Проточные ячейки

Группа изобретений относится к области биологических и химических исследований. Раскрыта проточная ячейка, включающая основу; расположенную на основе селективно удаляемую самособранную пористую молекулярную сетку, определяющую паттерн открытых участков основы; и наноструктуру, расположенную по меньшей мере на некоторых из открытых участков, и полимеразу, присоединенную к наноструктуре, и наноструктура представляет собой электропроводный канал, включающий материал, выбранный из группы, состоящей из проводника и полупроводника, и имеет геометрическую форму, выбранную из группы, состоящей из трубки, проволоки и полосы, где селективно удаляемая самособранная пористая молекулярная сетка представляет собой планарную надмолекулярную сетку из амина и диимида. Также раскрыты система для секвенирования и способ получения указанной выше проточной ячейки. Группа изобретений обеспечивает улучшенную специфичность присоединения биомолекул и лучшую чувствительность датчиков. 3 н. и 10 з.п. ф-лы, 11 ил.

 

Перекрестные ссылки на родственные заявки

Настоящая заявка претендует на полезный эффект предварительной патентной заявки US 62/715177, поданной 6 августа 2018 г., содержание которой полностью включено в настоящую заявку посредством ссылки.

Предшествующий уровень техники

Различные протоколы биологических или химических исследований включают проведение большого количества контролируемых реакций на локальных поверхностях подложек или внутри предустановленных реакционных камер. При этом определенные реакции можно наблюдать или обнаруживать, и последующее проведение анализа может позволить идентифицировать или определить свойства химических веществ, участвующих в реакции. В некоторых примерах при протекании контролируемых реакций генерируется флуоресценция, и, таким образом, для обнаружения может быть применена оптическая система. В других примерах при протекании контролируемых реакций изменяется заряд, проводимость или некоторое другое электрическое свойство, и, таким образом, для обнаружения может быть применена электронная система.

Сущность изобретения

Первый аспект настоящего изобретения относится к проточной ячейке. Проточная ячейка включает основу (англ. substrate); расположенную на основе селективно удаляемую пористую молекулярную сетку, определяющую открытые участки основы; и находящееся на поверхности химическое вещество (вещества, англ. surface chemistry) для секвенирования, расположенное на по меньшей мере некоторых из открытых участков, где находящееся на поверхности химическое вещество выбрано из группы, состоящей из: i) активированной подложки (англ. pad), полимерного слоя, присоединенного к активированной подложке, и праймера, присоединенного к полимерному слою; или ii) наноструктуры и фермента, присоединенного к наноструктуре.

В одном из примеров проточной ячейки селективно удаляемая пористая молекулярная сетка представляет собой планарную надмолекулярную (англ. supramolecular) сетку из амина и диимида. В одном из примеров амин представляет собой меламин или его аналог, и диимид представляет собой диимид перилентетракарбоновой кислоты или его аналог.

В одном из примеров проточной ячейки находящееся на поверхности химическое вещество представляет собой ii) наноструктуру и фермент, присоединенный к наноструктуре, где в ii): наноструктура представляет собой электропроводящий канал, включающий материал, выбранный из группы, состоящей из проводника и полупроводника, и имеет геометрическую форму, выбранную из группы, состоящей из трубки, проволоки и полосы; и фермент представляет собой полимеразу. В одном из примеров одна полимераза присоединена к одной наноструктуре. В одном из примеров наноструктура соединена электрическим соединением с двумя электродами. Водном из примеров проточная ячейка дополнительно включает соединительный элемент, присоединяющий полимеразу к наноструктуре. В одном из примеров наноструктура выбрана из группы, состоящей из кремниевой нанопроволоки и углеродной нанотрубки.

В одном из примеров проточной ячейки находящееся на поверхности химическое вещество представляет собой i) активированный слой, полимерный слой и праймер; где в i) полимерный слой представляет собой:

где: R¹ представляет собой Н или необязательно замещенный алкил; R^A выбран из группы, состоящей из азидогруппы, необязательно замещенной аминогруппы, необязательно замещенного алкенила, необязательно замещенного гидразона, необязательно замещенного гидразина, карбоксила, гидроксигруппы, необязательно замещенного тетразола, необязательно замещенного тетразина, нитрилоксида, нитрона и тиола; каждый из R⁵, R₆ и R₈ независимо выбран из группы, состоящей из Н и необязательно замещенного алкила; каждая из групп -(СН₂)_р- может быть необязательно замещена; р представляет собой целое число, составляющее от 1 до 50; n представляет собой целое число, составляющее от 1 до 50000; и m представляет собой целое число, составляющее от 1 до 100000.

Следует понимать, что любые признаки проточной ячейки, рассмотренные в настоящей работе, могут быть скомбинированы друг с другом любым требуемым образом и/или с образованием любой требуемой конфигурации.

Второй аспект настоящего изобретения относится к системе для секвенирования. Система для секвенирования включает съемную проточную ячейку, включающую: основу; расположенную на основе селективно удаляемую пористую молекулярную сетку, определяющую открытые участки основы; наноструктуру, присоединенную к каждому из открытых участков основы; фермент, присоединенный к по меньшей мере некоторым из наноструктур; и отверстия для впуска и выпуска текучих сред; резервуар для i) постоянного размещения съемной проточной ячейки или ii) для введения съемной проточной ячейки; и жидкостную систему (англ. fluidic system) для селективной подачи в съемную проточную ячейку деструктурирующего реагента (англ. de-patterning reagent) с целью удаления с основы селективно удаляемой пористой молекулярной сетки и для подачи в съемную проточную ячейку структурообразующего реагента (англ. patterning reagent) с целью нанесения новой (свежей) селективно удаляемой пористой молекулярной сетки на основу.

В одном из примеров системы для секвенирования каждая из наноструктур представляет собой электропроводный канал, включающий материал, выбранный из группы, состоящей из проводника и полупроводника, и имеет геометрическую форму, выбранную из группы, состоящей из трубки, проволоки и полосы; и каждая из наноструктур доступна для индивидуальной электроадресации.

В одном из примеров системы для секвенирования жидкостная система включает резервуар для картриджа для размещения картриджа с реагентами, включающего по меньшей мере деструктурирующий реагент и структурообразующий реагент. В некоторых примерах система для секвенирования дополнительно включает картридж с реагентами, и картридж с реагентами включает: систему для хранения текучих сред, включающую: резервуар для деструктурирующего реагента; деструктурирующий реагент, содержащийся в резервуаре для деструктурирующего реагента; резервуар для структурообразующего реагента, включающий два раздельных отделения; первый компонент структурообразующего реагента, содержащийся в первом из двух раздельных отделений, и второй компонент структурообразующего реагента, содержащийся во втором из двух раздельных отделений. В одном из примеров деструктурирующий реагент включает реагент-окислитель; первый компонент структурообразующего реагента представляет собой диимид перилентетракарбоновой кислоты или его аналог, и второй компонент структурообразующего реагента представляет собой меламин или его аналог. В одном из примеров реагент-окислитель выбран из группы, состоящей из перманганатов, перборатов, галогенов, перхлоратов и пероксидов.

Следует понимать, что любые признаки системы для секвенирования могут быть скомбинированы друг с другом любым требуемым образом. Кроме того, следует понимать, что любые комбинации признаков системы для секвенирования и/или проточной ячейки могут быть применены совместно и/или скомбинированы с любым из примеров, рассмотренных в настоящей работе.

Третий аспект настоящего изобретения относится к способу. Способ включает образование закрытой трафаретом основы (закрытой маской основы, англ. masked substrate) посредством нанесения пористой молекулярной сетки на поверхность основы, на которой расположены наноструктуры, таким образом, что по меньшей мере часть каждой наноструктуры остается открытой; и воздействие на закрытую трафаретом основу раствором фермента, инертного по отношению к пористой молекулярной сетке, что приводит к селективному присоединению соответствующего фермента к по меньшей мере некоторым из открытых частей наноструктур.

В одном из примеров этого способа нанесение пористой молекулярной сетки включает: нагревание насыщенной смеси диимида перилентетракарбоновой кислоты или его аналога и меламина или его аналога; осаждение насыщенной смеси на основу, к которой была присоединена нанопроволока; и охлаждение осажденной насыщенной смеси.

Следует понимать, что любые признаки этого способа могут быть скомбинированы друг с другом любым требуемым образом. Кроме того, следует понимать, что любые комбинации признаков этого способа и/или системы для секвенирования и/или проточной ячейки могут быть применены совместно и/или скомбинированы с любым из примеров, рассмотренных в настоящей работе.

Четвертый аспект настоящего изобретения относится к другому способу. Этот способ включает нанесение на основу пористой молекулярной сетки для определения структуры (или паттерна (англ. pattern)) открытых участков основы; активацию открытых участков основы, приводящую к образованию активированных подложек; удаление пористой молекулярной сетки, в результате чего остаются неповрежденные активированные подложки, разделенные промежуточными участками основы; нанесение соответствующего полимерного слоя на каждую из активированных подложек; и прививку праймера на каждый из соответствующих полимерных слоев.

В одном из примеров этого способа удаление пористой молекулярной сетки включает воздействие на пористую молекулярную сетку реагентом-окислителем.

В одном из примеров этого способа нанесение пористой молекулярной сетки включает: нагревание насыщенной смеси диимида перилентетракарбоновой кислоты или его аналога и меламина или его аналога; осаждение насыщенной смеси на основу, к которой была присоединена нанопроволока; и охлаждение осажденной насыщенной смеси.

Следует понимать, что любые признаки этого способа могут быть скомбинированы друг с другом любым требуемым образом. Кроме того, следует понимать, что любые комбинации признаков этого способа и/или системы для секвенирования и/или проточной ячейки могут быть применены совместно, и/или скомбинированы с любым из примеров, рассмотренных в настоящей работе.

Также следует понимать, что любые признаки любого из способов и/или любой из систем для секвенирования и/или любой из проточных ячеек могут быть скомбинированы друг с другом любым требуемым образом, и/или могут быть скомбинированы с любым из примеров, рассмотренных в настоящей работе.

Краткое описание графических материалов

Признаки примеров осуществления настоящего изобретения станут более очевидными после рассмотрения приведенного ниже подробного описания с учетом фигур, в которых подобные числовые обозначения относятся к подобным, но, возможно, неидентичным компонентам. Для краткости числовые обозначения или признаки, имеющие функции, описанные ранее, могут быть описаны или могут быть не описаны при описании других фигур, на которых они изображены.

