Тест-система для определения антител igm и igg к метапневмовирусу в сыворотках человека методом иммуноферментного анализа

Изобретение относится к медицине и вирусологии. Созданная тест-система для иммуноферментного анализа сыворотки крови человека, основанная на применении штамма метапневмовируса «НМ-1», зарегистрированного в ГКВ №2476 в качестве специфического антигена, накопленного в культуре клеток Hela и концентрированного методом дифференциального центрифугирования, пригодна для выявления антител IgM и IgG и определения их титра к метапневмовирусу. С помощью сконструированной тест-системы при серодиагностике метапневмовируса у пациентов можно выявлять достоверный прирост титров IgM и IgG и уровень неиммунных лиц. Разработка может быть успешно использована практическими врачами, лаборантами лечебных учреждений, особенно в условиях невозможности ПЦР-диагностики и для подтверждения перенесенной инфекции метапневмовирусом. 6 ил., 7 пр.

 

Изобретение относится к медицине и вирусологии и касается разработки новой оригинальной иммуноферментной тест-системы для обнаружения антител к метапневмовирусу, которая может быть использована для диагностических целей.

Острые инфекции дыхательных путей - самые распространенные заболевания, с которыми сталкиваются люди всех возрастов во всем мире, особенно уязвимы дети. Младшее население непропорционально сильно страдает от респираторных инфекций, которые являются ведущей причиной заболеваемости и смертности в этой демографической группе. Метапневмовирусная инфекция имеет клинические проявления, которые затрудняют дифференциацию от инфекций, вызванных другими респираторными вирусами, особенно респираторно-синцитиальным вирусом (hRSV) [1].

Метапневмовирус человека впервые был выделен из респираторных образцов у детей с острыми респираторными заболеваниями неясной этиологии в Нидерландах и Швеции в 2001 г. Впоследствии он был обнаружен у людей всех возрастов на всех континентах. Этот вирус был идентифицирован как новый тип метапневмовируса - метапневмовирус человека, который в настоящее время относится к роду Metapneumovirus семейства Pneumoviridae. Метапневмовирус человека (hMPV) является РНК-содержащим вирусом. Вирионы hMPV имеют плейоморфные, сферические и нитевидные формы. Сферические частицы различаются по размеру и имеют средний диаметр 209 нм. Вирионная РНК кодирует 9 структурных и неструктурных белков. В настоящее время идентифицированы две эволюционные линии (генотипы А и В) и два генетических кластера (субтипа) в пределах каждой линии. Сходство нуклеотидных и аминокислотных последовательностей изолятов двух основных типов hMPV составляет 80 и 90% [2].

Известно, что метапневмовирус способен проникать в центральную нервную систему, приводя к развитию тяжелых энцефалитов [3]. Метапневмовирусная инфекция редко протекает бессимптомно у детей. Этот вирус является причиной от 5 до 15% инфекций верхних и нижних дыхательных путей. Общая частота инфицирования hMPV у взрослых ниже, чем у детей. Бессимптомные инфекции ОРВИ также распространены и у взрослых, составляя не менее 40% случаев [4]. Однако у пожилых людей и пациентов с ослабленным иммунитетом может развиться тяжелая пневмония, которая в некоторых случаях может быть смертельной. Кроме того, от 6 до 12% обострений хронической обструктивной болезни легких у госпитализированных пациентов были связаны с метапневмовирусной инфекцией [5, 6]. У них наблюдаются общие симптомы, такие как жар, кашель, гипоксия, инфекции верхних дыхательных путей, инфекции нижних дыхательных путей и хрипы. Однако наиболее частыми причинами госпитализации являются бронхиолит и пневмония. Средняя продолжительность лихорадки у пациентов, с подтвержденной метапневмовирусной инфекцией, составляет около 10 суток. В учреждениях длительного пребывания сообщается о высоком уровне смертности из-за метапневмовирусной инфекции [7]. У молодых людей реинфекция метапневмовирусом вызывает легкие симптомы простуды с лихорадкой, у пожилых пациентов повторное заражение может привести к тяжелым проявлениям болезни, например, пневмониту и даже к смерти [8]. В одном исследовании у 50% детей с метапневмовирусной инфекцией был диагностирован отит, а в другом исследовании метапневмовирусная инфекция была обнаружена примерно у 8% детей, обратившихся в больницу с хрипом. Свистящее дыхание - распространенный клинический симптом, наблюдаемый в многочисленных исследованиях детей с инфекциями нижних дыхательных путей, ассоциированными с hMPV. Метапневмовирусная инфекция может приводить к обострениям астмы у маленьких детей и взрослых [9].

