "IFN-γ/TNF-α Synergism as the Final Effector in Autoimmune Diabetes: A Key Role for STAT1/IFN Regulatory Factor-1 Pathway in Pancreatic β Cell Death". J. Immunol. April 1, 2001, 166 (7) 4481-4489.
[11] (Непатентный документ 5) Piccirillo CA, Chang Y, Prud'homme GJ. "TGF-β1 Somatic Gene Therapy Prevents Autoimmune Disease in Nonobese Diabetic Mice" J. Immunol. 1998 Oct 15;161(8):3950-6.
Раскрытие изобретения
Техническая задача
[12] Целью настоящего изобретения является обеспечение нового пептида.
[13] Другой целью настоящего изобретения является обеспечение нового применения пептида по настоящему изобретению.
[14] Цели настоящего изобретения не ограничиваются вышеуказанным, а другие цели, не упомянутые в данном документе, будут более четко понятны специалистам в данной области техники из приведенного ниже описания.
Решение задачи
[15] В настоящем изобретении предусмотрен пептид, состоящий из аминокислотной последовательности под SEQ ID NO:1 (YGAGAGAGY), или его фармацевтически приемлемая соль.
[16] В аминокислотной последовательности Y представляет собой тирозин (Tyr), G представляет собой глицин (Gly) и A представляет собой аланин (Ala).
[17] Аминокислоты, которые входят в состав пептида, включают L-, D- и DL-формы, все из которых включены в аминокислоты пептида по настоящему изобретению. Также будет понятно, что Y можно интерпретировать как имеющий значение, включающее 4-гидроксифенилаланин, а также тирозин, в качестве аминокислоты.
[18] Пептид включает его варианты, в которых часть структуры пептида в соответствии с настоящим изобретением варьирует из-за спонтанной мутации или искусственной мутации без изменения его основной активности.
[19] Примеры фармацевтически приемлемой соли могут включать гидрохлорид, сульфат, фосфат, ацетат, цитрат, тартрат, сукцинат, лактат, малеат, фумарат, оксалат, метан сульфонат и пара-толуолсульфонат, натриевую соль, калиевую соль, кальциевую соль и т. п.
[20] Кроме того, в настоящем изобретении предусмотрено применение пептида или его фармацевтически приемлемой соли в соответствии с настоящим изобретением и предпочтительно его применение для лечения или предупреждения инсулита. При этом под термином «лечение» в полном объеме подразумевают снижение интенсивности или облегчение симптомов, а термин «предупреждение» применяют во всеобъемлющем значении, включая подавление прогрессирования заболевания от бессимптомной стадии до выражения симптомов.
[21] Лечение и предупреждение может быть обусловлено по меньшей мере одним из подавления экспрессии IFN-γ (гамма-интерферона), подавления экспрессии TNF-α (фактора некроза опухоли альфа) и индукции экспрессии TGF-β1 (трансформирующего ростового фактора бета 1).
[22] Подавление экспрессии IFN-γ может представлять собой подавление экспрессии мРНК IFN-γ.
[23] Подавление экспрессии TNF-α может представлять собой подавление экспрессии мРНК TNF-α.
[24] Индукция экспрессии TGF-β1 может представлять собой индукцию экспрессии мРНК TGF-β1.
[25] Кроме того, в настоящем изобретении предусмотрено применение пептида или его фармацевтически приемлемой соли в соответствии с настоящим изобретением и предпочтительно его применение для лечения или предупреждения диабета 1 типа (T1D).
[26] Диабет 1 типа может быть вызван инсулитом.
[27] Лечение или предупреждение может быть обусловлено по меньшей мере одним из подавления развития инсулита и уменьшения его развития.
[28] Лечение или предупреждение может быть обусловлено снижением уровня глюкозы в крови.
[29] Снижение уровня глюкозы в крови может быть обусловлено по меньшей мере одним из числа подавления развития инсулита и уменьшения его развития.
[30] Кроме того, в настоящем изобретении предусмотрена композиция для лечения или предупреждения инсулита, содержащая пептид или его фармацевтически приемлемую соль в соответствии с настоящим изобретением. Кроме того, в настоящем изобретении предусмотрена композиция для лечения или предупреждения диабета 1 типа, содержащая пептид или его фармацевтически приемлемую соль в соответствии с настоящим изобретением. Композиция может представлять собой фармацевтическую композицию.
[31] Композиция может содержать в качестве действующего вещества пептид или его фармацевтически приемлемую соль в соответствии с настоящим изобретением.
[32] Композиция дополнительно содержит фармацевтически приемлемую добавку и может состоять из пептида или фармацевтически приемлемой соли в соответствии с настоящим изобретением и фармацевтически приемлемой добавки.
[33] Пептид по настоящему изобретению можно получать с помощью способов, которые обычно применяют в области химии пептидов. Например, пептид можно получать со ссылкой на литературу, широко известную из уровня техники, или с помощью способа, такого как жидкофазный синтез или твердофазный синтез.
[34] Примеры способов образования пептидной связи могут включать ацилазидный способ, ацилгалогенидный способ, ацилимидазольный способ, карбодиимидный способ, способ с применением фосфония, ангидридный способ, смешанный ангидридный способ, окислительно-восстановительный способ и применение K-реагента Вудворда.