На Фиг. 1А и 1В схематично представлены виды сверху примера способа получения примера проточной ячейки, рассмотренной в настоящей работе;

На Фиг. 2 представлен вид проточной ячейки в разрезе вдоль линии 2-2, показанной на Фиг. 1В;

На Фиг. 3А представлена блок-схема другого примера способа, рассмотренного в настоящей работе;

На Фиг. 3В представлен вид в разрезе одного из примеров проточной ячейки, полученной способом, показанным на Фиг. 3А;

На Фиг. 4 представлена блок-схема другого примера способа, рассмотренного в настоящей работе;

На Фиг. 5А-5С схематично представлены виды сверху примера способа, показанного на Фиг. 4;

На Фиг. 6 представлен вид в разрезе вдоль линии 6-6, показанной на Фиг. 5С, за исключением того, что пористая молекулярная сетка, показанная на Фиг. 6, отличается от примера, показанного на Фиг. 5С; и

На Фиг. 7 показано аксонометрическое изображение части одного из примеров системы для секвенирования, рассмотренной в настоящей работе.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения

В примерах, рассмотренных в настоящей работе, создание нанометрической структуры возможно благодаря применению пористой молекулярной сетки. Пористая молекулярная сетка самособирается на поверхности основы и образует структуру, которая оставляет открытыми i) части нижележащей основы или ii) наноструктуры, предварительно нанесенные на основу. Чрезвычайно гидрофобная пористая молекулярная сетка закрывает по меньшей мере практически всю оставшуюся поверхность основы и, таким образом, на поверхности основы образуется трафарет (маска, англ. mask). Этот трафарет может минимизировать и в некоторых случаях даже полностью исключать присоединение наносимого впоследствии на поверхность химического вещества, но не предотвращает присоединение наносимого впоследствии на поверхность химического вещества i) к открытым частям нижележащей основы или ii) к открытым наноструктурам. Таким образом, пористая молекулярная сетка позволяет производить функционализацию только требуемых участков.

Пористая молекулярная сетка также легко удаляется с поверхности основы в мягких условиях, которые не оказывают негативного влияния на наносимые на поверхность химические вещества.

В некоторых примерах, рассмотренных в настоящей работе, пористая молекулярная сетка также может оставаться на поверхности основы при проведении секвенирования. В этих примерах чрезвычайно гидрофобная пористая молекулярная сетка может способствовать усилению взаимодействия между вводимыми реагентами и находящимся на поверхности химическим веществом.

Следует понимать, что, если не указано иное, то используемые в настоящем описании термины имеют свои обычные значения, известные в соответствующей области техники. Некоторые используемые в настоящем описании термины и их значения приведены ниже.

Формы единственного числа включают множественное число, если из контекста не ясно иное.

Термины "включающий", "содержащий" и различные формы этих терминов синонимичны по отношению друг к другу и имеют одинаково широкое значение.

Термины "верх", "низ", "верхний", "нижний", "на" и т.д. используются в настоящей работе для описания проточной ячейки и/или различных компонентов проточной ячейки. Следует понимать, что такие обозначения направления не относятся к специальной ориентации, а применяются для обозначения ориентации компонентов относительно друг друга. Применение обозначений направления не должно рассматриваться как ограничение примеров, рассмотренных в настоящем описании, какой-либо конкретной ориентацией (ориентациями).

Используемый в настоящем описании термин "присоединенный" означает состояние двух предметов, которые объединены, скреплены, склеены, соединены или прикреплены друг к другу. Например, нуклеиновая кислота может быть химически присоединена к полимерному покрытию ковалентной или нековалентной связью. Ковалентная связь характеризуется обобществлением пары электронов совокупностью атомов. Нековалентная связь представляет собой физическую связь, которая не включает обобществление пар электронов и может включать, например, водородные связи, ионные связи, ван дер Ваальсовы силы, гидрофильные взаимодействия и гидрофобные взаимодействия.

Используемый в настоящем описании термин "проточная ячейка" означает емкость, включающую камеру (т.е. проточный канал), в которой может быть проведена реакция, впускное отверстие для подачи реагента (реагентов) в камеру и выпускное отверстие для удаления реагента (реагентов) из камеры. В некоторых примерах камера позволяет наблюдать протекание реакции в камере. Например, камера может включать одну или более прозрачных поверхностей, через которые может быть произведено оптическое обнаружение массивов, оптически меченых молекул или подобных элементов, находящихся в углублении. В другом примере камера/проточный канал может включать электронную схему, которая позволяет регистрировать электрические сигналы.

Используемый в настоящем описании термин "осаждение" относится к любой подходящей методике нанесения, которая может быть выполнена вручную или может быть автоматизированной, и ее применение приводит к модификации свойств поверхности. Обычно осаждение может быть выполнено с применением методик осаждения из газовой фазы, методик нанесения покрытия, методик прививки или подобных методик. Некоторые конкретные примеры включают химическое осаждение из газовой фазы (ХОГФ), нанесение покрытия распылением (например, нанесение покрытия ультразвуковым распылением), нанесение покрытия центрифугированием, нанесение покрытия маканием или погружением, нанесение покрытия ножевым устройством, нанесение покрытия распределением раствора, нанесение покрытия непрерывным потоком, аэрозольной печатью, трафаретной печатью, микроконтактной печатью, струйной печатью или подобными способами.

Используемый в настоящем описании термин "нуклеотид" включает азотсодержащее гетероциклическое основание, сахар и одну или более фосфатных групп. Нуклеотиды представляют собой мономерные единицы последовательности нуклеиновой кислоты. В РНК сахар представляет собой рибозу, и в ДНК сахар представляет собой дезоксирибозу, т.е. сахар, не имеющий гидроксильной группы, которая присутствует в положении 2' рибозы. Азотсодержащее гетероциклическое основание (т.е. нуклеиновое основание) может представлять собой пуриновое основание или пиримидиновое основание. Пуриновые основания включают аденин (А) и гуанин (G) и их модифицированные производные или аналоги. Пиримидиновые основания включают цитозин (С), тимин (Т) и урацил (U) и их модифицированные производные или аналоги. Атом С-1 дезоксирибозы связан с N-1 пиримидна или N-9 пурина. В аналоге нуклеиновой кислоты могут быть изменены как фосфатная основная цепь, так и сахар или нуклеиновое основание. Примеры аналогов нуклеиновых кислот включают, например, универсальные основания или аналоги, имеющие аналогичную фосфат-сахарную основную цепь, такие как пептид-нуклеиновые кислоты (англ. peptide nucleic acid, сокращенно PNA).

Используемый в настоящем описании термин "праймер" означает одноцепочечную последовательность нуклеиновой кислоты (например, одноцепочечную ДНК или одноцепочечную РНК). Некоторые праймеры, которые могут быть названы праймерами амплификации, служат начальной точкой для матричной амплификации и генерации кластеров. Другие праймеры, которые могут быть названы праймерами секвенирования, служат начальной точкой для синтеза ДНК или РНК. Конец 5', например, праймера амплификации, может быть модифицирован для проведения реакции присоединения к функциональной группе полимерного покрытия. Длина праймера может составлять любое количество оснований, и праймер может включать различные не встречающиеся в природе нуклеотиды. В одном из примеров праймер секвенирования представляет собой короткую цепочку, включающую от 10 до 60 оснований или от 20 до 40 оснований.

Термин "основа" означает носитель, на котором могут быть расположены различные компоненты проточной ячейки. Носитель может представлять собой многослойную пластину, панель, прямоугольный лист, матрицу или иметь любую другую подходящую конфигурацию. Носитель обычно жесткий и нерастворим в водной жидкости. Носитель может быть инертным по отношению к химическим веществам, применяемым для модификации углублений. Например, носитель может быть инертным по отношению к химическим веществам, применяемым для образования блок-сополимера, для присоединения праймера (праймеров) и т.д. Примеры подходящих носителей будут дополнительно рассмотрены ниже.

Используемый в настоящем описании термин "находящееся на поверхности (наносимое на поверхность) химическое вещество (вещества)" в некоторых аспектах относится к активированной подложке, полимерному слою, присоединенному к активированной подложке, и к праймеру (праймерам), присоединенному к по меньшей мере части полимерного слоя. В других аспектах термин "находящееся на поверхности химическое вещество" относится к наноструктуре и ферменту, присоединенному к наноструктуре.

Пористая молекулярная сетка

В примерах, рассмотренных в настоящей работе, пористая молекулярная сетка представляет собой планарную надмолекулярную сетку из амина и диимида. Выбранные амин и диимид более предпочтительно образуют межмолекулярные водородные связи между разноименными молекулами, а не межмолекулярные водородные связи между одноименными молекулами. Ниже представлен пример межмолекулярного водородного связывания между меламином и диимидом перилентетракарбоновой кислоты (англ. perylene tetra-carboxylic di-imide, сокращенно PTCDI):

Как показано на изображении выше, между этими молекулами образуются три водородные связи. Меламин включает три функциональные единицы (H₂N-C-N-C-NH₂), которые могут участвовать в образовании сетки, связанной водородными связями, и диимид перилентетракарбоновой кислоты включает две функциональные единицы (O=CR-NR-CR=O), которые участвуют в образовании сетки, связанной водородными связями. Симметрия третьего и второго порядка, соответственно, меламина и диимида перилентетракарбоновой кислоты приводит к образованию гексагональной сетки, показанной, например на Фиг. 1А. Бимолекулярная сборка этих молекул определяет паттерн сетки (например, гексагональной сетки, показанной на Фиг. 1А) и приводит к образованию пор (например, в центре каждого шестиугольника, показанного на Фиг. 1А), которые определены контурами образованного паттерна.

Наличие множества доноров и/или акцепторов водородных связей позволяет образовывать двухмерную сетку на поверхности основы. Таким образом, несмотря на то, что меламин и FTCDI являются двумя примерами молекул, которые могут образовывать пористую молекулярную сетку, следует понимать, что для образования структур, имеющих паттерн другой геометрии, могут быть применены другие комбинации амина и диимида. Например, применение молекулы амина, содержащей четыре функциональные единицы меламина (H₂N-C-N-C-NH₂) и ось симметрии четвертого порядка, позволяет конструировать прямоугольные, например, квадратные поры, вместо гексагональных пор, получающихся при применении FTCDI и меламина. Это позволяет конструировать размер пор посредством правильного выбора составляющих молекул, из которых сформирована молекулярную сетка.

Примеры подходящих аминов включают меламин:

или его аналоги. Аналоги меламина включают по меньшей мере функциональную единицу (H₂N-C-N-C-NH₂), которая вместе с диимидом участвует в образовании связанной водородными связями сетки. Один из примеров аналога меламина включает 4,4',4'-(1,3,5-бензолтриил)трис-2,6-пиридиндиамин:

а также его варианты. В одном из возможных вариантов центральное бензольное кольцо замещено другой ароматической или другой циклической системой, которая позволяет присоединять другое количество (отличное от 3), например, 2 или 4, 2,6-диаминопиридильных фрагментов (или других фрагментов, содержащих H₂N-C-N-C-NH₂). В некоторых вариантах между центральной структурой и боковыми 2,6-диаминопиридильными фрагментами (или другими фрагментами, содержащими H₂N-C-N-C-NH₂) могут быть расположены одно или более разделительных звеньев, таких как алкиниленовые, бис(алкиниленовые) или ариленовые дирадикалы. Другой пример аналога меламина включает:

который включает четыре фрагмента H₂N-C-N-C-NH₂. Несмотря на то, что здесь описаны некоторые аналоги меламина, полагают, что также могут быть применены другие ароматические амины или неароматические сопряженные амины, при условии, что выбранный амин предпочтительно образует межмолекулярные водородные связи с выбранным диимидом.

Примеры подходящих диимидов включают диимид перилентетракарбоновой кислоты (PTCDI):

или его аналоги Аналоги PTCDI включают по меньшей мере две диимидных функциональных единицы (O=CR-NR-CR=O), которые участвуют в образовании водородных связей с молекулами амина с образованием сетки.

