Способ получения токсина

Изобретение относится к способу получения ботулинического токсина. Предложенный способ включает получение ботулинического токсина путем культивирования Clostridium botulinum типа А в композиции среды для культивирования Clostridium botulinum типа А и извлечение ботулинического токсина. При этом среда для культивирования Clostridium botulinum типа А содержит от 2 до 5 мас./об.% картофельного пептона, от 0,5 до 2 мас./об.% дрожжевого экстракта и от 0,75 до 1,5 мас./об.% глюкозы. Изобретение позволяет достичь максимального уровня токсинообразования и максимального уровня роста культуры в течение короткого времени, обеспечивая тем самым сокращение времени культивирования. 3 з.п. ф-лы, 7 ил., 13 табл., 5 пр.

 

Область техники

Настоящее изобретение относится к композиции среды для культивирования Clostridium botulinum и к способу получения ботулинического токсина с ее использованием, в частности, к композиции среды для культивирования Clostridium botulinum, содержащей картофельный пептон, дрожжевой экстракт и глюкозу, позволяющей эффективно сокращать время культивирования Clostridium botulinum, не содержащей при этом продуктов животного происхождения и основных аллергенов, и к способу получения ботулинического токсина с ее использованием.

Предшествующий уровень техники

Ботулинический токсин представляет собой нейротоксический белок, продуцируемый такими бактериями, как Clostridium butyricum, Clostridium baraffi и Clostridium botulinum. Ботулинический токсин блокирует нервно-мышечную передачу и вызывает нейропаралитические заболевания у человека и животных. В частности, известно, что ботулинический токсин типа А является смертельно опасным для человека. Помимо ботулинического токсина типа А были идентифицированы шесть других типов ботулинического токсина - В, Cl, D, Е, F, G и Н. Каждый тип ботулинического токсина можно отличить по соответствующему типоспецифическому антителу, при этом тяжесть паралича, вызываемого разными типами, и виды животных, на которых они действуют, различаются.

Молекулярная масса молекулы белка ботулинического токсина составляет приблизительно 150 кДа, включая легкую цепь приблизительно 50 кДа и соединенную с ней тяжелую цепь приблизительно 100 кДа. При этом ботулинический токсин, выделяемый бактериями Clostridium, высвобождается в виде комплекса, содержащего токсиновый белок массой 150 кДа в сочетании с по меньшей мере одним нетоксиновым белком. Например, ботулинический токсин высвобождается в виде комплексов с молекулярными массами 900 кДа, 500 кДа и 300 кДа.

Ботулинический токсин может быть смертельно опасным для человека, однако недавно был создан ботулинический токсин для лечения целого ряда симптомов, включая нервно-мышечные расстройства, характеризующиеся гиперактивностью скелетных мышц. Например, Botox® является товарным знаком ботулинического токсина А, коммерчески разработанного компанией Allergan, Inc., и применяется для облегчения или лечения блефароспазма, косоглазия, дистонии мышц шеи, глабеллярных (лицевых) морщин; кроме того, в настоящее время ведутся исследования по разработке способов применения, подходящих для других серотипов, и по клиническому применению серотипов.

Ботулинические токсины для клинического применения обычно выделяют из клеточных культур. Традиционно, ботулинические токсины в основном выделяют с помощью процессов культивирования, ферментации и очистки, используя продукты животного происхождения. Однако при получении ботулинического токсина с использованием продуктов животного происхождения возникает опасение, что при введении такого ботулинического токсина пациенту ему также могут быть введены различные патогены и инфекционные вещества животного происхождения. Например, в полученной композиции ботулинического токсина могут содержаться прионы. Прион представляет собой фактор инфекционного заболевания совершенно другого типа, чем бактерии, вирусы, грибы и паразиты. У животных, включая людей, инфицированных прионом, происходит перфорация головного мозга, придающая ему вид губки, и гибель нервных клеток, что приводит к потере соответствующей функции головного мозга. Прионы могут генерировать аномальную конформационную изоформу из той же последовательности нуклеиновых кислот, что образует нормальный белок, причем инвазивная способность проявляется во время "реакции рекрутирования", при которой нормальные изомеры становятся изоформами прионного белка на посттрансляционной стадии. Нормальные внутренние клеточные белки индуцируют неправильное скручивание в патогенные прионные структуры. Болезнь Крейтцфельдта-Якоба представляет собой редкое нейродегенеративное заболевание человека и классифицируется как трансмиссивная губчатая энцефалопатия, при этом инфекционным агентом является аномальная изоформа прионного белка. Субъекты с болезнью Крейтцфельдта-Якоба могут прогрессировать от здорового состояния до акинетического мутизма в течение 6 месяцев. Следовательно, при введении фармацевтической композиции, содержащей биологический агент, такой как ботулинический токсин, полученный с использованием продуктов животного происхождения, существует риск заражения прион-опосредованным заболеванием, таким как болезнь Крейтцфельдта-Якоба.