[35] Перед проведением реакции конденсации карбоксильную группу, аминогруппу или т. п., которые не участвуют в реакции, можно защитить, и карбоксильную группу, которая участвует в реакции конденсации, можно активировать с помощью способов, известных из уровня техники.
[36] Примеры функциональных групп для защиты карбоксильной группы могут включать группы, образующие сложный эфир, например, метил, трет-бутил, арил, пентафторфенил, бензил, параметоксибензил и метоксиэтоксиметил.
[37] Примеры функциональных групп для защиты аминогруппы могут включать тритилкарбонил, арилоксикарбонил, циклогексилоксикарбонил, трихлорэтилоксикарбонил, бензилоксикарбонил, трет-бутоксикарбонил и/или 9-флуоренилметилоксикарбонил.
[38] Примеры активных форм карбоксильной группы могут включать смешанный ангидрид, азид, ацилхлорид и активный сложный эфир [сложный эфир со спиртом (например, пентахлорфенол, 2,4-динитрофенол, цианометиловый спирт, п-нитрофенол, N-гидрокси-5-норборнен-2,3-дикарбоксимид, N-гидроксисукцинимид, N-гидроксифталамид или 1-гидроксибензотриазол)].
[39] Растворители, применяемые в реакции конденсации для образования пептидной связи, включают бензол, толуол, гексан, ацетон, нитрометан, циклогексан, эфир, хлороформ, дихлорметан, этилацетат, N,N-диметилформамид, диметилсульфоксид, пиридин, диоксан, тетрагидрофуран, воду, метанол и этанол, которые можно применять отдельно или в комбинации.
[40] Температура реакции может колебаться в диапазоне от приблизительно -70°C до 100°C, который обычно применяют в реакции, и предпочтительно колеблется в диапазоне от -30°C до 30°C.
[41] Реакцию снятия защиты для удаления защитной группы пептида можно осуществлять с применением кислотного соединения, основного соединения или переходного металла, способного удалять защитную группу не воздействуя на пептидную связь, в зависимости от вида защитной группы.
[42] Реакцию снятия защиты можно выполнять посредством кислотной обработки с применением, например, хлороводорода, бромоводорода, фторводорода, уксусной кислоты, метансульфоновой кислоты, трифторметансульфоновой кислоты, трифторуксусной кислоты, триметилхлорсилана или их смесей.
[43] При осуществлении реакции снятия защиты посредством кислотной обработки, ее можно стимулировать путем добавления вспомогательного вещества, такого как анизол, фенол или тиоанизол.
[44] В качестве альтернативы, реакцию снятия защиты можно выполнять посредством основной обработки с применением, например, аммиака, диэтиламина, гидразина, морфолина, N-метилпирролидина, пиперидина, карбоната натрия или их смесей.
[45] В качестве альтернативы, реакцию снятия защиты можно выполнять посредством обработки переходным металлом с применением, например, цинка, ртути, палладия/водорода и т. д.
[46] После завершения реакции пептид можно очищать с применением традиционного способа очистки пептида, такого как экстрагирование, разделение слоев, осаждение твердых частиц, рекристаллизация или колоночная хроматография.
[47] Кроме того, пептид в соответствии с настоящим изобретением можно превратить в его вариант или его фармацевтически приемлемую соль с применением традиционного способа.
[48] Пептид в соответствии с настоящим изобретением можно синтезировать с применением автоматического синтезатора пептидов или можно получить с помощью манипуляции с генами. Например, слитый ген, кодирующий слитый белок, содержащий партнера по слиянию и пептид в соответствии с настоящим изобретением, изготавливают с помощью манипуляции с генами, а затем применяют для трансформации микроорганизма-хозяина и слитый белок экспрессируется в микроорганизме-хозяине, после чего пептид в соответствии с настоящим изобретением расщепляется или отделяется от слитого белка с применением протеолитического фермента или соединения, с получением таким образом требуемого пептида.
[49] Пептид или его фармацевтически приемлемую соль в соответствии с настоящим изобретением вводят парентерально в количестве от 24,3 мг/день до 4860 мг/день и предпочтительно от 48,6 мг/день до 2430 мг/день. При пероральном введении его количество превышает в от 5 до 10 раз количество при парентеральном введении. Введение можно проводить один раз в день или несколько раз в день и его количество может зависеть от взрослого (с весом 60 кг), но может варьировать в зависимости от веса, состояния тела и т. п. Пептид или его фармацевтически приемлемая соль в соответствии с настоящим изобретением можно в основном вводить посредством парентеральных путей, например, внутривенной инъекции, подкожной инъекции, интраспинального введения, трансдермального введения, трансназального введения или ректального введения. В некоторых случаях возможно пероральное введение.
[50] Пептид или его фармацевтически приемлемая соль, или композиция в соответствии с настоящим изобретением могут быть составлены вместе с фармацевтически приемлемой добавкой в форме инъекции, суппозитория, порошка, назальных капель, гранулы, таблетки или трансдермального пластыря.