Пример аналога PTCDI включает:

Полагают, что в качестве аналога PTCDI могут быть применены любые из следующих ароматических фрагментов после их превращения в диимид:

Пористая молекулярная сетка может быть заранее собрана в растворе и затем осаждена на нужную поверхность основы. Поскольку молекулы способны к самосборке с образованием надмолекулярной структуры, раствор не включает никаких реагентов (например, катализатора), кроме растворителя и двух компонентов, составляющих получаемую матрицу/сетку. Примеры растворителя включают диметилсупьфоксид (ДМСО) и диметилформамид (ДМФА). Могут быть выбраны другие растворители, выбор которых может частично зависеть от типа двух компонентов, составляющих получаемую матрицу/сетку.

Собранная пористая молекулярная сетка может образовываться в растворе по достижении термодинамического равновесия. Один из способов достижения термодинамического равновесия состоит в нагревании насыщенной смеси диимида перилентетракарбоновой кислоты или его аналога и меламина или его аналога. Насыщенная смесь включает диимид перилентетракарбоновой кислоты или его аналог и меламин или его аналог в подходящем стехиометрическом отношении (молярном отношении). В одном из примеров диимид и амин присутствуют в молярном отношении 1:1. Однако стехиометрическое отношение зависит от типа выбранных молекул и их сродства к поверхности конкретной основы. Если одна из молекул имеет более высокое сродство к поверхности основы, то количество этой молекулы в растворе может составлять менее количества другой молекулы в растворе.

Температура, до которой нагревают раствор, частично зависит от типа двух составляющих раствора. В одном из примеров нагревание производят до температуры, составляющей от приблизительно 51°С (~325 K) до приблизительно 127°С (~400K).

Затем нагретая насыщенная смесь может быть осаждена на основу (например, любым из способов, рассмотренных в настоящей работе) и охлаждена. Охлаждение может произведено медленно, например, со скоростью, составляющей до приблизительно 10°С в минуту. В одном из примеров скорость охлаждения составляет от приблизительно 0,1°С в минуту до приблизительно 10°С в минуту. В другом примере скорость охлаждения составляет от приблизительно 0,5°С в минуту до приблизительно 5°С в минуту. В другом примере скорость охлаждения составляет приблизительно 1°С в минуту.

Пористая молекулярная сетка, образующаяся на поверхности основы, представляет собой нереакционноспособную пи-(π)-систему. В одном из примеров система этого типа по существу химически инертна и, таким образом, не будет реагировать с некоторыми реагентами и/или подвергаться активации, применяемой с целью функционализации поверхности основы, имеющей нанесенное на нее химическое вещество; таким образом, система этого типа успешно пассивирует поверхность основы, на которую она нанесена. Частично благодаря такой пассивирующей способности пористая молекулярная сетка может быть применена в качестве паттерна для селективной функционализации поверхности основы с находящимся на поверхности химическим веществом. Примеры возможного применения пористой молекулярной сетки в создании структуры различных проточных ячеек более подробно рассмотрены ниже.

Кроме того, нереакционноспособная пи-(π)-система пористой молекулярной сетки означает, что пористая молекулярная сетка не присоединена ковалентной связью к нижележащей поверхности основы. Таким образом, пористая молекулярная сетка при необходимости может быть легко удалена с поверхности основы. Для удаления пористой молекулярной сетки может быть применен реагент с более высоким сродством к диимидному фрагменту, чем к самой поверхности основы. Присутствие такого реагента сдвигает термодинамическое равновесие, и пористая молекулярная сетка десорбируется с поверхности основы. Примеры удаляющих реагентов включают реагент-окислитель, который может окислять циклический фрагмент диимида. Окисленный диимид имеет неплоскую структуру и легко десорбируется с поверхности основы. Подходящие реагенты-окислители выбирают из группы, состоящей из перманганатов, перборатов, галогенов, перхлоратов и пероксидов. Примеры вариантов удаления пористой молекулярной сетки более подробно рассмотрены ниже.

Проточная ячейка для оптического обнаружения

В одном из примеров, рассмотренных в настоящей работе, проточная ячейка включает основу; расположенную на основе селективно удаляемую пористую молекулярную сетку, определяющую открытые участки основы; и находящиеся на поверхности химические вещества для секвенирования, расположенные на по меньшей мере некоторых из открытых участков, где находящиеся на поверхности химические вещества включают активированный слой, полимерный слой, присоединенный к активированному слою, и праймер, присоединенный к полимерному слою.

Один из примеров способа получения такой проточной ячейки схематично представлен на Фиг. 1А и Фиг. 1В. Способ включает нанесение пористой молекулярной сетки 14 на основу 12 для определения паттерна открытых участков 18 основы (Фиг. 1А); и образование поверхностного химического вещества 20 на по меньшей мере некоторых из открытых участков 18 основы (Фиг. 1В). Как показано на Фиг. 2, в этом примере способа образование на поверхности химического вещества 20 включает активацию открытых участков 18 основы с образованием активированных подложек 22; нанесение соответствующего полимерного слоя 24 на каждую из активированных подложек; и прививку праймера 26 на каждый из соответствующих полимерных слоев 24.

На Фиг. 1А схематично представлен вид сверху основы 12, на которой самособрана пористая молекулярная сетка 14.

Примеры подходящих основ 12 включают эпоксисилоксан, стекло и модифицированное или функционализированное стекло, полимеры (включающие акриловые полимеры, полистирол и сополимеры стирола и других материалов, полипропилен, полиэтилен, полибутилен, полиуретаны, политетрафторэтилен (такой как TEFLON®, поставляемый Chemours), циклические олефины/циклоолефиновые полимеры (англ. cycloolefin polymer, сокращенно СОР) (такие как ZEONOR®, поставляемый Zeon), полиимиды и т.д.), нейлон, керамические материалы/керамические оксиды, оксид кремния, плавленый оксид кремния или материалы на основе оксида кремния, силикат алюминия, кремний и модифицированный кремний (например, легированный бором р+ кремний), нитрид кремния (Si₃N₄), оксид кремния (SiO₂), пентоксид тантала (TaO₅) или другой оксид (оксиды) тантала (ТаО_х), оксид гафния (HaO₂), углерод, металлы, неорганические стекла или подобные материалы. Носитель также может быть изготовлен из стекла или кремния и иметь на поверхности слой покрытия из оксида тантала или другого керамического оксида.

В одном из примеров диаметр основы 12 может составлять от приблизительно 2 мм до приблизительно 300 мм, или основа 12 может представлять собой прямоугольный лист или панель, наибольший размер которой составляет до приблизительно 10 футов (~ 3 метра). В одном из примеров основа представляет собой многослойную пластину, диаметр которой составляет от приблизительно 200 мм до приблизительно 300 мм. В другом примере носитель представляет собой матрицу (кубик, англ. die), ширина которой составляет от приблизительно 0,1 мм до приблизительно 10 мм. Несмотря на то, что в данной работе представлены примеры размеров, следует понимать, что может быть применен носитель любого подходящего размера. В другом примере может быть применена панель, которая представляет собой прямоугольный носитель, имеющий большую площадь поверхности, чем круглая многослойная пластина диаметром 300 мм.

Пористая молекулярная сетка 14 включает структуру 16, которая формируется самособранными молекулами амина и диимида, и поры, которые определены структурой 16. Структура 16 закрывает определенные части основы 12, и образующиеся поры соответствуют открытым участкам 18 основы. Пористая молекулярная сетка 14 может быть заранее собрана и осаждена на основу 12, как рассмотрено в настоящей работе. Промывка и сушка могут быть произведены до нанесения на поверхность химического вещества 20.

Как было отмечено выше, образование поверхностного химического вещества 20 в этом примере способа изначально включает активацию открытых участков 18 основы. В некоторых примерах активация включает силанизацию открытых участков основы под действием силана или производного силана. Силан или производное силана, применяемое для силанизации, не имеет сродства к расширенной пи-системе пористой молекулярной сетки 14, и, таким образом, пористая молекулярная сетка 14 эффективно определяет на основе 12 изолированные точки закрепления (например, открытые участки 18 основы), в которых будет протекать реакция силана или производного силана.

При активации открытых участков 18 основы посредством силанизации, силанизация может быть произведена с помощью любого силана или производного силана. Выбор силана или производного силана может частично зависеть от типа образуемого полимерного слоя 24, поскольку может быть желательно образование ковалентной связи между силаном или производным силана и полимерным слоем 24. Способы, применяемые для прикрепления силана или производного силана к открытым участкам 18 основы, мог/т различаться в зависимости от типа применяемого силана или производного силана. Ниже представлены некоторые примеры.

Примеры подходящих способов силанизации включают осаждение из газовой фазы (например, способ YES (способ, разработанный Yield Engineering Systems)), нанесение покрытия центрифугированием или другие способы осаждения.

В одном из примеров, в которых применяют печь для химического осаждения из газовой фазы способом YES, в печь ХОГФ помещают основу 12, на которую нанесена пористая молекулярная сетка 14. Камера может быть уравновешена с атмосферой, после чего начинают цикл силанизации. При проведении циклов, подходящая температура может поддерживаться в емкости с силаном или производным силана (например, приблизительно 120°С для норборненсилана), подходящая температура может поддерживаться в трубопроводах для паров силана или производного силана (например, приблизительно 125°С для норборненсилана), и подходящая температура может поддерживаться в вакуумных трубопроводах (например, приблизительно 145°С).

В другом примере силан или производное силана (например, жидкий норборненсилан) может быть осаждено внутри стеклянного флакона, который помещают в стеклянный вакуумный эксикатор, в котором находится основа 12 с нанесенной на нее пористой молекулярной сеткой 14. Затем эксикатор может быть откачан до достижения давления, составляющего от приблизительно 15 мТорр до приблизительно 30 мТорр (что приблизительно составляет от 0,13 до 0,26 Па), и помещен в печь, находящуюся при температуре, составляющей от приблизительно 60°С до приблизительно 125°С. После протекания силанизации эксикатор извлекают из печи, охлаждают и уравновешивают с атмосферой.

Осаждение из газовой фазы, способ YES и/или способ, выполняемый в вакуумном эксикаторе, могут быть проведены с использованием различных силанов или производных силанов, таких как силаны или производные силана, включающие циклоалкеновый ненасыщенный фрагмент, такой как норборнен, производное норборнена (например, гетеронорборнен, включающий вместо одного из атомов углерода атом кислорода или азота), транс-циклооктен, производные транс-циклооктена, транс-циклопентен, транс-циклогептен, транс-циклононен, бицикло[3,3,1]нон-1-ен, бицикло[4,3,1]дец-1(9)-ен, бицикло[4,2,1]нон-1(8)-ен и бицикдо[4,2,1]нон-1-ен. Любой из названных циклоалкенов может быть замещен, например, группой R, такой как водород, алкил, алкенил, алкинил, циклоалкил, циклоалкенил, циклоалкинил, арил, гетероарил, гетероалициклил, аралкил или гетероалициклилалкил. Один из примеров производного норборнена включает [(5-бицикло[2,2,1]гепт-2-енил)этил]триметоксисилан. В других примерах указанные способы могут быть применены, если силан или производное силана включает ненасыщенный циклоалкиновый фрагмент, такой как циклооктин, производное циклооктина или бициклононины (например, бицикло[6,1,0]нон-4-ин или его производные, бицикло[6,1,0]нон-2-ин или бицикло[6,1,0]нон-3-ин). Такие циклоалкины могут быть замещены любой из групп R, рассмотренных в настоящей работе.