Чтобы устранить такой риск, были, например, предприняты попытки исключить ингредиенты животного происхождения из культуральной среды в процессе получения ботулинического токсина. Так, например, компанией Allergan Inc. был разработан способ проведения ферментации в среде, содержащей соевые бобы в качестве ингредиента растительного происхождения вместо ингредиента животного происхождения (выложенная заявка на патент Кореи №10-2006-0102330), однако проблема способа заключалась в том, что для получения достаточного количества ботулинического токсина требовалось культивирование штамма в течение длительного времени.

Пищевая аллергия представляет собой аномальную реакцию иммунной системы на перевариваемую пищу. Пищевая аллергия обычно включает симптомы, доставляющие много неудобств в повседневной жизни, такие как сыпь, ангионевротический отек и атопический дерматит, и может привести к анафилаксии, являющейся серьезной и опасной аллергической реакцией, способной стать угрожающей жизни. По мнению FDA (англ. Food and Drug Administration -Управление по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных средств), к восьми основным причинам развития пищевой аллергии относятся молоко, яйца, рыба, ракообразные, лесные орехи, арахис, пшеница и соевые бобы, причем на их счет приходится от 85 до 90% от общего числа случаев.

В соответствии с этим, в результате значительных усилий по разработке компонента, позволяющего эффективно культивировать штамм, продуцирующий ботулинический токсин, при замене обычной среды, содержащей ингредиент животного происхождения, и при исключении возможных аллергенов, авторы настоящего изобретения обнаружили, что при культивировании бактерии Clostridium butyricum в композиции среды, содержащей картофельный пептон, дрожжевой экстракт и глюкозу, скорость культивирования может быть значительно улучшена, в результате чего Clostridium butyricum может достичь максимального уровня роста за достаточно короткое время. На основании этого открытия было завершено настоящее изобретение.

Сущность изобретения

Таким образом, настоящее изобретение было сделано с учетом указанных выше проблем, а целью настоящего изобретения является создание способа получения ботулинического токсина с использованием композиции среды, позволяющей улучшить скорость выращивания штамма, продуцирующего ботулинический токсин, по сравнению с традиционной композицией среды, в качестве композиции, не содержащей продукта животного происхождения и основного аллергена.

В соответствии с аспектом настоящего изобретения, указанные выше и другие цели могут быть достигнуты благодаря обеспечению способа получения ботулинического токсина, включающего в себя (а) получение ботулинического токсина путем культивирования Clostridium botulinum в композиции среды для культивирования Clostridium botulinum, содержащей картофельный крахмал, дрожжевой экстракт и глюкозу, и (b) извлечение ботулинического токсина.

Краткое описание графических материалов

Указанные выше и прочие цели, особенности и другие преимущества настоящего изобретения будут более понятны из следующего подробного описания во взаимосвязи с прилагаемыми графическими материалами, на которых:

на Фиг. 1 показан результат анализа нормального распределения, основанного на результатах факторных экспериментов в восьми диапазонах концентраций, для компонентов в соответствии с настоящим изобретением;

на Фиг. 2 показан результат анализа по Парето, основанного на результатах факторных экспериментов в восьми диапазонах концентраций, для компонентов в соответствии с настоящим изобретением;

на Фиг. 3 показан результат анализа пригодности модели, основанного на результатах факторных экспериментов, экспериментов в центральных точках и экспериментов в осевых точках, для компонентов в соответствии с настоящим изобретением;

на Фиг. 4 показан результат анализа поверхности, основанного на результатах факторных экспериментов, эксперимента в центральных точках и экспериментов в осевых точках, проведенных для компонентов в соответствии с настоящим изобретением;

на Фиг. 5 показан результат определения оптимального соотношения на основании результатов анализа поверхности для компонентов в соответствии с настоящим изобретением;

на Фиг. 6 показан результат определения оптической плотности в зависимости от уровня токсина и роста штамма при использовании в качестве переменной концентрации глюкозы при оптимальном соотношении в соответствии с настоящим изобретением; и

на Фиг. 7 показан результат определения оптической плотности в зависимости от уровня токсина и роста штамма с течением времени при культивировании бактерии Clostridium botulinum в оптимизированной композиции среды по настоящему изобретению.