[51] Фармацевтически приемлемую добавку можно применять в зависимости от различных факторов, хорошо известных специалистам в данной области техники, включая, например, определенный биоактивный материал, его концентрацию, стабильность и предполагаемую биодоступность; нарушения и заболевания, подлежащие лечению, или состояния, ассоциированные с ними; индивидуумы, подлежащие лечению, их возраст, размер и общее состояние здоровья; и пути введения композиции, например, назальный, пероральный, глазной, местный, трансдермальный и внутримышечный пути, однако, настоящее изобретение не ограничивается ими. Фармацевтически приемлемая добавка, которую применяют для введения биоактивного материала, в дополнение к пероральному пути введения, может включать водный раствор, включающий D5W (5% глюкозы в воде), декстрозу и физиологическую соль в количестве, находящемся в пределах 5% от ее объема. В случае местной инъекции, вводимой внутрь пораженных тканей, для усиления терапевтических эффектов и увеличения их продолжительности могут применяться любые инъецируемые гидрогели. Также фармацевтически приемлемая добавка может содержать дополнительные компоненты для улучшения стабильности эффективных компонентов, такие как консерванты и антиоксиданты. Пептид или его фармацевтически приемлемая соль, или композиция в соответствии с настоящим изобретением могут быть составлены с помощью подходящих способов в смежной области и предпочтительно составлены как подходящие для каждого заболевания или компонента по ссылке на широко известную литературу, относящуюся к способам составления в области техники.
[52] Пептид по настоящему изобретению может храниться в солевом растворе или может лиофилизироваться в ампуле после добавления маннита или сорбита и его можно вводить после растворения в солевом растворе.
[53] Кроме того, в настоящем изобретении предусмотрен способ лечения или предупреждения инсулита, в том числе введения пептида или его фармацевтически приемлемой соли в соответствии с настоящим изобретением млекопитающему, в том числе человеку, нуждающемуся во введении. Кроме того, в настоящем изобретении предусмотрен способ лечения или предупреждения диабета 1 типа, в том числе введения пептида или его фармацевтически приемлемой соли в соответствии с настоящим изобретением млекопитающему, в том числе человеку, нуждающемуся во введении. Кроме того, в настоящем изобретении предусмотрено применение пептида или его фармацевтически приемлемой соли в соответствии с настоящим изобретением для изготовления лекарственного препарата для лечения или предупреждения инсулита. Кроме того, в настоящем изобретении предусмотрено применение пептида или его фармацевтически приемлемой соли в соответствии с настоящим изобретением для изготовления лекарственного препарата для лечения или предупреждения диабета 1 типа. Введенные пептид или его фармацевтически приемлемая соль могут представлять собой пептид или его фармацевтически приемлемую соль в эффективном количестве.
[54] Если не указано иное, вещества, описанные в связи с пептидом или его фармацевтически приемлемой солью, а также применение, композиция и способ в соответствии с настоящим изобретением, применяются в равной степени друг к другу в том же объеме, если они не противоречат друг другу.
Полезные эффекты изобретения
[55] В соответствии с настоящим изобретением инсулит можно эффективно лечить или предупреждать. Более того, в соответствии с настоящим изобретением диабет 1 типа можно эффективно лечить или предупреждать.
Краткое описание графических материалов
[56] На фиг. 1 представлен график, демонстрирующий результаты анализа эффекта пептида из примера 1 в отношении подавления или снижения развития инсулита.
[57] На фиг. 2 представлен график, демонстрирующий результаты анализа эффекта пептида из примера 1 в отношении снижения уровней глюкозы в крови.
[58] На фиг. 3 представлен график, демонстрирующий результаты анализа эффекта пептида из примера 1 в отношении подавления экспрессии IFN-γ и экспрессии TNF-α.
[59] На фиг. 4 представлен график, демонстрирующий результаты анализа эффекта пептида из примера 1 в отношении индукции экспрессии TGF-β1.
[60] На фиг. 5 представлен график, демонстрирующий результаты анализа эффекта пептидов из сравнительного примера 1 и сравнительного примера 2 в отношении подавления экспрессии IFN-γ и экспрессии TNF-α.
[61] на фиг. 6 представлен график, демонстрирующий результаты анализа эффекта пептидов из сравнительного примера 1 и сравнительного примера 2, в отношении индукции экспрессии TGF-β1.
Вариант изобретения
[62] Лучшее понимание настоящего изобретения осуществляется с помощью следующих примеров, сравнительных примеров и примеров получения, в которых примеры и примеры получения изложены исключительно для иллюстрации настоящего изобретения и не должны быть истолкованы как ограничивающие объем настоящего изобретения.
[63] Реагенты, применяемые в следующих примерах и т. п., являются коммерчески доступными и высококачественными продуктами, приобретенными у Sigma-Aldrich, если не указано иное.
[64] <Пример 1> Получение пептида
[65] Пептид, показанный в таблице 1 ниже, получали с применением твердофазного способа синтеза пептида. В частности, пептид синтезировали с применением твердофазного способа с применением химических свойств Fmoc (9-флуоренилметоксикарбонила).
[66] Более конкретно, 0,55 ммоль/г твердой смолы (смолы Wang; Sigma-Aldrich), 5 мл диметилформамида (DMF), 1,1 ммоль Fmoc-Tyr(tBu)-OH и 0,55 ммоль О-бензотриазол-N,N,N',N'-тетраметилуроний-гексафторофосфата (HBTU) помещали в хорошо высушенный реактор и перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч, таким образом, синтезируя Fmoc-Tyr(tBu)-смолу, после чего синтезированную смолу фильтровали и затем промывали с помощью диметилформамида. В промытую смолу добавляли 8 мл 20% раствора пиперидина (растворенного в диметилформамиде) и перемешивали при комнатной температуре в течение 30 мин., таким образом синтезируя Fmoc (защитная группа флуоренилметилоксикарбонил)-незащищенную Tyr(tBu)-смолу. Синтезированную Tyr(tBu)-смолу фильтровали и затем промывали с помощью диметилформамида.
