Способ определения активности нейтрализующих антител к sars-cov-2 в сыворотке или плазме крови людей, перенесших covid-19 или привитых вакцинами для профилактики новой коронавирусной инфекции covid-19, с использованием набора реагентов для иммуноферментного анализа, содержащего рекомбинантный рецептор-связывающий домен (rbd) поверхностного гликопротеина s коронавируса sars-cov-2 и рекомбинантный человеческий рецептор асе2

Изобретение относится к области медицины и молекулярной биологии, к биотехнологии. Сущность изобретения заключается в том, что для определения нейтрализующих антител, блокирующих взаимодействие вируса с внеклеточным доменом АСЕ2 рецепторов клеток-мишеней человека в сыворотке или плазме крови реконвалесцентов и перенесших COVID-19, а также людей, вакцинированных против SARS-CoV-2, используют набор реагентов для конкурентного твердофазного иммуноферментного анализа. Исследуемый биологический образец инкубируют на иммуносорбенте, содержащем антигенные детерминанты домена RBDS1 белка SARS-CoV-2, а затем контролируют наличие нейтрализующих свойств у присоединившихся антител по их способности связываться с белками рецепторного комплекса АСЕ2 клеток человека. Изобретение расширяет арсенал тест-систем для серологической диагностики COVID-19 c целью обнаружения нейтрализующих антител в сыворотке или плазме крови людей, перенесших COVID-19 или вакцинированных против SARS-CoV-2, для определения их восприимчивости заражению этим коронавирусом. 7 н. и 4 з.п. ф-лы, 3 ил., 3 табл.

 

Изобретение относится к области медицины и молекулярной биологии, в частности, к использованию генноинженерных биотехнологий в совершенствовании тест-систем для серологической диагностики COVID-19 c целью определения активности нейтрализующих антител к SARS-CoV-2 в сыворотке или плазме крови людей, перенесших COVID-19 или привитых вакцинами для профилактики новой коронавирусной инфекции COVID-19, для определения их восприимчивости заражению этим коронавирусом.

Пандемия коронавирусного заболевания, начавшаяся в 2019 году (COVID-19), связанная с возможностью развития тяжелого острого респираторного синдрома, вызванного коронавирусом SARS-CoV-2 (Severe Acute Respiratory Syndrome-related CoronaVirus-2, SARS-CoV-2), до настоящего времени представляет собой чрезвычайную ситуацию глобального масштаба в области здравоохранения [1]. Развитие острого респираторного дистресс-синдрома при данном заболевании нередко приводит к респираторной или полиорганной недостаточности [2], а для пожилых людей с сопутствующими заболеваниями, такими как диабет, гипертония или сердечно-сосудистые заболевания, инфекция SARS-CoV-2 может привести к тяжелым и смертельным последствиям [3].

Подобно другим коронавирусам, патогенным для человека (SARS-CoV, MERS-CoV), SARS-CoV-2 представляет собой оболочечный вирус с одноцепочечной положительной (+) РНК, принадлежащий к роду β-коронавирусов в семействе Coronaviridae [4]. По своей структуре SARS-Cov-2 проявляет около 80% идентичности с SARS-CoV и использует тот же клеточный рецептор для проникновения в клетки, связывая ангиотензин-превращающий фермент 2 (ACE2) [5, 6, 7]. Основными клетками-мишенями для коронавирусов являются клетки альвеолярного эпителия, в которых после сборки вирионов происходит их миграция в составе цитоплазматических везикул к мембране клетки и выход во внеклеточное пространство путем экзоцитоза. При этом экспрессии вирусных антигенов на поверхности клетки до высвобождения из нее вирусов не происходит, поэтому антителообразование, как и развитие Т-клеточных реакций, при данном заболевании происходит относительно поздно [8].

Геном этого и других патогенных коронавирусов человека кодирует четыре основных структурных белка: шип (S), оболочка (E), мембрана (M) и нуклеокапсид (N), а также примерно 16 неструктурных белков (nsp1-16) и от пяти до восьми вспомогательных белков. Среди них белок S играет важную роль в прикреплении, слиянии, проникновении и передаче вирусов. Он состоит из N-концевой субъединицы S1, ответственной за связывание вируса с рецептором, и C-концевой субъединицы S2, ответственной за слияние вируса с клеточной мембраной [9, 10].

Субъеденица S1 включает N-концевой домен (NTD) и рецептор-связывающий домен (RBD). Во время инфекции коронавирус сначала связывается с клеткой-мишенью путем взаимодействия между вирусным S1-RBD и рецептором клеточной мембраны. Это вызывает конформационные изменения в субъединице S2, которые приводят к слиянию вируса с клеточной мембраной и его проникновению в клетку-мишень. В связи с этим RBD-специфические антитела обладают наибольшей способностью нейтрализовать коронавирус, что позволяет предположить, что RBD SARS-CoV-2 может служить важной мишенью для воздействия специфичных нейтрализующих антител (nAb) [11].

Нейтрализующими считаются антитела, которые снижают вирусную инфекционность за счет связывания с поверхностными эпитопами вирусных частиц, и тем самым блокируют проникновение вируса в инфицированную клетку [2]. Нейтрализующие антитела проявляют свои защитные свойства тремя механизмами: (1) препятствуют прикреплению вириона к рецепторам для него на клетках-мишенях организма хозяина; (2) вызывают агрегацию вирусных частиц; (3) способствуют лизису вирусных частиц через активацию системы комплемента [11].

Необходимо подчеркнуть, что нейтрализующие антитела функционально неоднородны [12]. Это обусловлено особенностями пространственной структуры S-белка коронавируса, имеющего тримерную структуру [13] и включающего три копии субъединицы S1, содержащей рецептор-связывающий домен RBD, и три копии S2. При этом домены RBD могут связывать рецептор АСЕ-2 только тогда, когда они находятся в так называемой «вверх» конформации, в противоположность стерически закрытой С-концевыми доменами S1 «вниз» конформации, которая характерна для состояния, предшествующего слиянию вируса с мембраной [14, 15, 16, 17, 18].

Антитела против SARS-CoV-2 и инфицированная плазма пациентов не давали перекрестной реакции с RBD других короновирусов, патогенных для человека (SARS-CoV, MERS-CoV), хотя имелась значительная перекрестная реактивность плазмы на тримерные шипованные (S) белки этих вирусов. Анализ кристаллической структуры таких RBD-связанных антител показал, что ингибирование взаимодействия SARS-CoV-2 с ACE2 объясняется, в первую очередь, конформационными изменениями RBD, блокирующими проникновение вируса в клетку. Эти данные свидетельствуют о том, что антитела против RBD в значительной степени являются вирус-специфичными ингибиторами [1]. Что касается механизма подобных проявлений, то они вполне могут быть связаны еще и с тем, что гликопротеин SARS-CoV-2 S содержит участок расщепления фурина на границе между S₁/S₂ субъединицами, который влияет на описанные выше процессы биогенеза этого белка и отличает вирус SARS-CoV2 от других коронавирусов [13].

В связи с указанными особенностями гетерогенность специфичности связывания антител с SARS-CoV-2, как установлено C.O.Barnes et al. [12], определяется генетическими особенностями кодирования вариабельных участков их тяжелых цепей и ассоциирована с механизмами их взаимодействия с RBD. Она предполагает выделение среди антител: (1) nAb, которые блокируют связь рецептора АСЕ2 с доменами RBD в конформации «вверх»; (2) nAb, которые блокируют ответ рецептора АСЕ2 на домены RBD одновременно в обеих конформациях - «вверх» и «вниз», запирая в последнем случае RBD в конформации «вниз» и препятствуя взаимодействию RBD c ACE2; (3) nAb, которые распознают домены RBD в обеих конформациях, но не влияют на их взаимодействие с АСЕ2; (4) антитела, которые не блокируют взаимодействие RBD и ACE2 и не относятся к категории нейтрализующих.

С точки зрения лечебно-профилактического применения антител при COVID-19 наибольший интерес представляют нейтрализующие антитела второй группы. С диагностической точки зрения для оценки восприимчивости человека к COVID-19 имело бы значение определение активности первых трех категорий антител, собственно, и характеризующихся как нейтрализующие антитела.

