Способ очистки l-фукозы от ферментационного бульона

Изобретение относится к пищевой промышленности. Предложен способ очистки L-фукозы от ферментационного бульона, согласно которому проводят удаление биомассы посредством центрифугирования и/или фильтрации из ферментационного бульона, содержащего L-фукозу, с получением осветленного раствора. Получение очищенного раствора путем подвергания осветленного раствора обработке на катионообменнике и обработке на анионообменнике. Удаление солей из очищенного раствора путем электродиализа и/или нанофильтрации, где биомасса содержит клетки, которые продуцируют L-фукозу. Изобретение обеспечивает эффективное выделение L-фукозы из ферментационного бульона. 16 з.п. ф-лы, 7 ил., 3 табл., 7 пр.

 

Настоящее изобретение относится к эффективному способу выделения L-фукозы из ферментационного бульона. L-Фукоза, содержащаяся в ферментационном бульоне, образуется в результате ферментации с использованием микроорганизмов (бактерий и дрожжей). Способ по изобретению включает стадию удаления биомассы из ферментационного бульона, стадию подвергания полученного раствора по меньшей мере одной обработке на катионообменнике и одной обработке на анионообменнике и стадию удаления солей после обработки на ионообменнике. Применение данного способа может обеспечить получение L-фукозы в порошковой форме, в гранулированной форме, а также в форме кристаллической L-фукозы.

Углеводы принимают участие во всех формах жизни, играя жизненно важные роли в запасании энергии, структурной функции, передаче сигнала, сохранении информации и так далее. Для решения этих задач в природе синтезируются несколько основных моносахаридов, таких как глюкоза, N-ацетилглюкозамин, манноза, N-ацетилманнозамин, фруктоза, фукоза, рибоза, L-фукоза, ксилоза и так далее, и несколько вспомогательных моносахаридов для более специализированных применений, такие как, например, D-аллоза.

L-Фукоза (6-дезокси-L-галактоза) представляет собой один из так называемых редко встречающихся моносахаридов. Она обнаружена во многих природных продуктах как в D-, так и в L-форме: в виде L-фукозы (также называемой рамнозой) и D-фукозы (CAS (Химическая реферативная служба) 3615-37-0). Самой распространенной в природе является L-форма. L-Фукоза представляет собой простую молекулу для применения в научных исследованиях и разработках и является характерным компонентом структуры гликанов. Научные исследования в области фукозилированных веществ показали, среди прочего, что они имеют очень важное значение для эмбрионального развития и вовлечены в иммунный ответ организма.

L-Фукоза и фукозилированные олиго- и полисахариды представляют особый интерес для химической, пищевой, косметической и фармацевтической промышленности, поскольку они обладают огромным потенциалом для применения в питании и биомедицине (Hauber et al., 2008, Int. J. Med. Sci., 5: 371-376.; Isnard et al., 2005, Ophthalmologics 219: 324-333; Robert et al., 2004, Biomed. Pharmacother., 58: 123-128; Wild et al., 2002, Cells Tissues Organs. 172: 161-173; Adam et al., 1997, Am. J. Respir. Care Med., 155: 2102-2104). В дополнение к этому, фукозилированные производные известны своими противоаллергическими и эмульгирующими свойствами. Также известно, что поступающая с пищей L-фукоза может быть использована для синтеза фукозилированных гликанов посредством пути реутилизации L-фукозы, имеющегося у млекопитающих. Таким образом, наличие L-фукозы важно для развития головного мозга и иммунной системы. Доказательством важности этого также служит существование синдрома дефицита адгезии лейкоцитов II типа, врожденного расстройства метаболизма фукозы.

В клетках млекопитающих L-фукоза присутствует в фукозилированных гликанах, таких как антигены группы крови АВО и олигосахариды грудного молока. L-Фукоза и фукозилированные олигосахариды или белки также представляют большой интерес для химической, фармацевтической и нутрицевтической промышленности.

L-Фукозу также обнаруживают, среди прочих веществ, в женском грудном молоке в концентрации приблизительно (0,5 г/л). Женскому грудному молоку придается важная роль в здоровом развитии детей. Вещества, содержащиеся в нем, в частности, олигосахариды (олигосахариды грудного молока (НМО)), являются одними из основных твердых компонентов грудного молока и имеют коровую структуру, которая содержит лактозное звено на редуцирующем конце и является разветвленной, или цепь заканчивается молекулой N-ацетиллактозамина. Структурная изменчивость усиливается благодаря модификациям остатка фукозы в концевых положениях. Если говорить о пользе для здоровья и развития, то биологическая функция НМО являлась объектом многочисленных исследований, но для ее выяснения требуется техническая очистка данных соединений в достаточных количествах. Из предшествующего уровня техники известно о получении L-фукозы либо путем непосредственной экстракции из природных источников, либо путем химической модификации моносахаридов (РТ Vanhooren et al., 1999, J. Chem., Technol., Biotechnol., 74, 479).

Несмотря на то, что некоторые моносахариды могут быть получены из природных источников в больших количествах и с разумными затратами (например, глюкоза, N-ацетилглюкозамин и фруктоза), большинство моносахаридов являются довольно редкими веществами и могут быть обнаружены в природе лишь в небольших количествах, такие как, например, L-фукоза (6-дезокси-L-галактоза).

В случае промышленного производства моносахаридов, в качестве источников используют почти исключительно олигосахариды, полученные из природных источников. Эти олигосахариды подвергают кислотному гидролизу и из высвободившихся моносахаридов выделяют индивидуальные сахара. Вследствие высокого химического сходства моносахаридов (отличающихся друг от друга главным образом только ориентацией индивидуальных гидроксильных групп) разделение индивидуальных моносахаридов в чистой форме является довольно трудоемким и дорогостоящим процессом.

Природными источниками L-фукозы являются полисахариды из растений, таких как морские водоросли (фукоидан, сульфатированный полимер на основе фукозы), картофель, соевые бобы и так далее. В растениях фукоза обычно входит в состав полисахаридов, имеющих L-фукопиранозильные звенья на концах или внутри полисахарид ной цепи. Другим важным источником L-фукозы являются внеклеточные полисахариды бактерий, грибов и микроскопических водорослей.

L-Фукоза может быть получена из природных источников, например, может происходить из водорослей или бактерий, с использованием различных методов экстракции. Эти редко встречающиеся вещества природного происхождения, используемые для извлечения L-фукозы, обычно представляют собой многокомпонентные смеси. В настоящее время L-фукозу получают посредством гидролиза этих сложных олигосахаридов. Выделение L-фукозы, обладающей достаточной степенью чистоты, является труднодостижимой процедурой и представляет собой проблему уровня данной области техники.

Для очистки отдельных моносахаридов из сложных гидролизатов зачастую должны быть применены токсичные химические реагенты. Например, в US 3240776 раскрыт способ экстрагирования L-фукозы, согласно которому L-фукозу выделяют путем применения ацетата свинца и избыточных количеств органических растворителей.

Поэтому выделение отдельных моносахаридов из сложного гидролизата олигосахаридов представляется проблематичным (вследствие большого химического сходства этих высвобождающихся отдельных моносахаридов) и вредного воздействия на окружающую среду (вследствие чрезмерного применения токсичных химических реагентов, таких как карбонат свинца).

Кроме того, в природе наличие олигосахаридов, богатых определенным сахаром, может быть довольно лимитировано и также сильно варьировать вследствие сезонных изменений. L-Фукоза происходит главным образом из полисахарида фукоидана, фукана моносульфата, присутствующего во всех обычных бурых морских водорослях, входящих в семейства Fucaceae и Laminariaceae (Black, WAP (1954): The seasonal variation in the combined L-fucose content of the common british Laminariaceae and Fucaceae. J. Sci. Food Agric, 5, 445-448).

На сегодняшний день L-фукозу получают в больших количествах главным образом благодаря сбору бурых морских водорослей, принадлежащих семейству Fucaceae, которые можно найти по всему миру, но в больших количествах на европейском побережье Атлантического океана. Крупномасштабный сбор бурых морских водорослей с морского побережья приводит к экологическим проблемам и ограничивается законами об охране окружающей среды. L-Фукоза и L-фукозосодержащие вещества являются предметом постоянных исследований.

Например, в JP 2000351790 раскрыт способ экстрагирования фукоидана и получения и выделения фукозосодержащего олигосахарида из экстрагированного фукоидана.

В WO 2012/034996 А1 показано, что L-фукоза также может быть получена путем гидролиза содержащих L-фукозу бактериальных полисахаридов природного происхождения. В этом документе раскрыт штамм, принадлежащий семейству Enterobacteriaceae, при этом штамм способен продуцировать внеклеточные полисахариды, которые содержат L-фукозу. Чтобы получить L-фукозу, полисахариды, продуцируемые данным штаммом, извлекают и подвергают гидролизу, например, путем обработки серной кислотой или трифторуксусной кислотой.

Помимо экстрагирования L-фукозы из гидролизатов поли- или олигосахаридов были разработаны различные способы получения L-фукозы путем синтеза. Исходным веществом в таких способах получения являются другие моносахариды, такие как L-арабиноза, D-галактоза, L-рамноза, D-манноза и D-глюкоза. Используя наиболее эффективный путь синтеза исходя из редко встречающегося моносахарида L-рамнозы, можно добиться эффективного синтеза L-фукозы (Defaye et al., 1984, Carbohydr. Res., 126, 165-169). Как правило, эти методы химического синтеза часто демонстрируют довольно низкие выходы и включают несколько стадий химических превращений. Для осуществления химического синтеза L-фукозы следует, помимо включения нескольких стадий синтеза, применять большой объем химических реакций для введения защитных групп. В общем, нет доказательств экономической целесообразности крупномасштабного химического синтеза моносахаридов по сравнению с экстрагированием L-фукозы из полисахаридов, собранных из природных источников.

Обычно для извлечения L-фукозы необходимы сложные методы разделения, такие как хроматография с использованием анионо- или катионообменных смол, диализ, фракционная кристаллизация и т.д., в зависимости от природы сопутствующих Сахаров или родственных сахарам соединений (WO 2005/040430 А1).

В JP 63027496 описывается прямая экстракция L-фукозы из водорослей, принадлежащих семейству Chordariaceae или Spermatochnaceae. Эти водоросли диспергировали в воде и обрабатывали концентрированной серной кислотой. Полученный раствор гидролизованных водорослей охлаждали и нерастворенные вещества удаляли фильтрованием. Значение рН фильтрата подводили до 5, фильтрат обрабатывали активированным углем и фильтровали. Для того, чтобы расщепить и удалить другие сахара, отличающиеся от L-фукозы, к фильтрату добавляли дрожжи. Смесь обрабатывали активированным углем и фильтровали. Фильтрат обрабатывали с использованием катионо- и анионообменных смол для деионизации и концентрировали. Концентрированный раствор сахара смешивали с этанолом и оставляли кристаллизоваться. Таким способом получали L-фукозу с чистотой 98,7%.

В одной из публикаций описывается выделение пектинов из нерастворимого в этаноле остатка свекловичного жома (Rombouts et al., 1986, Carbohydrate Research, 154: 177-187). Выделенные пектины очищали хроматографией на DEAE(диэтиламиноэтил)-целлюлозе или путем осаждения с использованием CuSO₄. Пектины имели относительно высокое содержание нейтральных сахаров. Основными нейтральными сахарами в каждом пектине были арабиноза и галактоза; другими присутствующими сахарами были рамноза, L-фукоза, ксилоза, манноза и глюкоза. L-Фукозу из смеси сахар/пектин не выделяли.

Таким образом, на сегодняшний день для получения любого моносахарида в чистой форме необходимо приложить значительное усилие, чтобы отделить желаемый моносахарид от других моносахаридов в смеси, зачастую с вовлечением больших объемов органических растворителей и других токсичных химических реагентов. Как следствие, огромной помощью было бы исключительное накопление одного желаемого моносахарида, типа, например L-фукозы. Однако, большинство микроорганизмов имеют ограничения с точки зрения видов моносахаридов, которые они способны использовать. Помимо этого, они часто отдают значительное предпочтение определенным моносахаридам в том случае, когда в качестве источника углерода одновременно доступны несколько моносахаридов.

Другим возможным способом получения L-фукозы является химический синтез. В результате деоксигенирования D-галактозы по атому углерода в положении С-6 образуется D-фукоза. Однако, эта методология нецелесообразна в случае синтеза L-фукозы, поскольку L-галактоза недоступна в больших количествах. L-Фукоза может быть получена из L-арабинозы в результате сложной последовательности реакций с участием многочисленных промежуточных соединений. Инверсия конфигурации при атоме С-5 и деоксигенирование по С-6 в D-глюкозе приводит к получению L-фукозы в результате осуществления многостадийной методики.

L-Фукоза также может быть получена путем химического синтеза из L-арабинозы (Tanimura, 1961, Chem. Abstr., 55: 12306), из D-глюкозы (Chiba, Т. & Tejima, 1979, Chem. Pharm. Bull., 27: 2838-2840), из метил-L-рамнозы (Defaye, J., et al., 1984, Carbohydrate Res., 126: 165-169), из D-маннозы (Gesson, J-P et al., 1992, Tetrahedron Lett., 33: 3637-3640) и из D-галактозы (Dejter-Juszynski, M & Flowers, H-M., 1973, Carbohydrate Res., 28: 144-146). С использованием мультиферментной системы был осуществлен ферментативный синтез L-фукозы и ее аналогов из фукулозо-6-фосфата (см. WO 97/15683 А1).

Для получения L-фукозы исходя из D-маннозы необходимы стереоселективное удлинение цепи по С-1 и отщепление концевой гликоль-содержащей части. В случае L-рамнозы, как 6-дезоксигексозы, для получения L-фукозы необходимы ОН-инверсии, а именно, при атомах С-2 и С-4. По-видимому, D-галактоза являлась наиболее подходящим исходным веществом для получения L-фукозы, поскольку нет необходимости в выполнении инверсии: L-фукоза образуется в результате восстановления формильной группы при С-1 и окисления первичного гидроксила при С-6 до формила. Общей характеристикой вышеупомянутых способов является неизбежная временная защита гидроксилов, которые в данном способе не должны подвергаться стадиям инверсии конфигурации, деоксигенации и восстановления и/или окисления. Многократно выполняемые стадии введения защиты/удаления защиты, часто требующие селективных методов, делают эти методологии неэффективными. Помимо этого, в некоторых случаях для трудоемких хроматографических разделений необходимо отделение промежуточных соединений от побочных продуктов.

В WO 2014/067696 А1 впервые описан способ получения L-фукозы с использованием рекомбинантного микроорганизма, обладающего гликозилтрансферазой и гликозидазой, которые действуют совместно для синтеза L-фукозы в свободной форме. Для этого способа необходимы два фермента и акцепторная молекула. Гликозилтрансфераза катализирует перенос фукозы с ГДФ-L-фукозы (гуанозин-дифосфат-L-фукозы) на акцептор, например лактулозу, с получением фукозиллактулозы. Затем фукозилированный акцептор (например, фукозиллактулоза) гидролизуется под действием гликозидазы до акцепторной молекулы и L-фукозы. Далее акцептор снова доступен для фукозилирования под действием применяемой фукозилтрансферазы. Затем L-фукоза высвобождается из клетки путем выделения в среду, после чего она может быть извлечена из супернатанта. Таким образом может быть легко преодолено ингибирование по типу обратной связи ГДФ-фукозного пути и могут быть получены значительные (несколько г/л) количества свободной L-фукозы в результате ферментации с применением микроорганизмов.

Сама L-фукоза и фукозилированные субстраты являются важными исходными веществами в химической и фармацевтической отраслях промышленности, равно как и полезными веществами для изготовления косметических и нутрицевтических средств. Поэтому существует постоянная потребность в инновационных производственных способах получения L-фукозы в промышленном масштабе.

Предложены биотехнологические способы извлечения L-фукозы. Например, в WO 2012/034996 А1 описывается способ получения L-фукозы с использованием выделенного микроорганизма семейства Enterobacteriaceae для ферментативного получения L-фукозы. Однако, L-фукозу получают только после длительной ферментации в виде неочищенной смеси, поэтому для получения L-фукозы необходимы тщательно разработанные дополнительные стадии очистки.