[67] В промытую Tyr(tBu)-смолу добавляли к 5 мл диметилформамида, 1,1 ммоль Fmoc-Gly-OH и 0,55 ммоль О-бензотриазол-N,N,N',N'-тетраметилуроний-гексафторофосфата (HBTU) и перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч., таким образом синтезируя Fmoc-Gly-Tyr(tBu)-смолу, после чего синтезированную смолу фильтровали и затем промывали с помощью диметилформамида. В промытую смолу добавляли 8 мл 20% раствора пиперидина (растворенного в диметилформамиде) и перемешивали при комнатной температуре в течение 30 мин., таким образом синтезируя Fmoc-незащищенную Gly-Tyr(tBu)-смолу. Синтезированную Gly-Tyr(tBu)-смолу фильтровали и затем промывали с помощью диметилформамида. С помощью этих процедур пептидная связь образовывалась между глицином и тирозином.
[68] После этого Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Gly-OH и Fmoc-Tyr(tBu)-OH последовательно применяли и повторяли такие же процедуры, как и для образования пептидной связи между глицином и тирозином, тем самым получая соединение пептид-смола, содержащее аминокислотную последовательность, показанную в таблице 1 ниже.
[69] После этого в соединение добавляли 10 мл смешанного раствора трифторуксусной кислоты и воды в соотношении 95:5 (об./об.), перемешивали при комнатной температуре в течение 3 ч. и затем фильтровали, после чего в полученный фильтрат добавляли диэтиловый эфир, чтобы таким образом кристаллизировать твердое вещество. Полученное таким образом твердое вещество фильтровали, промывали диэтиловым эфиром и затем сушили, таким образом синтезируя неочищенное соединение пептида, содержащее аминокислотную последовательность, показанную в таблице 1 ниже.
[70] Неочищенное соединение пептида очищали посредством обращенно-фазной высокоэффективной жидкостной хроматографии (RP-HPLC) с применением колонки Shimadzu 5 мм Shim-pack ODS C18 (20 х 250 мм) и лиофилизировали, таким образом получая пептид из примера 1 в форме белого твердого вещества.
[71] Очищенный пептид идентифицировали с помощью аналитической RP-HPLC с применением колонки Shimpak 5 мкм ODS C18 (4,6 x 250 мм) и молекулярный вес пептида измеряли с применением масс-спектрометрии с матрично-активированной лазерной десорбцией/ионизацией (MALDI) (Axima CFR, Kratos Analytical, Манчестер, Великобритания).
[72] [Таблица 1]
| Аминокислотная последовательность | SEQ ID NO: | |
| Пример 1 | YGAGAGAGY | 1 |
[73] В таблице 1 Y представляет собой тирозин (Tyr), G представляет собой глицин (Gly) и A представляет собой аланин (Ala).
[74] <Пример 2> Оценка эффектов пептида
[75] 2-1. Оценка эффекта подавления или уменьшения развития инсулита
[76] Эффект пептида из примера 1 в отношении подавления или уменьшения развития инсулита был экспериментально подтвержден.
[77] Экспериментальные животные представляли собой самок NOD/ShiLtJ (Jackson Lab) в возрасте 8 недель. Мыши NOD (диабетические, не страдающие ожирением) представляют собой животные модели инсулита и диабета 1 типа. Известно, что у этих животных диабет 1 типа возникает в среднем в возрасте 18 недель и 90% случаев возникает к возрасту 30 недель. Всех животных содержали в условиях барьера SPF. Это исследование было одобрено Институциональным комитетом по содержанию и использованию животных Osong Medical Innovation Foundation Laboratory Animal Center (Kbio-IACUC-2018-066). Период акклиматизации составлял 1 неделю и цикл дня и ночи составлял 12 ч. (08:00 свет выключен - 20:00 свет включен). Температура составляла 20±2°C и относительная влажность составляла от 60% до 80%. Поскольку распространение диабета можно подавлять с помощью кишечных микроорганизмов, воду, pH которой регулируется до 2,8-3,2 с применением HCl, подавали экспериментальным животным.
[78] Конец хвоста экспериментальных животных, полученных выше, кололи один раз в неделю, и в капле крови из укола измеряли уровни глюкозы в крови с применением глюкометра (Roche, Accu-CHEK Performa). Когда измеренные уровни глюкозы в крови составляли 250 мг/дл или более и уровни глюкозы в крови, повторно измеренные на третий день после этого, составляли также 250 мг/дл или более, считалось, что диабет 1 типа возник и проводили эксперимент.