Подробное описание изобретения

Если не указано иное, все технические и научные термины, использованные в данном документе, имеют значения, понятные специалистам в области техники, к которой относится изобретение. В целом, используемая в настоящем документе номенклатура хорошо известна в данной области и является общепринятой.

В настоящем изобретении было установлено, что при культивировании штамма Clostridium botulinum в культуральной среде, содержащей картофельный пептон, дрожжевой экстракт и глюкозу, используемой в качестве культуральной среды, не содержащей ингредиентов животного происхождения и аллергенов, штамм достигал максимального уровня роста в течение достаточно короткого времени, а скорость культивирования значительно улучшалась.

Соответственно, согласно одному из аспектов, настоящее изобретение направлено на композицию среды для культивирования Clostridium botulinum, содержащую картофельный пептон, дрожжевой экстракт и глюкозу.

Штамм, продуцирующий ботулинический токсин, используемый в настоящем изобретении, может представлять собой Clostridium botulinum или его вариант, наиболее предпочтительно, Clostridium botulinum типа A, NCTC13319, но не ограничивается этим. Специалистам в данной области техники будет очевидно, что можно использовать любой штамм, способный продуцировать ботулинические токсины.

Настоящее изобретение отличается тем, что композиция среды содержит от 2 мас./об.% до 5 мас./об.% картофельного пептона, от 0,5 мас./об.% до 2 мас./об.% дрожжевого экстракта и от 0,75 мас./об.% до 1,5 мас./об.% глюкозы, наиболее предпочтительно, композиция среды содержит 3 мас./об.% картофельного пептона, 1 мас./об.% дрожжевого экстракта и 1 мас./об.% глюкозы, но не ограничивается этим.

Вместе с тем, в настоящем изобретении было установлено, что при культивировании штамма Clostridium botulinum с использованием композиции среды в процессе получения ботулинического токсина скорость культивирования возрастает, благодаря чему может быть значительно сокращено время извлечения. Иначе говоря, при культивировании Clostridium botulinum с использованием соевого пептона Clostridium botulinum демонстрирует максимальный уровень роста через 24 ч. С другой стороны, Clostridium botulinum в соответствии с настоящим изобретением демонстрирует максимальный уровень роста приблизительно через от 14 до 18 ч. Что касается времени извлечения токсина, в случае традиционного культивирования Clostridium botulinum максимальное токсинообразование получали после по меньшей мере 48 ч культивирования, тогда как в настоящем изобретении максимальное токсинообразование было достигнуто в течение 48 ч, то есть приблизительно после 37 ч культивирования (см. Фиг. 7). Считается, что описанный выше эффект может быть достигнут при использовании в качестве пептона картофельного пептона.

Соответственно, согласно другому аспекту, настоящее изобретение направлено на способ получения ботулинического токсина, включающий в себя (а) получение ботулинического токсина путем культивирования Clostridium botulinum в композиции среды для культивирования Clostridium botulinum, содержащей картофельный пептон, дрожжевой экстракт и глюкозу, и (b) извлечение ботулинического токсина.

В настоящем изобретении Clostridium botulinum может представлять собой Clostridium botulinum типа А, предпочтительно, Clostridium botulinum типа А, NCTC13319, но не ограничивается этим.

В настоящем изобретении композиция среды для культивирования может не содержать продукта животного происхождения и аллергена.

В настоящем изобретении композиция среды содержит от 2 мас./об.% до 5 мас./об.% картофельного пептона, от 0,5 мас./об.% до 2 мае./об.% дрожжевого экстракта и от 0,75 мас./об.% до 1.5 мас./об.% глюкозы.