С развитием мультиплексной полимеразной цепной реакции с обратной транскриптазой (ОТ-ПЦР) разработан чувствительный и быстрый анализ для обнаружения РНК hMPV. Метод ОТ-ПЦР имеет чувствительность и специфичность, 100% и 96% соответственно, обладает способностью обнаруживать сочетанные инфекции даже при очень низких вирусных нагрузках, которые невозможно определить с помощью клеточной культуры или иммунофлюоресценции [10].

Для диагностики метапневмовирусной инфекции человека используют комбинацию иммунофлуоресцентных анализов с последующей ОТ-ПЦР [11]. Анализы ОТ-ПЦР более чувствительны для определения РНК метапневмовируса, чем выделение на культуре клеток. Однако мультиплексные анализы имеют пониженную чувствительность к одному агенту с удобством одновременного обнаружения нескольких разных вирусов. Еще одним ограничением молекулярного обнаружения всех вирусов является способность выявлять низкие уровни вирусной нуклеиновой кислоты в отсутствие инфекционного вируса [12]. Острые респираторные вирусные инфекции (ОРВИ) часто встречаются в детстве, и вероятность обнаружения вирусного генома до начала заболевания или в течение продолжительных периодов времени после разрешения болезни усложняет установление причинно-следственной связи одного из нескольких совместно обнаруженных вирусов.

Факторы гуморального иммунитета играют важную роль в ответе организма на метапневмовирусную инфекцию, поэтому очень важно совершенствование иммунологических способов для детекции специфических антител, особенно на ранних стадиях заболевания.

Как известно, иммуноферментный анализ (ИФА) - основной тест для обнаружения вирусных антител в сыворотке и плазме крови. ИФА является универсальным, серологическим тестом, используемым для подтверждения перенесенной инфекции, метод считается информативным при эпидемиологической оценке. В настоящее время известны тест-системы для выявления антител ко многим вирусам. Например, к респираторно-синцитиальному вирусу, к вирусам гриппа, аденовирусам, вирусам герпеса и др. Недавно было запатентована тест-система для иммуноферментного анализа SARS-CoV-2 [13].

И хотя инфицирование hMPV является обычным явлением, но ИФА для выявления антител к hMPV человека отсутствует. Метапневмовирусная инфекция распространена как в детской, так и во взрослой популяции [14, 15] в эпидемические и в межэпидемические периоды [16]. Большинство людей, вероятно, инфицированы в детстве, но реинфекция метапневмовирусом происходит в течение всей жизни.

В многочисленных исследованиях метапневмовируса был получен большой объем данных для понимания молекулярной основы его репликации, оценки клинического значения и патогенеза заболевания, однако требуются исследования, чтобы понять механизмы адаптивного иммунитета после инфекции и подтвердить существование реальной и длительной циркуляции различных генотипов hMPV в человеческой популяции. Выявление антител к hMPV будет иметь большое значение для диагностики hMPV. Поэтому существует необходимость разработки тест-системы для определения лиц, не обладающих специфическими антителами, которые способны поддерживать развитие эпидемического процесса в межэпидемические периоды. Следует разработать метод для определения специфических антител к метапневмовирусу, в связи с тем, что методом ПЦР метапневмовирус выявляется с достаточно высокой частотой ежегодно.

Учитывая аргументы, перечисленные выше, в настоящей разработке предложен новый способ обнаружения антител к метапневмовирусу на основе непрямого твердофазного ИФА.

Краткое описание чертежей:

На фиг. 1 представлены результаты определения антител IgG и их количества к метапневмовирусу в сыворотках крови взрослых пациентов.

На фиг. 2 представлены результаты определения антител IgG и их количества к метапневмовирусу в сыворотках детей, больных ОРВИ.

На фиг. 3 представлены результаты определения антител IgG и их количества к метапневмовирусу в сыворотках взрослых пациентов, переболевших COVID-19.

На фиг. 4 представлены результаты определения антител IgG и их количества к метапневмовирусу в сыворотках беременных.