[79] Два экспериментальных животных с диабетом 1 типа были выбраны в качестве группы обработки из примера 1 и им подкожно (SC) вводили 100 мкл пептида из примера 1 (5 мг/кг). Введение проводили каждое утро и вечер в течение 14 дней и уровни глюкозы в крови измеряли с применением глюкометра. Введение прекращали, когда уровень глюкозы в крови снижался до 250 мг/дл или менее. Кроме того, два экспериментальных животных с диабетом 1 типа были выбраны в качестве группы отрицательного контроля, и их обрабатывали таким же образом, как и группу обработки из примера 1, за исключением того, что PBS (забуференный фосфатом физиологический раствор, Welgene) вводили вместо пептида из примера 1. На 14-ый день одно экспериментальное животное, измеренные уровни глюкозы в крови которого составляли менее чем 250 мг/дл, было выбрано в качестве нормальной группы и его применяли для сравнения показателей инсулита экспериментальных животных с диабетом 1 типа и экспериментальных животных без диабета 1 типа.
[80] После измерений уровней глюкозы в крови на 14-ый день поджелудочную железу удаляли у экспериментальных животных и фиксировали в 10% нейтральном забуференном формалине (10% NBF, Sigma, HT5011) для изготовления парафинового блока. Фиксированную ткань поджелудочной железы нарезали, окрашивали гематоксилином и эозином (H&E) и исследовали с применением оптического микроскопа для подтверждения развития инсулита. Инсулит был поделен на 4 стадии в зависимости от его степени: стадия 0, при которой инсулит не наблюдается, стадия 1, при которой инсулит наблюдается вокруг панкреатических островков, стадия 2, при которой инсулит составляет 75%, и стадия 3, при которой инсулит составляет 75% или более. Для группы обработки примера 1 измеряли количество островков у двух животных, отдельные островки классифицировали в зависимости от стадии инсулита, таким образом определяя показатель инсулита, и количество островков, соответствующих каждой стадии инсулита, среди общего количества островков представляли в процентах. Для группы отрицательного контроля и нормальной группы показатели инсулита определяли как и для группы обработки примера 1, после чего количество островков, соответствующих стадии инсулита, среди общего количества островков представляли в процентах. Результаты показаны на фиг. 1.
[81] На фиг. 1 представлен график, демонстрирующий результаты анализа эффекта пептида из примера 1 в отношении подавления или снижения развития инсулита. На фиг. 1 ось х представляет собой каждую группу, а ось у представляет собой показатель инсулита {инсулит (% островков)}. На фиг. 1 показатель 0 означает стадию 0, показатель 1 означает стадию 1, показатель 2 означает стадию 2 и показатель 3 означает стадию 3.
[82] Как показано на фиг. 1, в группе обработки примера 1 процент в стадии 3, которая представляет собой самую тяжелую стадию, был снижен и проценты в стадиях 0-2, при которых может секретироваться инсулин, были повышены по сравнению с группой отрицательного контроля. В частности, в группе обработки примера 1 процент в стадии 0, при которой не возникает инсулит, был примерно удвоен по сравнению с группой отрицательного контроля. На основании приведенных выше результатов можно обнаружить, что пептид из примера 1 являлся эффективным в лечении инсулита путем подавления развития инсулита и облегчения проявлений инсулита. Кроме того, процент в стадии 0 был выше в группе обработки примера 1, чем у нормальной группы. Следовательно, пептид из примера 1 способен подавлять развитие инсулита, что указывает на то, что пептид из примера 1 являлся эффективным как в лечении, так и в предупреждении инсулита.
[83] В конечном счете, можно сделать вывод, что пептид по настоящему изобретению характеризуется терапевтическим и/или профилактическим эффектом в отношении инсулита.
[84] 2-2. Оценка эффекта снижения уровней глюкозы в крови
[85] Для оценки эффекта пептида из примера 1 в отношении диабета 1 типа (T1D) эффект пептида из примера 1 в отношении снижения уровней глюкозы в крови у экспериментальных животных с диабетом 1 типа был экспериментально подтвержден.
[86] В частности, уровни глюкозы в крови группы обработки примера 1 и группы отрицательного контроля среди экспериментальных животных примера 2-1 анализировали и, таким образом, оценивали эффект пептида из примера 1 в отношении снижения уровней глюкозы в крови. Результаты показаны на фиг. 2.
[87] На фиг. 2 представлен график, демонстрирующий результаты анализа эффекта пептида из примера 1 в отношении снижения уровней глюкозы в крови. В данном случае ось х представляет собой время после обработки (d), а ось y представляет собой уровни глюкозы в крови (мг/дл).
[88] Как показано на фиг. 2, уровни глюкозы в крови двух животных в группе обработки примера 1 (примера 1-1 и пример 1-2) снижались в значительной степени и затем оставались в диапазоне нормальных значений, но уровни глюкозы в крови двух животных в группе отрицательного контроля (группа отрицательного контроля 1 и группа отрицательного контроля 2) непрерывно повышались.
[89] На основании приведенных выше результатов можно подтвердить, что пептид по настоящему изобретению являлся эффективным в отношении снижения уровней глюкозы в крови. Поскольку пептид по настоящему изобретению являлся эффективным в отношении снижения уровней глюкозы в крови мышей с диабетом 1 типа и в отношении поддержания нормальных уровней глюкозы в крови, пептид по настоящему изобретению, как представляется, способен лечить или предупреждать диабет 1 типа путем снижения уровней глюкозы в крови. Кроме того, как подтверждено выше, поскольку пептид по настоящему изобретению способен подавлять и уменьшать развитие инсулита, он может проявлять терапевтический и/или профилактический эффект в отношении диабета 1 типа путем его действия и, можно считать, характеризуется эффектом снижения уровней глюкозы в крови.