В результате присоединения силана или производного силана к по меньшей мере некоторым из открытых участков 18 основы образуются активированные подложки 22. Поскольку силан или производное силана реагирует с основой 12 и не реагирует со структурой 16, соответствующие активированные подложки 22 образуются на открытых участках 18 основы. В этом примере активированные подложки 22 изолированы друг от друга с помощью структуры 16.

Затем на активированные подложки 22 может быть нанесен полимерный слой 24. Полимерный слой 24 может быть получен из полужесткого полимерного материала, проницаемого для жидкостей и газов. Тип молекул, используемых для образования полимерного слоя 24, может быть выбран таким образом, чтобы они преимущественно реагировали с активированными подложками 22, а не с пористой молекулярной сеткой 14. В некоторых случаях молекулы могут быть весьма реакционноспособными по отношению к активированным подложкам 22 и иметь весьма малое сродство или не иметь сродства к пористой молекулярной сетке. Это улучшает специфичность реакционной способности молекул и позволяет молекулам образовывать соответствующие полимерные слои 24 на активированных подложках 22, а не на пористой молекулярной сетке 14.

Один из примеров полимерного слоя 24 включает акриламидный сополимер, такой как сополимер N-(5-азидоацетамидилпентил)акриламида и акриламида (англ. poly(N-(5-azidoacetamidylpentyl)acrylamide-co-acrylamide, сокращенно PAZAM). PAZAM и некоторые другие формы акриламидных сополимеров имеют следующую структуру (I):

где:

R¹ представляет собой Н или необязательно замещенный алкил;

R^A выбран из группы, состоящей из азидогруппы, необязательно замещенной аминогруппы, необязательно замещенного алкенила, необязательно замещенного гидразона, необязательно замещенного гидразина, карбоксила, гидроксигруппы, необязательно замещенного тетразола, необязательно замещенного тетразина, нитрилоксида, нитрона и тиола;

каждый из R⁵, R₆ и R₈ независимо выбран из группы, состоящей из Н и необязательно замещенного алкила;

каждая из групп -(СН₂)_р- может быть необязательно замещена;

p представляет собой целое число, составляющее от 1 до 50;

n представляет собой целое число, составляющее от 1 до 50000; и

m представляет собой целое число, составляющее от 1 до 100000.

Специалисту в данной области техники должно быть понятно, что расположение повторяющихся элементов "n" и "m" в структуре (I) является неограничивающим примером, и мономерные субъединицы могут присутствовать в структуре полимера в любом порядке (например, в виде неупорядоченного полимера, блок-полимера, структурированного полимера или комбинации таких полимеров).

Молекулярная масса PAZAM может составлять от приблизительно 10 кДа до приблизительно 1500 кДа, или в одном из конкретных примеров она может составлять приблизительно 312 кДа.

В некоторых примерах PAZAM представляет собой линейный (неразветвленный) полимер. В некоторых других примерах PAZAM представляет собой сшитый до невысокой степени полимер.

В других примерах полимерный слой 24 может быть образован вариантом структуры (I). В одном из примеров акриламидная единица может быть заменена N,N-диметилакриламидом В этом примере акриламидная единица в структуре (I) может быть заменена на звено в котором каждый из R₆, R₇ и R₈ представляет собой Н, и каждый из R₉ и R₁₀ представляет собой метильную группу (вместо Н в случае акриламида). В этом примере q может представлять собой целое число, составляющее от 1 до 100000. В другом примере наряду с акриламидным звеном может быть применен N,N-диметилакриламид. В этом примере наряду с повторяющимися звеньями "n" и "m" структура (I) может включать единицу в которой каждый из R₆, R₇ и R₈ представляет собой Н, и каждый из R₉ и R₁₀ представляет собой метильную группу. В этом примере q может представлять собой целое число, составляющее от 1 до 100000.

Следует понимать, что для формирования полимерного слоя 24 могут быть применены другие молекулы, при условии, что их функциональные группы способны взаимодействовать с активированными подложками 22 и наносимым впоследствии праймером (праймерами) 26. Другие примеры молекул, подходящих для образования полимерного слоя 24, включают материалы, имеющие коллоидную структуру, такие как агароза, или полимерную сетку, такие как желатин, или поперечно-сшитую полимерную структуру, такие как полиакриламидные полимеры и сополимеры, не содержащий силана акриламид (англ. silane free acrylamide, сокращенно SFA) или азидолизированый вариант SFA. Примеры подходящих полиакриламидньк полимеров могут быть синтезированы из акриламида и акриловой кислоты или акриловой кислоты, содержащей винильную группу, или из мономеров, которые вступают в реакции [2+2] фотоциклоприсоединения. Другие примеры подходящих молекул, подходящих для образования полимерного слоя 24, включают смешанные сополимеры акриламидов и акрилатов.

Как было указано в настоящей работе, молекула, используемая для формирования полимерного слоя 24, не имеет сродства (или имеет очень малое сродство) к расширенной пи-системе пористой молекулярной сетки 14, и, таким образом, полимерный слой 24 образуется на активированной подложке 22, а не на пористой молекулярной сетке 14. Молекула (например, PAZAM) может быть осаждена нанесением покрытия центрифугированием или нанесением покрытия маканием или окунанием или пропусканием функционализированной молекулы под действием положительного или отрицательного давления или другим подходящим способом. Функционализированная молекула может присутствовать в составе смеси. В одном из примеров смесь включает PAZAM в воде или в смеси этанола и воды. Молекула реагирует с образованием полимерного слоя 24 на активированных подложках 22, а не на пористой молекулярной сетке 14.

После нанесения в виде покрытия молекула также может быть подвергнута отверждению, которое приводит к образованию полимерного слоя 24 на каждой из активированных подложек 22. В одном из примеров отверждение функционализированной молекулы может быть произведено при температуре, составляющей от комнатной температуры (например, приблизительно 25°С) до приблизительно 95°С, в течение времени, составляющего от приблизительно 1 миллисекунды до приблизительно нескольких суток. В другом примере продолжительность отверждения может составлять от 10 секунд до по меньшей мере 24 часов. В другом примере продолжительность отверждения может составлять от приблизительно 5 минут до приблизительно 2 часов.

Закрепление полимерного слоя 24 на активированных подложках 22 может быть произведено ковалентным связыванием. Ковалентное связывание полимерного слоя 24 с активированными подложками 22 позволяет удерживать находящееся на поверхности химическое вещество 20 на соответствующих изолированных участках в течение всего срока службы готовой проточной ячейки, применяемой в различных областях. Ниже приведены некоторые примеры реакций, которые могут протекать между активированными подложками 22 и полимерным слоем 24.

Если силан или производное силана включает в качестве ненасыщенного фрагмента норборнен или производное норборнена, то норборнен или производное норборнена может: i) вступать в реакцию 1,3-биполярного циклоприсоединения с азидом/азидогруппой PAZAM; ii) вступать в реакцию сочетания с группой тетразина, присоединенной к PAZAM; вступать в реакцию циклоприсоединения с группой гидразона, присоединенной к PAZAM; вступать в фото-клик реакцию с группой тетразола, присоединенной к PAZAM; или вступать в реакцию циклоприсоединения с группой нитрилоксида, присоединенной к PAZAM.

Если силан или производное силана в качестве ненасыщенного фрагмента включает циклооктин или производное циклооктина, то циклооктин или производное циклооктина мог/т: i) вступать в протекающую под действием напряжения реакцию азид-алкинного 1,3-цикпоприсоединения (англ. strain-promoted azide-alkyne 1,3-cycloaddition, сокращенно SPAAC) с азидом/азидогруппой PAZAM или ii) вступать в протекающую под действием напряжения реакцию алкин-нитрилоксидного циклоприсоединения с нитрилоксидной группой, присоединенной к PAZAM.

Если силан или производное силана в качестве ненасыщенного фрагмента включает бициклононин, то бициклононин под воздействием напряжения в бицикпической кольцевой системе может вступать в аналогичную реакцию циклоприсоединения алкина согласно механизму SPAAC с азидами или нитрилоксидами, присоединенными к PAZAM.

Для закрепления праймера 26 на полимерных слоях 24 выполняют прививку. Праймер 26 может представлять собой любой праймер прямой амплификации или праймер обратной амплификации, который включает функциональную алкинную группу, или праймер с другой концевой группой. Другие примеры праймеров с другой концевой группой, которые могут быть применены согласно изобретению, включают праймер с концевой группой тетразина, праймер с концевой азидогруппой, праймер с концевой аминогруппой, праймер с концевой эпоксидной или глицидильной группой, праймер с концевой тиофосфатной группой, праймер с концевой тиольной группой, праймер с концевой альдегидной группой, праймер с концевой гидразиновой группой и праймер с концевой группой тиазолиндиона. Также может быть применена смесь праймеров. Конкретные примеры подходящих праймеров включают праймеры Р5 и/или Р7, которые имеются на поверхности коммерчески доступных проточных ячеек, поставляемых Illumina inc. для секвенирования на платформах HISEQ™, HISEQX™, MISEQ™, MISEODX™, MINISEQ™, NEXTSEQ™, NEXTSEQDX™, NOVASEQ™, ISEQ™, GENOME ANALYZERS и т.д. и других инструментальных платформах.

В одном из примеров прививка может быть выполнена проточным осаждением (например, с применением временно закрепленной крышки), нанесением покрытия маканием, нанесением покрытия распылением, нанесением покрытия распределением раствора или любым другим подходящим способом, который позволяет закреплять праймер (праймеры) 26 на полимерных слоях 24. В каждом из примеров методики может быть применен раствор праймера или смесь, содержащая праймер, которые могут включать праймер (праймеры), воду, буфер и катализатор.

Нанесение покрытия маканием может включать погружение основы 12 (на которой имеются активированные подложки 22 и полимерные слои 24) в серию ванн с регулируемой температурой. В ваннах также может иметься регулировка потока, и/или они могут находиться в атмосфере азота. Ванны могут содержать раствор или смесь, включающие праймер. При пропускании через различные ванны происходит присоединение праймера (праймеров) 26 к функциональной группе (группам) полимерных слоев 24. В одном из примеров основу 12 вводят в первую ванну, содержащую раствор или смесь, включающие праймер, и в ванне протекает реакция присоединения праймера (праймеров) 26, после чего основу перемещают в следующие ванны для промывки. Перемещение из одной ванны в другую может быть произведено с помощью автоматического манипулятора или вручную. При нанесении покрытия маканием также может быть применена система сушки.

Нанесение покрытия распылением может быть выполнено распылением раствора праймера или смеси, содержащей праймер, непосредственно на основу 12 (на которой размещены активированные подложки 22 и полимерные слои 24). Многослойная пластина с покрытием, нанесенным распылением, может быть подвергнута инкубации в течение времени, составляющего от приблизительно 4 минут до приблизительно 60 минут, при температуре, составляющей от приблизительно 0°С до приблизительно 70°С. После инкубации раствор праймера или смесь, содержащая праймер, могут быть разбавлены и удалены с помощью, например, устройства для нанесения покрытия центрифугированием.