В US 8642297 В2 постулируется общий ферментативный способ, предлагаемый для получения L-фукозы с использованием рекомбинантной маннит-1-дегидрогеназы из Apium graveolens. Однако, для этой цели не описано ни конкретного воплощения, ни примера. Кроме того, не описано никакого альтернативного фермента, который можно было бы использовать для данной реакции.

В WO 2005/087941 А1 раскрыт комбинированный ферментационно-энзиматический способ получения L-фукозы. В этом случае сначала происходит образование L-фукулозы из L-фуцита в результате использования дегидрогеназы из ацетобактерии. Затем из нее на следующей стадии должен быть осуществлен синтез с получением L-фукозы.

Другой способ описывает разделение сложной смеси олигосахаридов посредством анионообменной хроматографии (Derevitskaya et al., 1975, Dokl. Akad. Nauk. SSSR, 223: 1137-1139). В соответствии с данным описанием 2-амино-2-дезоксиглюцит, глюкозамин, галактоза и L-фукоза были успешно разделены из смесей олигосахаридов, забуференных 0,2 М раствором бората, посредством анионообменной хроматографии.

В JP Н11-035591 раскрыт способ получения L-фукозы из фукоидана, полученного из Cladosiphon okamuranus Tokida, или экстракта, содержащего фукоидан. Данный способ представляет собой многостадийный способ, включающий, например, обработки водой и/или кислотой, нейтрализацию, обработки методами диализа и электродиализа и обработку на ионообменнике с использованием щелочного раствора в качестве элюента. В конце L-фукозу кристаллизуют из спирта.

Для получения L-фукозы также был использован ферментативный и микробиологический синтез. L-Фукозу получают посредством ферментативного синтеза из дигидроксиацетонфосфата (DHAP) и DL-лактальдегида, катализируемого L-фукулозо-1-фосфат-альдолазой с последующим взаимодействием с участием кислой фосфатазы и L-фукозоизомеразы. Продукт L-фукозу выделяли хроматографией на Dowex® 50W-X8 (в Ва²⁺-форме), возможно в сочетании с разделением на силикагеле (Wong et al., 1995; J. Org. Chem., 60: 7360-7363).

В ЕР 0102535 A2 раскрыт способ получения дезоксисахаров, выбранных из фукозы и рамнозы, путем ферментации с использованием видов Alcaligenes, Klebsiella, Pseudomonas или Enterobacter, которые продуцируют внеклеточные полисахариды, содержащие более 10% фукозы и/или рамнозы. Описано, что фукоза и/или рамноза могут быть извлечены из гидролизата продукта ферментации посредством хроматографии, ионообменной или адсорбционной (например, с использованием целитов), или посредством дополнительной обработки путем ферментации.

Аналогично, обнаружено, что бактериальный штамм семейства Enterobacteriaceae в аэробных условиях ферментации способен продуцировать L-фукозосодержащие полисахариды, при этом фукоза была отделена и выделена посредством кислотного гидролиза и многочисленных стадий очистки (WO 2012/034996 А1).

Однако, необходимы низкозатратные способы получения фукозилированных лактоз, как например, путем ферментации с использованием трансформированных Е. coli (Drouillard et al., 2006, Angew. Chem, Int. Ed., 45, 1778; WO 2010/070104 A1; WO 2010/142305 A1; WO 2012/097950 A1, WO 2012/112777 A2; Baumgartner et al., 2013, Microb. Cell Fact., 12: 40).

В WO 2015/032412 A1 раскрыт способ получения смеси 2'-фукозиллактозы (2'-FL) и дифукозиллактозы (DFL) с высоким выходом путем культивирования генетически модифицированной клетки, имеющей рекомбинантный ген, который кодирует единственную фукозил-трансферазу, в присутствии лактозы. Для образования L-фукозы с высокими выходами полученную смесь 2'-FL и DFL можно подвергнуть гидролизу, инициируемому кислотой или опосредуемому фукозидазой.

В WO 2016/150629 А1 показан способ биокаталитического и/или ферментативного получения L-фукозы путем использования L-фуцита в качестве исходного вещества. Чтобы преобразовать L-фуцит в L-фукозу в одностадийную реакции, используют галактозооксидазу после выделения на стадии биокатализа или непосредственно в продуцирующих клетках in vivo.

В WO 2016/120448 А1 описан способ ферментативного получения L-фукозы. Описан способ получения моносахарида, например L-фукозы, в свободной форме с использованием процесса микробиологической ферментации. Используемый микроорганизм проявляет гидролазную активность в отношении продуцируемых внутриклеточно активированных нуклеотидами сахаров и высвобождает моносахарид в немодифицированной свободной форме. L-Фукоза в свободной форме транспортируется в культуральный супернатант.

Существующие попытки получения очищенной L-фукозы включали только мелкомасштабные примеры, но на сегодняшний день не существует никакого способа очистки L-фукозы от ферментационного бульона в больших масштабах с достижением чистоты и качества, пригодных для применения в пищевой промышленности.

Цель настоящего изобретения заключалась в разработке способа крупномасштабной (в промышленных масштабах) очистки с получением L-фукозы высокой степени чистоты. В частности, данный способ должен быть пригоден для получения L-фукозы в масштабе от нескольких кг до нескольких тонн с качеством, подходящим для применения в пищевой промышленности, и должен быть пригоден для выполнения в непрерывном режиме.

Данная цель достигается путем разработки способа по п. 1, композиции по п. 18, пищевой композиции по п. 21, жидкого, готового к применению продукта питания для детей грудного или ясельного возраста по п. 28, высушенного распылением продукта в виде смеси для детей грудного возраста по п. 29, пищевой добавки по п. 30, премикса по п. 31 и применения композиции по п. 33. Зависимые пункты формулы изобретения иллюстрируют предпочтительные воплощения.

Согласно изобретению предложен способ очистки L-фукозы от ферментационного бульона. Данный способ включает следующие стадии:

удаление биомассы из ферментационного бульона, содержащего L-фукозу, при этом получается осветленный раствор,

получение очищенного раствора путем подвергания осветленного раствора обработке на катионообменнике с использованием катионообменного носителя, при этом обработку на катионообменнике осуществляют в условиях, при которых L-фукоза проходит через катионообменный носитель и присутствует в проходящем потоке; и

обработке на анионообменнике с использованием анионообменного носителя, при этом обработку на анионообменнике осуществляют в условиях, при которых L-фукоза проходит через анионообменный носитель и присутствует в проходящем потоке; и

удаление солей из очищенного раствора путем электродиализа и/или нанофильтрации.

Способ по изобретению подходит для получения желаемой L-фукозы с высокой степенью чистоты (с качеством, пригодным для применения в пищевой промышленности) и в больших масштабах (в промышленных масштабах в диапазоне от одного кг до нескольких тонн за один цикл). Помимо этого, способ по изобретению может быть осуществлен очень быстро и без больших затрат. Следовательно, он может быть проведен очень экономичным образом. Кроме того, способ может быть осуществлен периодическим или непрерывным образом. Последнее еще больше улучшает выход получаемого продукта в единицу времени. По окончании применения способа чистота L-фукозы может составлять выше 80%, предпочтительно выше 90%, более предпочтительно выше 95%, наиболее предпочтительно по меньшей мере 98%.

Преимущество предложенного способа очистки L-фукозы также заключается в том, что препарат L-фукозы не содержит рекомбинантной ДНК и рекомбинантных белков, происходящих при ферментации из рекомбинантных микробных штаммов, которые используют для получения L-фукозы.

Несмотря на то, что способ по изобретению был задуман для очистки конкретной L-фукозы от ферментационного бульона, указанный способ также может быть применен для очистки L-фукозы, получаемой с использованием ферментативной реакции in vitro, так называемой биокаталитической реакции in vitro, или с использованием метода биокатализа с применением пермеабилизированных цельных клеток. Очевидно, что при очистке L-фукозы из реакционной смеси в случае биокаталитической реакции in vitro нет необходимости в удалении биомассы из реакционной смеси. Таким образом, реакционная смесь в случае биокаталитической реакции in vitro соответствует осветленному технологическому потоку.

Определения

Согласно изобретению, термин "чистота" относится к химической чистоте и конкретизирует степень, до которой вещество, такое как L-фукоза, является неразбавленным или несмешанным с посторонними веществами. Таким образом, химическая чистота представляет собой показатель взаимосвязи между индивидуальным веществом и побочными продуктами/примесями. Химическую чистоту выражают в виде процентного содержания (%) и рассчитывают, используя следующую формулу:

В композиции, содержащей L-фукозу, чистота L-фукозы может быть определена любым подходящим методом, известным специалисту в данной области техники, например, посредством использования высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC). Соответствующий детектор может представлять собой детектор, выбранный из группы, состоящей из электрохимического детектора, рефрактометрического (RI) детектора, масс-спектрометрического (MS) детектора, диодного матричного детектора (DAD) и детектора ядерного магнитного резонанса (ЯМР). Например, в случае HPLC это есть отношение площади под пиком, представляющим количество L-фукозы, к сумме площадей под пиками, представляющими как количество L-фукозы, так и соединений, отличающихся от этой L-фукозы, на одной и той же хроматограмме. Тем не менее, это подразумевает, что выбранным методом с использованием HPLC могут быть проанализированы все примеси. В противном случае необходим подход, основанный на балансе масс, т.е. на определении абсолютного количества желаемого продукта (например, L-фукозы). В указанном подходе в качестве референсного вещества для количественного определения чистоты используют чистые вещества, и чистоту тогда оценивают для полученного продукта в виде сухого вещества (желаемого продукта со всеми примесями). Указанный подход, основанный на балансе масс, также можно использовать для определения чистоты согласно изобретению.

Согласно изобретению, термин "культуральная жидкость" относится к любой жидкости после проведения ферментации, которая содержит L-фукозу, подлежащую очистке. Термины "культуральная жидкость", "ферментационный бульон" и "культуральная среда" используют в данном описании как синонимы. Культуральная жидкость содержит L-фукозу, которая подлежит очистке, а также биомассу (например, биологические клетки и клеточный дебрис), компоненты среды, соли и примеси типа других кислот и окрашенных соединений. Чистота L-фукозы в пределах культуральной жидкости может составлять меньше 80%. Биологическими клетками, содержащимися в культуральной жидкости, являются биологические клетки, которые продуцируют L-фукозу внутриклеточно и секретируют продуцируемую L-фукозу в жидкую культуральную среду. Биологические клетки могут включать или представлять собой генетически модифицированные биологические клетки, например, генетически модифицированные клетки Е. coli. Генетическая модификация может включать или представлять собой модификацию с целью получения L-фукозы, в частности во время фазы роста указанных биологических клеток.

Термин "биомасса", использованный в данном описании, относится ко всей совокупности биологических клеток, находящихся в ферментационном бульоне по окончании стадии ферментации. Биомасса включает в себя клетки микроорганизма, которые продуцировали L-фукозу, дочерние клетки микроорганизма, которые могут утратить свою способность продуцировать L-фукозу в ходе стадии ферментации, а также какие-либо другие клетки, которые случайно находятся в ферментационном бульоне по окончании стадии ферментации. Поэтому, по существу все биологические клетки, находящиеся в ферментационном бульоне по окончании стадии ферментации, отделяют от ферментационного бульона, в результате чего осветленный ферментационный бульон, т.е. технологический поток, по существу не содержит клеток.

Термин "технологический поток" относится к любому раствору, содержащему L-фукозу, которая подлежит очистке.

Термин "проходящий поток" относится к раствору, содержащему L-фукозу, подлежащую очистке, который только что прошел через ионообменный носитель (т.е. катионо- и/или анионообменный носитель), т.е. представляет собой подвижную фазу, содержащую L-фукозу после контакта с твердой фазой ионообменного носителя. Другими словами, L-фукоза, находящаяся в проходящем потоке, не была адсорбирована или не абсорбировалась неподвижной фазой.

Согласно данному изобретению различие между слабым катионообменным носителем и сильным катионообменным носителем заключается в том, что у первого химические группы, подходящие для ионного обмена, имеют значения pKa, составляющие по меньшей мере 1 (например, pKa от 2 до 5, аналогично карбоксилатной группе), тогда как у последнего имеют значения pKa меньше 1 (например, pKa от -4 до 0, аналогично сульфогруппе).

Получение осветленного раствора

Биомасса предпочтительно содержит биологические клетки, которые продуцируют L-фукозу, предпочтительно бактериальные клетки, которые продуцируют L-фукозу, более предпочтительно рекомбинантные бактериальные клетки, которые продуцируют L-фукозу, наиболее предпочтительно рекомбинантные клетки Е. coii, рекомбинантные клетки Bacillus sp.и/или рекомбинантные клетки Corynebacterium sp., в особенности рекомбинантные клетки Bacillus subtilis и/или рекомбинантные клетки Bacillus megaterium, которые продуцируют L-фукозу.

Биомасса может быть удалена из ферментационного бульона посредством центрифугирования и/или фильтрации, при этом фильтрация предпочтительно выбрана из группы, состоящей из микрофильтрации, ультрафильтрации, фильтрации в тангенциальном потоке, диафильтрации и их комбинаций.

В методах центрифугирования, подходящих для удаления биомассы из культуральной жидкости, биомассу получают в виде осадка после центрифугирования, а супернатант в виде осветленного технологического потока, который подвергают дальнейшим обработкам. В методах фильтрации, подходящих для удаления биомассы из культуральной жидкости, фильтрат становится осветленным технологический потоком. Предпочтительным методом фильтрации для удаления биомассы является микрофильтрация и/или ультрафильтрация. При проведении ультрафильтрации могут быть удалены даже более мелкие частицы, чем при использовании микрофильтрации. Возможно, что ультрафильтрация представляет собой ультрафильтрацию в тангенциальном потоке.

Микрофильтрация представляет собой способ физического разделения, при котором содержащую частицы жидкость пропускают через среду, при этом указанная среда представляет собой либо пористое вещество, содержащее извилистые каналы для удерживания частиц (глубинное фильтрование) и/или мембрану с определенным размером пор, позволяющую проходить частицам/молекулам, размер которых меньше указанного размера пор (мембранная фильтрация или тупиковая фильтрация). Термин "микрофильтрация", использованный в данном описании, относится к способу физического разделения, при котором биологические клетки (и клеточный дебрис) удаляют из ферментационного бульона, получая (осветленный) технологический поток.

Ультрафильтрация представляет собой форму мембранной фильтрации, которая радикально не отличается от тупиковой микрофильтрации. При проведении ультрафильтрации силы, создаваемые градиентами давления и концентрации, приводят к удалению частиц и больших молекул растворенных веществ путем пропускания жидкости, содержащей такие частицы и большие молекулы растворенных веществ, через полупроницаемую мембрану, в результате чего частицы и большие молекулы растворенных веществ будут удерживаться в так называемом ретентате, в то время как вода и низкомолекулярные растворенные вещества, такие как L-фукоза, проходят через мембрану в пермеат (фильтрат). Мембраны для ультрафильтрации характеризуются в соответствии с их значением отсечения по молекулярной массе (MWCO), которое описывает максимальную молекулярную массу молекулы растворенного вещества, которая может пройти через мембрану в пермеат. Любые частицы, а также молекулы размером больше MWCO, не способны пройти через мембрану и остаются в ретентате. Ультрафильтрация может применяться в режиме с тангенциальным потоком, когда поток жидкости параллелен поверхности мембраны, или в тупиковом режиме, когда поток жидкости перпендикулярен поверхности мембраны.

Неограничивающие примеры и подходящие фильтры для микрофильтрации и/или ультрафильтрации для удаления биомассы из ферментационного бульона включают SPIRA-CEL® DS МР005 4333, который представляет собой модуль, содержащий полиэфирсульфоновую мембрану с намоткой по спирали для обеспечения компактной конструкции и лучшей производительности и имеющую номинальный размер пор 0,05 мкм для ультрафильтрационных применений. Подходящие мембраны для удаления биомассы посредством микрофильтрации могут иметь размер пор по меньшей мере 0,2 мкм. Альтернативно, удаление биомассы может быть выполнено посредством микрофильтрации с применением мембран, имеющих MWCO от 100 до 1000 кДа, предпочтительно от 150 кДа до 500 кДа, для удаления биомассы и дополнительного клеточного дебриса, такого как более крупные белки. Например, в качестве альтернативы можно использовать FS10-FC FUS1582 (Microdyn-Nadir GmbH, Wiesbaden, DE), ультрафильтрационный модуль на полых волокнах, в котором применяется полиэфирсульфоновая мембрана (5 м²) с MWCO 150000 дальтон (150 кДа).