[90] В конечном счете, можно сделать вывод, что пептид по настоящему изобретению осуществляет лечение и/или предупреждение диабета 1 типа.
[91] 2-3. Оценка эффекта подавления экспрессии IFN-γ и экспрессии TNF-α и индукции экспрессии TGF-β1.
[92] Оценивали эффект пептида из примера 1 в отношении цитокина {IFN-γ (гамма-интерферона), TNF-α (фактора некроза опухоли альфа) и TGF-β1 (трансформирующего ростового фактора бета 1)}, ассоциированных с инсулитом. Известно, что инсулит вызван экспрессией IFN-γ и TNF-α, и известно, что повышенная экспрессия TGF-β1 защищает поджелудочную железу от инсулита. Таким образом, путем определения того, подавляет ли пептид из примера 1 экспрессию IFN-γ и TNF-α и индуцирует ли экспрессию TGF-β1, оценивали его эффект в отношении инсулита.
[93] Конец хвоста экспериментальных животных, полученных как в примере 2-1, кололи один раз в неделю, и в капле крови из укола измеряли уровни глюкозы в крови с применением глюкометра (Roche, Accu-CHEK Performa). Было подтверждено, что уровни глюкозы в крови являлись «высокими» (600 мг/дл или более), мыши подвергались цервикальной дислокации и из них извлекали селезенку. Клеточное сито (BD, 352350) помещали в пробирку объемом 50 мл, и ткань извлеченной селезенки пропускали через клеточное сито с применением наконечника шприца, после чего в пробирку, содержащую клеточное сито, добавляли HBSS (сбалансированный солевой раствор Хенкса) таким образом, что клетки промывали водой с последующим центрифугированием (1000 об/мин, 5 мин) для удаления супернатанта. Клетки суспендировали в 1 мл HBSS с добавлением 10 мл 1x лизирующего буфера RBC (Ebioscience, 00-4333-57), смешивали при легком перемешивании, оставляли во льду в течение 5 мин и затем центрифугировали (1000 об/мин, 5 мин) для удаления супернатанта. К полученным клеткам снова добавляли 10 мл лизирующего буфера RBC, оставляли во льду в течение 5 мин, дополнительно центрифугировали (1000 об/мин, 5 мин) для удаления супернатанта и затем промывали два раза с помощью 10 мл HBSS. После окончательного центрифугирования (1000 об/мин, 5 мин) клетки суспендировали в 1 мл HBSS, 50 мкл клеток разбавляли раствором трипанового синего 1:1 и количество клеток подсчитывали с применением гемоцитометра. Извлеченные спленоциты помещали в количестве 1x107 клеток на лунку в 6-луночный планшет в 2 мл среды RPMI-1640 (Welgene, LM011-01), содержащей 10% FBS (эмбриональную бычью сыворотку, Corning, 35-015-CV), и добавляли к ней 2 нг/мл антител к CD28 мыши (Ebioscience, 16-0281-82) для индукции активности Т-клеток. Одновременно клетки обрабатывали 100 ммоль пептида из примера 1 в 5% CO2 инкубаторе при 37°C в течение 3 ч. для оценки изменений экспрессии IFN-γ и TNF-α и в течение 72 ч. для оценки изменений экспрессии TGF-β1.
[94] После этого клетки центрифугировали (1000 об/мин, 5 мин.) для удаления супернатанта, лизировали посредством пипетирования 5 мл TRIzol (Invitrogen, 15596-018) и оставляли при комнатной температуре в течение 5 мин. К клеткам добавляли 100 мкл хлороформа, смешивали при энергичном перемешивании и затем оставляли при комнатной температуре в течение 2 мин. После этого проводили центрифугирование (12000 об/мин, 15 мин.) и только супернатант осторожно переносили на новую е-пробирку объемом 1,5 мл с добавлением 300 мкл изопропанола, смешивали при легком перемешивании и затем оставляли при комнатной температуре в течение 10 мин. Затем проводили центрифугирование (12000 об/мин, 15 мин.) для удаления супернатанта с промыванием в 500 мкл 70% этанола, разбавленного в обработанной DEPC (диэтилпирокарбонатом) воде (раствор LPS, CBW004), и центрифугирование (12000 об/мин, 10 мин.) для удаления супернатанта, после чего оставшийся этанол выпаривали в непокрытом состоянии. РНК элюировали путем добавления 30 мкл обработанной DEPC воды и количественно определяли.
[95] cDNA синтезировали посредством методики эксперимента для набора для синтеза cDNA (ELPISbio, EBT-1512) с применением 1 мг количественно определенной РНК. Затем в соответствии с методикой для набора для ПЦР (полимеразной цепной реакции) (Solgent, SEF01-M50H) амплифицировали cDNA каждого цитокина (IFN-γ, TNF-α, TGF-β1) и конститутивный ген GAPDH для количественного определения изменений экспрессии цитокинов. Затем продукты ПЦР подвергались электрофорезу на 2% агарозном геле, чтобы таким образом подтвердить связи ДНК, которые затем количественно определяли с применением программы Image J, и количественно определенные значения рассчитывали как процентное отношение к GAPDH. Контрольную группу обрабатывали таким же образом, как и группу обработки примера 1, за исключением того, что PBS (забуференный фосфатом физиологический раствор, Welgene) применяли вместо пептида из примера 1 и антитела к CD28 мыши, и группу отрицательного контроля обрабатывали таким же образом, как и группу обработки примера 1, за исключением того, что PBS (забуференный фосфатом физиологический раствор, Welgene) применяли вместо пептида из примера 1. Результаты показаны на фиг. 3 и 4. Последовательности праймера для ПЦР каждого цитокина показаны в таблице 2 ниже.