Нанесение покрытия распределением раствора может быть выполнено способом, включающим налив и центрифугирование, и, таким образом, оно может быть выполнено с помощью устройства для нанесения покрытия центрифугированием. Раствор праймера или смесь, содержащая праймер, могут быть нанесены (вручную или автоматизированным способом) на основу 12 (на которой размещены активированные подложки 22 и полимерные слои 24). Наносимый раствор праймера или смесь, содержащая праймер, могут быть нанесены на или распределены по всей поверхности, включая структуру 16. Основа 12 с покрытием, содержащим праймер, может быть подвергнута инкубации в течение времени, составляющего от приблизительно 2 минут до приблизительно 60 минут, при температуре, составляющей от приблизительно 0°С до приблизительно 80°С. После инкубации раствор праймера или смесь, включающая праймер, могут быть разбавлены и удалены с помощью, например, устройства для нанесения покрытия центрифугированием.

Праймеры 26 реагируют с функциональными группами полимерных слоев 24 и не имеют сродства к расширенной пи-системе пористой молекулярной сетки 14. Таким образом, праймеры 26 прививаются к полимерному слою 24, а не к пористой молекулярной сетке 14.

В другом примере способа нанесение поверхностного химического вещества 20 может быть произведено до и после нанесения пористой молекулярной сетки. В подобных примерах активацию поверхности основы производят до нанесения пористой молекулярной сетки 14, и образование полимерного слоя 24 и прививку праймера 26 производят после нанесения пористой молекулярной сетки.

В этом примере (открытую) поверхность основы 12 подвергают плазменному травлению, что приводит к генерации на поверхности основы 12 агента (агентов), активирующего поверхность (например, -ОН групп). Отмечено, что добавление -ОН групп может снизить сродство основы 12 к пористой молекулярной сетке (которая гидрофобна), и, таким образом, условия и продолжительность плазменного травления можно регулировать таким образом, чтобы поверхность не была слишком гидрофильной.

В этом примере на активированную поверхность основы наносят пористую молекулярную сетку 14, в результате чего открытыми остаются дискретные участки активированной поверхности основы. В результате нанесения пористой молекулярной сетки 14 на активированную основу образуются активированные подложки 22.

Кроме того, в этом примере затем на активированные подложки 22 может быть селективно нанесен полимерный слой 24, как указано в настоящей работе, и, как указано в настоящей работе, на полимерный слой 24 могут быть привиты праймеры 26.

На Фиг. 2 представлен пример проточной ячейки 10, полученной способом, представленным на Фиг. 1А и Фиг. 1В (например, создание структуры и нанесение поверхностного химического вещества 20). Несмотря на то, что показан единственный вид праймера 24, следует понимать, что могут быть привиты два или более различных праймера 24.

В этом примере размеры X и Y каждого из дискретных участков, покрытых находящимся на поверхности химическим веществом 20, по существу соответствуют размерам X и Y каждой из пор пористой молекулярной сетки 14. Поры пористой молекулярной сетки 14 позволяют упорядочение наносить на поверхность химическое вещество 20 с точностью до нанометра.

В других примерах селективно удаляемая пористая молекулярная сетка 14 может быть удалена с основы 12 при выполнении способа и уже не присутствовать в виде части проточной ячейки при проведении последующей операции секвенирования. Пример такого способа 100 показан на Фиг. 3А и пример получаемой проточной ячейки 10' показан на Фиг. 3В. Способ 100 включает нанесение пористой молекулярной сетки 14 на основу 12 для определения паттерна открытых участков 18 основы (условное обозначение 102); активацию открытых участков 18 основы с образованием активированных подложек 22 (условное обозначение 104); удаление пористой молекулярной сетки 14, при котором активированные подложки 22 остаются неповрежденными и разделенными промежуточными участками 28 основы (условное обозначение 104); нанесение соответствующего полимерного слоя 24 на каждую из активированных подложек 22 (условное обозначение 106); и прививку праймера 26 на каждый из соответствующих полимерных слоев 24 (условное обозначение 108). Применение способа 100 может быть желательным, если молекулы пористой молекулярной сетки 14 могут взаимодействовать с флуорофорами, применяемыми при проведении операции секвенирования. Некоторые флуорофоры могут склеиваться с некоторыми примерами пористой молекулярной сетки 14. Такое взаимодействие нарушает или оказывает другие нежелательное воздействие на операцию секвенирования, поскольку меченные флуорофорами анализируемые вещества, присоединенные к пористой молекулярной сетке 14, не могут взаимодействовать с матрицей (англ. template) секвенирования. В этих примерах может быть применен способ 100, в котором для создания активированных подложек 22 (участков закрепления оставшегося поверхностного химического вещества 20) эффективно применяют пористую молекулярную сетку 14 и затем удаляют пористую молекулярную сетку 14, чтобы она не препятствовала проведению последующей операции секвенирования. В этих примерах удаляют отпечаток пористой молекулярной сетки 14, исключая ее потенциальное влияние.

В способе 100 пористая молекулярная сетка 14 может быть образована так, как рассмотрено в настоящей работе, и активация может быть произведена так, как рассмотрено в настоящей работе, с использованием силана или производного силана. В этом примере при активации открытых участков 18 основы в порах силаном или производным силана размеры X и Y каждой из дискретных активированных подложек 22 (и, таким образом, каждого из участков, на поверхность которых нанесено химическое вещество 20) соответствуют размерам X и Y каждой из пор пористой молекулярной сетки 14.

По окончании формирования активированных подложек 22, в способе 100 производят удаление пористой молекулярной сетки 14. Химическая природа пористой молекулярной сетки 14 позволяет воздействовать на нее любому из реагентов-окислителей, рассмотренных в настоящей работе. Реагент-окислитель может быть нанесен на пористую молекулярную сетку 14 (и на оставшуюся часть основы 12) с помощью любой подходящей методики нанесения. Воздействие реагента-окислителя снимает пористую молекулярную сетку 14 с основы 12 (например, посредством десорбции) в результате окисления диимида. Реагент-окислитель не реагирует с активированными подложками 22, и, таким образом, эти активированные части основы 12 остаются интактными для участия в последующих реакциях. После удаления пористой молекулярной сетки 14 основа 12 и находящиеся на ней активированные подложки 22 могут быть промыты (например, водой).

В результате удаления пористой молекулярной сетки 14 обнажаются части основы 12, которые в настоящем описании названы промежуточными участками 28. Промежуточные участки 18 могут быть непрерывными (и иметь тот же паттерн, что и пористая молекулярная сетка 14), в то время как силанизированные участки 22 являются дискретными.

В способе 100 полимерные слои 24 могут быть сформированы так, как рассмотрено в настоящей работе. В этих примерах молекула, применяемая для образования полимерного слоя 24, не имеет сродства к основе 12, и, таким образом, полимерный слой (слои) 24 селективно образуется на силанизированной подложке (подложках) 22, а не на промежуточных участках 28 основы 12. В способе 100 прививка 26 праймера также может быть выполнена так, как рассмотрено в настоящей работе.

Проточные ячейки 10, 10', рассмотренные в настоящей работе, могут быть применены для осуществления множества различных методик или способов секвенирования, включающих методики, часто называемые секвенированием синтезом (англ. sequencing-by-synthesis, сокращенно SBS), циклическим секвенированием массивов, секвенированием лигированием, пиросеквенированием и т.д. При применении любой из перечисленных методик праймер (праймеры) 26 присутствует в виде части находящегося на поверхности химического вещества 20 не на структуре 16 или не на промежуточных участках 28, и поэтому секвенирование ограничено площадью, покрытой находящимся на поверхности химическим веществом 20.

В качестве примера можно указать, что реакция секвенирования синтезом (SBS) может быть проведена в такой системе, как системы секвенирования HISEQ™, HISEQX™, MISEQ™, MISEQDX™, MINISEQ™, NOVASEQ™, NEXTSEQDX™ или NEXTSEQ™ или любая другая система секвенирования, поставляемая Illumina, Inc. (San Diego, CA). При проведении SBS для определения последовательности нуклеотидов в матрице отслеживают удлинение (достройку) праймера секвенирования вдоль матрицы нуклеиновой кислоты (т.е. матрицы секвенирования). Химическим процессом, лежащим в основе этого способа, может быть полимеризация (например, катализируемая ферментом полимеразой) или лигирование (например, катализируемое ферментом лигазой).

В одном из конкретных способов SBS с применением полимеразы в проточную ячейку 10, 10' вводят матрицу библиотеки нуклеиновых кислот, и матрица библиотеки нуклеиновых кислот гибридизуется с праймером 26. Совокупность матриц библиотеки нуклеиновых кислот гибридизуется, например, с одним из двух типов праймеров 26, иммобилизованных на проточной ячейке 10, 10'. Затем может быть выполнена генерация кластеров. В одном из примеров генерации кластеров матрицы библиотеки нуклеиновых кислот копируются с гибридизованных праймеров 26 достройкой по 3'-концу под действием высокоточной (англ. high-fidelity) ДНК полимеразы. Исходные матрицы библиотеки нуклеиновых кислот подвергают денатурации, в результате которой остаются копии, иммобилизованные в местах локализации праймеров 26. Для амплификации иммобилизованных копий может быть применена изотермическая мостиковая амплификация. Например, скопированные матрицы скручиваются для гибридизации с соседним комплементарным праймером 26, и полимераза копирует скопированные матрицы с образованием двухцепочечных мостиков, которые подвергают денатурации с образованием двух одноцепочечных нитей. Эти две нити скручиваются и гибридизуются с соседними комплементарными праймерами 26 и вновь достраиваются, образуя две новые двухцепочечные петли. Процесс повторяется на каждой копии матрицы при проведении циклов изотермической денатурации и амплификации с целью получения плотных клональных кластеров. Каждый кластер двухцепочечных мостиков подвергается денатурации. В одном из примеров цепочку с обратной ориентацией удаляют специфическим отщеплением основания, в результате чего остаются матричные цепочки с прямой ориентацией.

Концы 3' матриц и любые праймеры 26 мог/т быть заблокированы для предотвращения нежелательного инициирования (примирования, англ. priming). В проточную ячейку 10, 10' может быть введен праймер секвенирования. Поскольку праймер секвенирования комплементарен адаптору матричной цепочки нуклеиновой кислоты, он будет гибридизоваться с адаптором (например, прочтение 1 праймера секвенирования матрицы).

Флуоресцентно меченые нуклеотиды присоединяются к матрице (достраивая праймер секвенирования) в соответствии со строением матрицы, и, таким образом, для определения последовательности матрицы может быть применено определение порядка и типа нуклеотидов, добавляемых к праймеру. Например, для инициирования первого цикла SBS в/через проточный канал и т.д., в котором находится массив праймеров 26, к которым присоединены матричные цепочки, может быть доставлен один или более меченых нуклеотидов, ДНК полимераза и т.д. Достройка праймера секвенирования вызывает встраивание меченого нуклеотида, и это встраивание может быть обнаружено с помощью визуализации. При визуализации система освещения (не показана) может испускать излучение, возбуждающее находящееся на поверхности химическое вещество 20.

В некоторых примерах нуклеотиды могут дополнительно обладать свойством обратимого терминатора, который позволяет предотвращать последующее удлинение праймера после добавления нуклеотида. Например, к праймеру секвенирования вдоль матричной цепочки может быть добавлен нуклеотидный аналог, содержащий фрагмент обратимого терминатора, в результате чего последующее удлинение не может произойти до тех пор, пока не будет добавлен деблокирующий агент, способный удалить этот фрагмент. Таким образом, в тех примерах, в которых применяют обратимые терминаторы, в проточный канал и т.д. может быть направлен деблокирующий реагент (до или после обнаружения).