На фиг. 5 представлены результаты определения антител IgM и их количества к метапневмовирусу в сыворотках госпитализированных детей с ОРВИ.

На фиг. 6 представлены результаты определения антител IgM и их количества к метапневмовирусу в сыворотках беременных пациенток с ОРВИ.

Задача, на решение которой направлено изобретение, заключается в разработке непрямого метода иммуноферментного анализа для обнаружения антител к метапневмовирусу, основанного на применении в качестве специфического антигена штамма метапневмовируса «НМ-1», для создания (конструирвания) эффективной тест-системы.

Технический результат от использования предлагаемого изобретения заключается в расширении арсенала современных методов, используемых для диагностики вирусных инфекций, предлагаемой тест-системой, основанной на ИФА и предназначенной для определения антител IgM и IgG к метапневмовирусу человека, содержащей сорбирующий специфический антиген метапневмовируса, полученный из штамма «НМ-1», депонированного в Государственную Коллекцию Вирусов (ГКВ) №2476, путем накопления вируса в культуре клеток Hela, концентрирования его методом дифференциального центрифугирования.

В состав предлагаемой тест-системы на основе ИФА входят:

1. Планшет для иммуноферментного анализа с адсорбированным в лунках антигеном, в качестве антигена штамм метапневмовируса ГКВ №2476;

2. Положительный контроль - сыворотки крови человека, содержащие антитела к IgM и IgG к метапневмовирусу;

3. Отрицательный контроль, сыворотка крови человека, не содержащая антитела к метапневмовирусу;

4. Конъюгат, содержащий 20-кратный концентрат моноклональных антител к IgM или IgG человека, конъюгированных с пероксидазой хрена;

5. Раствор хромогена, содержащий 0,4% раствор тетраметилбензидина (ТМБ)

6. Раствор субстрата, содержащий 0,05 М цитратно-фосфатный буфер (рН 5,0) с раствором перекиси водорода (0,015%).

7. Стоп-реагент;

8. Карбонатно-бикарбонатный буфер 0,05 М раствор (рН 9,25);

9. Буфер для отмывки, содержащий фосфатно-солевой буфер 0,02 М (ФСБ) с 0,1% раствор твин-20;

10. Блокирующий буфер, содержащий 2% раствор бычьего сывороточного альбумина в ФСБ;

11. Буфер для разведения сыворотки, содержащий 1% раствор бычьего сывороточного альбумина в ФСБ.

Тест-систему хранят при температуре от 2°С до 8°С и относительной влажности не более 80%. Замораживание реагентов набора не допускается.

Статистический анализ проводят с применением программного обеспечения (ПО) Microsoft Excel, используя критерий Стьюдента.

Предлагаемая тест-система применима для анализа титра антител в сыворотках крови человека.

Для более полной иллюстрации настоящего изобретения ниже приводятся примеры. Однако эти примеры не должны рассматриваться как некое ограничение объема настоящего изобретения во всех отношениях.

Пример 1. Выявление методом ИФА антител IgM или IgG и определение их титра к метапневмовирусу разработанной тест-системой.

Для получения антигенов вируса использован штамм метапневмовируса ГКВ №2476. Штамм вирулентный, предназначен для проведения научно-исследовательских работ и приготовления диагностических тест-систем. Штамм не контаминирован бактериальной микрофлорой, посторонними вирусами. Титр вируса 10⁵ ТЦД₅₀/мл. Штамм обладает высокой биологической, антигенной и иммуногенной активностью, отличается высокой продуктивностью в чувствительных биологических системах культивирования. Вирус был накоплен в культуре клеток Hela, концентрирован методом дифференциального центрифугирования. Пермиссивными клетками для метапневмовируса также являются А549, Нер-2 и LLC-MK2.