Такое диагностическое направление серодиагностики очень важно по той причине, что основной его задачей является не оценка уровня ответной гуморальной реакции на развитие COVID-19 в целом, а определение степени восприимчивости человека к повторному заражению путем определения активности нейтрализующих антител, что особенно важно с позиций подхода к этому заболеванию как источнику возникновения пандемии.

В этой ситуации важно оценить наличие нейтрализующих антител не только у людей, перенесших эту инфекцию в бессимптомной или манифестной форме, но и у вакцинированной части населения. В последнем случае необходимо учитывать, что основным компонентом вакцины, доставляемой в организм в молекулярной форме или с помощью так называемых псевдовирусов (не являющихся коронавирусами), служит S-белок SARS-CoV-2, при этом гуморальный иммунный ответ с участием нейтрализующих антител достигает пика через 28 дней после вакцинации [18]. Согласно данным литературы [19], если в анализируемом образце активность к SARS-CoV-2 менее 400 IU/ml, то этого недостаточно для защиты организма от коронавируса SARS-CoV-2 и пациенту показана вакцинация/ревакцинация.

Поиск аналогов изобретения показал, что в настоящее время сформировалась некоторая мировая база данных, сориентированная не на оценку уровня антител разных классов к RBD SARS-CoV-2 в сыворотке больных или реконвалесцентов, а именно антител с нейтрализующими свойствами методом иммуноферментного анализа, содержащая описание тест-систем для этой цели и способов получения основных реагентов.

Так, известна тест-система для иммуноферментного анализа (ИФА), основным компонентом которой служили эпитопы рецептор-связывающего домена (RBD) поверхностного гликопротеина S коронавируса SARS-CoV-2, распознаваемые В-лимфоцитами (но не Т-клетками), что значительно повышало специфичность выявляемых с их помощью антител именно к SARS-CoV-2 (заявка на патент CN112213497(A), G01N33/6854 опубл. 2021-01-12 [20]). Этот способ, как и набор для ИФА, по данным авторов, был особенно эффективен для выявления антител в период реконвалесценции.

Еще одна разработка, появившаяся примерно в то же время (заявка на патент CN112794884 (A), C07K14/005, опубл. 2021-05-14 [21]), была конкретно нацелена на выявление нейтрализующих антител тоже с использованием оригинальной тест-системы для иммуноферментного анализа. Особенностью этого способа было получение на основе RBD SARS-CoV2 рекомбинантного белка димерной структуры, использование которого значительно повышало специфичность метода по выявлению нейтрализующих антител у реконвалесцентов и вакцинированных лиц.

Учитывая значение способа получения рекомбинантных белков, целесообразно отметить, что в отечественной патентной литературе известен способ получения рекомбинантного белка RBD в клетках млекопитающих и его использование в тест-системе для иммуноферментного анализа по обнаружению антител (патент РФ 2723008, C07K1/16, опубл. 08.06.2020 г.[22]).

Описан и другой способ получения рекомбинантного RBD, значительно увеличивающий экспрессию целевого белка, путем использования протокола на базе клеточной линии эмбриональной почки человека HEK293-SARS-COV2-RBD (заявка на патент CN112375741 (A), C12N5/0686, опубл. от 2021-02-19 [23]). Обоснование наиболее оптимального протокола с использованием клеточной линии Freestyle HEK 293F представлено в публикации N. Portolano et al. [24].

Все представленные изобретения и публикации, предназначенные для определения нейтрализующих антител к вирусу SARS-CoV-2, не могут служить аналогами данного изобретения, поскольку предусматривали использование в составе тест-систем одного основного реагента на основе белка RBD данного вируса, что оставляло сомнения в выявлении только таких антител, которые могли бы полностью блокировать поступление вируса в клетку-мишень.

Аналогом настоящего изобретения может служить тест-система, предназначенная для выявления антител к коронавирусу методом твердофазного иммуноферментного анализа и основанная на конкурентном использовании белков RBD и АСЕ2. Эта тест-система была разработана в Сингапуре (заявка на патент EP3800473 (A1), G01N33/6854, опубл. 2021-04-07 [25]), однако она была создана на основе белка RBD SARS-CoV, а не SARS-CoV-2, и была предназначена для низкоспецифичного выявления нейтрализующих антител к суррогатным вирусам с широким охватом вариантов постановки теста.

Технической проблемой, решаемой настоящим изобретением, является создание такой тест-системы для конкурентного твердофазного иммуноферментного анализа, которая способствовала бы выявлению антител, препятствующих образованию комплекса рецептор-связывающего домена (RBD) поверхностного гликопротеина S коронавируса SARS-CoV-2 (с учетом специфичных для него конформационных изменений) с человеческим рецептором ACE2, то есть нейтрализующих антител, в сыворотке или плазме крови людей, перенесших COVID-19 в бессимптомной или манифестной форме, а также у людей, вакцинированных против SARS-CoV-2.

Для решения заявленной технической проблемы и получения технического результата предлагаются следующие генетические конструкции:

а) Генетическая конструкция pFUSE-RBD-6his на основе экспрессионного вектора pFUSE-CHIg-hG1, содержащая следующие генетические элементы:

- точку начала репликации плазмид (ori);

- последовательность гена BleoR, продукт которого обеспечивает устойчивость клетки к антибиотику зеоцин под контролем корового промотора легкой цепи ферритина (hFerL promoter) и энхансера раннего гена 1 цитомегаловируса человека (CMV enchancer);

- последовательности сигналов полиаденилирования бета-глобина человека (β-globin poly(A)) и вируса макаки SV40 poly(A);

- промоторную последовательность фактора элонгации 1(человека (EF-1(core promoter);

- укороченную последовательность длинных концевых повторов типа1 вируса лейкемии Т-клеток человека (5' LTR truncated);

- сигнальную последовательность интерлейкина 2 человека (IL-2), отличающаяся тем, что содержит:

- нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1, кодирующую рецептор-связывающий домен (RBD) S-белка вируса SARS-CoV-2 и объединенную в единой рамке считывания с последовательностью шести гистидинов.

б) Генетическая конструкция pFUSE-ACE2-3FLAG-6his на основе экспрессионного вектора pFUSE-CHIg-hG1, содержащая следующие генетические элементы:

- точку начала репликации плазмид (ori);

- последовательность гена BleoR, продукт которого обеспечивает устойчивость клетки к антибиотику зеоцин под контролем корового промотора легкой цепи ферритина (hFerL promoter) и энхансера раннего гена 1 цитомегаловируса человека (CMV enchancer);

- последовательности сигналов полиаденилирования бета-глобина человека (β-globin poly(A)) и вируса макаки SV40 poly(A);

- промоторную последовательность фактора элонгации 1(человека (EF-1(core promoter);

- укороченную последовательность длинных концевых повторов типа1 вируса лейкемии Т-клеток человека (5' LTR truncated);

- сигнальную последовательность интерлейкина 2 человека (IL-2), отличающаяся тем, что содержит:

- нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 2, кодирующую внеклеточный домен ACE-2 человека и объединенную в единой рамке считывания с последовательностью 3FLAG эпитопа и шести гистидинов.

Предлагается рекомбинантный белок, содержащий антигенные детерминанты рецептор-связывающего домена (RBD) S-белка вируса SARS-CoV-2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 3, полученный путем трансфекции клеточной линии эмбриональной почки человека в бессывороточной среде комплексом генетической конструкции pFUSE-RBD-6his с полиэтиленимином, и инкубированием с последующим выделением целевого белка из культуральной среды.

Предлагается рекомбинантный белок, содержащий антигенные детерминанты внеклеточного домена рецептора АСЕ2 человека и имеющий аминокислотную последовательностью SEQ ID NO: 4, полученный путем трансфекции клеточной линии эмбриональной почки человека в бессывороточной среде комплексом генетической конструкции pFUSE-ACE2-3FLAG-6his с полиэтиленимином, и инкубированием с последующим выделением целевого белка из культуральной среды.

Заявлен иммуносорбент, содержащий рекомбинантный белок, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, сорбированный в лунках планшета.

Предлагается тест-система для твердофазного иммуноферментного определения активности нейтрализующих антител к вирусу SARS-CoV-2 в сыворотке или плазме крови у переболевших COVID-19 и у людей, привитых вакцинами для профилактики новой коронавирусной инфекции COVID-19, содержащая планшет с иммуносорбентом, рекомбинантный белок, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, и набор реагентов. Набор реагентов для твердофазного иммуноферментного определения активности нейтрализующих антител к вирусу SARS-CoV-2 включает положительный контроль, отрицательный контроль, раствор для промежуточного разведения образцов, раствор для разведения образцов, раствор для разведения рецептора ACE2, концентрат коньюгата, раствор для разведения конъюгата, ТМБ-хромоген, концентрат промывочного раствора, стоп-реагент.