Между различными этапами подачи текучих сред может быть проведена промывка (промывки). Затем цикл SBS может быть повторен n раз для удлинения праймера секвенирования на n нуклеотидов, в результате чего может быть определена последовательность длины n.

Несмотря на то, что был подробно рассмотрен способ SBS, следует понимать, что проточные ячейки 10, 10', рассмотренные в настоящей работе, могут быть применены в других протоколах секвенирования, для генотипирования или в других химических и/или биологических анализах. В другом примере проточные ячейки 10, 10', рассмотренные в настоящей работе, могут быть применены для генерации библиотеки на клетках.

Проточная ячейка для электрического обнаружения

В другом примере, рассмотренном в настоящей работе, проточная ячейка включает основу; расположенную на основе селективно удаляемую пористую молекулярную сетку, определяющую открытые участки основы; и находящееся на поверхности химическое вещество для секвенирования, расположенное на по меньшей мере некоторых из открытых участков, где находящееся на поверхности химическое вещество включает наноструктуру и фермент, присоединенный к наноструктуре.

Один из примеров способа получения такой проточной ячейки показан на Фиг. 4 и на Фиг. 5А - Фиг. 5С.

Как показано на Фиг. 4, способ 200 включает образование закрытой трафаретом основы посредством нанесения пористой молекулярной сетки 14 на поверхность основы 12, на которой имеются собранные наноструктуры, таким образом, что по меньшей мере часть каждой наноструктуры остается открытой (условное обозначение 202); и воздействие на закрытую трафаретом основу раствором фермента, инертного по отношению к пористой молекулярной сетке 14, что приводит к селективному присоединению соответствующего фермента к по меньшей мере некоторым из открытых частей наноструктуры (условное обозначение 204).

На Фиг. 5А схематично представлен вид сверху основы 12, на которой собраны наноструктуры. Основа 12 может представлять собой любой из примеров основы, рассмотренных в настоящей работе.

На Фиг. 5А наноструктура обозначена условным обозначением 30. Наноструктура 30 представляет собой электропроводящий канал датчика 32 заряда, который также включает электроды 34, 34'. Употребляемый в настоящей работе термин "датчик заряда" означает устройство обнаружения, которое преобразует возмущения на его поверхности или в окружающем его электрическом поле в электрический сигнал. Например, датчик 32 заряда может преобразовывать момент доставки или выхода реакционного компонента в электрический сигнал. В некоторых примерах датчик 32 заряда также может преобразовывать в электрический сигнал взаимодействия между двумя реакционными компонентами (например, матричной нуклеиновой кислоты и нуклеотида). Примером датчика 32 заряда является транзистор с управлением полем (также называемый полевым транзистором, англ. field effect transistor, сокращенно FET), такой как FET на основе углеродных нанотрубок (англ. carbon nanotube transistor, сокращенно CNT), FET на основе одностенных углеродных нанотрубок (англ. single-wailed carbon nanotube transistor, сокращенно SWNT), FET на основе кремниевой нанопроволоки (SiNW), FET на основе полимерной нанопроволоки и FET на основе графеновых нанополос (и соответствующие нанополосные FET, получаемые из 2D материалов, таких как MoS₂, силицен и т.д.). В полевом транзисторе ток протекает по токопроводящей дорожке (электропроводящий канал/наноструктура 30), которая соединена с двумя электродами 34, 34' (источником и стоком). Проводимость канала между источником и стоком перекрывают и возобновляют с помощью третьего (вентильного) электрода, который может быть соединен емкостным соединением через тонкий слой диэлектрика.

Может быть применена наноструктура 30 любого типа, при условии, что она может служить электропроводящим каналом для датчика 32 заряда. Примеры материалов, подходящих для получения электропроводящих каналов, включают проводники (например, металлы, материалы на основе углерода, некоторые оксиды металлов, электропроводящие полимеры и т.д.) или полупроводники (например, кремний, оксиды других металлов и т.д.). Наноструктура 30 может иметь любую подходящую геометрическую форму, такую как трубка, проволока, полоса и т.д., и по меньшей мере один размер (например, длина, ширина, диаметр и т.д.) наноструктуры 30 может находиться в нанодиапазоне. В различных примерах наноструктура 30 представляет собой электропроводный канал, включающий материал, выбранный из группы, состоящей из проводника и полупроводника, и имеет геометрическую форму, выбранную из группы, состоящей из трубки, проволоки и полосы. Некоторые специфические примеры наноструктуры 30 включают углеродную нанотрубку (CNT), односменную углеродную нанотрубку (SWCN), кремниевую на но проволоку (SiNW), полимерную нанопроволоку, нанополосу (например, графеновую нанополосу, нанополосу, получаемую из 2D материалов, таких как MoS₂, силицен и т.д.) или любую другую наноструктуру, которая может служить электропроводящим каналом датчика 32 заряда. В одном из примеров наноструктура 30 представляет собой кремниевую нанопроволоку. В другом примере наноструктура представляет собой углеродную нанотрубку.

Как показано на Фиг. 5А, противоположные концы наноструктуры 30 находятся в электрическом соединении с соответствующими электродами 34, 34'. Может быть применен любой подходящий материал электродов, который может быть химическим и электрическим образом присоединен к наноструктуре 30. Примеры подходящих материалов электродов включают золото, платину, углерод, оксид индия-олова и т.д.

В некоторых примерах сборка датчика (датчиков) 32 заряда на основе 12 может включать формирование электродов 34, 34' и формирование наноструктуры 30 между электродами 34, 34' с помощью любой подходящей методики, такой как непосредственный рост, прикапывание раствора или различные методики печати. В одном из примеров углеродная нанотрубка может быть получена с помощью дугового разряда, лазерной абляции, диспропорционирования моноксида углерода при высоком давлении или химического осаждения из газовой фазы (ХОГФ). В другом примере кремниевая нанопроволока (SiNW) может быть получена из кремнийорганического предшественника травлением твердого вещества или катализируемым выращиванием из паров или жидкой фазы.

Каждый датчик 32 заряда может быть подключен индивидуально (и, таким образом, его состояние отслеживается индивидуально). Другими словами, электроды 34, 34' любого индивидуального датчика 32 заряда могут быть соединены с электронной схемой, которая регулирует его работу (например, после соединения со средством обнаружения и источником питания). Электронная схема может иметь возможность электрического соединения со средством обнаружения и с источником питания.

Расположение датчиков 32 заряда на основе 12 может частично зависеть от геометрии структуры 16 и, в особенности, пор пористой молекулярной сетки 14, которая должна быть образована на основе 12. Частично это объясняется тем фактом, что пористая молекулярная сетка 14 самособирается на основе 12 и на датчиках 32 заряда, и поэтому желательно, чтобы по меньшей мере часть наноструктуры 30 была локализована в порах пористой молекулярной сетки 14. Пористая молекулярная сетка 14 может быть частично осаждена на поверхности наноструктуры 30 для ограничения количества функциональных групп, образующихся на наноструктуре 30 и/или для сохранения должного расстояния между биомолекулами, присоединенными к наноструктурам 30, и/или для пассивации участков датчика 32 заряда с целью предотвращения взаимодействия реагентов (например, растворов солей и т.д.) с пассивированными участками.

Как показано условным обозначением 202 на Фиг. 4, способ 200 включает образование закрытой трафаретом основы посредством нанесения пористой молекулярной сетки 14 на поверхность основы 12, на которой таким образом размещены наноструктуры 30, что по меньшей мере часть каждой наноструктуры 30 остается открытой. Пористая молекулярная сетка 14 может быть заранее собрана в растворе и затем осаждена на основу 12, как рассмотрено в настоящей работе.

Пористая молекулярная сетка 14 самособирается на поверхности основы 12 и в некоторых случаях на компонентах (30, 34, 34) датчика 32 заряда в зависимости, по меньшей мере частично, от размера пор и размера и расположения датчика 32 заряда. После осаждения пористая молекулярная сетка 14 самособирается таким образом, что части основы 12 и/или части датчиков 32 заряда, находящиеся на основе 12 в порах, оказываются открытыми. При этом образуется закрытая трафаретом основа, показанная на Фиг. 5В. Для простой и ясной иллюстрации пористой молекулярной сетки 14 и датчиков 32 заряда, каждый датчик 32 заряда на Фиг. 5В показан открытым и расположенным в соответствующей поре пористой молекулярной сетки 14. Однако следует понимать, что индивидуальные поры пористой молекулярной сетки 14 имеют меньшие размеры, чем датчик 32 заряда и в некоторых случаях меньшие размеры, чем наноструктура 30. Таким образом, пористая молекулярная сетка 14 может закрывать электроды 34, 34' и/или некоторую часть или всю наноструктуру 30 датчиков 32 заряда, а не только открытую основу 12. Пример пористой молекулярной сетки 14, располагающейся поверх электродов 34, 34' и некоторой части наноструктуры 30, показан на Фиг. 6. Следует понимать, что участки, которые закрыты пористой молекулярной сеткой 14, и участки, которые открываются в порах пористой молекулярной сетки 14, частично зависят от размеров и расположения датчиков 32 заряда и самосборки пористой молекулярной сетки 14. В примерах, рассмотренных в настоящей работе, по меньшей мере в некоторых из пор пористой молекулярной сетки 14 остаются открытыми участки по меньшей мере некоторой доли наноструктуры 30; тем не менее, следует понимать, что некоторые наноструктуры 30 могут быть полностью закрыты пористой молекулярной сеткой 14, и/или что участки основы 12 также могут быть оставаться открытыми в некоторых порах.

После этого способ 200 включает воздействие на закрытую трафаретом основу раствором фермента, инертного по отношению к пористой молекулярной сетке 14. Термин "инертный" означает, что раствор фермента не соединяется с или не реагирует с пористой молекулярной сеткой, и, таким образом, ферменты, находящиеся в растворе, селективно присоединяются к по меньшей мере некоторым из открытых частей наноструктуры 30. Инертность раствора фермента может объясняться гидрофильностью раствора и гидрофобностью пористой молекулярной сетки 14. Пористая молекулярная сетка 14 является сопряженной и, таким образом, очень гидрофобна. Раствор фермента гидрофилен (по сравнению с пористой молекулярной сеткой 14) и, таким образом, не соединяется с или не реагирует с пористой молекулярной сеткой 14. Таким образом, при воздействии на закрытую трафаретом основу раствором фермента находящиеся в растворе ферменты могут присоединяться к любой из открытых частей наноструктуры 30, но не к пористой молекулярной сетке 14. Поскольку пористая молекулярная сетка 14 может закрывать некоторые участки поверхности некоторой части или всей наноструктуры 30, только небольшие участки этой наноструктуры (наноструктур) 30 могут оставаться открытыми в порах. Функционализация, которая может быть произведена на любой из наноструктур 30, ограничена этими небольшими открытыми частями, что может повышать специфичность присоединения биомолекул. В некоторых примерах на небольшой открытой части наноструктуры может закрепляться один фермент, что может улучшать чувствительность датчика 32 заряда.

Раствор фермента может включать фермент 36 (как таковой или в комбинации с присоединенным к нему соединительным элементом 38) и жидкий носитель фермента. Жидкий носитель представляет собой водный раствор. В одном из примеров в качестве жидкого носителя может быть применен солевой раствор.