[96] [Таблица 2]
| Цитокин | Последовательность оснований | SEQ ID NO: | |
| IFN-γ | прямая | actggcaaaaggatggtgac | 2 |
| обратная | tgagctcattgaatgcttgg | 3 | |
| TNF-α | прямая | agcccccagtctgtatcctt | 4 |
| обратная | ctccctttgcagaactcagg | 5 | |
| TGF-β1 | прямая | gcttcagctccacagag | 6 |
| обратная | ggttgtagagggcaagg | 7 | |
| GAPDH | прямая | tcatgaccacagtccatgcc | 8 |
| обратная | tccaccaccctgttgctgta | 9 |
[97] В таблице 2 t представляет собой тимин, а представляет собой аденин, с представляет собой цитозин и g представляет собой гуанин.
[98] На фиг. 3 представлен график, демонстрирующий результаты анализа эффекта пептида из примера 1 в отношении подавления экспрессии IFN-γ и экспрессии TNF-α, и на фиг. 4 представлен график, демонстрирующий результаты анализа эффекта пептида из примера 1 в отношении индукции экспрессии TGF-β1. На фиг. 3 и 4 ось х представляет собой контрольную группу {(-)}, группу отрицательного контроля (антитело к CD28) и группу обработки примера 1 (антитело к CD28 + пример 1), и на фиг. 3 и 4 ось у представляет собой уровень экспрессии мРНК в процентном отношении к GAPDH {цитокины/GAPDH (%)}.
[99] Как показано на фиг. 3, на основании результатов оценки уровней экспрессии IFN-γ и TNF-α, которые, как известно, вызывают инсулит, каждый уровень экспрессии был снижен по сравнению с группой отрицательного контроля. Следовательно, можно подтвердить, что пептид из примера 1 подавлял экспрессию IFN-γ и TNF-α, что указывает на то, что развитие инсулита было подавлено, таким образом эффективно осуществляя лечение и/или предупреждение инсулита.
[100] Как показано на фиг. 4, на основании результатов оценки уровня экспрессии TGF-β1, который, как известно, поражает защиту поджелудочной железы от инсулита, уровень экспрессии был повышен по сравнению с группой отрицательного контроля. Следовательно, можно подтвердить, что пептид из примера 1 индуцирует экспрессию TGF-β1, тем самым защищая поджелудочную железу от инсулита, таким образом эффективно лечит и/или предупреждает инсулит.
[101] Соответственно, можно подтвердить, что пептид из примера 1 является эффективным в лечении и/или предупреждении инсулита путем подавления экспрессии IFN-γ и экспрессии TNF-α и/или индукции экспрессии TGF-β1.
[102] В заключение, пептид или его фармацевтически приемлемая соль в соответствии с настоящим изобретением способны проявлять терапевтический и/или профилактический эффект в отношении инсулита путем подавления экспрессии IFN-γ, подавления экспрессии TNF-α и/или индукции экспрессии TGF-β1. В конечном счете, можно сделать вывод, что пептид или его фармацевтически приемлемая соль в соответствии с настоящим изобретением способны лечить и/или предупреждать диабет 1 типа.
[103] <Сравнительный пример 1 и сравнительный пример 2> Получение пептида
[104] Для оценки того, проявляет ли активность часть пептида из примера 1, получали пептид из сравнительного примера 1 и пептид из сравнительного примера 2, содержащие аминокислотные последовательности, соответствующие части аминокислотной последовательности пептида из примера 1. Пептид из сравнительного примера 1 и пептид из сравнительного примера 2 представляли собой пептид (GAGAGY), состоящий из 6 аминокислот последовательно от С-конца аминокислотной последовательности (YGAGAGAGY) пептида из примера 1, и пептид (YGAGAG), состоящий из 6 аминокислот последовательно от его N-конца соответственно. Пептид из сравнительного примера 1 и пептид из сравнительного примера 2 изготавливали таким же образом, что и пептид из примера 1, на основании аминокислотной последовательности, показанной в таблице 3 ниже.
[105] [Таблица 3]
| Аминокислотная последовательность | SEQ ID NO: | |
| Сравнительный пример 1 | GAGAGY | 10 |
| Сравнительный пример 2 | YGAGAG | 11 |
[106] В таблице 3 Y представляет собой тирозин (Tyr), G представляет собой глицин (Gly) и A представляет собой аланин (Ala).
[107] <Сравнительный пример> Оценка эффектов пептида из сравнительного примера 1 и сравнительного примера 2
[108] Для оценки того, являются ли эффективными пептиды из сравнительных примеров 1 и 2 в отношении подавления экспрессии IFN-γ и экспрессии TNF-α и индукции экспрессии TGF-β1, как пептид из примера 1, проводили следующий эксперимент.