В дополнительном и/или альтернативном воплощении более мелкие частицы и большие молекулы растворенных веществ удаляют из осветленного технологического потока с использованием ультрафильтрации в тангенциальном потоке. Здесь осветленный технологический поток может быть подвергнут стадии ультрафильтрации с применением фильтра, имеющего MWCO равное 10 кДа, например, Spira-Cel® DSUP010 (Microdyn-Nadir GmbH, Wiesbaden, DE), ультрафильтрационного модуля с намоткой по спирали с использованием полиэфирсульфоновой мембраны (5,7 м²) с MWCO 10000 дальтон (10 кДа).

В итоге, в настоящем изобретении могут быть использованы следующие возможности для удаления биомассы из ферментационного бульона:

1) сбор посредством центрифугирования. Нерастворенные части удаляют из культуральной жидкости за одну стадию. Преимущество: быстрое удаление нерастворенных частей;

2) сбор посредством микрофильтрации. Нерастворенные части и большие молекулы выше определенного размера удаляют из культуральной жидкости за одну стадию. При проведении микрофильтрации можно использовать мембраны с намоткой по спирали или фильтровальное устройство на полых волокнах в режиме с тангенциальным потоком. Можно использовать микрофильтрационные мембраны, которые имеют значение отсечения по молекулярной массе ≥500 кДа, более предпочтительно ≥150 кДа. Преимущество: быстрое удаление нерастворенных частей и больших молекул выше определенного размера;

3) сбор посредством ультрафильтрации. Нерастворенные части, большие молекулы и малые молекулы выше определенного размера удаляют из культуральной жидкости за одну стадию. При проведении ультрафильтрации можно использовать мембраны с намоткой по спирали или фильтровальное устройство на полых волокнах в режиме с тангенциальным потоком. Можно использовать ультрафильтрационные мембраны, которые имеют значение отсечения по молекулярной массе ≤100 кДа, более предпочтительно ≤10 кДа. Преимущество: быстрое удаление нерастворенных частей, больших молекул и малых молекул выше определенного размера;

4) сбор посредством центрифугирования в сочетании с микрофильтрацией. Нерастворенные части и большие молекулы выше определенного размера удаляют из культуральной жидкости за две стадии. При проведении микрофильтрации можно использовать мембраны с намоткой по спирали или фильтровальное устройство на полых волокнах в режиме с тангенциальным потоком. Можно использовать микрофильтрационные мембраны, которые имеют значение отсечения по молекулярной массе ≥500 кДа, более предпочтительно ≥150 кДа. Преимущество: быстрое удаление нерастворенных частей и больших молекул выше определенного размера без забивания пор в мембранах или фильтрах, используемых при проведении микрофильтрации;

5) сбор посредством центрифугирования в сочетании с ультрафильтрацией. Нерастворенные части, большие молекулы и малые молекулы выше определенного размера удаляют из культуральной жидкости за две стадии. При проведении ультрафильтрации можно использовать мембраны с намоткой по спирали или фильтровальное устройство на полых волокнах в режиме с тангенциальным потоком. Можно использовать ультрафильтрационные мембраны, которые имеют значение отсечения по молекулярной массе ≤100 кДа, более предпочтительно ≤10 кДа. Преимущество: быстрое удаление нерастворенных частей, больших молекул и малых молекул выше определенного размера без забивания пор в мембранах или фильтрах, используемых при проведении ультрафильтрации;

6) сбор посредством микрофильтрации в сочетании со стадией ультрафильтрации. Нерастворенные части, большие молекулы и малые молекулы выше определенного размера удаляют из культуральной жидкости за две стадии. При проведении микрофильтрации и/или ультрафильтрации можно использовать мембраны с намоткой по спирали или фильтровальное устройство на полых волокнах в режиме с тангенциальным потоком. Можно использовать микрофильтрационные мембраны, которые имеют значение отсечения по молекулярной массе ≥500 кДа, более предпочтительно ≥150 кДа. Можно использовать ультрафильтрационные мембраны, которые имеют значение отсечения по молекулярной массе ≤100 кДа, более предпочтительно ≤10 кДа. Преимущество: наиболее быстрое удаление нерастворенных частей, больших молекул и малых молекул выше определенного размера со сниженным риском забивания пор в мембранах или фильтрах, используемых при проведении ультрафильтрации.

Осветленный технологический поток, содержащий L-фукозу, обычно может содержать значительное количество нежелательных примесей, включая (но не ограничиваясь этим) одновалентные ионы, двухвалентные ионы, аминокислоты, полипептиды, белки, органические кислоты, нуклеиновые кислоты, моносахариды и/или олигосахариды.

Стадии, которые предпочтительно отсутствуют в способе по изобретению

Способ по изобретению может включать одну или более чем одну стадию хроматографического разделения. Однако, в предпочтительных воплощениях данный способ может отличаться тем, что он не требует или не включает хроматографического разделения (например, нет никакой необходимости в хроматографическом фракционировании). Преимущество отсутствия хроматографического разделения заключается в том, что данный способ можно быть выполнен быстрее и с меньшими затратами, потому что отпадают затраты времени и средств на приготовление элюирующего раствора, его использование для элюирования L-фукозы с твердой фазы и сбор фракций после элюирования.

Кроме того, способ по изобретению может отличаться тем, что он не включает применение метанола, н-пропанола, изопропанола, 2-бутанона и/или этилацетата, возможно не включает применение какого-либо органического растворителя. Преимущество неиспользования органического растворителя заключается в том, что это может гарантировать отсутствие метанола, этанола, н-пропанола, изопропанола, 2-бутанона и/или этилацетата в конечном продукте, конечной L-фукозе или композиции, содержащей L-фукозу, возможно отсутствие какого-либо органического растворителя. Помимо этого данный способ становится менее затратным, экологически чистым и более безопасным для работников.

Кроме того, способ по изобретению может отличаться тем, что он не включает стадии элюирования L-фукозы с неподвижной фазы с использованием раствора, содержащего органический растворитель. Преимущество заключается в том, что очищенную L-фукозу можно хранить без какого-либо органического растворителя. Помимо этого данный способ становится менее затратным, экологически чистым и более безопасным для работников.

Более того, способ по изобретению может отличаться тем, что он не требует применения тяжелого металла. Преимущество заключается в том, что он может гарантировать отсутствие тяжелых металлов в очищенной L-фукозе.

Способ по изобретению может включать одну или более стадий нагревания технологического потока, предпочтительно до температуры выше 45°С. Однако, в предпочтительном воплощении способ по изобретению не включает стадию нагревания ферментационного бульона, осветленного раствора и/или очищенного раствора до температуры выше 45°С. Преимущество заключается в том, что по сравнению со способами предшествующего уровня техники, в которых используется такая стадия тепловой обработки, экономится энергия на нагревание соответствующих растворов, что делает данный способ более экономичным и более экологичным.

Обработка на катионообменнике

Катионы могут быть удалены из осветленного технологического потока среди других примесей на стадии обработки на катионообменнике способа по изобретению, т.е. путем применения по меньшей мере одной обработки на катионообменнике осветленного технологического потока. Конкретно, катионы заменяют на другие катионы, которые связывают с катионообменным носителем (неподвижной фазой) перед тем, как осветленный технологический поток подают на стадию обработки на катионообменнике. Важно, что было обнаружено, что в результате обработки на катионообменнике из осветленного технологического потока удаляется аммиак и часть загрязняющих белков.

На стадии обработки на катионообменнике положительно заряженные вещества могут быть удалены из не содержащей клеток культуральной жидкости, поскольку они связываются со смолой. Водный раствор L-фукозы приводят в контакт любым подходящим способом, который позволяет положительно заряженным веществам адсорбироваться на катионообменном носителе, в то время как L-фукоза проходит через него. Жидкость, полученная после приведения в контакт с катионообменной смолой, содержит воду, определенные катионы (те, которые были иммобилизованы на катионообменном носителе до проведения этой стадии), анионы, окрашивающие вещества и L-фукозу.

Обработка на катионообменнике может быть проведена с применением слабого катионообменного носителя или с применением сильного катионообменного носителя, предпочтительно ее проводят с применением сильного катионообменного носителя.

При обработке на катионообменнике согласно способу по изобретению можно использовать сильный катионообменник. Подходящие для удаления положительно заряженных соединений катионообменные смолы представляют собой сильнокислотные катионообменные смолы, такие как смолы, которые содержат карбоксильную группу (слабый катионообменник) или сульфогруппу (сильный катионообменник), присоединенную к твердому остову (например, к полистирольному остову). Подходящие смолы включают (но не ограничиваются этим) Lewatit^® S2568 (Н⁺) (Lanxess AG, Cologne, DE), Dowex^® 50WX2 (Merck KGaA, Darmstadt, DE); Amberlite^® IR-116 (Japan Organo Co., Ltd.) и Diaion™ SK-102 (Mitsubishi Chemical Industries, Ltd).

Стадия обработки на катионообменнике может представлять собой первую стадию после удаления биомассы из культуральной среды, т.е. первую стадию, которой подвергают осветленную культуральную среду.

Неспецифические катионы предпочтительно заменяют на конкретный катион Н⁺ или Na⁺. Если неспецифические катионы заменяют на Н⁺, то значение рН в проходящем потоке предпочтительно доводят до рН 6-8 перед проведением последующей стадии обработки (например, обработки на анионообменнике), наиболее предпочтительно путем добавления NaOH к проходящему потоку.

В предпочтительном воплощении перед попаданием на катионообменник осветленного технологического потока катионообменный носитель находится в Н⁺-форме, т.е. обменивающийся ионами лиганд на катионообменном носителе протонирован. Это приводит к тому, что при проведении катионного обмена катионы в осветленном технологическом потоке заменяются на Н⁺. Поэтому значение рН раствора после завершения указанной стадии (в проходящем потоке) оказывается соответствующим более кислым средам, чем значение рН раствора до проведения указанной стадии. Предпочтительно, чтобы перед проведением последующих стадий очистки значение рН в проходящем потоке было повышено до нейтрального или почти нейтрального значения рН (например, рН ≥6,5 и рН ≤7,5). Повышение значения рН может быть достигнуто путем добавления NaOH в технологический поток.

В качестве противоиона в катионообменнике может быть использован ион любого щелочного металла (Li⁺, Na⁺, K⁺), ион щелочноземельного металла (такой как Са²⁺, Mg²⁺), ион аммония или карбонат-ион. Предпочтительно, противоионом катионообменника является ион натрия (Na⁴). Более предпочтительно, противоионом является ион водорода (Н⁴). Преимущество иона водорода как противоиона заключается в том, что в результате приведения в контакт с катионообменным носителем образуется протонированная форма анионов в технологическом потоке, и эти протонированные анионы обнаруживаются в проходящем потоке, т.е. в растворе, прошедшем через катионообменный носитель. После этого протонированная форма указанных анионов может быть нейтрализована путем добавления основания (например, NaOH) в содержащий продукт поток, в результате чего протонированная форма указанных анионов преобразуется в конкретную солевую форму (например, натриевую солевую форму). Наличие анионов в натриевой солевой форме предпочтительно, поскольку ионы натрия являются относительно небольшими катионами и могут быть с большей легкостью удалены посредством нанофильтрации и/или электродиализа, чем более крупные катионы.

Предпочтительно, стадию обработки на катионообменнике осуществляют перед стадией обработки на анионообменнике. Однако, в принципе, обработка на катионообменнике также может быть проведена после стадии обработки на анионообменнике.

Размер частиц катионообменной смолы предпочтительно находится в диапазоне от 0,1 до 1 мм. Такой диапазон размера частиц способствует эффективному прохождению используемой не содержащей клеток культуральной жидкости, по-прежнему с одновременным эффективным удалением заряженных веществ на катионообменной смоле. Чтобы обеспечить возможность протекания эффективного обмена ионов, объемная скорость потока предпочтительно должна составлять от 0,5 до 2,5 объема хроматографического слоя, более предпочтительно от 1,0 до 2,0 объема хроматографического слоя. Обработка на ионообменнике может быть осуществлена традиционным образом, например, партиями или непрерывно, предпочтительно непрерывно.

Условия, при которых L-фукоза проходит через катионообменный носитель, могут быть установлены путем регулирования рН и/или концентрации солей в осветленном растворе, предпочтительно путем доведения рН осветленного раствора до значения рН в диапазоне 6-8 и/или путем регулирования концентрации солей, если необходимо.

После обработки на катионообменнике и обработки на анионообменнике очищенный раствор может содержать L-фукозу, придающие окраску вещества и соль, при этом соль предпочтительно представляет собой NaCl. Согласно предпочтительному воплощению изобретения, при обработке на анионообменнике анионообменный носитель используют в хлоридной форме.

Согласно следующему предпочтительному воплощению изобретения, при обработке на катионообменнике катионообменный носитель используют в водородной форме. Было обнаружено, что использование катионообменника в водородной форме (противоионом является Н⁺) является предпочтительным, поскольку достигается гораздо лучшее связывание солей и загрязняющих белков по сравнению с катионообменным носителем в любой другой форме (противоионом не является Н⁺). Применение водородной формы приводит к тому, что проходящий поток имеет соответствующее более кислым средам значение рН, чем раствор, который наносили для проведения обработки на катионообменнике. Однако, указанное значение рН можно легко повысить путем добавления основания, предпочтительно NaOH, до нейтрального значения рН, предпочтительно до значения рН в диапазоне 6-8. Осуществление нейтрализации с использованием NaOH предпочтительно, поскольку введенные ионы натрия являются относительно небольшими и могут быть легко удалены посредством нанофильтрации и/или электродиализа.

Размер частиц катионообменной смолы следует выбирать таким, чтобы способствовать эффективному прохождению используемой не содержащей клеток культуральной жидкости по-прежнему с одновременным эффективным удалением заряженных веществ на катионообменной смоле. Чтобы обеспечить возможность протекания эффективного обмена ионов, объемная скорость потока предпочтительно должна составлять от 0,2 до 2,0 объема хроматографического слоя, более предпочтительно от 0,5 до 1,5 объема хроматографического слоя. Обработка на ионообменнике может быть осуществлена традиционным образом, например, партиями или непрерывно, предпочтительно непрерывно.

Сначала осветленный раствор может быть подвергнут обработке на катионообменнике, а затем обработке на анионообменнике. Преимущество такой последовательности в способе заключается в том, что катионообменный носитель может быть в Н⁺-форме для получения сильного связывания загрязняющих белков, а после нейтрализации с использованием основания (например, NaOH) через анионообменный носитель может быть пропущен раствор, содержащий определенную солевую форму анионов в технологическом потоке (например, анионы в Na⁺-форме).

Обработка на анионообменнике

Предпочтительно, стадию обработки на анионообменнике осуществляют после стадии обработки на катионообменнике. Однако, в принципе, она также может быть проведена до стадии обработки на катионообменнике, т.е. до того, как технологический поток будет обработан на катионообменнике.

Стадию обработки на анионообменнике проводят для удаления неспецифических анионов и замены их на конкретные анионы, предпочтительно на конкретный анион Cl^- или ОН^-. Если неспецифические анионы заменяют на Cl^-, то значение рН в проходящем потоке предпочтительно доводят до рН 6-8 перед проведением последующей стадии обработки (например, удаление солей из очищенного раствора путем электродиализа), наиболее предпочтительно путем добавления NaOH к проходящему потоку.

Анионы могут быть удалены из осветленного технологического потока на стадии обработки на анионообменнике способа по изобретению, т.е. посредством применения по меньшей мере одной обработки на анионообменнике в отношении осветленного технологического потока. Стадия обработки на анионообменнике может представлять собой первую стадию после удаления биомассы из культуральной среды, т.е. первую стадию, которой подвергают осветленную культуральную среду. Предпочтительно, обработку на анионообменнике проводят на стадии, осуществляемой после стадии обработки на катионообменнике.