В примерах, рассмотренных в настоящей работе, желательно, чтобы один фермент 36 присоединялся к одной наноструктуре 30 (как показано на Фиг. 5С и Фиг. 6). Для выполнения этого условия применяемый фермент 36 может быть выбран таким образом, чтобы его гидродинамический радиус в растворе был близок к размеру того участка наноструктуры 30, который может оставаться открытым в поре структуры 16. Под выражением "близкий" подразумевают то, что гидродинамический радиус может на 50% превышать размер поры или составлять на 50% менее размера поры пористой молекулярной сетки. Примером подходящего фермента 36 является полимераза. Примеры подходящих ДНК-полимераз включают полимеразы, отнесенные в соответствии со структурной гомологией к семействам, обозначаемым А, В, С, D, X, Y и RT. ДНК-полимеразы Семейства А включают, например, Т7 ДНК-полимеразу, эукариотическую митохондриальную ДНК-полимеразу y, Е. coli ДНК Pol I, Thermys aquaticus Pol I и Bacillus stearothermophilus Pol I. ДНК-полимеразы Семейства В включают, например, эукариотические ДНК-полимеразы α, δ и ε; ДНК-полимеразу ζ; Т4 ДНК-полимеразу, Phi29 ДНК-полимеразу и RB69 бактериофагиальную ДНК-полимеразу. Примеры Семейства С включают, например, альфа-субъединицу ДНК-полимеразы III Е. coli. Примеры Семейства D включают, например, полимеразы, полученные из субдомена Euryarchaeota домена Archaea. ДНК-полимеразы Семейства X включают, например, эукариотические полимеразы Pol β, Pol σ, Pol λ и Pol μ и S. cerevisiae Pol4. ДНК-полимеразы Семейства Y включают, например, Pol η., Pol йота, Pol каппа, Е. coli Pol IV (DINB) и Е. coli Pol V (UmuD'2C). Семейство RT (сокр. от англ. "reverse transcriptase", что означает "обратная транскриптаза") ДНК-полимераз включает, например, обратные транскриптазы ретровирусов и эукариотические теломеразы.

Фермент 36 может быть непосредственно присоединен к открытому участку наноструктуры 30 или опосредованно присоединен к открытому участку наноструктуры 30, например, через соединительный элемент 38 (показанный на Фиг. 6). Соединение между ферментом 36 и открытым участком наноструктуры 30 или между ферментом 36 и соединительным элементом 38 и между соединительным элементом 38 и открытым участком наноструктуры 30 может быть ковалентным или нековалентным, что может зависеть от типа материала наноструктуры 30, фермента 36 и любого применяемого соединительного элемента 38. В одном из примеров соединение выполнено способом с применением никель-нитрилуксусной кислоты/гистидиновой метки (nickel NTA/His tag).

Соединительный элемент 38 может быть применен как якорь для фермента 36 (например, полимеразы). Примеры подходящих соединительных элементов 38 включают полиэтиленгликоль (ПЭГ), цепочку ДНК, цепочку пептиднуклеиновой кислоты (ПНК), цепочку алифатического углеводорода и т.д. В некоторых примерах длина соединительного элемента 38 достаточна для удержания фермента 36 на расстоянии по меньшей мере 10 нм от наноструктуры 30. Это может быть желательным, например, для того, чтобы конформационные изменения полимеразы (или другого фермента 36), заряды полимеразы (или другого фермента 36) и/или заряды целевой/матричной полинуклеотидной цепочки, удерживаемой полимеразой (или другим ферментом 36), не препятствовали сенсорному обнаружению с помощью наноструктуры 30.

Воздействие на закрытую трафаретом основу раствором фермента может сопровождаться нагреванием для проведения сочетания фермента 36 или соединительного элемента 38 с открытой частью (частями) любой наноструктуры (наноструктур) 30. Однако, следует понимать, что некоторые реакции сочетания (например, амидное сочетание) могут протекать при комнатной температуре (например, составляющей от приблизительно 18°С до приблизительно 25°С), и, таким образом, необходимость добавочного нагревания может определяться типом фермента 36 или соединительного элемента 38, наноструктуры 30 и типом реакции сочетания, протекающей между компонентами 36 и 30 или 38 и 30.

Пример проточной ячейки 10'', показанный на Фиг. 6, получен способом 200. Несмотря на то, что каждая из наноструктур 30 массива может быть функционализирована ферментом 36, следует понимать, что в некоторых примерах реакция сочетания может протекать не по всей наноструктуре 30, и, таким образом, лишь некоторая часть (но не вся) наноструктуры 30 в массиве может быть функционализирована ферментом 36. В этом примере проточной ячейки 10'' пористая молекулярная сетка 14 может оставаться на основе 12 и на закрытых участках датчика 32 заряда при последующем проведении операции секвенирования. Поскольку обнаружение производят электронным устройством, и оно не включает применения флуорофоров, гидрофобная пористая молекулярная сетка 14 может направлять вводимые реагенты (которые гидрофильны) к функционализированной ферментом наноструктуре 30.

Несмотря на то, что это не показано на Фиг. 6, следует понимать, что каждый датчик 32 заряда также может включать средства обнаружения, которые могут воспринимать электрический ответ индивидуального датчика 32. В одном из примеров каждое из средств обнаружения представляет собой амперметр.

Проточная ячейка 10'', рассмотренная в настоящей работе, может быть применена для обнаружения встраивания под воздействием полимеразы в одну молекулу (т.е. для обнаружения события встраивания нуклеотида в растущую цепочку). В частности, датчики 32 заряда мог/т отслеживать динамику реакций единственной молекулы.

Для исследования одной молекулы матричная полинуклеотидная цепочка может быть введена в проточную ячейку 10''. Матричная полинуклеотидная цепочка может представлять собой любой образец, подвергаемый секвенированию, и она может состоять из ДНК, РНК или их аналогов (например, пептидных нуклеиновых кислот). Источником матричной (или целевой) полинуклеотидной цепочки может быть геномная ДНК, информационная РНК или другие нуклеиновые кислоты, полученные из природных источников.

Матричная полинуклеотидная цепочка может удерживаться на месте полимеразой (один из примеров фермента 36), которая непосредственно или опосредованно присоединена к наноструктуре 30. Матричная полинуклеотидная цепочка может быть введена в биологически стабильный раствор наряду с реагентами, такими как нуклеотид (нуклеотиды), встраиваемые в растущую цепочку, образующуюся вдоль матричной полинуклеотидной цепочки. Биологически стабильный раствор может представлять собой любой буфер, подходящий для полимеразных реакций встраивания основания, таких как полимеразная цепная реакция (ПЦР) или линейная амплификация. В одном из примеров биологически стабильный раствор может включать буфер, рН которого составляет приблизительно 7, концентрация солей составляет более нескольких миллимоль, и концентрация ионов Mg²⁺ составляет порядка миллимолей.

По меньшей мере некоторые вводимые нуклеотиды могут включать основание, комплементарное целевой нуклеиновой кислоте матричной полинуклеотидной цепочки. Частично нуклеотид удерживается на месте полимеразой, которая также связана с матричной полинуклеотидной цепочкой. Связанный нуклеотид изменяет сигнал датчика 32 заряда, который считывается средствами обнаружения.

Следует понимать, что после анализа одной молекулы (нуклеотида) с помощью датчика (датчиков) 32 заряда, проточная ячейка 10'' может быть подвергнута воздействию деструктурирующего реагента, такого как реагенты-окислители, рассмотренные в настоящей работе. В этом примере деструктурирующий реагент отщепляет связанный нуклеотид от полимеразы, а также окисляет диимид пористой молекулярной сетки 14, что приводит к отщеплению пористой молекулярной сетки 14 от основы 12.

Проточная ячейка 10'' может быть применена повторно после введения структурообразующего реагента (включающего пористую молекулярную сетку, заранее собранную в растворе), который образует новую пористую молекулярную сетку 14 на основе 12 вокруг датчиков 32 заряда, после чего в ячейку вводят образец, который включает нуклеотид (нуклеотиды), которые впоследствии встраиваются в следующую целевую нуклеиновую кислоту матричной полинуклеотидной цепочки. Обнаружение одной молекулы, удаление структуры и повторное создание структуры могут быть многократно повторены для анализа всей матричной полинуклеотидной цепочки.

Рассмотренная проточная ячейка 10'' также может быть применена повторно в других операциях секвенирования с другой матричной полинуклеотидной цепочкой.

Крышки для проточных ячеек

Примеры, показанные на Фиг. 2, Фиг. 3В и Фиг. 6, представляют собой примеры проточных ячеек 10, 10', 10'', на которых не закреплены крышки. Несмотря на то, что это не показано, проточные ячейки 10, 10', 10'' могут иметь крышки, закрепленные на по меньшей мере части основы 12. Крышка может быть расположена на основе 12 таким образом, что она определяет один проточный канал или совокупность жидкостно разделенных проточных каналов. Следует понимать, что в проточном канале (каналах) на поверхности присутствуют химические вещества 20, 20' (как одиночные, так и в виде массива).

Крышки для проточных ячеек 10, 10' (которые применяют для оптического обнаружения) могут быть изготовлены из любого материала, который прозрачен для возбуждающего излучения, направляемого на находящееся на поверхности химическое вещество 20. Например, крышка может быть изготовлена из стекла (например, боросиликатного стекла, плавленого оксида кремния и т.д.), полимера или подобного материала. Коммерчески доступным примером подходящего боросиликатного стекла является стекло D 263®, поставляемое Schott North America, Inc. Коммерчески доступными примерами подходящих полимерных материалов, а именно, циклоолефиновых полимеров, являются продукты ZEONOR®, поставляемые Zeon Chemicals L.P. Крышки для проточных ячеек 10'' (которые применяют для электронного обнаружения) могут быть изготовлены из любого материала, включающего прозрачные материалы или любой другой требуемый материал. Крышка может быть закреплена с помощью любой подходящей методики, такой как лазерная сварка, диффузионная сварка, анодная сварка, пайка эвтектическим сплавом, плазмоактивируемое соединение, стеклокристаллический припой или другие способы, известные в данной области техники.

Система обнаружения

Один из примеров системы 40 обнаружения, рассматриваемый в настоящей работе, показан на Фиг. 7. Эта система 40 включает проточную ячейку 10'' и представляет собой электронную систему 40 обнаружения. В этом примере в качестве проточной ячейки 10'' представлена съемная проточная ячейка 10'', но следует понимать, что проточная ячейка 10'' может быть на постоянной основе включена в систему 40 или может быть извлекаемой из системы 40. В примере извлекаемой ячейки съемная проточная ячейка 10'' может быть извлечена и заменена новой съемной проточной ячейкой 10'', например, для проведения других операций секвенирования. Система 40 обнаружения представляет собой один из примеров, и следует понимать, что могут быть применены другие конфигурации системы.