Предлагается применение тест-системы для определения активности нейтрализующих антител к вирусу SARS-CoV-2 с использованием иммуносорбента и рекомбинантного белка, имеющего последовательность SEQ ID NO: 4. При этом на первом этапе осуществляют внесение в лунки контрольных образцов и анализируемых образцов, перемешивание, инкубирование иммуносорбента в присутствии контрольных и анализируемых образцов с последующей промывкой, инкубирование иммуносорбента в присутствии рабочего разведения белка рецептора АСЕ2 человека с последующей промывкой, инкубирование иммуносорбента в присутствии рабочего разведения конъюгата с последующей промывкой, инкубирование иммуносорбента с ТМБ-хромогеном, добавление стоп-реагента, оценка оптической плотности.

В качестве анализируемого образца используют сыворотку или плазму крови от переболевших COVID-19 и от людей, привитых вакцинами для профилактики новой коронавирусной инфекции COVID-19.

Иммуносорбент инкубируют с образцами в термостатирующем шейкере при температуре от 35°С до 39°С и постоянном встряхивании при скорости от 700 до 800 об\мин в течение 30 минут, с последующей промывкой, затем инкубируют с раствором рекомбинантного белка, по п.4 в термостатирующем шейкере при температуре от 35°С до 39°С и постоянном встряхивании при скорости от 700 до 800 об\мин в течение 30 минут, с последующей промывкой, затем инкубируют с раствором конъюгата в термостатирующем шейкере при температуре от 35°С до 39°С и постоянном встряхивании при скорости от 700 до 800 об\мин в течение 30 минут, с последующей промывкой, затем инкубируют с раствором ТМБ-хромогена при температуре от 15°С до 25(в течение 15 минут, реакцию останавливают добавлением стоп-реагента, измеряют оптическую плотность.

Таким образом, в состав разрабатываемой тест-системы для иммуноферментного анализа был введен не только рекомбинантный RBD белок коронавируса, как и в большинстве описанных к настоящему времени способах, а еще и рекомбинантный белок, имеющий последовательность SEQ ID NO: 4., являющийся внеклеточным доменом рецептора АСЕ2 человека как сайта проникновения SARS-CoV-2 в клетку, что позволило в условиях конкурентного ИФА обнаруживать в сыворотке крови человека только нейтрализующие антитела со свойством блокировать инфицирование клеток данным видом коронавируса. При этом полагалось, что домен RBD S1-белка SARS-CoV-2 в должен находиться в доступном для антител состоянии - в виде отдельной молекулы в фиксированной форме, а молекула АСЕ2 человека - в растворимой форме.

В процесс реализации технического решения по данному изобретению входили несколько этапов:

- создание генетических конструкций на основе искусственно синтезированных фрагментов ДНК, содержащих нуклеотидные последовательности фрагментов RBD SARS-CoV-2 и АСЕ2 человека с последующим их клонированием в модифицированный коммерческий экспрессионный вектор pFUSE-CHIg-hG1 (InvivoGen);

- раздельная трансфекция клеточной линии эмбриональной почки человека в бессывороточной среде (Freestyle HEK 293F) путем эндоцитоза комплекса каждой из созданных генетических конструкций с полиэтиленимином (PEI) и последующим получением целевых рекомбинантных белков;

- получение растворов, содержащих один из очищенных рекомбинантных ACE2 и RBD белков, и сорбирование рекомбинантного белка RBD SARS-CoV-2 в лунках разборного полистиролового планшета;

- формирование набора реагентов для выявления активности нейтрализующих антител к SARS-CoV-2 в сыворотке или плазме крови человека методом конкурентного твердофазного иммуноферментного анализа;

- разработка на основе сформированного набора способа определения активности нейтрализующих антител в сыворотке или плазме крови людей, перенесших COVID-19 или вакцинировнных против SARS-CoV-2.

Заявленные изобретения ллюстрируется следующими фигурами:

Фиг.1. Схема экспрессионной генетической конструкции pFUSE-ACE2-3FLAG-6his

Фиг.2. Схема экспрессионной генетической конструкции pFUSE-RBD-6his

Фиг.3. Графики корреляции данных количественного определения активности нейтрализующих антител к SARS-CoV-2, полученных референтным методом, с данными, полученными испытуемым набором реагентов «SARS-CoV-2 Нейтрализация количественный ИФА ИБХ РАН» серия №053-02 (А) серия №053-02 (Б).

Создание генетической конструкции pFUSE-ACE2-3FLAG-6his для экспрессии внеклеточного домена ACE2 человека.

Коммерческий экспрессионный вектор pFUSE-CHIg-hG1 (InvivoGen) был модифицирован следующим образом. Синтетическая нуклеотидная последовательность, кодирующая 3FLAG эпитоп и шесть гистидинов, была клонирована по сайтам EcoRV и NheI в экспрессионный вектор pFUSE-CHIg-hG1 с элиминацией фрагмента, кодирующего константный регион IgG1 тяжелой цепи человека с получением модифицированного вектора pFUSE-3FLAG-6his. Нуклеотидную последовательность белка внеклеточного домена ACE-2 человека амплифицировали методом от-ПЦР с кДНК клеточной культуры HEPG2 человека и клонировали в модифицированный вектор pFUSE-3FLAG-6his по сайтам эндонуклеаз рестрикции EcoRI и NheI в состав единой рамки считывания с нуклеотидными последовательностями: сигнальной последовательностью интерлейкина 2 человека (IL-2) на 5'-конце и последовательностями 3FLAG эпитопа и шести гистидинов на 3'-конце с получением экспрессионного вектора pFUSE-ACE2-3FLAG-6his.

Создание генетической конструкции pFUSE-RBD-6his для экспрессии рецепторсвязывающего домена (RBD) S-белка вируса SARS-CoV-2.

Коммерческий экспрессионный вектор pFUSE-CHIg-hG1 (InvivoGen) был модифицирован следующим образом. Синтетическая нуклеотидная последовательность, кодирующая шесть гистидинов, была клонирована в экспрессионный вектор pFUSE-CHIg-hG1 по сайтам EcoRV и NheI с элиминацией фрагмента, кодирующего константный регион IgG1 тяжелой цепи человека с получением модифицированного вектора pFUSE-6his. Синтетическую нуклеотидную последовательность рецепторсвязывающего домена (RBD) S-белка вируса SARS-CoV-2 клонировали в модифицированный вектор pFUSE-6his по сайтам эндонуклеаз рестрикции EcoRI и NheI в состав единой рамки считывания с нуклеотидными последовательностями: сигнальной последовательностью интерлейкина 2 человека (IL-2) на 5'-конце и последовательностью шести гистидинов на 3'-конце с получением экспрессионного вектора pFUSE-RBD-6his.

Полученные таким образом генетические конструкции pFUSE-ACE2-3FLAG-6his (фиг.1) и pFUSE-RBD-6his (фиг.2) содержат общие генетические элементы, идентичные таковым коммерческой плазмидной ДНК pFUSE-CHIg-hG1 (InvivoGen):

- точку начала репликации плазмид (ori);

- последовательность гена BleoR, продукт которого обеспечивает устойчивость клетки к антибиотику зеоцин под контролем корового промотора легкой цепи ферритина (hFerL promoter) и энхансера раннего гена 1 цитомегаловируса человека (CMV enchancer);

- последовательности сигналов полиаденилирования бета-глобина человека (β-globin poly(A)) и вируса макаки SV40 poly(A);

- промоторную последовательность фактора элонгации 1(человека (EF-1(core promoter);

- укороченную последовательность длинных концевых повторов типа 1 вируса лейкемии Т-клеток человека (5' LTR truncated);

- сигнальную последовательность интерлейкина 2 человека (IL-2).

Дополнительно генетическая конструкция pFUSE-ACE2-3FLAG-6his содержит:

- нуклеотидную последовательность, кодирующую внеклеточный домен ACE-2 человека и объединенную в единой рамке считывания с последовательностью 3FLAG эпитопа и шести гистидинов.