Отрицательно заряженные вещества могут быть удалены из технологического потока, поскольку они связываются с анионообменной смолой. Водный раствор, содержащий L-фукозу, приводят в контакт любым подходящим способом, который позволяет отрицательно заряженным веществам адсорбироваться на анионообменном носителе, в то время как L-фукоза проходит через него. Жидкость, полученная после приведения в контакт с анионообменной смолой, содержит воду, определенные катионы, определенные анионы, окрашивающие вещества и L-фукозу. Условия стадии обработки на анионообменнике таковы, что L-фукоза не связывается с анионообменным носителем, т.е. находится в проходящем потоке после контакта с носителем.

В начале обработки на анионообменнике значение рН содержащего продукт потока предпочтительно доводят до рН 6-8 (наиболее предпочтительно до рН 7). Проходящий поток (содержащий продукт поток, прошедший через анионообменный носитель) может иметь более низкое значение рН, например, рН в диапазоне от 4,5 до 6. При этом значении рН анионы в проходящем потоке могут находиться в протонированной форме. Значение рН в проходящем потоке может быть повышено путем добавления основания, например, NaOH.

Во время обмена анионов анионы в осветленном технологическом потоке могут быть заменены на Cl^-. Поэтому значение рН в технологическом потоке становится соответствующим немного более кислым средам. Предпочтительно, значение рН повышают перед последующими стадиями очистки, предпочтительно до достижения нейтрального или почти нейтрального значения рН (т.е. рН ≥6,5 и рН ≤7,5) в технологическом потоке. Более предпочтительно, данного повышения значения рН в технологическом потоке достигают путем добавления в технологический поток NaOH.

Анионообменник может представлять собой слабый анионообменник или сильный анионообменник, предпочтительно сильный анионообменник.

Подходящими сильноосновными анионообменными смолами являются смолы, которые содержат группу триметиламмония или гидроксиэтильную группу, соединенную с твердым остовом (например, с полистирольным остовом). Подходящие смолы включают (но не ограничиваются этим) Lewatit^® S6368 А, Lewatit^® S4268, Lewatit^® S5528, Lewatit^® S6368A (Lanxess AG, Cologne, DE), Dowex^® AG 1×2, Dowex^® 1×8, Purolite^® Chromalite CGA100x4 (Purolite GmbH, Ratingen, DE), Amberlite® FPA51 (Dow Chemicals, MI, USA). Анионообменная смола предпочтительно находится в хлоридной форме. Подходящими слабыми анионообменными смолами являются смолы, которые содержат аминогруппу, соединенную с твердым остовом (например, с полистирольным остовом).

Анионообменник может быть использован с любым основанием в качестве противоиона, например, НСО₃^-, I^-, Br^-, NO₃^-. Предпочтительно, противоионом является гидроксид-ион (ОН^-). Более предпочтительно, противоионом является хлорид-ион (Cl^-). Преимущество использования хлорид-иона в качестве противоиона заключается в том, что анион Cl^- меньше многих других анионов, которые изначально присутствуют в ферментационном бульоне. Это приводит к тому, что анион хлора может быть более легко удален из технологического потока путем электродиализа и/или нанофильтрации (например, диафильтрации). Преимущество использования аниона ОН^- в качестве противоиона заключается в том, что, когда на стадии после обработки на анионообменнике рН доводят до нейтрального значения с использованием HCl, тогда в технологический поток вводят небольшой анион хлора, который может быть более легко удален, чем другие анионы.

Размер частиц анионообменной смолы предпочтительно находится в диапазоне от 0,1 до 1 мм, что способствует эффективному прохождению используемого технологического потока по-прежнему с одновременным эффективным удалением заряженных веществ на анионообменной смоле. Чтобы обеспечить возможность протекания эффективного обмена ионов, объемная скорость потока предпочтительно должна составлять от 0,5 до 2,5 объема хроматографического слоя, более предпочтительно от 1,0 до 2,0 объема хроматографического слоя. Обработка на ионообменнике может быть осуществлена традиционным образом, например, партиями или непрерывно, предпочтительно непрерывно.

Условия, при которых L-фукоза проходит через анионообменный носитель, могут быть установлены путем регулирования рН и/или концентрации солей в осветленном растворе, предпочтительно путем доведения рН осветленного раствора до значения рН в диапазоне 6-8 и/или путем подведения концентрации солей, если необходимо. Например, отмечено, что, если раствор, содержащий L-фукозу, который получен в результате обработки проходящего потока на катионообменнике с Н⁺ в качестве противоиона и в котором значение рН подведено до 6-8 путем добавления NaOH, подвергают обработке на анионообменнике, то концентрация солей в проходящем потоке оказывается достаточно высокой, чтобы предотвратить связывание L-фукозы с анионообменной смолой. Тем не менее отмечено, что нежелательные примеси (например, некоторые белки, молекулы ДНК и РНК (в частности, молекулы рекомбинантных ДНК и РНК) и окрашенные вещества) все же связываются с анионообменной смолой в указанных условиях.

В предпочтительном воплощении способ очистки включает обработку с использованием катионообменной смолы в водородной (Н⁺) форме и анионообменной смолы в хлоридной (Cl^-) форме. Катионообменная смола предпочтительно представляет собой сильный катионообменник. Анионообменник может быть слабым или сильным анионообменником, предпочтительно он является сильным анионообменником. Кроме того, анионообменный носитель также может представлять собой абсорбирующий носитель. Обработка с использованием как катионообменной смолы, так и анионообменной смолы позволяет удалить все неспецифические ионы из содержащего продукт потока. Таким образом, неспецифические ионы могут быть заменены на конкретные ионы, предпочтительно на катион натрия (например, введенный в результате нейтрализации содержащего продукт потока с использованием NaOH после контактирования с катионообменным носителем с Н⁺ в качестве противоиона) и анион хлора. Катион натрия и анион хлора оба являются относительно небольшими ионами и могут быть удалены посредством электродиализа и/или нанофильтрации (диафильтрации) более быстрым и более экономичным образом, чем более крупные ионы.

Концентрирование очищенного раствора

В предпочтительном воплощении раствор после обработки на ионообменнике (проходящий поток), который содержит L-фукозу, концентрируют, предпочтительно посредством нанофильтрации, обратного осмоса и/или упаривания в вакууме (например, с применением испарителя с падающей пленкой, роторного испарителя или пластинчатого испарителя). Обратный осмос и/или нанофильтрация представляют собой предпочтительные способы (например, нанофильтрация с применением нанофильтрационной мембраны, имеющей предел исключения по размеру Особенно предпочтительной является нанофильтрация и/или обратный осмос.Преимущество нанофильтрации по сравнению с обратным осмосом заключается в том, что нанофильтрация обеспечивает более быстрое концентрирование, а также позволяет частично удалять ионы солей. Преимущество нанофильтрации и/или обратного осмоса по сравнению с упариванием в вакууме заключается в том, что никаких реакций карамелизации с L-фукозой не происходит, т.е. в процессе концентрирования не образуется никаких окрашенных "карамельных" продуктов.

Наиболее предпочтительно концентрирование очищенного раствора посредством нанофильтрации, при этом наиболее предпочтительной используемой нанофильтрационной мембраной является мембрана, которая имеет значение отсечения по молекулярной массе в диапазоне 100-200 кДа. Преимущество такого отсечения по молекулярной массе заключается в том, что L-фукоза удерживается, в то время как ионы солей могут проходить через мембрану, т.е. помимо концентрирования осуществляется обессоливание.

Перед концентрированием раствора концентрация L-фукозы в растворе может составлять ≤20% (масс/масс), ≤10% (масс/масс.) или ≤5% (масс/масс).

В ходе этого процесса осветленный раствор и/или очищенный раствор может быть сконцентрирован до концентрации L-фукозы ≥100 г/л, предпочтительно ≥200 г/л, более предпочтительно ≥300 г/л.

Кроме того, осветленный раствор и/или очищенный раствор может быть сконцентрирован посредством нанофильтрации при температуре ниже 80°С, предпочтительно ниже 50°С, более предпочтительно от 4°С до 45°С, более предпочтительно от 10°С до 40°С, еще более предпочтительно от 15°С до 30°С, наиболее предпочтительно от 15°С до 20°С.

Кроме того, осветленный раствор и/или очищенный раствор может быть сконцентрирован посредством обратного осмоса при температуре от 20°С до 50°С, более предпочтительно от 30°С до 45°С, наиболее предпочтительно от 35°С до 45°С.

Более того, осветленный раствор и/или очищенный раствор может быть сконцентрирован посредством нанофильтрации при давлении в диапазоне от выше 5 бар (0,5 МПа) до ниже 50 бар (5 МПа), предпочтительно при давлении от выше 10 бар (1 МПа) до ниже 40 бар (4 МПа), более предпочтительно при давлении от выше 15 до ниже 30 бар (3 МПа).

Кроме того, осветленный раствор и/или очищенный раствор может быть сконцентрирован посредством обратного осмоса при давлении в диапазоне от выше 5 бар (0,5 МПа) до ниже 100 бар (10 МПа), предпочтительно при давлении от выше 10 бар (1 МПа) до ниже 80 бар (8 МПа), более предпочтительно при давлении от выше 15 до ниже 70 бар (7 МПа).

Обратный осмос представляет собой способ мембранной фильтрации, с помощью которого из раствора (технологического потока) удаляют частицы размером больше 0,1 нм. Из технологического потока будет удалена только вода, в то время как все другие молекулы, например, ионы, сахара и т.д., будут концентрироваться внутри ретентата. При использовании обратного осмоса можно осуществить только повышение концентрации L-фукозы, но без ее обессоливания.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении стадия концентрирования характеризуется по меньшей мере одним из следующих параметров, возможно всеми следующими параметрами:

1) концентрирование проводят до достижения концентрации L-фукозы ≥100 г/л, предпочтительно ≥200 г/л, более предпочтительно ≥300 г/л;

2) концентрирование проводят при температуре ниже 80°С, предпочтительно ≤50°С, более предпочтительно от 4°С до 45°С; наиболее предпочтительно от 4°С до 40°С, если концентрирование проводят посредством нанофильтрации;

3) концентрирование проводят при температуре ниже 50°С, предпочтительно от 20°С до 45°С; наиболее предпочтительно от 30°С до 45°С, более предпочтительно от 35°С до 45°С, если концентрирование проводят посредством обратного осмоса и/или упаривания в вакууме; и

4) концентрирование осуществляют при давлении в диапазоне от выше 5 бар (0,5 МПа) до ниже 50 бар (5 МПа), предпочтительно при давлении от выше 10 бар (1 МПа) до ниже 40 бар (4 МПа), более предпочтительно при давлении от выше 15 до ниже 30 бар (3 МПа).

В предпочтительном воплощении изобретения раствор, содержащий L-фукозу, концентрируют перед проведением стадии электродиализа с использованием упаривания в вакууме (например, используя испаритель с падающей пленкой или пластинчатый испаритель), обратного осмоса или нанофильтрации (например, нанофильтрации с применением нанофильтрационной мембраны, имеющей предел исключения по размеру предпочтительно с использованием нанофильтрации или обратного осмоса, более предпочтительно с использованием нанофильтрации.

В другом предпочтительном воплощении изобретения раствор, содержащий L-фукозу, концентрируют после стадии электродиализа с использованием упаривания в вакууме (например, используя испаритель с падающей пленкой или пластинчатый испаритель), обратного осмоса или нанофильтрации (например, нанофильтрации с применением нанофильтрационной мембраны, имеющей предел исключения по размеру предпочтительно с использованием нанофильтрации или обратного осмоса, более предпочтительно с использованием нанофильтрации.

Предпочтительно, раствор, содержащий L-фукозу, концентрируют перед проведением выделения L-фукозы в твердой форме (например, кристаллической форме или гранулированной форме).

Удаление солей

Способ очистки L-фукозы включает стадию, на которой из раствора удаляют соли, предпочтительно удаляют из осветленного раствора и/или очищенного раствора. Удаление солей может быть достигнуто путем подвергания раствора обессоливанию с использованием нанофильтрации и/или электродиализа.

Нанофильтрация представляет собой метод мембранной фильтрации, при котором мембрана содержит поры нанометрового размера. Нанофильтрационные мембраны имеют размеры пор в диапазоне от 1 до 10 нанометров. Размер пор нанофильтрационных мембран меньше размеров пор, используемых при микрофильтрации, и даже меньше размеров пор ультрафильтрационных мембран, но обычно больше размеров пор мембран, используемых для обратного осмоса. Мембраны для применения при нанофильтрации преимущественно изготавливают из тонких полимерных пленок. Обычно используемые материалы включают полиэтилентерефталат или такие металлы, как алюминий. Плотность пор может находиться в диапазоне от 1 до 10⁶ пор на один см². Нанофильтрацию используют в способе очистки L-фукозы для повышения концентрации L-фукозы в растворе, например, в осветленный растворе и/или очищенном растворе. Помимо этого происходит обессоливание раствора (технологического потока).

Мембраны, подходящие для нанофильтрации, включают мембраны из полиамида или полипиперазина, тонкопленочного композитного мембранного материала, обеспечивающего исключение по размеру в диапазоне от 150 до 300 Да, например, Dow Filmtec™ NF270 (Dow Chemical Company, USA). Такие мембраны позволяют работать с большим потоком. В частности, нанофильтрационные мембраны с отсечением по молекулярной массе в диапазоне от 100 до 300 кДа выгодны для повышения концентрации L-фукозы в технологическом потоке. Мембраны с таким значением отсечения по молекулярной массе предотвращают прохождение L-фукозы через мембрану и имеют то преимущество, что они также выполняют обессоливание, поскольку соль (например, хлорид натрия), которая имеется в технологическом потоке после обработки на ионообменном(ых) носителе(ях), проходит через мембрану и отделяется от L-фукозы. Дополнительные примеры мембран, подходящих для нанофильтрации, включают Trisep^® 4040-XN45-TSF (Microdyn-Nadir GmbH, Wiesbaden, DE), GE4040F30 и GH4040F50 (GE Water & Process Technologies, Ratingen, DE).

Было обнаружено, что с использованием нанофильтрации эффективно удаляются значительные количества примесей (например, ионов солей) перед обработкой раствора, содержащего L-фукозу, электродиализом. Также было обнаружено, что нанофильтрация эффективна для удаления низкомолекулярных примесей из осветленной ферментационного бульона после удаления биомассы из ферментационного бульона (например, на стадии ультрафильтрации). Удаление низкомолекулярных компонентов оказывается полезным для концентрирования и деминерализации раствора, содержащего L-фукозу, перед обработкой на ионообменнике. Применение нанофильтрации для повышения концентрации L-фукозы приводит к снижению энергетических затрат и затрат на переработку, а также к улучшению качества продукта благодаря уменьшению теплового воздействия.

Электродиализ сочетает в себе диализ и электролиз, и его можно использовать для разделения или концентрирования ионов в растворах на основании их селективной электромиграции через полупроницаемую мембрану. Первые применения электродиализа в промышленности датируются началом 1960-х годов, когда этот метод использовали для деминерализации сырной сыворотки с целью включения в смесь для грудных детей. Другие применения электродиализа включают его использование для регулирования рН таких напитков, как вина, виноградное сусло, яблочный сок и апельсиновый сок.

Опреснение слабоминерализованной воды с целью получения питьевой воды и деминерализация молочной сыворотки для производства детского питания являются наиболее распространенными видами применения электродиализа в настоящее время. Основной принцип электродиализа заключается в использовании электролитической ячейки, содержащей пару электродов, погруженных для обеспечения ионной проводимости в электролит и подключенных к источнику постоянного тока. Электрод, соединенный с положительным полюсом источника постоянного тока, представляет собой анод, а электрод, соединенный с отрицательным полюсом, представляет собой катод. Таким образом, раствор электролита поддерживает электрический ток, который обусловлен движением отрицательных и положительных ионов по направлению к аноду и катоду, соответственно. Мембраны, используемые для электродиализа, по существу представляют собой листы из пористых ионообменных смол с отрицательно или положительно заряженными группами и поэтому описываются как катионные или анионные мембраны, соответственно. Ионообменные мембраны обычно изготовлены из полистирола, несущего подходящую функциональную группу (такую как сульфогруппа для катионных мембран или группа четвертичного аммония для анионных мембран), перекрестно сшитого с использованием дивинилбензола.