Примером системы 40 обнаружения является электронная система обнаружения, которая включает корпус 42, который содержит различные фиксированные компоненты, включающие, например, электрические компоненты, компьютерные компоненты, источник питания, вентилятор (воздуходувку) и подобные компоненты. Система может включать экран 44, например, на передней поверхности корпуса 42, который может служить графическим интерфейсом для пользователя и может предоставлять различную информацию, такую как рабочее состояние, состояние текущей аналитической процедуры (например, цикла секвенирования), состояние передачи данных к или от устройства 40, инструкции по применению, предупреждения или подобную информацию. На передней поверхности корпуса 42 также расположен резервуар 46. Резервуар 46 может включать две секции, отделение, относящееся к обслуживанию проточной ячейки, и отделение, относящееся к резервуару для картриджа с реагентами. Съемная проточная ячейка 10'' может постоянно находиться в отделении резервуара 46 для обслуживания проточной ячейки, или съемная проточная ячейка 10'' может быть помещена в отделение резервуара 46 (и извлечена из нее). Если съемная проточная ячейка 10'' постоянно находится в отделении резервуара 46 для обслуживания проточной ячейки, то резервуар 46 может включать одно окно 50 для размещения картриджа с реагентами в отделении резервуара для картриджа с реагентами. Если в отделение резервуара 46 для обслуживания проточной ячейки помещают заменяемую проточную ячейку 10'', то резервуар 46 может включать два окна 48, 50, одно из которых предназначено для введения съемной проточной ячейки 10'', а другое предназначено для размещения картриджа с реагентами. Окно (окна) 48, 50 может иметь защитную дверцу (дверцы).

Система 40 обнаружения может включать индикатор 52 состояния, который в этом примере представляет собой индикаторную лампочку на раме резервуара 46. Индикатор 52 состояния может указывать наличие или отсутствие картриджа с реагентами и/или заменяемой проточной ячейки 10''.

Как показано, проточная ячейка 10'' включает основу 12 и крышку 54. Как стационарная, так и заменяемая съемная проточная ячейка 10'' также может включать отверстия 56, 58 для впуска и выпуска текучих сред, которые позволяют доставлять объем реагентов к датчику (датчикам) 32 заряда (Фиг. 5А) съемной проточной ячейки 10''.

Система 40 для секвенирования также может включать систему доставки реагентов для селективного введения реагента (реагентов) во впускное отверстие 56 для текучих сред съемной проточной ячейки 10'' с протеканием по датчикам 32 с последующим извлечением через выпускные отверстия 58 для текучих сред, имеющиеся в съемной проточной ячейке 10''. Система доставки реагентов может включать трубки или другие жидкостные системы, которые могут быть стационарно или съемным образом присоединены к отверстиям 56, 58. Система доставки реагентов также может включать трубки или другие жидкостные системы, которые могут быть соединены рабочим соединением с картриджем 60 с реагентами. Система доставки реагентов также может включать насос или другое подходящее оборудования для извлечения реагента (реагентов) из картриджа 60 с реагентами и его подачи во впускное отверстие 56 для текучих сред в соответствии с протоколами секвенирования и удаления структуры /создания структуры (например, согласно способу применения съемной проточной ячейки 10'', рассмотренному в настоящей работе).

Различные реагенты могут быть поданы из картриджа 60 с реагентами в съемную проточную ячейку 10''. Картридж 60 с реагентами включает корпус, защищающий различные компоненты системы для работы с текучими средами, такие как резервуары, жидкостные соединения, насосы, клапаны и подобные компоненты. В одном из примеров картридж 60 с реагентами включает систему для хранения текучих сред, которая включает резервуар 62 для деструктурирующего реагента и деструктурирующий реагент (например, реагент-окислитель), содержащийся в резервуаре 62 для деструктурирующего реагента; резервуар для структурообразующего реагента, включающий два раздельных отделения 64, 66, где первый компонент структурообразующего реагента (например, меламин или его аналог) содержится в первом из двух раздельных отделений 64, и второй компонент структурообразующего реагента (например, PTCDI или его аналог) содержится во втором из двух раздельных отделений 66. Картридж 60 с реагентами также может включать отделение 68 для образца, которое может включать подотделения для матричной полинуклеотидной цепочки (которую подвергают секвенированию) и для образцов, включающих нуклеотиды (которые встраиваются в растущую цепочку, образующуюся вдоль матричной полинуклеотидной цепочки). Картридж 60 с реагентами может быть запрограммирован для высвобождения матричной полинуклеотидной цепочки и образца (образцов) во время секвенирования, для высвобождения деструктурирующего реагента с целью удаления закрепленного нуклеотида и пористой молекулярной сетки 14 и для высвобождения структурообразующих реагентов с целью образования новой пористой молекулярной сетки 14. Картридж 60 с реагентами также может включать смесительную камеру, в которую направляют структурообразующие реагенты для предварительной сборки перед их подачей на основу 12 съемной проточной ячейки 10''.

Дополнительные замечания

Следует понимать, что все комбинации приведенных выше признаков и дополнительных признаков, более подробно рассмотренных ниже (при условии, что эти признаки не являются взаимоисключающими) составляют часть предмета изобретения, рассмотренного в настоящей работе. В частности, все комбинации раскрытых предметов изобретения, очевидные после прочтения предлагаемого описания, составляют часть предмета изобретения, рассмотренного в настоящей работе. Также следует понимать, что употребляемая в настоящем описании терминология, которая также может употребляться в любом документе, включенном в настоящее описание посредством ссылки, должна иметь значение, в наибольшей мере соответствующее конкретным признакам, рассмотренным в настоящей работе.

Упоминание в настоящем описании "одного примера", "другого примера", "примера" и т.д. означает, что конкретный элемент (например, элемент, структура и/или характеристика), раскрытый при описании этого примера, включен в по меньшей мере один пример, рассмотренный в настоящей работе, и может присутствовать или может отсутствовать в других примерах. Кроме того, следует понимать, что, если из контекста не ясно иное, то рассмотренные элементы любого примера могут быть скомбинированы в различных примерах любым подходящим образом.

Термины "по существу" и "приблизительно", упоминаемые в настоящем описании, включая формулу изобретения, применены для описания и объяснения небольших отклонений, например, обусловленных вариациями при обработке. Например, эти отклонения могут составлять меньше или быть равными плюс/минус 5%, например, составлять меньше или быть равными плюс/минус 2%, например, составлять меньше или быть равными плюс/минус 1%, например, составлять меньше или быть равными плюс/минус 0,5%, например, составлять меньше или быть равными плюс/минус 0,2%, например, составлять меньше или быть равными плюс/минус 0,1%, например, составлять меньше или быть равными плюс/минус 0,05%.

Кроме того, следует понимать, что приведенные в настоящем описании диапазоны включают указанные диапазоны и любые величины или поддиапазоны, находящиеся в пределах указанного диапазона, как если бы такие величины или поддиапазоны были ясно обозначены. Например, диапазон, составляющий от 1 до 50, включает не только явным образом упомянутые пределы от 1 до 50, но также включает индивидуальные величины, такие как приблизительно 15, 22,5, 45 и т.д., и поддиапазоны, такие как от приблизительно 20 до приблизительно 48 и т.д.

Несмотря на то, что некоторые примеры были описаны подробно, следует понимать, что рассмотренные примеры могут быть модифицированы. Таким образом, приведенное выше описание не является ограничивающим.

1. Проточная ячейка, включающая:

основу;

расположенную на основе селективно удаляемую самособранную пористую молекулярную сетку, определяющую паттерн открытых участков основы; и

наноструктуру, расположенную по меньшей мере на некоторых из открытых участков, и полимеразу, присоединенную к наноструктуре, и наноструктура представляет собой электропроводный канал, включающий материал, выбранный из группы, состоящей из проводника и полупроводника, и имеет геометрическую форму, выбранную из группы, состоящей из трубки, проволоки и полосы,

где селективно удаляемая самособранная пористая молекулярная сетка представляет собой планарную надмолекулярную сетку из амина и диимида.

2. Проточная ячейка по п. 1, в которой амин представляет собой меламин или его аналог, и диимид представляет собой диимид перилентетракарбоновой кислоты или его аналог.

3. Проточная ячейка по п. 1, в которой одна полимераза присоединена к одной наноструктуре.

4. Проточная ячейка по п. 1, в которой наноструктура соединена электрическим соединением с двумя электродами.

5. Проточная ячейка по п. 1, дополнительно включающая соединительный элемент, присоединяющий полимеразу к наноструктуре.

6. Проточная ячейка по п. 1, в которой наноструктура выбрана из группы, состоящей из кремниевой нанопроволоки и углеродной нанотрубки.

7. Система для секвенирования, включающая:

съемную проточную ячейку, включающую:

основу;

расположенную на основе селективно удаляемую самособранную пористую молекулярную сетку, определяющую паттерн открытых участков основы, где селективно удаляемая самособранная пористая молекулярная сетка представляет собой планарную надмолекулярную сетку из амина и диимида;

наноструктуру, присоединенную к каждому из открытых участков основы, причем наноструктура представляет собой электропроводный канал, включающий материал, выбранный из группы, состоящей из проводника и полупроводника, и имеет геометрическую форму, выбранную из группы, состоящей из трубки, проволоки и полосы;

полимеразу, присоединенную к по меньшей мере некоторым из наноструктур; и

отверстия для впуска и выпуска текучих сред;

резервуар для i) постоянного размещения съемной проточной ячейки или ii) для введения съемной проточной ячейки; и

жидкостную систему для селективной подачи в съемную проточную ячейку деструктурирующего реагента с целью удаления с основы селективно удаляемой самособранной пористой молекулярной сетки и селективной подачи в съемную проточную ячейку структурообразующего реагента с целью нанесения новой селективно удаляемой самособранной пористой молекулярной сетки на основу.

8. Система для секвенирования по п. 7, в которой жидкостная система включает резервуар для картриджа для размещения картриджа с реагентами, включающего по меньшей мере деструктурирующий реагент и структурообразующий реагент.

9. Система для секвенирования по п. 8, дополнительно включающая картридж с реагентами, где картридж с реагентами включает:

систему для хранения текучих сред, включающую:

резервуар для деструктурирующего реагента;

деструктурирующий реагент, содержащийся в резервуаре для деструктурирующего реагента;

резервуар для структурообразующего реагента, включающий два раздельных отделения;

первый компонент структурообразующего реагента, содержащийся в первом из двух раздельных отделений; и

второй компонент структурообразующего реагента, содержащийся во втором из двух раздельных отделений.

10. Система для секвенирования по п. 9, в которой:

деструктурирующий реагент включает реагент-окислитель;

первый компонент структурообразующего реагента представляет собой диимид перилентетракарбоновой кислоты или его аналог; и

второй компонент структурообразующего реагента представляет собой меламин или его аналог.

11. Система для секвенирования по п. 10, в которой реагент-окислитель выбран из группы, состоящей из перманганатов, перборатов, галогенов, перхлоратов и пероксидов.

12. Способ получения проточной ячейки по п. 1, включающий:

образование закрытой трафаретом основы посредством нанесения самособирающейся пористой молекулярной сетки на поверхность основы, на которой расположены наноструктуры, где самособирающаяся пористая молекулярная сетка представляет собой планарную надмолекулярную сетку из амина и диимида, и где самособирающаяся пористая молекулярная сетка самособирается, образуя паттерн открытых участков основы, так что по меньшей мере часть каждой наноструктуры остается открытой; и

воздействие на закрытую трафаретом основу раствором полимеразы, инертной по отношению к самособранной пористой молекулярной сетке, что приводит к селективному присоединению соответствующей полимеразы к по меньшей мере некоторым из открытых частей наноструктур.

13. Способ по п. 12, в котором нанесение самособирающейся пористой молекулярной сетки включает:

нагревание насыщенной смеси диимида перилентетракарбоновой кислоты или его аналога и меламина или его аналога;

осаждение насыщенной смеси на основу, к которой была присоединена нанопроволока; и

охлаждение осажденной насыщенной смеси.