Дополнительно генетическая конструкця pFUSE-RBD-6his содержит:

- нуклеотидную последовательность, кодирующую рецептор-связывающий домен (RBD) S-белка вируса SARS-CoV-2 и объединенную в единой рамке считывания с последовательностью шести гистидинов.

Получение рекомбинантных белков ACE2 и RBD.

Трансфекцию клеточной линии HEK293F проводили стандартным способом. Клеточную культуру HEK293F в день трансфекции рассевали до концентрации 1 млн/мл в объем 30 мл в колбу Эрленмейера 125 мл. Для трансфекции 30 мкг плазмидной ДНК pFUSE-ACE2-3FLAG-6his или pFUSE-RBD-6his смешивали с 1 мл бессывороточной среды OPTIMEM (Gibco). В отдельной пробирке 60 мкл трансфецирующего агента полиэтиленимина (PEI) до конечной концентрации 9 мкг/мл смешивали с 1 мл бессывороточной среды OPTIMEM. Далее растворы плазмидной ДНК и PEI объединяли и инкубировали в течение 30 минут при комнатной температуре в отсутствие света. Затем трансфецирующую смесь выливали в колбу с заранее подготовленной клеточной культурой. Экспрессия рекомбинантных белков происходила в течение последующих 5-7 дней в зависимости от состояния и жизнеспособности клеточной культуры (не ниже 60% живых клеток).

Очистка и получение рекомбинантного RBD, сорбированного в лунках разборного полистиролового планшета, и рекомбинантного человеческого рецептора ACE2 в растворе.

По окончании экспрессии культуральную среду осветляли последовательными центрифугированиями 100 об/мин и 1200 об/мин, супернатант фильтровали через фильтр с размером пор 0,22 мкм и таким образом получали растворы, содержащие один из рекомбинантных белков ACE2 или RBD. Колонку, содержащую сорбент NiNTA уравновешивали буфером нанесения (50 мМ Трис-HCl, рН 8.0), наносили раствор, содержащий один из рекомбинантных белков ACE2 или RBD. Колонку промывали 20 объемами буфера нанесения, связавшийся белок элюировали буфером для элюции (50 мМ Трис-HCl, 300 мМ имидазол рН 8.0) и переводили в солевой фосфатный буфер (8.0 г/л NaCl, 0.2 г/л KCl, 1.44 г/л Na₂HPO₄, 0.24 г/л KH₂PO₄, рН 7.2.) методом диализа. Таким образом, получали растворы, содержащие один из очищенных рекомбинантных ACE2 и RBD.

Полученный очищенный рекомбинантный белок RBD вносили в солевой фосфатный буфер (8.0 г/л NaCl, 0.2 г/л KCl, 1.44 г/л Na₂HPO₄, 0.24 г/л KH₂PO₄, рН 7.2.), в количестве, соответствующем конечной концентрации 1 мкг нг/мл. По 100 мкл полученного раствора вносили в лунки разборных стандартных плоскодонных 96-луночных планшетов («Nunc maxisorb», Дания) и инкубировали при 4°С 16 часов без перемешивания. По окончании инкубации удаляли раствор из лунок, вносили по 150 мкл блокирующего раствора (2.83 г/л натрия фосфорнокислого двузамещенного 12-ти водного, 0.34 г/л натрия фосфорнокислого однозамещенного 2-х водного, 0,05% Tween-20, 50 г/л сахароза, 1 г/л бычий сывороточный альбумин). Планшеты инкубировали 1 час при комнатной температуре без перемешивания. По окончании инкубации удаляли блокирующий раствор и высушивали досуха при комнатной температуре. Полученный планшет хранили при температуре+(2-8)°С в течение 12 месяцев и использовали для тестирования согласно инструкции.

Конечный раствор ACE2 готовили из концентрированного стока (3 мг/мл) разведением в стабилизирующем буфере (1,44 г/л Na₂HPO₄, 0,24 г/л KH₂PO₄, 8,0 г/л NaCl, 2 г/л бычьего сывороточного альбумина, 75 г/л сахарозы, 1 мл/л Proclin 300, 0,5 г/л фенола, 50 мг/л гентамицина, рН 7,2) до концентрации 0,2 мкг/мл.

Формирование тест-системы для иммуноферментного определения активности нейтрализующих антител к SARS-CoV-2 в сыворотке или плазме крови человека «SARS-CoV-2 Нейтрализация количественный ИФА ИБХ РАН».

В состав тест-системы входят следующие компоненты:

- иммуносорбент - 96-луночный планшет из бесцветного полистирола, с плоским дном, разборный, в лунках которого сорбирован рекомбинантный рецептор-связывающий домен (RBD) поверхностного гликопротеина S коронавируса SARS-CoV-2 - 2 шт.;

- отрицательный контроль (К-), не содержащий антитела к коронавирусу SARS-CoV-2, инактивированный - прозрачная жидкость светло-желтого цвета, слегка опалесцирующая, во флаконе - 1 (3 мл;

- положительный контроль (К+), содержащий нейтрализующие антитела к коронавирусу SARS-CoV-2, инактивированный - прозрачная жидкость розового цвета, слегка опалесцирующая, во флаконе - 1 (3 мл;

- раствор для промежуточного разведения образцов (РПРО) - прозрачная жидкость фиолетового цвета, слегка опалесцирующая, во флаконе - 1 (30 мл;

- раствор для разведения образцов (РРО) - прозрачная бесцветная жидкость, слегка опалесцирующая, во флаконе - 1 (25 мл;

- раствор для разведения рецептора ACE2 (РРА) - прозрачная жидкость красного цвета, слегка опалесцирующая, во флаконе - 1 (25 мл;

- концентрат рецептора ACE2 (ACE2 (×11)) - прозрачная бесцветная жидкость, слегка опалесцирующая, во флаконе - 1 (2,5 мл;

- концентрат конъюгата (Кг (×11)) - прозрачная бесцветная жидкость, слегка опалесцирующая, во флаконе - 1 (2,5 мл;

- раствор для разведения конъюгата (РРК) - прозрачная жидкость синего цвета, слегка опалесцирующая, во флаконе - 1 (25 мл;

- ТМБ-хромоген - прозрачная бесцветная жидкость, во флаконе - 1 (25 мл;

- концентрат промывочного раствора, 25-кратный (КПР(×25)) - бесцветная опалесцирующая жидкость, во флаконе - 1 (50 мл;

- стоп-реагент - прозрачная бесцветная жидкость, во флаконе- 1 (25 мл;

- пленка для заклеивания иммуносорбента - 8 шт.;

- одноразовые ванночки для реагентов - 8 шт.;

- одноразовые сменные наконечники к дозаторам пипеточным (10-300 мкл) - 64 шт.;

- планшет для разведения образцов - 96-луночный планшет из бесцветного полистирола, с плоским дном - 2 шт.;

- калибровочный график - 1 шт.;

- инструкция по применению набора реагентов - 1 шт.

Тест-система «SARS-CoV-2 Нейтрализация количественный ИФА ИБХ РАН» рассчитана на проведение 192 определений, включая контрольные.

Тест-система предназначена для ручной постановки и для постановки на автоматических анализаторах для иммуноферментного анализа открытого типа с возможностью как дробного использования планшета (набора), так и использования для постановки целого планшета (набора).

Способ определения нейтрализующих антител к SARS-CoV-2 в сыворотке или плазме крови человека с использованием набора реагентов «SARS-CoV-2 Нейтрализация количественный ИФА ИБХ РАН» с использованием тест-системы.

Принцип способа. Способ основан на выявлении активности нейтрализующих антител к SARS-CoV-2 с использованием конкурентного твердофазного иммуноферментного анализа. На первой стадии инкубации исследуемого образца сыворотки или плазмы крови с иммуносорбентом происходит взаимодействие нейтрализующих антител к SARS-CoV-2 (при их наличии в исследуемом образце) с сорбированным на поверхности лунок планшета RBD. На второй стадии инкубации происходит взаимодействие RBD с рекомбинантным человеческим рецептором ACE2. Если исследуемый образец не содержит нейтрализующие антитела к SARS-CoV-2, то происходит образование комплекса «RBD-ACE2». Если исследуемый образец содержит нейтрализующие антитела к SARS-CoV-2, то комплекс «RBD-ACE2» образуется частично или не образуется. На третьей стадии инкубации, образовавшийся комплекс «RBD-ACE2» выявляют с помощью иммуноферментного конъюгата. Визуализация результата происходит при добавлении к комплексу «RBD-ACE2-конъюгат» рабочего раствора хромогена. Пероксидазную реакцию останавливают, добавляя стоп-реагент, и измеряют на фотометре вертикального сканирования оптическую плотность в лунках при двух длинах волн: основной 450 нм и референс-фильтр 620-700 нм, которая обратно пропорциональна активности нейтрализующих антител к SARS-CoV-2 в исследуемых образцах сыворотки или плазмы крови.