Электролитом может быть, например, водный раствор, содержащий хлорид натрия, ацетат натрия, пропионат натрия и/или сульфаминовую кислоту. Электролит окружает катод и анод и служит для обеспечения протекания электрического тока внутри ячейки. Затем собирают электродиализный пакет таким образом, чтобы анионные и катионные мембраны располагались параллельно как в фильтр-прессе между двумя электродными блоками, с тем, чтобы поток, подвергающийся обеднению ионами, хорошо отделялся от потока, подвергающегося обогащению ионами (эти два раствора также называются разбавленным раствором (раствором, подвергающимся обеднению ионами) и концентратом (раствором, подвергающимся обогащению ионами)).

Основой процесса электродиализа является использование пакета мембран, который состоит из нескольких разделенных прокладками анионообменных мембран и катионообменных мембран, установленных между двумя электродами. При подключении источника постоянного электрического тока анионы и катионы будут мигрировать сквозь мембраны по направлению к электродам, образуя (обессоленный) поток разбавленного раствора и поток концентрата.

Размер пор ионообменных мембран для применения в электродиализе достаточно мал, чтобы предотвратить диффузию продукта из потока разбавленного раствора в поток концентрата, обусловленную большой разницей в концентрациях между этими двумя потоками. После отделения биомассы и/или обмена катионов и/или анионов должно произойти количественное удаление белков и в особенности молекул рекомбинантной ДНК (изменяющихся в размере от фрагментов до целых геномов) из желаемого продукта.

Электродиализ используют для удаления ионов из водного раствора, в то время как L-фукоза будет оставаться внутри технологического потока. Важное преимущество электродиализа заключается в том, что из раствора, содержащего L-фукозу, молекулы рекомбинантной ДНК могут быть удалены полностью. Кроме того обнаружено, что посредством электродиализа можно значительно уменьшать количество соли в технологическом потоке. Фактически было открыто, что из содержащего продукт потока можно полностью удалить хлорид натрия. Это имеет то преимущество, что можно получить L-фукозу, не содержащую такой соли, как хлорид натрия, что предотвращает любое негативное влияние, которое может оказать наличие соли (например, хлорида натрия) в конечном продукте, например, для питания детей грудного возраста.

Удаление солей (например, путем электродиализа) можно проводить до тех пор, пока не будет достигнуто стабильное значение электропроводности (мСм/см²) в диапазоне от 0,2 до 10,0 мСм/см², предпочтительно от 0,4 до 5,0 мСм/см², более предпочтительно от 0,5 до 1,0 мСм/см². Кроме того, электродиализ может быть проведен до тех пор, пока концентрация соли (г/л) не станет ниже 10,0 г/л, предпочтительно ниже 5,0 г/л, более предпочтительно ниже 1,0 г/л, еще более предпочтительно ≤0,5 г/л, наиболее предпочтительно ≤0,4 г/л, в особенности ≤0,2 г/л.

Электродиализ можно проводить в нейтральных условиях или в кислотных условиях. Различие между этими двумя вариантами заключается в форме анионов, находящихся в технологическом потоке.

В случае электродиализа в нейтральных условиях, до начала проведения электродиализа, значение рН технологического потока может быть подведено с использованием кислоты, предпочтительно соляной кислоты (HCl), или основания, предпочтительно гидроксида натрия (NaOH), до достижения рН от 5,0 до 9,0, предпочтительно от 6,0 до 8,0, более предпочтительно от 6,5 до 7,5.

В случае электродиализа в кислотных условиях, до начала проведения электродиализа, технологический поток подкисляют с использованием кислоты, предпочтительно соляной кислоты (HCl), до достижения рН от 1,0 до 3,0, предпочтительно от 1,5 до 2,5, более предпочтительно от 1,8 до 2,2. Электродиализ предпочтительно проводят до достижения стабильных значений электропроводности (мСм/см²) и рН.

Электродиализ может быть проведен до тех пор, пока не достигнуто стабильное значение электропроводности (мСм/см²) в диапазоне от 1,0 до 10,0 мСм/см², предпочтительно от 1,5 до 10,0 мСм/см², более предпочтительно от 2,0 до 8,0 мСм/см². Во время проведения электродиализа рН необходимо регулировать и доводить с использованием основания, предпочтительно гидроксида натрия. В нейтральных условиях электродиализ может быть проведен с использованием биполярных мембран. В этом случае L-фукоза может быть сконцентрирована в отдельном контуре для электродиализного концентрата. Таким образом, во время проведения электродиализа L-фукоза может быть обогащена.

В данном способе после удаления солей из очищенного раствора

1) количество соли в очищенном растворе может составлять меньше 10% (масс./масс.), предпочтительно меньше 5% (масс./масс.), более предпочтительно меньше 1% (масс./масс.), еще более предпочтительно ≤0,5% (масс./масс.), наиболее предпочтительно ≤0,4% (масс./масс.), в особенности ≤0,2% (масс./масс.); и/или

2) значение электропроводности может находиться в диапазоне от 0,2 до 10,0 мСм/см², предпочтительно в диапазоне от 0,4 до 5,0 мСм/см², более предпочтительно в диапазоне от 0,5 до 1,0 мСм/см².

Обесцвечивание осветленного и/или очищенного раствора Осветленный раствор и/или очищенный раствор может быть подвергнут стадии обесцвечивания, предпочтительно путем обработки активированным углем и/или обработки с использованием катионообменника и анионообменника, которые соединены последовательно.

Стадия обесцвечивания может быть проведена

1) до или после стадии диафильтрации и/или концентрирования осветленного раствора; и/или

2) до или после стадии электродиализа и/или диафильтрации осветленного раствора.

Предпочтительно, стадию обесцвечивания проводят после стадии электродиализа, особенно в том случае, когда указанную стадию проводят путем обработки с использованием катионообменника и анионообменника (которые соединены последовательно). Преимущество заключается в том, что на катионообменнике и анионообменнике можно работать с использованием технологического потока, который содержит соль в очень низкой концентрации, и это приводит к тому, что многие электрически заряженные вещества (например, электрически заряженные пептиды и/или молекулы ДНК) связываются с ионообменным носителем, в то время как L-фукоза остается несвязанной и находится в проходящем потоке. Таким образом, на этой стадии чистота L-фукозы в отношении окрашенных веществ и неокрашенных электрически заряженных веществ может быть значительно улучшена. Возможно, что указанную стадию проводят после стадии нанофильтрации и/или перед стадией электродиализа.

Преимущество удаления придающих окраску веществ путем обработки активированным углем по сравнению с обработкой с использованием катионообменника и анионообменника (которые соединены последовательно) заключается в том, что могут быть удалены как электрически заряженные, так и электрически незаряженные (нейтральные) придающие окраску вещества и могут быть удалены электрически незаряженные (нейтральные) углеводы (например, олигосахариды, моносахариды).

Активированный углерод, также называемый активированным углем, представляет собой форму углерода, которая была обработана с целью получения небольших пор малого объема, которые увеличивают площадь поверхности, доступную для адсорбции. Обычно всего лишь один грамм активированного угля ввиду высокой степени его микропористости имеет площадь поверхности, превышающую 3000 м², что определено по данным адсорбции газа.

Углевод, подобный моносахариду или олигосахариду, имеет тенденцию связываться с поверхностью частиц активированного угля из водного раствора. Взаимодействие олигосахаридов с активированным углем является гораздо более сильным, чем взаимодействие моносахаридов. Такое поведение обусловлено их структурой и приводит к тому, что L-фукоза связывается слабее, т.е. в меньшем количестве, с активированным углем, чем примесный олигосахарид. Кроме олигосахаридов на активированном угле адсорбируются окрашенные вещества. Другие водорастворимые соединения, такие как соли, связываются слабее и элюируются с активированного угля вместе с L-фукозой в результате промывки активированного угля водой (после инкубирования). После элюирования водой адсорбированные олигосахариды и окрашенные вещества по-прежнему остаются связанными с активированным углем. Поэтому на стадии обработки активированным углем возможно удаление примесных олигосахаридов и окрашенных примесей. В итоге, на стадии с использованием активированного угля удаляются окрашивающие вещества, другие примеси и уменьшается количество водорастворимых загрязняющих веществ, таких как соль.

Подходящими активированными углями для удаления придающих окраску соединений, олигосахаридов или загрязняющих веществ являются (но не ограничиваются этим) гранулированные активированные угли, такие как Norit^® GAC830EN (Carbot Cooperation) и Epibon^® Y 12x40 spezial (Donaucarbon) или порошкообразный активированный уголь, такой как Norit^® DX1, Norit^® SA2 (Carbot Cooperation) и Carbopal^® MB 4 (Donaucarbon).

Удаление придающих окраску веществ путем обработки с использованием катионообменника и анионообменника (которые соединены последовательно) имеет то преимущество по сравнению с обработкой активированным углем, что не только придающие окраску вещества могут быть удалены из раствора, но и в растворе может быть выполнена замена неспецифических ионов солей на конкретные ионы солей, такие как, например, Na⁺ и Cl^-, и могут быть удалены электрически заряженные пептиды. Преимущество указанного ионного обмена заключается том, что процесс обессоливания может стать более эффективным (Na⁺ и Cl^- являются небольшими ионами по сравнению с другими возможными ионами и поэтому могут быть более легко удалены на стадии обработки с целью обессоливания). Дополнительное преимущество заключается в том, что можно избежать негативного влияния некоторых неспецифических солей на кристаллизацию L-фукозы.

Обработку на ионообменнике проводят таким образом, что заряженные вещества и придающие окраску вещества адсорбируются на соответствующем ионообменном носителе, в то время как L-фукоза проходит через соответствующий ионообменный носитель, т.е. находится в проходящем потоке. Полученная жидкость (проходящий поток) содержит воду, небольшое количество определенных ионов, более низкое количество придающих окраску веществ и L-фукозу.

Катионообменник может представлять собой слабый катионообменник или сильный катионообменник, предпочтительно сильный катионообменник.

Подходящими катионообменными смолами являются сильнокислотные катионообменные смолы, такие как (но не ограничиваясь этим) Lewatit^® S2568(H⁺) (Lanxess AG, Cologne, DE), Dowex^® 50WX2 (Merck KGaA, Darmstadt, DE); Amberlite^® IR-116 (Japan Organo Co., Ltd.) и Diaion™ SK-102 (Mitsubishi Chemical Industries, Ltd).

Катионообменник можно использовать с ионом любого щелочного металла (Li⁺, Na⁺, K⁺), ионом щелочноземельного металла (таким как Са²⁺, Mg²⁺), ионом аммония или карбонат-ионом в качестве противоиона. Предпочтительно, противоионом является ион натрия (Na⁺).

Анионообменник может представлять собой слабый анионообменник или сильный анионообменник, предпочтительно сильный анионообменник.

Подходящими анионообменными смолами являются сильноосновные (типа I) анионообменные смолы, такие как (но не ограничиваясь этим) Lewatit^® S6368 А, Lewatit^® S4268, Lewatit^® S5528, Lewatit^® S6368A (Lanxess AG, Cologne, DE), Dowex^® AG 1×2, Dowex^® 1×8, Purolite^® Chromalite CGA100×4 (Purolite GmbH, Ratingen, DE), Amberlite^® FPA51 (Dow Chemicals, MI, USA). Предпочтительно, анионообменная смола находится в хлоридной форме.

Анионообменник можно использовать с любым основанием в качестве противоиона, например, HCO₃^-, I^-, Br^-, NO₃^-. Предпочтительно, в качестве противоиона используют гидроксид-ион (ОН). Более предпочтительно, в качестве противоиона используют хлорид-ион (Cl^-).

В случае последовательного соединения катионообменника и анионообменника анионообменник может быть расположен выше или ниже по потоку по отношению к катионообменнику. Предпочтительно, анионообменник располагают ниже по потоку по отношению к катионообменнику в случае последовательного соединения. Таким образом, раствор, проходящий через такое последовательное соединение, сначала проходит через катионообменник, а затем проходит через анионообменник.

Значение рН технологического потока, прошедшего через катионообменник и/или анионообменник (т.е. соответствующего проходящего потока), предпочтительно составляет выше 2,0 и ниже 10,0, более предпочтительно выше 3,0 и ниже 9,0, наиболее предпочтительно выше 4,0 и ниже 8,0.

Размер частиц ионообменной смолы должен быть выбран таким, чтобы способствовать эффективному прохождению технологического потока с одновременным при этом эффективным удалением заряженных веществ и придающих окраску веществ на ионообменной смоле. Чтобы обеспечить эффективный обмен ионов, объемная скорость потока предпочтительно должна составлять от 0,2 до 2,0 объема хроматографического слоя, более предпочтительно от 0,5 до 1,5 объема хроматографического слоя и наиболее предпочтительно от 0,75 до 1,2 объема хроматографического слоя. Обработка на ионообменнике может быть осуществлена традиционным образом, например, партиями или непрерывно, предпочтительно непрерывно.

Однако, в случае использования не содержащего эндотоксинов штамма (например, штамма Bacillus и/или генетически модифицированного не содержащего эндотоксинов штамма) стадия удаления эндотоксинов может не потребоваться.

Стерилизующая фильтрация и/или удаление эндотоксинов В предпочтительном воплощении изобретения очищенный раствор фильтруют в стерильных условиях и/или подвергают удалению эндотоксинов, предпочтительно путем фильтрования очищенного раствора через фильтрующий модуль (≤10 кДа). В качестве примера очищенный раствор, содержащий L-фукозу, стерилизуют фильтрованием и/или подвергают стадии удаления эндотоксинов путем фильтрования очищенного раствора через фильтр (3 кДа) или через фильтр (6 кДа). Удаление эндотоксинов является необходимым, если L-фукоза предназначена для потребления человеком.

Получение гранулированной формы L-фукозы

Агломерация порошкобразного пищевого концентрата обычно используется для улучшения свойств гранулированных (например, высушенных распылением) продуктов с точки зрения быстрого приготовления. Этот способ используют, когда желательно увеличить размер частиц продукта с целью улучшения их сыпучести и/или внешнего вида.

В общем случае, основные свойства гранулятов или агломератов, такие как размер, пористость, растворимость, смачиваемость, форма и/или плотность, зависят от типа способа агломерации (гранулирования) и от технологических условий в процессе агломерации. Агломерация в псевдоожиженном слое является одним из способов, подходящих для получения агломератов с высокой пористостью и хорошей механической прочностью при транспортировке и упаковке.

Принципы применения агломерации в псевдоожиженном слое заключаются во флюидизации частиц потоком горячего воздуха и смачивания поверхности частиц распылением жидкого связующего вещества. В результате столкновений между влажными частицами в псевдоожиженном слое образуются жидкие мостики и происходит слияние частиц. После высушивания этих частиц мостики отвердевают, что приводит к укрупнению агломератов.

Согласно данному изобретению очищенный раствор может быть подвергнут гранулированию, в частности, подвергнут гранулированию при концентрации L-фукозы 5-50% (масс./масс.), предпочтительно 10-40% (масс./масс.), более предпочтительно 15-35% (масс./масс.).

Температура на входе может находиться в диапазоне 50°С-120°С, предпочтительно 65°С-110°С, более предпочтительно 80°С-100°С.

Температура на выходе (температура продукта) может находиться в диапазоне 30°С-80°С, предпочтительно 35°С-75°С, более предпочтительно 40°С-75°С.

Полученный гранулят должен иметь потери при сушке, составляющие предпочтительно от 0,1 до 5% массы вещества, более предпочтительно от 0,5 до 2,5% массы вещества, наиболее предпочтительно от 0,7 до 1,5% массы вещества.

В предпочтительном воплощении гранулированная L-фукоза предпочтительно по меньшей мере на 50% (масс./масс.) представляет собой вещество с размером частиц от 150 мкм до 1400 мкм, более предпочтительно по меньшей мере выше, чем 60% (масс./масс.), с размером частиц от 150 мкм до 1400 мкм, наиболее предпочтительно выше, чем 70% (масс./масс.), с размером частиц от 150 мкм до 1400 мкм.

Размер частиц может быть определен путем просеивания вещества через сита, имеющие разные размеры пор. Например, чтобы получить L-фукозу в виде вещества с размером частиц от 150 мкм до 1400 мкм, можно использовать последовательно (в любом порядке) сито, имеющее диаметр ячейки сита 1400 мкм, и сито с диаметром ячейки сита 150 мкм для отбора вещества, имеющего желаемый размер частиц.