[109] Настоящий эксперимент проводили таким же образом, что и в примере 2-3, за исключением того, что пептид из сравнительного примера 1 или пептид из сравнительного примера 2 применяли вместо пептида из примера 1. Результаты показаны на фиг. 5 и 6.
[110] На фиг. 5 представлен график, демонстрирующий результаты анализа эффектов пептидов из сравнительных примеров 1 и 2 в отношении подавления экспрессии IFN-γ и экспрессии TNF-α, и на фиг. 6 представлен график, демонстрирующий результаты анализа эффектов пептидов из сравнительных примеров 1 и 2 в отношении индукции экспрессии TGF-β1. На фиг. 5 и 6 ось х представляет собой контрольную группу {(-)}, группу отрицательного контроля (антитело к CD28) и группу обработки сравнительного примера 1 (антитело к CD28 + сравнительный пример 1) и группу обработки сравнительного примера 2 (антитело к CD28 + сравнительный пример 2) и на фиг. 5 и 6 ось у представляет собой уровень экспрессии мРНК в процентном отношении {цитокины/GAPDH (%)} к GAPDH.
[111] Как показано на фиг. 5, на основании результатов оценки уровней экспрессии IFN-γ и TNF-α, которые, как известно, вызывают инсулит, уровень их экспрессии в каждой из группы обработки сравнительного примера 1 и группы обработки сравнительного примера 2 не изменялся значительно по сравнению с группой отрицательного контроля, и вместо этого было обнаружено, что в группе обработки сравнительного примера 2 повышался уровень экспрессии TNF-α. Кроме того, как представлено на фиг. 6, на основании результатов оценки уровней экспрессии TGF-β1, которые, как известно, поражают защиту поджелудочной железы от инсулита, уровень его экспрессии в каждой из группы обработки сравнительного примера 1 и группы обработки сравнительного примера 2 не изменялся значительно по сравнению с группой отрицательного контроля. Из этих результатов можно увидеть, что пептиды из сравнительного примера 1 и сравнительного примера 2 не проявляли эффектов в отношении подавления экспрессии IFN-γ, подавления экспрессии TNF-α и индукции экспрессии TGF-β1, в отличие от пептида из примера 1.
[112] На основании приведенных выше результатов можно сделать вывод, что целый пептид из примера 1, а не его часть, является эффективным в отношении подавления экспрессии IFN-γ и экспрессии TNF-α и индукции экспрессии TGF-β1 и характеризуется эффектом в отношении инсулита и диабета 1 типа.
[113] <Пример получения 1> Получение инъекционного раствора
[114] Для получения 1 мл раствора 10 мг пептида, полученного таким же образом, что и в примере 1, растворяли в PBS. Этот раствор загружали в ампулу для инъекции для получения инъекционного раствора.
Промышленная применимость
[115] Настоящее изобретение является эффективным в лечении или предупреждения инсулита. Кроме того, настоящее изобретение является эффективным в лечении или предупреждения диабета 1 типа. Следовательно, настоящее изобретение является промышленно применимым.
--->
<110> Инсол Байосайенсиз, инк.
<120> НОВЫЙ ПЕПТИД И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ
<130> GP19010PCT
<160> 11
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 9
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> пептид
<400> 1
Tyr Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Tyr
1 5
<210> 2
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> прямой праймер для IFN-гамма
<400> 2
actggcaaaa ggatggtgac 20
<210> 3
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> обратный праймер IFN-гамма
<400> 3
tgagctcatt gaatgcttgg 20
<210> 4
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> прямой праймер для TNF-альфа
<400> 4
agcccccagt ctgtatcctt 20
<210> 5
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> обратный праймер для TNF-альфа
<400> 5
ctccctttgc agaactcagg 20
<210> 6
<211> 17
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> прямой праймер для TGF-бета1
<400> 6
gcttcagctc cacagag 17
<210> 7
<211> 17
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> обратный праймер для TGF-бета1
<400> 7
ggttgtagag ggcaagg 17
<210> 8
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> прямой праймер для GAPDH
<400> 8
tcatgaccac agtccatgcc 20
<210> 9
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> обратный праймер для GAPDH
<400> 9
tccaccaccc tgttgctgta 20
<210> 10
<211> 6
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> пептид
<400> 10
Gly Ala Gly Ala Gly Tyr
1 5
<210> 11
<211> 6
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> пептид
<400> 11
Tyr Gly Ala Gly Ala Gly
1 5
<---
1. Пептид, состоящий из аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 1, или его фармацевтически приемлемая соль.
2. Фармацевтическая композиция для лечения или предупреждения инсулита, содержащая эффективное количество пептида или его фармацевтически приемлемой соли по п. 1.
3. Фармацевтическая композиция по п. 2, где лечение или предупреждение обусловлено по меньшей мере одним из подавления экспрессии IFN-γ (гамма-интерферона), подавления экспрессии TNF-α (фактора некроза опухоли альфа) и индукции экспрессии TGF-β1 (трансформирующего ростового фактора бета 1).
4. Фармацевтическая композиция для лечения или предупреждения диабета 1 типа, содержащая эффективное количество пептида или его фармацевтически приемлемой соли по п. 1.
5. Фармацевтическая композиция по п. 4, где диабет 1 типа вызван инсулитом.
6. Фармацевтическая композиция по п. 5, где лечение или предупреждение обусловлено по меньшей мере одним из подавления развития инсулита и уменьшения его развития.