Соотношение ингредиентов в композиции, как описано выше, представляет собой соотношение компонентов композиции, обеспечивающее 90% уровня токсинообразования, полученное с помощью метода анализа поверхности, основанного на программе настройки оптимизации концентрации программы minitab, когда за 100% принимают уровень токсинообразования в композиции среды, содержащей 3 мас./об.% картофельного пептона, 1 мае./об.% дрожжевого экстракта и 1 мас./об.% глюкозы, являющейся наилучшим вариантом соотношения компонентов в композиции по настоящему изобретения. То есть уровень токсинообразования, соответствующий 90% от уровня токсинообразования, получаемого с помощью композиции среды, содержащей 3 мас./об.% картофельного пептона, 1 мас./об.% дрожжевого экстракта и 1 мас./об.% глюкозы, может быть получен, когда композиция среды содержит от 2 мас./об.% до 5 мас./об.% картофельного пептона, от 0,5 мас./об.% до 2 мае./об.% дрожжевого экстракта и от 0,75 мас./об.% до 1,5 мас./об.% глюкозы.

В настоящем изобретении картофельный пептон может присутствовать в количестве 3 мас./об.%, дрожжевой экстракт может присутствовать в количестве 1 мас./об.%, а глюкоза может присутствовать в количестве 1 мас./об.%, но не ограничивается этим.

В настоящем изобретении ботулинический токсин извлекают в течение 48 ч после начала культивирования на стадии (b), предпочтительно, ботулинический токсин извлекают в течение 40 ч после начала культивирования на стадии (b).

Согласно настоящему изобретению, термин "не содержащий ингредиента животного происхождения" означает «по существу не содержащий ингредиента животного происхождения» или «по существу не содержащий белка животного происхождения» и, в частности, означает, что продукты или соединения, полученные из крови, смешанной крови, либо другие продукты или соединения животного происхождения отсутствуют или по существу отсутствуют. Термин "животное" означает млекопитающих (таких как человек), птиц, рептилий, рыб, насекомых, пауков или животных других видов. Термин "животное" не включает микроорганизмы, такие как бактерии. Таким образом, среда или способ, не содержащие продукта животного происхождения, или среда или способ, по существу не содержащие продукта животного происхождения, подпадающие под объем настоящего изобретения, могут содержать ботулинические токсины или бактерии Clostridium botulinum. Например, способ, не содержащий продукта животного происхождения, или способ, по существу не содержащий продукта животного происхождения, означает способ, который по существу не содержит, в основном не содержит или полностью не содержит белка животного происхождения, такого как иммуноглобулин, мясной гидролизат, мясной субпродукт, а также молоко или молочный продукт или гидролизат. Таким образом, примеры способа, не содержащего продукта животного происхождения, включают способ (такой как с использованием метода бактериального культивирования или бактериальной ферментации), не содержащий мясных и молочных продуктов или мясных и молочных субпродуктов.

При использовании в данном контексте термин "ботулинический токсин" означает не только нейротоксин, продуцируемый Clostridium botulinum, но также ботулинический токсин (или легкую или тяжелую цепь), рекомбинантно продуцируемый видами, не относящимися к Clostridium botulinum. При использовании в данном контексте термин "ботулинический токсин" относится к ботулиническому токсину подтипов А, В, С, D, Е, F, G и Н (WellerC (15 October 2013). "New Botulium Toxin Deemed Deadliest Substance Ever: Sniffing 13-Billionths of a Gram Can Kill (Новый ботулинический токсин, признанный самым смертоносным веществом из когда-либо существовавших: вдыхание миллиардной доли грамма может убить", Medical Daily) и G. При использовании в данном контексте ботулинический токсин также включает комплекс ботулинического токсина (т.е. комплексы с молекулярной массой 300, 600 и 900 кДа) и чистый ботулинический токсин (т.е. с молекулярной массой приблизительно 150 кДа). Термин "чистый ботулинический токсин" определяется как ботулинический токсин, изолированный или по существу изолированный от других белков, включая белки, образующие комплекс ботулинического токсина. Чистый ботулинический токсин может иметь чистоту 95% или выше, предпочтительно, 99% или выше.

В настоящем изобретении предложена среда, содержащая по меньшей мере пониженные уровни субпродуктов животного происхождения или молочных субпродуктов, по существу не содержащая субпродуктов животного происхождения или молочных субпродуктов. Термин "субпродукты животного происхождения или молочные субпродукты" означает соединение или комбинацию соединений, получаемые в клетках животных (за исключением бактерий) или с их помощью in vivo или in vitro. Предпочтительные источники ингредиентов среды неживотного происхождения, таких как белки, аминокислоты и азот, включают растения, микроорганизмы (такие как дрожжи) и синтетические соединения.