Получение формы L-фукозы, высушенной на вальцовой сушилке

L-Фукоза может быть получена в форме, высушенной на вальцовой сушилке. С этой целью очищенный раствор может быть высушен на вальцовой сушилке, т.е. подвергнут процедуре сушки на вальцовой сушилке.

Получение кристаллической формы L-фукозы

L-Фукоза может быть получена в кристаллической форме. Способ кристаллизации L-фукозы из водных растворов будет изложен в данном описании.

Обнаружено, что L-фукоза может быть избирательно закристаллизована после применения биокаталитического подхода с использованием ферментов или из ферментационного бульона (культуральной жидкости).

В предпочтительном воплощении водный раствор L-фукозы, подлежащий кристаллизации, характеризуется содержанием данного углевода выше 50% (масс./масс.), предпочтительно выше 60% (масс./масс.), предпочтительно выше 70% (масс./масс.), в особенности, выше 80% (масс./масс.).

Альтернативно, концентрация L-фукозы в водном растворе, подлежащем кристаллизации, составляет 650-950 г/л, предпочтительно 800-880 г/л.

Приведенные выше диапазоны и соотношения концентраций могут быть достигнуты традиционным образом путем концентрирования водного технологического потока из культуральной жидкости, предпочтительно после удаления, например клеток, придающих окраску веществ, солей и/или заряженных молекул, из культуральной жидкости с использованием описанных ранее способов.

Концентрирование раствора, содержащего L-фукозу, может быть осуществлено путем удаления воды с применением нанофильтрации и/или упаривания в вакууме (например, с использованием роторного испарителя или пластинчатого испарителя), предпочтительна нанофильтрация в сочетании с упариванием в вакууме.

Для начала кристаллизации к указанному концентрированному раствору L-фукозы могут быть добавлены затравочные кристаллы при температуре в диапазоне от 20°С до 50°С, предпочтительно при 25°С.

Концентрированный раствор, содержащий L-фукозу, предпочтительно имеет концентрацию данного углевода, в частности, выше 75% (масс./масс.).

Раствор, содержащий L-фукозу, можно инкубировать под вакуумом, предпочтительно при давлении ниже 200 мбар (20 кПа), более предпочтительно при давлении ниже 100 мбар (10 кПа), в частности, при давлении ниже 50 мбар (5 кПа).

Кроме того, раствор, содержащий L-фукозу, можно инкубировать при температуре в диапазоне от 15°С до 60°С, предпочтительно от 20°С до 45°С, более предпочтительно от 25°С до 40°С, в частности, от 30°С до 35°С.

Кроме того, раствор, содержащий L-фукозу, можно инкубировать до тех пор, пока концентрация данного углевода не достигнет значения выше 85%, предпочтительно выше 90%, или пока не образуется вязкая пульпа кристаллизации.

Затем раствор (кристаллизуемую смесь), содержащий(ую) L-фукозу, можно поместить в подходящий сосуд для кристаллизации и инкубировать при комнатной температуре (25°С) в течение 12-96 часов до тех пор, пока не образуется твердая закристаллизованная масса.

Закристаллизованную массу можно разделить механически и в раствор с кристаллами можно добавить органический растворитель, например, метанол, ацетон, изопропанол и/или этанол, предпочтительно этанол. Для того, чтобы разъединить кристаллы L-фукозы, 1 кг раствора закристаллизованного вещества смешивают с 0,5-3 л этанола, предпочтительно с 0,7-2,0 л этанола, более предпочтительно с 1,0-1,5 л этанола.

Кристаллы L-фукозы могут быть извлечены из жидкой фазы путем фильтрования (с использованием или без использования вакуума) или путем центрифугирования. Для удаления оставшейся маточной жидкости кристаллы можно промывать органическим растворителем, например, метанолом, ацетоном, изопропанолом и/или этанолом, предпочтительно этанолом. Чтобы удалить оставшуюся маточную жидкость, 1 кг закристаллизованной L-фукозы предпочтительно промывают 0,5-3 л, предпочтительно 0,7-2,0 л, более предпочтительно 1,0-1,5 л этанола.

Полученные кристаллы можно сушить в течение 4-48 ч, предпочтительно 8-36 ч, более предпочтительно 12-24 ч или до тех пор, пока не будет происходить никакого изменения массы. Температуру сушки выбирают в диапазоне от 10°С до 80°С, предпочтительно от 20°С до 70°С, более предпочтительно от 30°С до 60°С, в частности, от 40° до 50°С.

Для кристаллизации L-фукозы из водного раствора в данном описании будет изложен второй альтернативный способ кристаллизации L-фукозы из водных растворов с использованием органических растворителей.

В предпочтительном воплощении водный раствор L-фукозы, подлежащий кристаллизации, имеет содержание данного углевода выше 40% (масс./масс.), предпочтительно выше 50% (масс./масс.), более предпочтительно выше 60% (масс./масс.), в частности, выше 70% (масс./масс.).

Альтернативно, концентрация L-фукозы в водном растворе, подлежащем кристаллизации, может составлять 650-850 г/л, предпочтительно 700-780 г/л.

Приведенные выше диапазоны и соотношения концентраций могут быть достигнуты традиционным образом путем концентрирования водного технологического потока из культуральной жидкости, предпочтительно после удаления, например, клеток, придающих окраску веществ, солей и/или заряженных молекул, из культуральной жидкости с использованием описанных ранее методов.

Концентрирование раствора, содержащего L-фукозу, может быть осуществлено путем удаления воды с применением нанофильтрации и/или упаривания в вакууме (например, с использованием роторного испарителя или пластинчатого испарителя). Предпочтительно используют нанофильтрацию в сочетании с упариванием в вакууме.

После концентрирования раствора, содержащего L-фукозу, данный раствор имеет концентрацию углевода L-фукозы, составляющую, в частности, выше 70% (масс/масс). Для того, чтобы удалить оставшуюся воду из кристаллизуемой смеси, в этот раствор можно добавить 0,5 объема бутанола. Затем кристаллизуемую смесь можно инкубировать под вакуумом до тех пор, пока вакуумной перегонкой не будет удалено эквивалентное количество добавленной жидкости.

Для начала кристаллизации к указанному концентрированному раствору L-фукозы могут быть добавлены затравочные кристаллы при температуре в диапазоне от 20°С до 50°С, предпочтительно при 25°С.

Кристаллизация может быть предпочтительно осуществлена при давлении ниже 200 мбар (20 кПа), более предпочтительно ниже 100 мбар (10 кПа), в частности, ниже 50 мбар (5 кПа).

Кроме того, кристаллизация может быть осуществлена при температуре кристаллизуемого раствора в диапазоне от 15°С до 60°С, предпочтительно от 20°С до 45°С, более предпочтительно от 25°С до 40°С, в частности, от 30°С до 35°С.

Более того, кристаллизуемый раствор можно инкубировать до тех пор, пока концентрация данного углевода не достигнет значения выше 85%, предпочтительно выше 90%, или пока не образуется вязкая пульпа кристаллизации.

Затем кристаллизуемую смесь можно поместить в подходящий сосуд для кристаллизации и инкубировать при комнатной температуре (25°С) в течение 12-96 часов до тех пор, пока не образуется твердая закристаллизованная масса.

Закристаллизованную массу можно разделить механически и к закристаллизованной массе можно добавить органический растворитель, например, метанол, ацетон, изопропанол и/или этанол, предпочтительно этанол. Для того чтобы разъединить кристаллы L-фукозы, 1 кг раствора закристаллизованного вещества предпочтительно смешивают с 0,5-3 л этанола, предпочтительно с 0,7-2,0 л этанола, более предпочтительно с 1,0-1,5 л этанола.

Кристаллы L-фукозы могут быть извлечены из жидкой фазы путем фильтрования с использованием или без использования вакуума либо путем центрифугирования. Для удаления оставшейся маточной жидкости кристаллы можно промывать органическим растворителем, например, метанолом, ацетоном, изопропанолом и/или этанолом, предпочтительно этанолом. Чтобы удалить оставшуюся маточную жидкость, 1 кг кристаллизованной L-фукозы предпочтительно промывают 0,5-3 л, предпочтительно 0,7-2,0 л, более предпочтительно 1,0-1,5 л этанола.

Полученные кристаллы можно сушить в течение 4-48 ч, предпочтительно 8-36 ч, более предпочтительно 12-24 ч или до тех пор, пока не будет происходить никакого изменения массы. Температура сушки может быть выбрана в диапазоне от 10°С до 80°С, предпочтительно от 20°С до 70°С, более предпочтительно от 30°С до 60°С, в частности, от 40° до 50°С.

Получение лиофилизированной формы L-фукозы

Очищенный раствор, содержащий L-фукозу, также может быть лиофилизирован. При указанной лиофилизации очищенный раствор, содержащий L-фукозу, замораживают и затем снижают давление, в результате чего замороженная вода сублимируется непосредственно из твердой фазы в газовую фазу. При применении этого метода обычно получается гигроскопичный порошок L-фукозы.

Композиции и продукты, предложенные согласно изобретению

Согласно данному изобретению предложена композиция, которая содержит

a) по меньшей мере 98 масс. % L-фукозы;

b) не более 1 масс. % органического растворителя; и

c) не более 1 масс. % солей.

В предпочтительном воплощении композиция содержит

a) от 95,50 до 100,00 масс. % L-фукозы, предпочтительно от 98,00 до 100,00 масс. % L-фукозы, более предпочтительно от 98,50 до 100,00 масс. % L-фукозы, возможно от 98,70 до 99,90 масс. % L-фукозы; и/или

b) от 0,00 до 1,00 масс. % органического растворителя, предпочтительно от 0,00 до 0,50 масс. % органического растворителя, более предпочтительно от 0,00 до 0,40 масс. % органического растворителя, возможно от 0,10 до 0,20 масс. % органического растворителя; и/или

c) от 0,00 до 1,00 масс. % солей, предпочтительно от 0,00 до 0,50 масс. % солей, более предпочтительно от 0,00 до 0,40 масс. % солей, возможно от 0,10 до 0,20 масс. % солей.

Предпочтительно, композиция содержит (только)

а) от 0,00 до 0,50 масс. % белков, более предпочтительно от 0,00 до 0,40 масс. % белков, возможно от 0,10 до 0,20 масс. % белков; и/или

b) от 0,00 до 0,50 масс. % ДНК, более предпочтительно от 0,00 до 0,40 масс. % ДНК, возможно от 0,10 до 0,20 масс. % ДНК.

Композиция может отличаться тем, что L-фукоза находится в аморфной форме или в кристаллической форме, предпочтительно в гранулированной форме или в кристаллической форме. Кристаллическая форма предпочтительно представляет собой кристаллическую форму в виде дигидрата.

Грудное молоко является самым лучшим источником питания для младенца. Грудное молоко содержит свободную L-фукозу. Известно, что фукоза может усваиваться людьми и активироваться посредством пути реутилизации фукозы с образованием ГДФ-фукозы. Затем ГДФ-фукоза используется для синтеза фукозилированных гликанов, которые играют важную роль в процессах межклеточной коммуникации, таких как иммунное распознавание, и в развитии головного мозга.

Предложена пищевая композиция, предпочтительно смесь для питания детей грудного возраста, смесь для питания детей ясельного возраста или продукт для лечебного питания, причем данная пищевая композиция содержит L-фукозу и пробиотический углевод (например, галактоолигосахарид (GOS), фруктоолигосахарид (FOS), инулин, мальтодекстрин, изомальтозу, лактулозу и т.д.) или другой моносахарид (например, сиаловую кислоту, такую как N-ацетилнейраминовая кислота).

Пищевая композиция, предпочтительно смесь для питания детей грудного возраста, смесь для питания детей ясельного возраста или продукт для лечебного питания, может содержать L-фукозу и по меньшей мере один олигосахарид грудного молока.

Пищевая композиция может содержать по меньшей мере один сахар, выбранный из группы, состоящей из 2'-фукозиллактозы, 3-фукозиллактозы, лакто-N-тетраозы, лакто-N-триозы II, лакто-N-фукопентаозы I, лакто-N-фукопентаозы III, лакто-N-фукопентаозы V, дифукозиллактозы, лакто-N-неотетраозы, 3'-сиалиллактозы, 6'-сиалиллактозы и сиалилированных производных лакто-N-неотетраозы и лакто-N-тетраозы.

Пищевая композиция может представлять собой

1) жидкую пищевую композицию и содержать L-фукозу в концентрации от 1 мг/л до 2 г/л, более предпочтительно в концентрации от 5 мг/л до 1,5 г/л, еще более предпочтительно в концентрации от 20 мг/л до 1 г/л, наиболее предпочтительно в концентрации от 50 мг/л до 0,7 г/л; или

2) твердую пищевую композицию и содержать L-фукозу в концентрации от 5 мг/кг до 15 г/кг, более предпочтительно в концентрации от 25 мг/кг до 10 г/кг, еще более предпочтительно в концентрации от 100 мг/кг до 10 г/кг, наиболее предпочтительно в концентрации от 375 мг/кг до 5,25 г/кг.

Пищевая композиция может содержать сиаловую кислоту (например, N-ацетилнейраминовую кислоту) в той же концентрации (том же диапазоне), что и для L-фукозы (см. выше).

Пищевая композиция может содержать

1) по меньшей мере один нейтральный олигосахарид грудного молока, предпочтительно по меньшей мере один нейтральный олигосахарид грудного молока выбранный из группы, состоящей из 2'-фукозиллактозы, 3-фукозиллактозы, лакто-N-тетраозы и лакто-N-неотетраозы, наиболее предпочтительно все из указанных нейтральных олигосахаридов грудного молока; и

2) по меньшей мере один кислый олигосахарид грудного молока, предпочтительно по меньшей мере один кислый олигосахарид грудного молока, выбранный из группы, состоящей из 3'-сиалиллактозы и 6'-сиалиллактозы, наиболее предпочтительно все из указанных кислых олигосахаридов грудного молока; и

3) сиаловую кислоту (например, N-ацетилнейраминовую кислоту).

Композиция может дополнительно содержать по меньшей мере одно вещество, возможно все вещества, выбранное(ые) из группы, состоящей из лактозы, белка молочной сыворотки, биотина, обезжиренного молока, растительного масла, сухого обезжиренного молока, масла из Mortierella alpine, рыбьего жира, карбоната кальция, хлорида калия, витамина С, хлорида натрия, витамина Е, ацетата железа, сульфата цинка, ниацина, D-пантотената кальция, сульфата меди, витамина А, витамина В1, витамина В6, сульфата магния, иодата калия, фолиевой кислоты, витамина K, селенита натрия и витамина D.

Пищевая композиция может содержать по меньшей мере одно вещество, выбранное из группы, состоящей из источника белка, витамина, масла, минерального вещества, фермента, дополнительного углевода и пробиотического штамма.

Пищевой композицией может быть композиция, выбранная из группы, состоящей из композиции для лечебного питания, пищевой добавки, продукта в саше, жидкого готового к применению продукта питания для детей грудного возраста, жидкого готового к применению продукта питания для детей ясельного возраста, гранулированного продукта, высушенного распылением продукта в виде смеси для детей грудного возраста и их комбинаций.

Далее предложен жидкий готовый к применению продукт питания для детей грудного или ясельного возраста, содержащий L-фукозу в концентрации от 1 мг/л до 2 г/л, сиаловую кислоту (например, N-ацетилнейраминовую кислоту) (предпочтительно в концентрации от 1 мг/л до 2 г/л) и

1) по меньшей мере один нейтральный олигосахарид грудного молока, выбранный из группы, состоящей из 2'-фукозиллактозы, 3-фукозиллактозы, дифукозиллактозы, лакто-N-тетраозы и лакто-N-неотетраозы; и/или

2) по меньшей мере один кислый олигосахарид грудного молока, выбранный из группы, состоящей из 3'-сиалиллактозы или 6'-сиалиллактозы.

