Эталонный штамм вида thiopseudomonas alkaliphila, впервые идентифицированный в россии

Настоящее изобретение относится к микробиологии, в частности к штамму Thiopseudomonas alkaliphila, редкого и уникального микроорганизма, впервые выделенного на территории РФ. Штамм депонирован в Государственную коллекцию патогенных микроорганизмов и клеточных культур (ГКПМ-Оболенск) под регистрационным номером В-9992 и предназначен для уточнения строения и функции данного микроорганизма. Штамм Thiopseudomonas alkaliphila выделен в 2019 году из сельскохозяйственного предприятия, специализирующегося на крупном рогатом скоте. Вид микроорганизма - Thiopseudomonas alkaliphila - грамотрицательные, короткие палочки с закругленными концами, в мазке располагаются одиночно или попарно, не образуют спор, неподвижны, аэробные. Для данного штамма характерна устойчивость к меропенему и фосфомицину. Чувствителен к ципрофлоксацину, цефтазаидим/авибактаму, гентамицину, тигециклину, ампициллину и тетрациклину. 2 табл., 2 пр.

 

Семейство Pseudomonadaceae относится классу Gammaproteobacteria и включает в себе 13 родов (Azomonas, Azomonotrichon, Azorhizophilus, Azotobacter, Cellvibrio, Chryseomonas, Flavimonas, Mesophilobacter, Pseudomonas, Rhizobacter, Rugamonas, Serpens и Thiopseudomonas), а типовой род Pseudomonas был впервые предложен Вальтером Мигулой в 1894 г.

В 2016 г. Адамом Дробышем был обнаружен вид микроорганизма, который был отнесен к новому роду - Oblitimonas. Штаммы были обнаружены в ходе ретроспективного изучения микроорганизмов не поддающихся идентификации стандартными микробиологическими и масс-спектрометрическими способами определения. Штаммы были собраны в период с 1969 по 1979 года [1]. Однако чуть позже, в ходе подробного изучения данной филы, штаммы Oblitimonas alkaliphila были отнесены уже к известному роду Thiopseudomonas с единственным представленным видом Thiopseudomonas denitrificans [2]. Данный вид микроорганизма способен окислять ацетат и сульфид, используя нитрат в качестве акцептора электронов. Конечным продуктом окисления сульфидов является S⁰, а не сульфат, даже при избыточной подаче нитратов. Благодаря новым физиологическим свойствам штамм Х2 является подходящим кандидатом для очистки промышленных сточных вод [3].

Сейчас же это род уже представлен с двумя видами: Thiopseudomonas denitrificans и Thiopseudomonas alkaliphila.

В России впервые обнаружен и идентифицированный данный вид микроорганизма, поэтому заявителем не выявлены источники, содержащие информацию о технических решениях, идентичных настоящему изобретению, что позволяет сделать вывод о его соответствии критерию «новизна».

Заявителю не известны какие-либо публикации, которые содержали бы сведения о влиянии отличительных признаков изобретения на достигаемый технический результат. В связи с этим, по мнению заявителя, можно сделать вывод о соответствии заявляемого технического решения критерию «изобретательский уровень».

Задачей изобретения является получение эталонного штамма, для уточнения строения и функции данного микроорганизма.

Технический результат данной работы является получение уникального штамма Thiopseudomonas alkaliphila.

Указанный результат достигается путем выделения штамма Thiopseudomonas alkaliphila обнаруженный на территории Российской Федерации.

Сущность изобретения заключается в следующем.

Штамм Thiopseudomonas alkaliphila выделен в 2019 году из сельскохозяйственного предприятия специализирующегося на крупном рогатом скоте. Штамм был депонирован в Государственную коллекцию патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-Оболенск» под регистрационными номером В-9992.

Вид микроорганизма - Thiopseudomonas alkaliphila - грамотрицательные, короткие палочки с закругленными концами, в мазке располагаются одиночно или попарно, хорошо окрашиваются по Граму, не образуют спор, неподвижны. Аэроб.