Среда в соответствии с настоящим изобретением включает, не ограничиваясь перечнем, среду для ферментации небольшого или большого количества Clostridium botulinum, среду для выращивания и культивирования Clostridium botulinum, используемую для инокуляции в среду для посева (первичную) и среду для ферментации (вторичную), и среду, используемую для длительного хранения культур Clostridium botulinum (например, исходных культур).

В качестве конкретного предпочтительного варианта осуществления настоящего изобретения, среда для выращивания Clostridium botulinum и образования ботулинических токсинов может содержать ингредиент картофельного происхождения, предпочтительно, картофельный пептон, заменяющий ингредиент животного происхождения.

В настоящем изобретении предложен способ выращивания Clostridium botulinum, позволяющий максимально увеличить образование ботулинических токсинов в течение кратчайшего времени при использовании среды, по существу не содержащей ингредиента животного происхождения. Clostridium botulinum можно выращивать с использованием композиции среды, содержащей вместо ингредиента животного происхождения картофельный пептон.

Согласно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения, выращивание Clostridium botulinum осуществляют в две стадии (т.е. выращивания посевного материала и ферментации). Обе эти стадии предпочтительно проводят в анаэробных условиях. Выращивание посевного материала обычно используют для "увеличения" количества микроорганизмов в законсервированной культуре. Целью выращивания посевного материала является увеличение количества микроорганизмов, которые могут использоваться для ферментации. Кроме того, выращивание посевного материала позволяет относительно дремлющим микроорганизмам в законсервированной культуре оживляться и превращаться в активно растущую культуру. При этом объем и количество жизнеспособных микроорганизмов, используемых для инокуляции в ферментационную среду, в активно растущей культуре можно регулировать более точно, чем в законсервированной культуре. Следовательно, выращивание посевной культуры для инокуляции ферментационной среды является предпочтительным. Кроме того, можно использовать несколько последовательных стадий, включающих выращивание в посевной среде, для увеличения количества Clostridium botulinum для инокуляции ферментационной среды. Выращивание Clostridium botulinum на стадии ферментации также можно проводить путем прямой инокуляции из законсервированной среды.

На стадии ферментации часть или всю посевную среду, содержащую Clostridium botulinum из продукта выращивания посевного материала, можно использовать для инокуляции ферментационной среды. Предпочтительно, приблизительно от 1 до 10% посевной среды, содержащей Clostridium botulinum из продукта выращивания посевного материала, используют для инокуляции ферментационной среды. Ферментацию применяют для получения наибольшего количества микроорганизмов в анаэробной среде в больших масштабах.

Ботулинический токсин, содержащийся в культуре штамма, культивируемого при помощи данного способа, может быть изолирован и очищен с использованием методов очистки белка, известных специалистам в области очистки белка.

Выращивание Clostridium botulinum можно проводить в одну или несколько стадий. Предпочтительно, выращивание проводят в две стадии. На первой стадии, выращивания посевного материала, Clostridium botulinum суспендируют в композиции среды в соответствии с изобретением и культивируют при температуре 34 плюс/минус 1°С в анаэробной среде в течение от 10 до 24 ч. Предпочтительно, выращивание посевного материала продолжается в течение приблизительно 14 ч. Также предпочтительно, чтобы выращивание в посевной среде на любой стадии не приводило к автолизу клеток до инокуляции ферментационной среды конечным выращиваемым в посевной среде продуктом.

После этого для дальнейшего выращивания Clostridium botulinum и извлечения ботулинического токсина выполняют вторую стадию, ферментацию, путем инокуляции композиции среды по настоящему изобретению с помощью части или всей среды для выращивания посевного материала. После инокуляции Clostridium botulinum также культивируют при температуре 34 плюс/минус 1°С в анаэробной среде в течение приблизительно 4 дней, отслеживая рост путем измерения оптической плотности (OD) среды. Предпочтительно, на стадии ферментации с использованием композиции среды в соответствии с настоящим изобретением максимальный уровень роста достигается приблизительно через 14 и 18 ч, клетки лизируются и величина OD снижается, вследствие чего на стадии ферментации ботулинический токсин извлекают из Clostridium botulinum в течение 48 ч, более предпочтительно, в течение 40 ч после инкубации.

Согласно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения, когда культуру Clostridium botulinum хранят при температуре 4°С с целью длительного хранения Clostridium botulinum и последующей инокуляции посевной среды, Clostridium botulinum предпочтительно хранят в среде для хранения (3% картофельного пептона, 1% дрожжевого экстракта, 1% глюкозы и 25% глицерина), чтобы среда по существу не содержала побочных продуктов животного происхождения на протяжении всего производства ботулинического токсина.