Согласно изобретению также предложен высушенный распылением продукт в виде смеси для детей грудного возраста, содержащий L-фукозу в концентрации от 5 мг/кг до 15 г/кг, сиаловую кислоту (например, N-ацетилнейраминовую кислоту) (предпочтительно в концентрации от 5 мг/кг до 15 г/кг) и

1) по меньшей мере один нейтральный олигосахарид грудного молока, выбранный из группы, состоящей из 2'-фукозиллактозы, 3-фукозиллактозы, дифукозиллактозы, лакто-N-тетраозы и лакто-N-неотетраозы; и/или

2) по меньшей мере один кислый олигосахарид грудного молока, выбранный из группы, состоящей из 3'-сиалиллактозы и 6'-сиалиллактозы.

Кроме того, предложена пищевая добавка, содержащая L-фукозу и по меньшей мере один нейтральный НМО, выбранный из группы, состоящей из 2'-фукозиллактозы, 3-фукозиллактозы, дифукозиллактозы, лакто-N-триозы II, лакто-N-тетраозы и лакто-N-неотетраозы, лакто-N-фукопентаозы I.

Согласно изобретению предложен премикс для пищевого продукта (например, премикс для смеси для питания детей грудного возраста или ясельного возраста), который содержит L-фукозу и по меньшей мере одно вещество, выбранное из группы, состоящей из источника белка, витамина, масла, минерального вещества, фермента, дополнительного углевода (например, углевода, отличающегося от L-фукозы, уже имеющейся в премиксе) и пробиотического штамма. Более предпочтительно, премикс содержит все из указанных веществ.

Источник белка может быть выбран из группы, состоящей из молочной сыворотки, соево-зерновой смеси (CSB), белковых гидролизатов и их комбинаций.

Витамин может быть выбран из группы, состоящей из витамина А, тиамина, рибофлавина, витамина В12, фолата и их комбинаций.

Масло может быть выбрано из группы, состоящей из пальмового масла, докозагексаеновой кислоты (DHA), арахидоновой кислоты и их комбинаций.

Минеральное вещество может быть выбрано из группы, состоящей из хлорида калия, иодата калия, оксида цинка и их комбинаций.

Фермент может быть выбран из группы, состоящей из амилазы, амилоглюкозидазы и их комбинаций.

Углевод может быть выбран из группы, состоящей из олигосахарида грудного молока (НМО), галактоолигосахарида (GOS), инулина, фруктоолигосахарида (FOS), лактозы, изомальтозы, сиаловой кислоты и их комбинаций.

Пробиотический штамм может быть выбран из группы, состоящей из штаммов Lactobacillus, Bifidobacterium, Bacillus, дрожжей и их комбинаций.

Премикс может быть в форме высушенного распылением, гранулированного или жидкого (сиропообразного) продукта.

Согласно данному изобретению предложена фармацевтическая композиция, предпочтительно фармацевтическая композиция для применения в предупреждении или лечении по меньшей мере одного из следующего: вирусной инфекции, бактериальной инфекции (для улучшения иммунной функции), потери памяти, нарушения развития головного мозга и дисбиоза. Такая фармацевтическая композиция содержит композицию по изобретению и возможно содержит по меньшей мере один сахар, отличающийся от L-фукозы, и/или по меньшей мере один пробиотический бактериальный штамм, при этом по меньшей мере один сахар представляет собой предпочтительно по меньшей мере один сахар, выбранный из группы, состоящей из лактозы, лактулозы, инулина и сахарозы.

Все композиции по настоящему изобретению (например, пищевая композиция, жидкий готовый к применению продукт питания для детей грудного или ясельного возраста, высушенный распылением продукт в виде смеси для детей грудного возраста, пищевая добавка и премикс) могут характеризоваться по меньшей мере одним из приведенных далее признаков.

Композиция предпочтительно содержит лактозу.

В случае твердой композиции концентрация лактозы может составлять от 50 до 800 г/кг, предпочтительно от 100 до 750 г/кг, более предпочтительно от 200 до 700 г/кг, еще более предпочтительно от 300 до 650 г/кг, наиболее предпочтительно от 400 до 600, в особенности от 440 до 560 г/кг.

В случае жидкой композиции концентрация лактозы может составлять от 10 до 95 г/л, предпочтительно от 20 до 90 г/л, более предпочтительно от 30 до 85 г/л, еще более предпочтительно от 40 до 80 г/л, наиболее предпочтительно от 50 до 75 г/л, в особенности от 60 до 74 г/л.

Было обнаружено, что наличие в композиции лактозы положительно влияет на самочувствие субъекта, который потребляет такую композицию в качестве пищи. Это влияние обусловлено комбинаторным действием лактозы вместе с другими ингредиентами, которые присутствуют в композиции по изобретению (например, с фукозой, сиаловой кислотой, нейтральным НМО и кислым НМО). Предполагается, что лактоза вместе с другими ингредиентами действуют совместно, защищая организм от патогенных бактерий и снижая интенсивность воспалительных реакций в желудочно-кишечном тракте субъектов, потребляющих данную композицию.

Композиция предпочтительно содержит НМО (кислые и нейтральные НМО) в максимальном количестве.

В случае твердой композиции максимальная концентрация НМО может находиться в диапазоне от 20 до 70 г/кг, предпочтительно от 25 до 65 г/кг, более предпочтительно от 30 до 60 г/кг, еще более предпочтительно от 35 до 55 г/кг, наиболее предпочтительно от 40 до 50, в особенности от 42,2 до 48,1 г/кг.

В случае жидкой композиции максимальная концентрация НМО может составлять от 2,0 до 9,0 г/л, предпочтительно от 3,0 до 8,0 г/л, более предпочтительно от 4,0 до 7,0 г/л, еще более предпочтительно от 4,5 до 6,5 г/л, наиболее предпочтительно от 5,0 до 7,0 г/л, в особенности от 5,7 до 6,5 г/л.

Композиция предпочтительно содержит НМО в определенной концентрации.

В случае твердой композиции концентрация 2'-фукозиллактозы (2'-FL) может составлять от 5 до 40 г/кг, предпочтительно от 10 до 35 г/кг, более предпочтительно от 12,5 до 30 г/кг, наиболее предпочтительно от 15 до 25 г/кг, в особенности от 18,5 до 22,2 г/кг.

В случае жидкой композиции концентрация 2'-FL может составлять от 0,5 до 5,5 г/л, предпочтительно от 1,0 до 4,5 г/л, более предпочтительно от 1,5 до 4,0 г/л, наиболее предпочтительно от 2,0 до 3,5 г/л, в особенности от 2,5 до 3,0 г/л.

В случае твердой композиции концентрация 3'-FL может составлять от 3,5 до 7,5 г/кг, предпочтительно от 4,0 до 7,0 г/кг, более предпочтительно от 4,5 до 6,5 г/кг, наиболее предпочтительно от 5,0 до 6,0 г/кг, в особенности от 5,5 до 5,9 г/кг.

В случае жидкой композиции концентрация 3'-FL может составлять от 500 до 1000 мг/л, предпочтительно от 600 до 950 мг/л, более предпочтительно от 650 до 900 мг/л, наиболее предпочтительно от 700 до 850 мг/л, в особенности от 750 до 800 мг/л.

В случае твердой композиции концентрация лакто-N-тетраозы (LWT) может составлять от 7 до 15 г/кг, предпочтительно от 8 до 14 г/кг, более предпочтительно от 9 до 13 г/кг, наиболее предпочтительно от 10 до 12 г/кг, в особенности 11,1 г/кг.

В случае жидкой композиции концентрация LNT может составлять от 0,2 до 3,5 г/л, предпочтительно от 0,4 до 3,0 г/л, более предпочтительно от 0,8 до 2,5 г/л, наиболее предпочтительно от 1,0 до 2,0 г/л, в особенности 1,5 г/л.

В случае твердой композиции концентрация 3'-сиалиллактозы (3'-SL) может составлять от 0,4 до 3,5 г/кг, предпочтительно от 0,8 до 3,0 г/кг, более предпочтительно от 1,0 до 2,5 г/кг, наиболее предпочтительно от 1,4 до 2,0 г/кг, в особенности от 1,48 до 1,7 г/кг.

В случае жидкой композиции концентрация 3'-SL может составлять от 50 до 400 мг/л, предпочтительно от 100 до 350 мг/л, более предпочтительно от 150 до 300 мг/л, наиболее предпочтительно от 180 до 250 мг/л, в особенности от 200 до 230 мг/л.

В случае твердой композиции концентрация 6'-SL может составлять от 0,5 до 3,5 г/кг, предпочтительно от 1,0 до 3,0 г/кг, более предпочтительно от 1,5 до 2,5 г/кг, наиболее предпочтительно от 2,0 до 2,3 г/кг, в особенности от 2,07 до 2,22 г/кг.

В случае жидкой композиции концентрация 6'-SL может составлять от 100 до 500 мг/л, предпочтительно от 150 до 450 мг/л, более предпочтительно от 200 до 400 мг/л, наиболее предпочтительно от 250 до 350 мг/л, в особенности от 280 до 300 мг/л.

В случае твердой композиции концентрация лакто-N-неотетраозы (LNnT) может составлять от 0,2 до 3,5 г/кг, предпочтительно от 0,4 до 1,8 г/кг, более предпочтительно от 0,8 до 1,4 г/кг, наиболее предпочтительно от 1,0 до 1,2 г/кг, в особенности 1,11 г/кг.

В случае жидкой композиции концентрация LNnT может составлять от 10 до 350 мг/л, предпочтительно от 20 до 300 мг/л, более предпочтительно от 50 до 250 мг/л, наиболее предпочтительно от 100 до 200 мг/л, в особенности 150 мг/л.

В случае твердой композиции концентрация лакто-N-фукопентаозы I (LNFP-I) может составлять от 1,0 до 10,0 г/кг, предпочтительно от 3,0 до 9,0 г/кг, более предпочтительно от 6,0 до 8,0 г/кг, наиболее предпочтительно от 7,0 до 7,5 г/кг, в особенности 7,4 г/кг.

В случае жидкой композиции концентрация LNFP-I может составлять от 0,1 до 2,0 г/л, предпочтительно от 0,3 до 1,5 г/л, более предпочтительно от 0,6 до 1,2 г/л, наиболее предпочтительно от 0,8 до 1,1 г/л, в особенности 1,0 г/л.

В том случае, когда композиция представляет собой премикс, вышеупомянутые концентрации могут быть выше по меньшей мере в 2 раза, предпочтительно по меньшей мере в 4 раза, более предпочтительно по меньшей мере в 8 раз, еще более предпочтительно по меньшей мере в 16 раз, наиболее предпочтительно по меньшей мере в 20 раз, в особенности, по меньшей мере в 22 раза.

Типичная пищевая композиция

Способ по изобретению обеспечивает получение желаемой L-фукозы с чистотой, достаточной для того, чтобы ее можно было использовать в пищевых продуктах или кормах, в частности, пригодной для включения в продукты питания для детей грудного и ясельного возраста. Полученную L-фукозу можно использовать для приготовления смеси для грудных детей путем смешивания ее с компонентами базовой смеси для грудных детей. Смесь для грудных детей может представлять собой сухую смесь или готовую к применению жидкую смесь для грудных детей.

Базовая смесь может иметь по меньшей мере один, возможно все, из приведенных ниже компонентов.

Применение композиции по изобретению

Предложено применение композиции по изобретению для изготовления пищевой композиции и/или фармацевтической композиции.

Подразумевается, что на основании следующих далее фигур и примеров предмет изобретения будет более подробно разъяснен без ограничения указанного предмета специальными воплощениями, показанными в данном описании.

На Фиг. 1 показан пример способа очистки L-фукозы по изобретению. После проведения ферментации среду ферментации осветляют посредством центрифугирования и/или фильтрования. Осветленную среду ферментации подвергают обработке на ионообменнике для удаления электрически заряженных примесей и для обмена неспецифических ионов на конкретные ионы. Проходящий поток после обработки на ионообменнике затем подвергают диафильтрации и/или концентрированию. После выполнения указанной стадии раствор, содержащий L-фукозу, подвергают электродиализу и/или диафильтрации. Затем раствор, содержащий L-фукозу, подвергают дополнительной обработке на ионообменнике для удаления электрически заряженных окрашенных веществ и пептидов. После этого раствор, содержащий L-фукозу, подвергают обработке активированным углем. Затем раствор либо подвергают кристаллизации L-фукозы, либо подвергают дополнительной стадии электродиализа и/или диафильтрации с последующим проведением гранулирования и/или распылительной сушки.

На Фиг. 2 показан пример второго способа очистки L-фукозы по изобретению. После проведения ферментации среду ферментации осветляют посредством центрифугирования и/или фильтрования. Осветленную среду ферментации подвергают обработке на ионообменнике для удаления электрически заряженных примесей и для обмена неспецифических ионов на конкретные ионы. Проходящий поток после обработки на ионообменнике затем подвергают диафильтрации и/или концентрированию. После выполнения указанной стадии раствор, содержащий L-фукозу, подвергают электродиализу и/или диафильтрации. Затем раствор, содержащий L-фукозу, подвергают обработке активированным углем. После этого раствор, содержащий L-фукозу, подвергают дополнительной обработке на ионообменнике для удаления электрически заряженных окрашенных веществ и пептидов. Затем раствор либо подвергают кристаллизации L-фукозы, либо подвергают дополнительной стадии электродиализа и/или диафильтрации с последующим проведением гранулирования и/или распылительной сушки.

На Фиг. 3 показан пример третьего способа очистки L-фукозы по изобретению. После проведения ферментации среду ферментации осветляют посредством центрифугирования и/или фильтрования. Осветленную среду ферментации подвергают диафильтрации и/или концентрированию. Затем раствор подвергают обработке на ионообменнике для удаления электрически заряженных примесей и для обмена неспецифических ионов на конкретные ионы. После выполнения указанной стадии раствор, содержащий L-фукозу, подвергают электродиализу и/или диафильтрации. Затем раствор, содержащий L-фукозу, подвергают обработке активированным углем. После этого раствор, содержащий L-фукозу, подвергают дополнительной обработке на ионообменнике для удаления электрически заряженных окрашенных веществ и пептидов. Затем раствор либо подвергают кристаллизации L-фукозы или подвергают дополнительной стадии электродиализа и/или диафильтрации с последующим проведением гранулирования и/или распылительной сушки.

На Фиг. 4 показан пример четвертого способа очистки L-фукозы по изобретению. После проведения ферментации среду ферментации осветляют посредством центрифугирования и/или фильтрования. Осветленную среду ферментации подвергают диафильтрации и/или концентрированию. Затем раствор подвергают обработке активированным углем. После выполнения указанной стадии раствор, содержащий L-фукозу, подвергают обработке на ионообменнике для удаления электрически заряженных примесей и для обмена неспецифических ионов на конкретные ионы. После этого раствор, содержащий L-фукозу, подвергают электродиализу и/или диафильтрации. После этого раствор подвергают дополнительной обработке на ионообменнике для удаления электрически заряженных окрашенных веществ и пептидов. Затем раствор либо подвергают кристаллизации L-фукозы или подвергают дополнительной стадии электродиализа и/или диафильтрации с последующим проведением гранулирования и/или распылительной сушки.

На Фиг. 5 показано изображение под микроскопом кристаллов L-фукозы, образованных в результате кристаллизации из водного раствора. Можно видеть, что L-фукоза образует иглоподобные кристаллы длиной от 50 мкм до 150 мкм.

На Фиг. 6 приведена HPLC-диаграмма, которая была зарегистрирована для L-фукозы, закристаллизованной из водного раствора. Обнаружено, что чистота закристаллизованной L-фукозы составляет 99,8%. Содержание воды составляет 0,1% (масс./масс.).

На Фиг. 7 приведена HPLC-диаграмма, которая была зарегистрирована для L-фукозы, подвергнутой гранулированию из водного раствора. Обнаружено, что чистота гранулированной L-фукозы составляет 97,8%. Содержание воды составляет 1,7% (масс./масс.).

Пример 1. Очистка L-фукозы после бактериальной ферментации

L-Фукоза образовывалась в результате бактериальной ферментации, и ее собирали фильтрованием. Полученный прозрачный, не содержащий частиц раствор L-фукозы (34 г/л) обрабатывали с использованием сильного катионообменника (Lewatit^® S2568 в протонированной форме, Lanxess). После нейтрализации с использованием гидроксида натрия раствор дополнительно обрабатывали с использованием сильного анионообменника (Lewatit^® S 6368А в хлорид ной форме).