Количественное определение активности нейтрализующих антител к SARS-CoV-2 выражается в IU/мл - международных единицах активности нейтрализующих антител к SARS-CoV-2, относительно стандарта «First WHO International Standard for anti-SARS-CoV-2 immunoglobulin (human)», NIBSC code: 20/136 - первый международный стандарт ВОЗ.

Выполнение способа обнаружения нейтрализующих антител в клинических условиях проводилось с использованием спектрофотометра "Лазурит" (Dynex, США), тест-системы для ИФА, являющейся предметом данного изобретения, и испытуемых образцов сывороток или плазмы крови человека.

Тест-систему и анализируемые образцы сывороток крови человека выдерживали не менее 30 минут при комнатной температуре+(18-25)°C до начала проведения анализа. Неизрасходованные компоненты хранили при температуре+(2-8)°С в течение срока годности.

Подготовительные манипуляции включали приготовление необходимого числа стрипов иммуносорбента, а также промывочного раствора, положительного и отрицательного контролей, раствора для предварительного разведения образцов (РПРО), растворы для разведения образцов (РРО), рецептора (РРА), конъюгата (РРК), рабочих растворов разведения рецептора АСЕ2, конъюгата, ТМБ-хромогена, стоп-реагента в соответствии с инструкцией по применению набора.

Для получения разведения анализируемых образцов 1:5 в лунки планшета для разведения образцов вносили по 80 мкл раствора для предварительного разведения образцов (РПРО), в эти же лунки вносили по 20 мкл анализируемых образцов. Содержимое лунок перемешивали пипетированием.

Выполнение способа начинали с внесения контрольных образцов: в лунку А1 - 100 мкл положительного контроля (К+); в лунки B1- C1 - по 100 мкл отрицательного контроля (К-); в остальные лунки - по 90 мкл раствора для разведения образцов (РРО) и по 10 мкл анализируемых образцов. Содержимое лунок перемешивали пипетированием.

Иммуносорбент заклеивали клейкой пленкой и инкубировали в термостатирующем шейкере при температуре+(37±2)°С и постоянном встряхивании 700-800 об/мин в течение 30 минут.По окончании инкубации лунки планшета промывали 5 раз с использованием вошера.

Во все лунки вносили по 100 мкл рабочего разведения ACE2. Иммуносорбент заклеивали клейкой пленкой и инкубировали в термостатирующем шейкере при температуре+(37±2)°С и постоянном встряхивании 700-800 об/мин в течение 30 минут.По окончании инкубации лунки планшета промывали 5 раз с использованием вошера.

Во все лунки вносили по 100 мкл рабочего разведения конъюгата. Иммуносорбент заклеивали клейкой пленкой и инкубировали в термостатирующем шейкере при температуре+(37±2)°С и постоянном встряхивании 700-800 об/мин в течение 30 минут.По окончании инкубации лунки планшета промывали 5 раз с использованием вошера.

Во все лунки вносили по 100 мкл раствора ТМБ-хромогена. Иммуносорбент заклеивали новой клейкой пленкой, помещали в защищенное от света место и инкубировали при температуре+(20±5)°С в течение 15 минут.

В лунки вносили по 100 мкл стоп-реагента для остановки цветной реакции. Не более чем через 15 минут после остановки цветной реакции на фотометре вертикального сканирования оптическую плотность в лунках при двух длинах волн: основной 450 нм и референс-фильтр 620-700 нм. Допускается измерение при одной длине волны с фильтром 450 нм. Выведение спектрофотометра на нулевой уровень («бланк») осуществляется по воздуху.

Результаты анализа учитывали только при соблюдении следующих условий: значения ОПК- в лунках с отрицательным контролем (К-) должны быть не менее 1,2 оптических единиц; значения ОПК+в лунках с положительным контролем (К+) должны быть в пределах, указанных в аналитическом паспорте.

Далее рассчитывали среднее арифметическое значение оптической плотности (ОПК+_ср.) в лунках с положительным (К+) контролем и поправочный коэффициент (ПК) для анализируемых образцов используя следующую формулу:

ПК=ОПА - ОПК+_ср.,

где ОПА - величина оптической плотности, указанная в аналитическом паспорте; ОПК+_ср. - среднее арифметическое значение оптической плотности в лунках с положительным контролем (К+).

Определяли приведенную оптическую плотность анализируемых образцов (ПОП_обр.), используя следующую формулу:

ПОП_обр.=ОП_обр.+ПК,

где ОП_обр. значение оптической плотности анализируемого образца, ПК - поправочный коэффициент.

Для количественного определения активности нейтрализующих антител к SARS-CoV-2 в исследуемых образцах использовали приложенный к набору реагентов калибровочный график. Значение активности нейтрализующих антител к SARS-CoV-2 при этом умножали на фактор разведения, равный 50.

Аналитическая чувствительность набора реагентов составляет 4 IU/мл, пределы количественного определения набора реагентов - от 4 IU/мл до 60 IU/мл. Пределы количественного определения набора реагентов с учетом фактора разведения анализируемых образцов (х50), - от 200 IU/мл до 3000 IU/мл.

Точка отсечения. Согласно данным литературы, если в анализируемом образце уровень вируснейтрализующих антител (ВНА) к вирусу SARS-CoV-2 в реакции нейтрализации in vitro классическим методом (метод сравнения) [26] составляет величину менее 40 ВНА (разведение 1:40), то этого недостаточно для защиты организма от коронавируса SARS-CoV-2 [27]. Валидация набора реагентов «SARS-CoV-2 Нейтрализация количественный ИФА ИБХ РАН», серия 053-03 при помощи метода сравнения показывает, что эта величина соответствует 400 IU/мл. Таким образом, если в анализируемом образце активность нейтрализующих антител к SARS-CoV-2 составляет величину менее 400 IU/мл, то этого недостаточно для защиты организма».

Примером использования настоящего изобретения служили клинико-лабораторные испытания способа определения активности нейтрализующих антител к SARS-CoV-2 с использованием набора «SARS-CoV-2 Нейтрализация количественный ИФА ИБХ РАН» в сыворотке или плазме крови пациентов стационара Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Центральная клиническая больница Российской академии наук» (ФГБНУ ЦКБ РАН, Лицензия на медицинскую деятельность ФС-77-01-007328 от 12.02.2020 г., включение в перечень медицинских организаций, проводящих клинические испытания медицинских изделий - 12.03.2014 г.), полученных в ходе проведения рутинных клинико-лабораторных тестов.

Испытаниям подвергались:

26 образцов сыворотки крови от пациентов с подтвержденным (методом ОТ-ПЦР или КТ) диагнозом COVID-19 и от пациентов, привитых вакцинами для профилактики новой коронавирусной инфекции COVID-19 (образцы №№1-26); активность нейтрализующих антител к SARS-CoV-2 в исследуемых образцах крови подтверждалась методом определения уровня вируснейтрализующих антител к вирусу SARS-CoV-2 в реакции нейтрализации in vitro классическим методом (методом сравнения);

26 образцов сыворотки крови от невакцинированных и не болевших COVID-19 пациентов (образцы №№27-52) отсутствие активности нейтрализующих антител к SARS-CoV-2 в исследуемых образцах крови подтверждалась методом определения уровня вируснейтрализующих антител к вирусу SARS-CoV-2 в реакции нейтрализации in vitro классическим методом (методом сравнения).;

16 образцов сыворотки (плазмы) крови от невакцинированных и не болевших COVID-19 пациентов, ранее перенесших заболевания, вызванные следующими возбудителями: другими типами коронавируса, вирусами гепатита В, С, ВИЧ-1, ВИЧ-2, аденовирусами, метапневмовирусами человека, вирусами парагриппа 1-4, вирусами гриппа А, В, энтровирусом 71, респираторно-синцитиальным вирусом, риновирусом, Chlamydia pneumoniae, Streptococcus pneumoniae, Эпштейн-Барр вирусом (образцы №№53-68).