Культивируется на среде Мюддер-Хинтон при 37°С 24 ч и образует мелкие круглые светло белые колонии. На кровяном агаре рост в виде «росы», на среде Эндо не растет. Вирулентные свойства. Штамм №177 Thiopseudomonas alkaliphila при однократном внутрибрюшинном введение мышам не оказал негативного действия - имеет низкую вирулентность.

Для данного штамма характерна устойчивость к меропенему и фосфомицину. Чувствителен к ципрофлоксацину, цефтазаидим/авибактаму, гентамицину, тигециклину, ампициллину и тетрациклину.

Для таксономической идентификации штаммов использовалась секвенирование 16S рибосомальной РНК, что позволяет, изучит филогению и таксономию образцов, которые трудно или же невозможно изучить в лабораторных условиях. Также полногеномное секвенирование с применением гибридного подхода, включающего секвенирование на платформах Illumina MiSeq и Oxford Nanopore.

Генетические характеристики:

Хромосома несет в своем составе структуры, не характерные для нее, такие как ген резистентности к металло-бета лактамам IMP-27 и систему токсин-антитоксин HipB.

Условия хранения: лиофильно высушенная культура при температуре 4±2°С в защищенном от прямых солнечных лучей месте при относительной влажности воздуха не более 60% в течение 2 лет. После хранения культура образует однотипные колонии.

Пример 1.

Проводились эксперименты по секвенированию 16S рРНК. Выделение нуклеиновых кислот проводилось с помощью набора «QIAamp DNA Mini Kit» (Qiagen, Германия) согласно инструкции производителя. Для апмлификации полноразмерного гена 16S применялись универсальные праймеры: прямой праймер- 27F (5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'), обратный праймер - 1492R (3'-CGGTTACCTTGTTACGACTT-5') с последующим секвенированием по Сэнгеру. Режим амплификации представлен в таблице 1.

Визуализацию ампликонов проводили после разделения в 2% агарозном геле с электрофоретической детекцией. Чтобы получить точную последовательность, обе цепи ДНК были секвенированы с использованием нескольких праймеров. В таблице 2 представлены сиквенсовые реакции с праймерами.

Пример 2.

Проводилась биопроба для определения вирулентности данного штамма на модели внутрибрюшинного заражения мышей.

Для проведения биопробы были отобраны мыши линии «Balb с» в количестве 10 животных, 18-22-дневные, самки.

Для заражения использовали 18-24-часовую культуру Thiopseudomonas alkaliphila, выращенного на чашке Петри с агаром Muller Hinton. Суспензию с мутностью 0,5 по McFarland разводили в 4,3 раза для получения взвеси с концентрацией 2×10⁷ КОЕ/мл (суспензия для заражения). Из полученной суспензии для заражения отбирали по 500 мкл на животное. Количество КОЕ в 500 мкл составляло 10⁷.

По результатам биопробы выявлено, что штамм имеет низкую вирулентность.

Штамм может быть использован для разработки различных диагностических платформ; уточнения биологии и физиологии с целью поиска возможных биосинтетических путей уникальных соединений.

Литература

1. Drobish, A.M., et al., Oblitimonas alkaliphila gen. nov., sp. nov., in the family Pseudomonadaceae, recovered from a historical collection of previously unidentified clinical strains. Int J Syst Evol Microbiol, 2016. 66(8): p. 3063-3070.

2. Tan, W.B., et al., Thiopseudomonas denitrificans gen. nov., sp. nov., isolated from anaerobic activated sludge. Int J Syst Evol Microbiol, 2015. 65(Pt 1): p. 225-229.

3. Tan, W., et al., Bioaugmentation of activated sludge with elemental sulfur producing strain Thiopseudomonas denitrificans X2 against nitrate shock load. Bioresour Technol, 2016. 220: p. 647-650.

Эталонный штамм вида Thiopseudomonas alkaliphila, впервые идентифицированный в России, депонирован в Государственную коллекцию патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-Оболенск» под регистрационным номером В-9992.