Для концентрирования раствора L-фукозы после обработки на ионообменнике раствор дополнительно обрабатывали, используя стадию с применением обратного осмоса. Систему обратного осмоса Emrich EMRO 1.8 (Emrich Edelstahlbau) оснащали нанофильтрационным модулем Trisep^® TS80 (80-40-TS80-TSA). Устанавливали давление на входе 25 бар (2,5 МПа) и раствор концентрировали до тех пор, пока концентрация L-фукозы не достигала 100 г/л. Альтернативно, концентрирование раствора L-фукозы также можно осуществлять посредством упаривания в вакууме, тем не менее методы фильтрации снижают возможность образования продуктов реакций Майяра в процессе концентрирования.

Для удаления хлорида натрия со стадии с использованием ионообменника и других ионов раствор подвергали электродиализу с применением системы для электродиализа PCCell Р15 (производства PCCell, Heusweiler, Германия), оснащенную пакетом мембран PCCell ED 1000А. Указанный пакет содержал следующие мембраны: катионообменную мембрану СЕМ: PC SK и анионообменную мембрану СЕМ: PcAcid60, имеющие предел исключения по размеру, составляющий 60 Да. Значение электропроводности исходных растворов составляло от 15 до 25 мСм/см², и раствор подвергали электродиализу до достижения значения электропроводности 1,5-2 мСм/см².

После проведения электродиализа раствор еще раз обрабатывали с использованием сильного катионообменника (Lewatit^® S2568 в натриевой форме, Lanxess) и сильного анионообменника (Lewatit^® S 6368А в хлоридной форме), чтобы удалить окрашенные вещества и возможно оставшиеся неспецифические ионы (такие как, например, заряженные пептиды).

Для более полноценного удаления окрашенных веществ раствор, содержащий L-фукозу, далее обрабатывали порошком активированного угля. Раствор инкубировали в течение 2 часов при перемешивании с активированным углем Norit DX1. После инкубирования активированный уголь удаляли фильтрованием.

После обработки активированным углем раствор, содержащий L-фукозу, концентрировали посредством фильтрования с использованием обратного осмоса, применяя систему обратного осмоса Emrich EMRO 1.8 (Emrich Edelstahlbau), которая была оснащена модулем обратного осмоса CSM RE8040BE. Раствор концентрировали до тех пор, пока скорость потока не падала ниже 50 литров в час.Содержание по сухому веществу после концентрирования составляло от 30 до 35% (масс./масс.).

Альтернативно, концентрирование раствора L-фукозы также можно осуществлять посредством упаривания в вакууме. Этот метод приводит к достижению более высокой концентрации (от 50 до 60% (масс./масс.) L-фукозы. Недостаток концентрирования посредством упаривания в вакууме заключается в том, что L-фукоза будет частично подвергаться карамелизации, о чем свидетельствует изменение окраски раствора до отчетливого коричневого цвета. Вкратце, этот метод концентрирования снижает качество продукта, чистоту продукта и выход продукта.

Пример 2. Кристаллизация L-фукозы с использованием органических растворителей

Для проведения кристаллизации L-фукозы 15 литров 32%-ного (масс./масс.) раствора концентрировали до конечной концентрации по сухому веществу 80-85% (масс./масс.) посредством упаривания в вакууме с применением промышленного испарителя Hei-VAP (Heidolph Instruments GmbH, Schwabach, Германия) с целью получения маточной жидкости для кристаллизации L-фукозы.

Чтобы начать процесс кристаллизации, в маточную жидкость вводили затравочные кристаллы. Добавляли дополнительно 2,5 литра н-бутанола (соотношение бутанола и фукозы составляло 1:2) и раствор концентрировали под вакуумом до насыщения раствора кристаллами.

Закристаллизованную массу снимали с крышки резервуара (piston) и инкубировали в течение по меньшей мере 24 часов до получения твердой закристаллизованной массы.

Твердые кристаллы смешивали с этанолом в соотношении 1:1 (1 литр этанола с 1 кг закристаллизованной массы). Для отделения маточной жидкости и этанола от кристаллов раствор центрифугировали.

Кристаллы снова промывали этанолом (2,5 литра на 5 кг кристаллов L-фукозы) и вновь центрифугировали. Твердые кристаллы L-фукозы извлекали из центрифуги и сушили при 40°С до полного отсутствия этанола. L-Фукозу просеивали через грубое сито с диаметром ячейки 0,2 мм.

В итоге из 5 кг содержащей L-фукозу кристаллизуемой смеси получали 3,3 кг L-фукозы (выход: 66%).

Пример 3. Кристаллизация L-фукозы из водных растворов

Для проведения кристаллизации L-фукозы из водных растворов 15 литров 32%-ного (масс./масс.) раствора концентрировали до конечной концентрации по сухому веществу 80-85% (масс./масс.) посредством упаривания в вакууме с применением промышленного испарителя Hei-VAP (Heidolph Instruments GmbH, Schwabach, Германия).

Чтобы начать процесс кристаллизации, в маточную жидкость вводили затравочные кристаллы. Раствор концентрировали под вакуумом до тех пор, пока не начинали образовываться прозрачные кристаллы.

Закристаллизованную массу снимали с крышки резервуара (piston) и инкубировали в течение по меньшей мере 72 часов до получения твердой закристаллизованной массы. Твердые кристаллы смешивали с этанолом в соотношении 1:1 (1 литр этанола с 1 кг закристаллизованной массы).

Для отделения маточной жидкости и этанола от кристаллов раствор центрифугировали. Кристаллы промывали этанолом (2,5 литра на 5 кг кристаллов L-фукозы) и снова центрифугировали. Твердые кристаллы L-фукозы извлекали из центрифуги и сушили при 40°С до полного отсутствия этанола. L-Фукозу просеивали через грубое сито с диаметром ячейки 0,2 мм.

В итоге из 5 кг содержащей L-фукозу кристаллизуемой смеси получали 3,0 кг L-фукозы (выход: 60%).

Пример 4. Выделение L-фукозы посредством гранулирования

Для гранулирования L-фукозы использовали систему с псевдоожиженным слоем от Glatt (Glatt GmbH, Германия). Из кристаллизуемой смеси L-фукозы готовили 40%-ный (масс./масс.) раствор L-фукозы и его использовали для гранулирования в системе с псевдоожиженным слоем.

В систему с псевдоожиженным слоем загружали в общей сложности 500 г твердой L-фукозы и систему запускали путем добавления исходного раствора. В системе постоянно поддерживали температуру продукта от 45°С до 50°С. После добавления 300 г L-фукозы образовывались первые агломераты. После добавления 1000 г 40%-ного (масс/масс.) раствора L-фукозы (400 г L-фукозы) систему останавливали и проводили анализ.

После проведения гранулирования и достижения степени извлечения, равной 80%, можно было получить 720 г L-фукозы с насыпной плотностью 570 г/л и потерями при сушке, составляющими 0,9%. Размер гранулированной L-фукозы анализировали путем просеивания. Этот тест показывает, что 70% данного вещества имеет размер от 150 мкм до 1400 мкм.

Пример 5. Степень чистоты после типичной очистки L-фукозы

Степень чистоты после типичной очистки L-фукозы из культуральной жидкости показана в Таблице 1.

Пример 6. Состав типичного продукта в виде смеси для детей грудного возраста

Далее представлен состав типичного продукта в виде смеси для детей грудного возраста (см. приведенную ниже Таблицу 2).

В данный состав входит L-фукоза в комбинации с имеющимися в избытке нейтральными НМО, а именно: 2'-фукозиллактозой (2-FL), 3-фукозиллактозой (3-FL), лакто-N-тетраозой (LWT) и возможно лакто-N-неотетраозой (LNnT) и лакто-N-фукопентаозой I (LNFP-I), кислыми НМО (6'-сиалиллактозой (6'-SL) и 3'-сиалиллактозой (3'-SL)) и сиаловой кислотой N-ацетилнейраминовой кислотой (Neu5Ac).

В продукте может быть представлен один или более чем один из пробиотических штаммов. Значение конечной концентрации каждого ингредиента основывается на приготовлении композиции из расчета 13,5 г порошка в 90 мл воды.

Пример 7. Состав типичного премикса для продукта в виде смеси для детей грудного возраста, содержащего олигосахариды грудного молока, моносахарид L-фукозу и моносахарид N-ацетилнейраминовую кислоту (Neu5Ac)

Далее представлен состав типичного премикса для продукта в виде смеси для детей грудного возраста (см. приведенную ниже Таблицу 3).

В данный состав входит моносахарид L-фукоза в комбинации с имеющимися в избытке нейтральными НМО, а именно: 2'-фукозиллактозой (2'-FL), 3-фукозиллактозой (3-FL), лакто-N-тетраозой (LNnT) и возможно лакто-N-неотетраозой (LNnT) и лакто-N-фукопентаозой I (LNFP-I), кислыми НМО (такими как 6'-сиалиллактоза (6'-SL), 3'-сиалиллактоза (3'-SL) и сиалилированные производные LNT) и сиаловой кислотой N-ацетилнейраминовой кислотой (Neu5Ac).

Такой премикс можно использовать для повторного разведения смеси для грудных детей путем добавления указанного премикса к другим продуктам питания, которые необходимы для повторного разведения смеси для питания детей грудного возраста, таким как молочная сыворотка, лактоза, липиды (насыщенные и ненасыщенные жирные кислоты) и минеральные вещества. Подразумевается, что премикс, приведенный в Таблице 3, будет использован для приготовления 1 кг конечного продукта в виде смеси для детей грудного возраста.

1. Способ очистки L-фукозы от ферментационного бульона, включающий следующие стадии:

удаление биомассы посредством центрифугирования и/или фильтрации из ферментационного бульона, содержащего L-фукозу, с получением осветленного раствора,

получение очищенного раствора путем подвергания осветленного раствора обработке на катионообменнике и обработке на анионообменнике; и

удаление солей из очищенного раствора путем электродиализа и/или нанофильтрации,

где биомасса содержит клетки, которые продуцируют L-фукозу.

2. Способ по п. 1, где обработку на катионообменнике осуществляют в условиях, при которых L-фукоза проходит через катионообменный материал и присутствует в проходящем потоке, и где обработку на анионообменнике осуществляют в условиях, при которых L-фукоза проходит через анионообменный материал и присутствует в проходящем потоке.

3. Способ по п. 1 или 2, в котором

1) биомассу удаляют из ферментационного бульона посредством центрифугирования и/или фильтрации, при этом фильтрация предпочтительно выбрана из группы, состоящей из микрофильтрации, ультрафильтрации, фильтрации в тангенциальном потоке, диафильтрации и их комбинаций; и/или

2) биомасса содержит бактериальные клетки, которые продуцируют L-фукозу, предпочтительно рекомбинантные бактериальные клетки, наиболее предпочтительно рекомбинантные клетки Е. coli, рекомбинантные клетки Bacillus sp. и/или рекомбинантные клетки Corynebacterium sp., в частности рекомбинантные клетки Bacillus subtiils и/или рекомбинантные клетки Bacillus megaterium.

4. Способ по любому из пп. 1-3, в котором при обработке на катионообменнике используют сильный катионообменник и/или при обработке на анионообменнике используют сильный анионообменник.

5. Способ по любому из пп. 1-4, где обработку на катионообменнике выполняют для удаления неспецифических катионов и для замены их на конкретные катионы, предпочтительно для замены их на конкретный катион Н⁺ или Na⁺, при этом если неспецифические катионы заменяют на Н⁺, то значение рН в проходящем потоке предпочтительно доводят до рН 6-8 перед проведением последующей стадии обработки, наиболее предпочтительно путем добавления NaOH к проходящему потоку.

6. Способ по любому из пп. 1-5, где стадию обработки на анионообменнике проводят для удаления неспецифических анионов и замены их на конкретные анионы, предпочтительно на конкретный анион Cl^- или ОН^-, при этом если неспецифические анионы заменяют на Cl^-, то значение рН в проходящем потоке предпочтительно доводят до рН 6-8 перед проведением последующей стадии обработки, наиболее предпочтительно путем добавления NaOH к проходящему потоку.

7. Способ по любому из пп. 1-6, где условия, при которых L-фукоза проходит через анионообменный материал и катионообменный материал, устанавливают путем регулирования рН и/или концентрации солей в осветленном растворе, предпочтительно путем доведения рН осветленного раствора до значения рН в диапазоне 6-8.

8. Способ по любому из пп. 1-7, где после обработки на катионообменнике и обработки на анионообменнике очищенный раствор содержит L-фукозу, придающие окраску вещества и соль, при этом соль предпочтительно представляет собой NaCl.

9. Способ по любому из пп. 1-8, где при обработке на анионообменнике используют анионообменный материал в хлоридной форме и/или при обработке на катионообменнике используют катионообменный материал в водородной форме.

10. Способ по любому из пп. 1-9, где осветленный раствор сначала подвергают обработке на катионообменнике, а затем обработке на анионообменнике.

11. Способ по любому из пп. 1-10, где очищенный раствор концентрируют, предпочтительно посредством нанофильтрации и/или обратного осмоса, более предпочтительно посредством нанофильтрации, при этом наиболее предпочтительно используют нанофильтрационную мембрану, которая имеет значение отсечения по молекулярной массе в диапазоне 100-200 кДа.

12. Способ по любому из пп. 1-11, где осветленный раствор и/или очищенный раствор концентрируют

1) до достижения концентрации L-фукозы, большей или равной 100 г/л, предпочтительно большей или равной 200 г/л, более предпочтительно большей или равной 300 г/л; и/или

2) посредством нанофильтрации при температуре ниже 80°С, предпочтительно ниже 50°С, более предпочтительно от 4 до 45°С, более предпочтительно от 10 до 40°С, еще более предпочтительно от 15 до 30°С, наиболее предпочтительно от 15 до 20°С; и/или

3) посредством обратного осмоса при температуре от 20 до 50°С, более предпочтительно от 30 до 45°С, наиболее предпочтительно от 35 до 45°С; и/или

4) посредством нанофильтрации при давлении в диапазоне от выше 5 бар (0,5 МПа) до ниже 50 бар (5 МПа), предпочтительно при давлении от выше 10 бар (1 МПа) до ниже 40 бар (4 МПа), более предпочтительно при давлении от выше 15 бар (1,5 МПа) до ниже 30 бар (3 МПа); и/или

5) посредством обратного осмоса при давлении в диапазоне от выше 5 бар (0,5 МПа) до ниже 100 бар (10 МПа), предпочтительно при давлении от выше 10 бар (1 МПа) до ниже 80 бар (8 МПа), более предпочтительно при давлении от выше 15 бар (1,5 МПа) до ниже 70 бар (7 МПа).

13. Способ по любому из пп. 1-12, где электродиализ представляет собой электродиализ в нейтральных условиях или электродиализ в кислотных условиях.

14. Способ по любому из пп. 1-13, где после удаления солей из очищенного раствора

1) количество соли в очищенном растворе составляет меньше 10% (масс/масс), предпочтительно меньше 5% (масс./масс.), более предпочтительно 1% (масс./масс.) или менее, еще более предпочтительно 0,5% (масс./масс.) или менее, наиболее предпочтительно 0,4% (масс./масс.) или менее, в особенности 0,2% (масс./масс.) или менее; и/или

2) значение электропроводности находится в диапазоне от 0,2 до 10,0 мСм/см², предпочтительно от 0,4 до 5,0 мСм/см², более предпочтительно от 0,5 до 1,0 мСм/см².

15. Способ по любому из пп. 1-14, где осветленный раствор и/или очищенный раствор подвергают стадии обесцвечивания, предпочтительно путем обработки активированным углем и/или обработки с использованием катионообменника и анионообменника, которые соединены последовательно, причем указанное удаление возможно осуществляют

1) до или после стадии диафильтрации и/или концентрирования осветленного раствора; и/или

2) до или после стадии электродиализа и/или диафильтрации осветленного раствора.

16. Способ по любому из пп. 1-15, где очищенный раствор подвергают

1) гранулированию;

2) распылительной сушке;

3) сушке на вальцовой сушилке; или

4) лиофилизации.

17. Способ по любому из пп. 1-16, где очищенный раствор подвергают кристаллизации, возможно, путем добавления бутанола к очищенному раствору или без добавления какого-либо органического растворителя к очищенному раствору.