Для валидации типа пробы у 15-ти пациентов каждой группы была одновременно взята кровь в вакуумные пробирки с ЭДТА-К3, цитратом натрия и Li-гепарином для получения плазмы.

В качестве метода сравнения для определения наличия или отсутствия нейтрализующей активности антител в клинических образцах использовался метод выявления антител, специфично нейтрализующих образование бляшек монослоя культуры клеток Vero после инфицирования препаратом коронавируса SARS-CoV-2 в реакции нейтрализации in vitro классическим методом для определения уровня вируснейтрализующих антител.

Для постановки реакции нейтрализации готовили ряд последовательных 20-кратных, 10-кратных и 5-кратных разведений испытуемых сывороток на среде 199 в одинаковых объемах. Ко всем разведениям сыворотки добавляли вирус SARS-CoV-2, штамм «Вариант В», в дозе 70 БОЕ. Смесь вируса и сыворотки выдерживали при температуре 37°С в течение 60 минут.Далее проводили заражение 1-суточного монослоя культуры клеток Vero C1008 (постоянная культура клеток почки африканской зеленой мартышки). В качестве контроля использовали нормальную сыворотку крови человека и образцы испытуемых сывороток в разведении 1:2 на среде 199. Инфицированный монослой клеток термостатировали в течение 60 минут при 37 °С, удаляли инокулят и на монослой наносили питательное агаровое покрытие, под которым монослой инкубировали в течение 2 суток, потом окрашивали витальным красителем (нейтральный красный) и через сутки учитывали результаты. Определение титра вируснейтрализующих антител в пробах проводили по методу, предложенному Н.Н. Гинсбург и др., А. Китамура и др. [26]. Данные исследования проводились на базе Федерального государственного бюджетного учреждения «48 Центральный научно-исследовательский институт» Минобороны России.

Клинико-лабораторные испытания проводились на 2-х сериях испытуемого набора реагентов (серия №053-02 и серия №053-03) и методом сравнения (определение уровня вируснейтрализующих антител к вирусу SARS-CoV-2 в реакции нейтрализации in vitro классическим методом).

Результаты оценки чувствительности и специфичности набора реагентов, полученные на образцах сыворотки крови от пациентов с подтвержденным (методом ОТ-ПЦР или КТ) диагнозом COVID-19 (образцы №№1-13), и от пациентов, привитых вакцинами для профилактики новой коронавирусной инфекции COVID-19 (образцы №№14-26), и на образцах сыворотки крови от невакцинированных и не болевших COVID-19 пациентов (образцы №№27-52) показали, что активность нейтрализующих антител к SARS-CoV-2 в образцах №№1-26 и отсутствие активности нейтрализующих антител к SARS-CoV-2 в образцах №№27-52 подтверждены методом сравнения (таблица 1). На выборке образцов №№1-26 испытуемый набор реагентов в 100% случаев (доверительный интервал 92-100% с доверительной вероятностью 90%) определяет наличие активности нейтрализующих антител к SARS-CoV-2. На выборке образцов №№27-52 испытуемый набор реагентов в 100% случаев (доверительный интервал 92-100% с доверительной вероятностью 90%) выявляет отсутствие активности нейтрализующих антител к SARS-CoV-2.

Определение корреляции между данными количественного определения активности нейтрализующих антител к SARS-CoV-2, полученных методом сравнения (методом определения уровня вируснейтрализующих антител к вирусу SARS-CoV-2 в реакции нейтрализации in vitro классическим методом), и данными, полученными в ходе клинических испытаний образцов №№1-26 с помощью двух серий (серия 053-02 и серия 053-03) набора реагентов «SARS-CoV-2 Нейтрализация количественный ИФА ИБХ РАН», входящего в предмет изобретения, показало, что наблюдается высокая корреляция (R²=0.97) данных количественного определения активности нейтрализующих антител к SARS-CoV-2, полученных референтным методом, с данными, полученными с помощью обеих серий испытуемого набора «SARS-CoV-2 Нейтрализация количественный ИФА ИБХ РАН» (фиг.3).

Далее анализировались данные по оценке перекрестной реактивности набора реагентов, на образцах сыворотки и плазмы крови человека, полученных в ходе проведения рутинных клинико-лабораторных тестов. Перекрестная реактивность оценивалась по результатам испытаний образцов сыворотки (плазмы) крови, от невакцинированных и не болевших COVID-19 пациентов, которые содержат маркеры к следующим патогенам: другие типы коронавируса, HBV, HCV, HIV-1, HIV-2, Adenovirus, Human Metapneumovirus (hMPV), Parainfluenza virus 1-4, Influenza virus A, Influenza virus B, Enterovirus 71, Respiratory syncytial virus, Rhinovirus, Eppstein-Barr virus, Chlamydia pneumoniae, Streptococcus pneumoniae (таблица 2). Получены воспроизводимые результаты с помощью обеих серий представленных для исследований наборов реагентов. В анализируемых образцах испытуемые наборы реагентов нейтрализующих антител не выявил.

Анализ эквивалентности сыворотки к плазме крови человека (валидация типа пробы) с использованием набора реагентов проводили на 120 образцах сывороток/плазмы крови, полученных: от 15 пациентов - образцы, содержащие нейтрализующие антитела к SARS-CoV-2; и от 15 пациентов - образцы, не содержащие нейтрализующие антитела к SARS-CoV-2. Результаты, полученные с помощью набора реагентов «SARS-CoV-2 Нейтрализация количественный ИФА ИБХ РАН» серии 053-03, подтвердили эквивалентность сыворотки к плазме, полученной с использованием разных антикоагулянтов: ЭДТА-К3, Li-гепарин, цитрат натрия (таблица 3).

В таблице 1 показаны результаты исследования сывороток крови с использованием 2-х серий ИФА-набора реагентов «SARS-CoV-2 Нейтрализация количественный ИФА ИБХ РАН» в сопоставлении с методом сравнения для определения чувствительности и специфичности способа выявления нейтрализующих антител к SARS-CoV-2.

В таблице 2 показаны результаты исследования сывороток крови, содержащих маркеры к различным патогенам, кроме SARS-CoV-2, с использованием набора реагентов «SARS-CoV-2 Нейтрализация количественный ИФА ИБХ РАН» для определения перекрестной реактивности способа выявления нейтрализующих антител к SARS-CoV-2.

В таблице 3 показаны результаты исследования отдельно отобранных сывороток и плазмы крови, с использованием одной из серий набора реагентов «SARS-CoV-2 Нейтрализация количественный ИФА ИБХ РАН» для определения эквивалентности сыворотки к плазме крови человека (валидации типа пробы).

Таблица 1.
№ об-раз-ца	Клиническая характеристика	Уровень нейтрализующих антител при использовании количественного ИФА	Титр нейтрализующих антител в реакции нейтрализации (3)	Коэффициенты корреляции Спирмена (r), их достовер-ность (*)
серия 053-02 (1)	серия 053-03 (2)
1	Образцы сыворотки крови от пациентов с подтвержденным (методом ОТ-ПЦР или КТ) диагнозом COVID-19	325	325	1:8	r (1-2)=0,995* r (1-3)=0,971* r (2-3)=0,972*
2		275	300	1:6
3		2125	2075	1:1000
4		700	675	1:230
5		900	900	1:310
6		850	850	1:250
7		975	1000	1:390
8		450	450	1:80
9		700	675	1:270
10		1325	1325	1:510
11		1100	1075	1:520
12		925	850	1:370
13	800	800	1:215
14	Образцы сыворотки крови от пациентов, привитых вакцинами для профилактики коронавирусной инфекции COVID-19	625	600	1:160
15		550	575	1:135
16		700	650	1:170
17		700	725	1:200
18		775	750	1:215
19		400	400	1:90
20		500	475	1:115
21		525	525	1:130
22		450	400	1:85
23		450	425	1:80
24		475	500	1:125
25		550	550	1:130
26	650	625	1:170
27	Образцы сыворотки крови от невакци-нированных и не болевших COVID-19 пациентов	<200	<200	0	Полное соответствие
28		<200	<200	0
29		<200	<200	0
30		<200	<200	0
31		<200	<200	0
32		<200	<200	0
33		<200	<200	0
34		<200	<200	0
35		<200	<200	0
36		<200	<200	0
37		<200	<200	0
38		<200	<200	0
39		<200	<200	0
40		<200	<200	0
41		<200	<200	0
42		<200	<200	0
43		<200	<200	0
44		<200	<200	0
45		<200	<200	0
46		<200	<200	0
47		<200	<200	0
48		<200	<200	0
49		<200	<200	0
50		<200	<200	0
51		<200	<200	0
52	<200	<200	0