- для получения сорбирующего специфического антигена метапневмовируса в лунки планшета («CORNING9018», США) вносят метапневмовирус в концентрации 5,0 мкг/мл по 100,0 мкл в карбонатно-бикарбонатном буфере;

- инкубацию проводят в течение 16 часов при 4°С;

- по стандартной процедуре промывают лунки планшета не менее 3 раз буфером для отмывки;

- вносят блокирующий буфер («ПанЭко», Австралия);

- инкубацию проводят при комнатной температуре в течение 1 часа;

- по стандартной процедуре промывают лунки планшета не менее 3 раз буфером для отмывки;

- для иммуноферментного анализа в лунки планшета вносят положительный контроль, отрицательный контроль, а также серии 2-кратных разведений испытуемых образцов сывороток крови человека;

- инкубацию проводят в течение 2 часов при температуре 37°С в термостатируемом шейкере с интенсивностью перемешивания 700 об/мин;

- по стандартной процедуре промывают лунки планшета не менее 3 раз буфером для отмывки;

- вносят конъюгат моноклональных антител к IgM или IgG человека с пероксидазой хрена в разведении 1:2000 («АО Вектор-Бест», Новосибирск);

- инкубацию проводят 60 мин при 37°С;

- по стандартной процедуре промывают лунки планшета не менее 3 раз буфером для отмывки;

- затем вносят хромоген-субстратный раствор;

- последующую инкубацию проводят в защищенном от света месте 20 мин при температуре от 18°С до 25°С;

- в лунки планшета вносят стоп-реагент («АО Вектор-Бест», Новосибирск);

- измерение оптической плотности (ОП) проводят при длине волны 450 нм против 630 нм на фотометре iMark («BIO-RAD», Япония).

- проводят анализ результатов.

ОП в лунках с отрицательным контрольным образцом рассчитывается по среднему арифметическому значению (ОПср.К^-).

Среднее значение ОП в лунках с К^- не должно превышать 0,20 единиц оптической плотности (ед. ОП) при использовании двухволнового режима измерения и не превышать 0,25 ед. ОП при измерении на одной волне волны.

Значения ОП в лунке с положительным контролем (К⁺) должно быть не менее, чем 0,80 ед. ОП.

На основании полученных данных вычисляем критическое значение оптической плотности (ОПкрит.).

ОПкрит.=ОПср.К^-+0,3

Результат анализа считается положительным, если ОПобр.>ОПкрит.

Результат анализа считается отрицательным, если ОПобр.<0,8×ОПкрит.,

где ОПобр. - средняя арифметическая оптическая плотность трех лунок с анализируемым образцом сыворотки.

Пример 2. Выявление антител IgG и определение их титра к метапневмовирусу в сыворотках взрослых пациентов предлагаемой тест-системой.

С помощью тест-системы исследованы 140 образцов сывороток взрослых пациентов, полученных до пандемии COVID-19, методом ИФА на антитела IgG к метапневмовирусу. Статистический анализ проводили с применением ПО Microsoft Excel, используя критерий Стьюдента.

При исследовании уровня антител IgG в группе установлено, что в титре 1:400 положительных образцов составило 20,7±3,4% (29 образцов). Высокие титры 1:800 и 1:1600 выявлены в 28,6±3,8% (40 образцов) и 26,4±3,7% (37 образцов), соответственно. В титре 1:200 процент был невысоким 6,4±2,1% (9 образцов). Отрицательных сывороток, не содержащих антитела к метапневмовирусу, идентифицировано 17,9±3,2% (25 образцов). Результаты представлены на фиг. 1.

Пример 3. Выявление антител IgG и определение их титра к метапневмовирусу в сыворотках детей предлагаемой тест-системой.

Исследование антител IgG к метапневмовирусу у детей с диагнозом острые респираторные вирусные инфекции проводили предлагаемой тест-системой. Уровень антител IgG в группе детей возраста от 2 до 13 лет в количестве 134 сывороток исследовали во время пандемии COVID-19. Сыворотки отрицательны на антитела к COVID-19. Статистический анализ проводили с применением ПО Microsoft Excel, используя критерий Стьюдента.

Обнаружено, что в титре 1:200 и 1:400 положительных образцов к метапневмовирусу 17,2±4,3% (23 образца) и 26,9±5,0% (36 образцов), соответственно. В титре 1:800 выявлено 16,4±4,3% (22 образца). Самое меньшее количество положительных сывороток идентифицировано в титре 1:1600, что составило 8,9±3,4% (12 образцов), при этом отрицательных образцов 30,6±5,1% (41 образец). Результаты представлены на фиг. 2.

Пример 4. Выявление антител IgG и определение их титра к метапневмовирусу у взрослых пациентов, переболевших COVID-19, предлагаемой тест-системой.

С помощью тест-системы исследованы 23 образца сывороток крови взрослых пациентов на антитела IgG к метапневмовирусу. Статистический анализ проводили с применением ПО Microsoft Excel, используя критерий Стьюдента.