Таблица 2
№ образ-ца	Маркеры к различным патогенам в испытуемых сыворотках	Уровень нейтрализующих антител при использовании количественного ИФА	Соответствие результатов
серия 053-02	серия 053-02
53	Другие коронавирусы (не SARS-Cov2)	<200	<200	Полное соответствие
54	HBV	<200	<200
55	HCV	<200	<200
56	HIV-1	<200	<200
57	HIV-2	<200	<200
58	Adenovirus	<200	<200
69	Human Metapneumovirus (hMPV)	<200	<200
60	Parainfluenza virus 1-4	<200	<200
61	Influenza virus A	<200	<200
62	Influenza B	<200	<200
63	Enterovirus 71	<200	<200
64	Respiratory syncytial virus	<200	<200
65	Rhinovirus	<200	<200
66	Epstein-Barr virus	<200	<200
67	Chlamydia pneumoniae	<200	<200
68	Streptococcus pneumoniae	<200	<200

Таблица 3.
№образца	Сыворотка крови (1)	Плазма крови / ЭДТА К3 (2)	Плазма крови / Li-гепарин (3)	Плазма крови /цитрат натрия (4)	Коэффициенты корреляции Спирмена (r), их достовер-ность (*)
Образцы сыворотки и плазмы крови человека, содержащие нейтрализующие антитела к SARS-CoV-2, IU/мл
1	325	325	300	325	r (1-2)=0,995* r (1-3)=0,985* r (1-4)=0,995*
2	300	325	300	300
3	2075	2075	2050	2025
4	675	650	700	675
5	900	900	900	925
6	850	850	875	875
7	1000	1050	975	1000
8	450	450	450	475
9	675	700	625	650
10	1325	1250	1300	1325
11	1075	1075	1800	1800
12	850	850	850	850
13	800	850	700	825
14	600	550	600	575
15	575	550	625	550
Образцы сыворотки и плазмы крови человека, не содержащие нейтрализующие антитела к SARS-CoV-2, IU/мл
27	<200	<200	<200	<200	Полное соответствие
28	<200	<200	<200	<200
29	<200	<200	<200	<200
30	<200	<200	<200	<200
31	<200	<200	<200	<200
32	<200	<200	<200	<200
33	<200	<200	<200	<200
34	<200	<200	<200	<200
35	<200	<200	<200	<200
36	<200	<200	<200	<200
37	<200	<200	<200	<200
38	<200	<200	<200	<200
39	<200	<200	<200	<200
40	<200	<200	<200	<200
41	<200	<200	<200	<200

Перечни нуклеотидных и аминокислотных последовательностей:

SEQ ID NO: 1. Нуклеотидная последовательность экспрессионной генетической конструкции pFUSE-RBD-6his

SEQ ID NO: 2. Нуклеотидная последовательность экспрессионной генетической конструкции ACE2-3FLAG-6his

SEQ ID NO: 3. Фрагмент белка RBD

SEQ ID NO: 4. Фрагмент белка ACE2

Литература:

1. Ju B., Zhang Q., Ge J. et al. Human neutralizing antibodies elicited by SARS-CoV-2 infection // Nature. 2020; 584 (7819): 115-119.

2. Huang C., Wang Y., Li X. et al. Clinical features of patients infected with 2019 novel coronavirus in Wuhan, China. Lancet. 2020; 395 (10223): 497-506.

3. Jiang S., Hillyer C., Du L. Neutralizing antibodies against SARS-CoV-2 and other human coronaviruses. Trends Immunol. 2020; 41 (5): 355-359.

4. Zhou P., Yang X.-L., Wang X.-G. et al. A pneumonia outbreak associated with a new coronavirus of probable bat origin. Nature. 2020; 579 (7798):270-273.

5. Li W., Moore M. J., Vasilieva N. et al. Angiotensin-converting enzyme 2 is a functional receptor for the SARS coronavirus. Nature. 2003; 426 (6965): 450-454.

6. Kuhn J. H., Li W., Choe H., Farzan M. Angiotensin-converting enzyme 2: A functional receptor f SorARS coronavirus. Cell Mol Life Sci. 2004; 61 (21): 2738-2743.

7. Wang Q., Zhang Y., Wu L. et al. Structural and functional basis of SARS-CoV-2 entry by using human ACE2. Cell. 2020; 181 (4): 894-904.e9.

8. Никифоров В.В., Суранова Т.Г., Чернобровкина Т.Я. и др. Новая короновирусная инфекция (COVID-19): клинико-эпидемиологические аспекты. Архив внутренней медицины. 2020; (2): 87-93.

9. Du L., He Y., Zhou Y. et al. The spike protein of SARS-CoV - a target for vaccine and therapeutic development. Nat. Rev. Microbiol. 2009; 7 (3): 226-236.

10. Du L., Yang Y., Zhou Y. et al. MERS-CoV spike protein: a key target for antivirals. Expert Opin Ther Targets. 2017; 21 (2): 131-143.

11. Coughlin M.M., Prabhakar B.S. Neutralizing human monoclonal antibodies to severe acute respiratory syndrome coronavirus: target, mechanism of action, and therapeutic potential. Rev Med Virol. 2012; 22 (1): 2-17.

12. Barnes C.O., Jette C.A., Abernathy M.E. et al. SARS-CoV-2 neutralizing antibody structures inform therapeutic strategies. Nature. 2020; 588 (7839): 682-687.

13. Walls A.C., Tortorici M.A., Bosch B.J. et al. Cryo-electron microscopy structure of a coronavirus spike glycoprotein trimer. Nature. 2016; 531 (7592): 114-117.

14. Kirchdoerfer R.N., Cottrell C.A., Wang N. et al. Pre-fusion structure of a human coronavirus spike protein. Nature. 2016; 531 (7592): 118-121.

15. Yuan Y., Cao D., Zhang Y. et al. Cryo-EM structures of MERS-CoV and SARS-CoV spike glycoproteins reveal the dynamic receptor binding domains. Nat Commun. 2017; 8: 15092.

16. Walls A.C., Park Y.-J., Tortorici M.A. et al. Structure, function, and antigenicity of the SARS-CoV-2 spike glycoprotein. Cell. 2020; 181 (2): 281-292.

17. Wrapp D., Wang N., Corbett K.S. et al. Cryo-EM structure of the 2019-nCoV spike in the prefusion conformation. Science. 2020; 367 (6483): 1260-1263.

18. Zhu F.-C., Li Y.-H., Guan X.-H. et al. Safety, tolerability, and immunogenicity of a recombinant adenovirus type-5 vectored COVID-19 vaccine: a dose-escalation, open-label, non-randomised, first-in-human trial. Lancet. 2020; 395 (10240): 1845-1854.

19. Gonzales S., Olszevicki S., Salazar M. et al. Effectiveness of the first component of Gam-COVID-Vac (Sputnik V) on reduction of SARS-CoV-2 confirmed infections, hospitalisations and mortality in patients aged 60-79: a retrospective cohort study in Argentina. E Clinical Medcine. 2021. 40: 101126.

20. Patent application CN112213497 (A), publ. 2021-01-12. Polypeptide-ELISA kit for detecting novel coronavirus S protein unique antibody. Inventors: Luo Y.; Lyu J.; Tao W.; Wu Q.; Hong Y.; Zhang F.; Jiang H. Applicant: Hangzhou Medical College. Priority date: 2020-09-24.

21. Patent application CN112794884 (A), publ. 2021-05-14. Novel corona-virus protein, preparation method and neutralizing antibody detection kit. Inventors: Gao F.; Song H.; Sun K.; Tong Z.; Huang B.; Dai L.; Pan W. Applicant: Inst Microbiology CAS; Jiangsu Medomics Medical Tech Co LTD. Priority date: 2020-09-24.

22. Патент РФ 2723008, опубл. 08.06.2020 г.Способ получения штамма клеток яичника китайского хомячка, продуцента рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2, штамм клеток яичника китайского хомячка, продуцент рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2, способ получения рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2, тест-система для иммуноферментного анализа сыворотки или плазмы крови человека и ее применение. Авторы: Щебляков Д.В., Есмагамбетов И.Б., Логунов Д.Ю. и др. (всего 15 чел.). Патентообладатель: Федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации. Дата подачи заявки: 19.05.2020.

23. Patent application CN112375741 (A), publ. 2021-02-19. Cell strain for highly expressing SARS-COV2-RBD and screening method thereof. Inventors: Hou C.; Zhang H. Applicant: Shanghai Daiao Biological Tech Co LTD. Priority date: 2020-11-18.

24. Portolano N., Watson P.J., Fairall L. et al. Recombinant protein expression for structural biology in HEK 293F suspension cells: a novel and accessible approach. J Vis Exp.2014; (92): e51897.

25. Patent application EP3800473 (A1), publ. 2021-04-07. Detection of antibodies to SARSR-COV. Inventor: Wang L. Applicant: Nat Univ Singapore. Priority date: 2020-03-25.

26. Стандартизация методов вирусологических исследований / В.А. Пшеничнов, Б.Ф. Семенов, Е.Г. Зезеров. Москва: Медицина. 1974. 168 с.

27. Logunov D.Y., Dolzhikova I.V., Shcheblyakov D.V. et al. Safety and efficacy of an rAd26 and rAd5 vector-based heterologous prime-boost COVID-19 vaccine: an interim analysis of a randomised controlled phase 3 trial in Russia. Lancet. 2021; 397 (10275): 671-681.

1. Генетическая конструкция для получения рецептор-связывающего домена (RBD) S-белка вируса SARS-CoV-2, объединенного в единую рамку считывания с последовательностью шести гистидинов pFUSE-RBD-6his на основе экспрессионного вектора pFUSE-CHIg-hG1, содержащая следующие генетические элементы:

- точку начала репликации плазмид (ori);

- последовательность гена BleoR, продукт которого обеспечивает устойчивость клетки к антибиотику зеоцин под контролем корового промотора легкой цепи ферритина (hFerL promoter) и энхансера раннего гена 1 цитомегаловируса человека (CMV enchancer);

- последовательности сигналов полиаденилирования бета-глобина человека (β-globin poly(A)) и вируса макаки SV40 poly(A);

- промоторную последовательность фактора элонгации 1α человека (EF-1α core promoter);

- укороченную последовательность длинных концевых повторов типа 1 вируса лейкемии Т-клеток человека (5' LTR truncated);

- сигнальную последовательность интерлейкина 2 человека (IL-2), отличающаяся тем, что содержит:

- нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1, кодирующую рецептор-связывающий домен (RBD) S-белка вируса SARS-CoV-2 и объединенную в единой рамке считывания с последовательностью шести гистидинов.

2. Генетическая конструкция для получения внеклеточного домена ACE-2 человека, объединенного в единую рамку считывания с последовательностью 3FLAG эпитопа и шести гистидинов pFUSE-ACE2-3FLAG-6his на основе экспрессионного вектора pFUSE-CHIg-hG1, содержащая следующие генетические элементы:

- точку начала репликации плазмид (ori);

- последовательность гена BleoR, продукт которого обеспечивает устойчивость клетки к антибиотику зеоцин под контролем корового промотора легкой цепи ферритина (hFerL promoter) и энхансера раннего гена 1 цитомегаловируса человека (CMV enchancer);

- последовательности сигналов полиаденилирования бета-глобина человека (β-globin poly(A)) и вируса макаки SV40 poly(A);

- промоторную последовательность фактора элонгации 1α человека (EF-1α core promoter);

- укороченную последовательность длинных концевых повторов типа 1 вируса лейкемии Т-клеток человека (5' LTR truncated);

- сигнальную последовательность интерлейкина 2 человека (IL-2), отличающаяся тем, что содержит:

- нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 2, кодирующую внеклеточный домен ACE-2 человека и объединенную в единой рамке считывания с последовательностью 3FLAG эпитопа и шести гистидинов.

3. Рекомбинантный белок для твердофазного иммуноферментного определения активности нейтрализующих антител к вирусу SARS-CoV-2 в сыворотке или плазме крови у переболевших COVID-19 и у людей, привитых вакцинами для профилактики новой коронавирусной инфекции COVID-19, содержащий антигенные детерминанты рецептор-связывающего домена (RBD) S-белка вируса SARS-CoV-2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 3, полученный путем трансфекции клеточной линии эмбриональной почки человека в бессывороточной среде комплексом генетической конструкции по п. 1 с полиэтиленимином, и инкубированием с последующим выделением целевого белка из культуральной среды.

4. Рекомбинантный белок для твердофазного иммуноферментного определения активности нейтрализующих антител к вирусу SARS-CoV-2 в сыворотке или плазме крови у переболевших COVID-19 и у людей, привитых вакцинами для профилактики новой коронавирусной инфекции COVID-19, содержащий антигенные детерминанты внеклеточного домена рецептора АСЕ2 человека и имеющий аминокислотную последовательностью SEQ ID NO: 4, полученный путем трансфекции клеточной линии эмбриональной почки человека в бессывороточной среде комплексом генетической конструкции по п.2 с полиэтиленимином, и инкубированием с последующим выделением целевого белка из культуральной среды.

5. Иммуносорбент для твердофазного иммуноферментного определения активности нейтрализующих антител к вирусу SARS-CoV-2 в сыворотке или плазме крови у переболевших COVID-19 и у людей, привитых вакцинами для профилактики новой коронавирусной инфекции COVID-19, содержащий рекомбинантный белок по п. 3, сорбированный в лунках планшета.

6. Тест-система для твердофазного иммуноферментного определения активности нейтрализующих антител к вирусу SARS-CoV-2 в сыворотке или плазме крови у переболевших COVID-19 и у людей, привитых вакцинами для профилактики новой коронавирусной инфекции COVID-19, содержащая планшет с иммуносорбентом по п. 5, рекомбинантный белок по п. 4 и набор реагентов.

7. Тест-система по п. 6, отличающаяся тем, что наборов реагентов для твердофазного иммуноферментного определения активности нейтрализующих антител к вирусу SARS-CoV-2 включает положительный контроль, отрицательный контроль, раствор для промежуточного разведения образцов, раствор для разведения образцов, раствор для разведения рецептора ACE2, концентрат конъюгата, раствор для разведения конъюгата, ТМБ-хромоген, концентрат промывочного раствора, стоп-реагент.

8. Применение тест-системы по п. 7 для определения активности нейтрализующих антител к вирусу SARS-CoV-2 с использованием иммуносорбента по п. 5 и раствора рекомбинантного белка по п. 4.

9. Применение по п. 8, отличающееся тем, что на первом этапе осуществляют внесение в лунки контрольных образцов и анализируемых образцов, перемешивание, инкубирование иммуносорбента в присутствии контрольных и анализируемых образцов с последующей промывкой, инкубирование иммуносорбента в присутствии рабочего разведения белка рецептора АСЕ2 человека с последующей промывкой, инкубирование иммуносорбента в присутствии рабочего разведения конъюгата с последующей промывкой, инкубирование иммуносорбента с ТМБ-хромогеном, добавление стоп-реагента, оценка оптической плотности.

10. Применение по п. 9, отличающееся тем, что в качестве анализируемого образца используют сыворотку или плазму крови от переболевших COVID-19 и от людей, привитых вакцинами для профилактики новой коронавирусной инфекции COVID-19.

11. Применение по п. 8, отличающееся тем, что иммуносорбент инкубируют с образцами в термостатирующем шейкере при температуре от 35°С до 39°С и постоянном встряхивании при скорости от 700 до 800 об/мин в течение 30 мин, с последующей промывкой, затем инкубируют с раствором рекомбинантного белка по п. 4 в термостатирующем шейкере при температуре от 35°С до 39°С и постоянном встряхивании при скорости от 700 до 800 об/мин в течение 30 мин, с последующей промывкой, затем инкубируют с раствором конъюгата в термостатирующем шейкере при температуре от 35°С до 39°С и постоянном встряхивании при скорости от 700 до 800 об/мин в течение 30 мин, с последующей промывкой, затем инкубируют с раствором ТМБ-хромогена при температуре от 15°С до 25° в течение 15 мин, реакцию останавливают добавлением стоп-реагента, измеряют оптическую плотность.