Результаты серологического исследования показали, что достаточно высокий процент сывороток с содержанием антител к метапневмовирусу определяли в титре 1:100, что составило 39,1±10,2% (9 образцов), с титром 1:200 выявлено 26,1±4,4% (6 образцов). Сывороток отрицательных на антитела определено 34,8±9,9% (8 образцов). Результаты показаны на фиг. 3.

Пример 5. Выявление антител IgG и определение их титра к метапневмовирусу у беременных пациенток предлагаемой тест-системой.

С помощью тест-системы исследованы образцы сывороток 101 беременной пациентки в возрасте 20-25 лет. Статистический анализ проводили с применением ПО Microsoft Excel, используя критерий Стьюдента.

Определение антител к метапневмовирусу показало высокий уровень положительных сывороток 1:400, что составило 27,7±4,4% (28 образцов), в титрах 1:200 и 1:800 выявлен одинаковый процент 14,9±3,5% (по 15 образцов), минимальное количество образцов с титром 1:1600 определено в 3,0±1,6% (3 образца), сывороток отрицательных на антитела IgG 39,6±4,9% (40 образцов). Результаты представлены на фиг. 4.

Пример 6. Выявление антител IgM и определение их титра к метапневмовирусу в сыворотках детей предлагаемой тест-системой.

С помощью тест системы исследованы образцы сывороток госпитализированных детей с ОРВИ на антитела IgM к метапневмовирусу. Статистический анализ проводили с применением ПО Microsoft Excel, используя критерий Стьюдента.

При исследовании уровня антител IgM в 112 сыворотках обнаружено, что в титре 1:100 и 1:400 положительных образцов к метапневмовирусу по 8,9±2,7% (по 10 образцов). В титре 1: 200 выявлено 15,2±3,4% (17 образцов). Самое меньшее количество положительных сывороток идентифицировано в титре 1:800, что составило7,1±2,4% (8 образцов). При этом отрицательных образцов 59,8±4,6% (67 образцов). Результаты представлены на фиг. 5.

Пример 7. Выявление антител IgM и определение их титра к метапневмовирусу у беременных пациенток предлагаемой тест-системой.

Предлагаемой тест-системой исследованы образцы 124 сывороток крови беременных пациенток с признаками ОРВИ на антитела IgM к метапневмовирусу. Статистический анализ проводили с применением ПО Microsoft Excel, используя критерий Стьюдента.

Результаты серологического исследования показали, что достаточно высокий процент сывороток с содержанием антител IgM к метапневмовирусу определяли в титре 1:400, что составило 21,8±3,7% (27 образцов), с титром 1:200 определено 19,4±3,6% (24 образца). В титре 1:800 выявлено 8,9±2,6% (11 образцов), минимальное количество образцов с титром 1:1600 определено в 6,5±2,2% (8 образцов). Отрицательных сывороток составило 43,5±4,5% (54 образца). Антитела в титре 1:100 в образцах выявлено не было. Результаты показаны на фиг. 6.

Таким образом, создана тест-система для иммуноферментного анализа сыворотки крови человека, основанная на применении штамма метапневмовируса «НМ-1», зарегистрированного в ГКВ №2476 в качестве специфического антигена, накопленного в культуре клеток Hela и концентрированного методом дифференциального центрифугирования пригодна для выявления антител IgM и IgG и определения их титра к метапневмовирусу. С помощью сконструированной тест-системы при серодиагностике метапневмовируса у пациентов можно определить достоверный прирост титров IgM и IgG и уровень неиммунных лиц.

Разработка может быть успешно использована практическими врачами, лаборантами лечебных учреждений, особенно в условиях невозможности ПЦР-диагностики и для подтверждения перенесенной инфекции метапневмовирусом.

Библиография:

1. Esposito S., Mastrolia M.V. Metapneumovirus Infections and Respiratory Complications. Semin Respir Crit Care Med. 2016; 37(4): 512-521. Doi: 10.1055/s-0036-1584800.

2. Козулина И.С., Самсыгина Г.А., Исаева Е.И. Метапневмовирус - один из лидирующих вирусов, вызывающих респираторные заболевания у детей. Педиатрия. 2011. Том 90. №2.

3. Isaeva EI, Nebol'sin VE, Kozulina IS, Morozova OV. In vitro investigation of the antiviral activity of Ingavirin against human metapneumovirus. Vopr Virusol. 2012; 57(1): 34-38. PMID: 22624471.

4. Walker C.L., Rudan I., Liu L. et al. Global burden of childhood pneumonia and diarrhoea. Lancet. 2013; 381 (9875): 1405-1416.

5. Osterback R., Peltola V., Jartti Т., Vainionpaa R.. Human metapneumovirus infections in children. Emerg Infect Dis. 2008; 14(1): 101-106.

6. Gaunt E., McWilliam - Leitch E.C., Templeton K., Simmonds P. Incidence, molecular epidemiology and clinical presentations of human metapneumovirus; assessment of its importance as a diagnostic screening target. J Clin Virol. 2009; 46(4): 318-324.

7. Qaisy L.M., Meqdam M.M., Alkhateeb A., Al - Shorman A., Al - Rousan H.O., Al - Mogbel M.S. Human metapneumovirus in Jordan: prevalence and clinical symptoms in hospitalized pediatric patients and molecular virus characterization. Diagn Microbiol Infect Dis. 2012; 74(3): 288-291.

8. Panda S., Mohakud N.K., Pena L., Kumar S. Human metapneumovirus: review of an important respiratory pathogen. Int J Infect Dis. 2014; 25: 45-52. Doi: 10.1016/j.ijid.2014.03.1394.

9. Boivin G., De Serres G., Cote S., Gilca R., Abed Y., Rochette L. Human metapneumovirus infections in hospitalized children. Emerg Infect Dis. 2003; 9: 634-640.

10. Bharaj P., Sullender W.M., Kabra S.K., Mani K., Cherian J., Tyagi V. Respiratory viral infections detected by multiplex PCR among pediatric patients with lower respiratory tract infections seen at an urban hospital in Delhi from 2005 to 2007. Virol J. 2009; 6: 89.

11. Jokela P., Piiparinen H., Luiro K., Lappalainen M. Detection of hMPV and RSV by duplex real time PCR assay in comparison with DFA. Clin Microbiol Infect. 2012; 16: 1568-1573.

12. Ebihara Т., Endo R., Ma X., Ishiguro N., Kikuta H. Detection of human metapneumovirus antigens in nasopharyngeal secretions by an immunofluorescent-antibody test. J Clin Microbiol. 2005; 43(3): 1138-41. Doi: 10.1128/JCM.43.3.1138-1141.

13. Щебляков Д.В., Есмагамбетов И.Б., Логунов Д.Ю. и др. «Способ получения штамма клеток яичника китайского хомячка, продуцента рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2, штамм клеток яичника китайского хомячка, продуцент рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2, способ получения рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2, тест-система для иммуноферментного анализа сыворотки или плазмы крови человека и ее применение» Петент RU №2723008, приоритет 19.05.2020

14. Madeley С.R., Peiris J.S. Methods in virus diagnosis: immunofluorescence revisited. J. Clin. Virol. 2002; 25: 121-134.

15. Ahluwalia, G., Embree J., McNicol P., Law В., Hammond G.W. Comparison of nasopharyngeal aspirate and nasopharyngeal swab specimens for respiratory syncytial virus diagnosis by cell culture, indirect immunofluorescence assay, and enzyme-linked immunosorbent assay. J. Clin. Microbiol. 1987; 5: 763-767.

16. Landry, M.L., Ferguson. D. Suboptimal detection of influenza virus in adults by the Directigen Flu A+B enzyme immunoassay and correlation of results with the number of antigen-positive cells detected by cytospin immunofluorescence. J. Clin. Microbiol. 2003: 41: 3407-3409.

Тест-система для определения специфических антител к метапневмовирусу в сыворотках крови детей и взрослых, основанная на непрямом варианте твердофазного ИФА, включающая: планшет для иммуноферментного анализа, содержащий в лунках адсорбированный антиген - штамм метапневмовируса ГКВ 2476; положительный контроль; отрицательный контроль; конъюгат моноклональных антител к IgM или IgG человека, конъюгированных с пероксидазой хрена; раствор хромогена; раствор субстрата; стоп-реагент; карбонатно-бикарбонатный буфер; буфер для отмывки; блокирующий буфер; буфер для разведения сыворотки.