Описание примеров осуществления изобретения

Далее настоящее изобретение будет описано более подробно с помощью примеров. Однако для специалистов в данной области будет очевидно, что эти примеры предназначены исключительно для иллюстрации настоящего изобретения и их не следует рассматривать, как ограничивающие объем настоящего изобретения.

Пример 1

Подготовка препаратов и культивирование бактерий 1-1. Подготовка препаратов

Штамм ботулина, используемый в настоящем изобретении, представляет собой Clostridium botulinum типа A, NCTC13319, при приготовлении среды для экспериментальной группы и контрольной группы использовали следующие препараты: фитоновый пептон (BD, 211906), триптон (BD, 211705), дрожжевой экстракт (BD, 212750), картофельный пептон Е210 (Organotechnie, 19425), гороховый пептон А482 (Organotechnie, A1275), растительный пептон Е1 (Organotechnie, 19025), селективный фитон UF (BD, 210931), пептон из соевых бобов (Sigma, 70178), сою Hy-Soy (Kerry, 5X59022), пептон Hy-peptone (Kerry, 5X01111), соевый пептон A2SC (Organotechnie, 19649), соевый пептон A3SC (Organotechnie, 19685), соевый пептон Е110 (Organotechnie, 19885), соевый пептон К200 (Organotechnie, 19749), глюкозу (Sigma, G5767), тиогликолят натрия (Sigma, Т0632), очищенную воду (особо чистую воду или воду, качество которой эквивалентно или превышает качество особо чистой воды).

1-2. Культивирование бактерий

Один флакон, содержащий штамм Clostridium botulinum, хранящийся в криогенном морозильном аппарате, размораживали в инкубаторе при температуре 37°С в течение 30 минут. Штамм Clostridium botulinum гомогенизировали от 3 до 5 раз в BSC (англ. biological safety cabinet - бокс с биозащитой), 0,1 мл гомогенизированного штамма Clostridium botulinum инокулировали в среду и затем культивировали при температуре 34 плюс/минус 1°С в анаэробном инкубаторе. После культивирования измеряли величину OD₆₀₀ с помощью спектрофотометра.

1-3. Измерение уровня токсина

Для измерения уровня токсина использовали метод тестирования ботулинического нейротоксина типа A DuoSet ELISA (англ. Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay - иммуноферментный анализ) (система R&D) в соответствии с инструкциями производителя. 100 мкл иммобилизованного антитела, полученного разведением в PBS (англ. phosphate-buffered saline - фосфатно-солевой буфер), высевали в каждую лунку 96-луночного микропланшета и покрывали в течение не менее 16 ч, промывку каждой лунки промывочным буфером повторяли в общей сложности 3 раза. Каждую лунку блокировали реагентом-разбавителем, а затем промывали в общей сложности 3 раза промывочным буфером.

После завершения культивирования культуральный раствор стерилизовали с использованием шприцевого фильтра 0,2 мкм, разводили, добавляли в каждую лунку в количестве 100 мкл и оставляли реагировать в течение 2 ч, затем каждую лунку промывали промывочным буфером в общей сложности 3 раза. В каждую лунку добавляли по 100 мкл разведенного идентифицирующего антитела и оставляли реагировать в течение 2 ч, затем каждую лунку промывали промывочным буфером в общей сложности 3 раза. В каждую лунку добавляли по 100 мкл разведенного раствора стрептавидин-HRP (англ. HRP, horse-radish peroxidases -пероксидаза хрена) и оставляли реагировать в течение 20 минут, каждую лунку промывали промывочным буфером в общей сложности 3 раза. В каждую лунку добавляли по 100 мкл субстратного раствора и оставляли реагировать в течение 20 минут, затем в каждую лунку добавляли по 50 мкл останавливающего раствора и встряхивали соответствующим образом для остановки ферментативной реакции. В каждой лунке измеряли оптическую плотность при длине волны 450 нм с помощью считывающего устройства для микропланшетов.

Пример 2

Выбор пептона для замены среды TPYG (англ. Sodium Thioglucolate, Peptone, Yeast Extract, Glucose -тиогликолят натрия, пептон, дрожжевой экстракт, глюкоза)

Была предпринята попытка замены среды TPYG, содержащей казеиновый пептон, соевый пептон, дрожжевой экстракт, глюкозу и тиогликолят натрия, обычно используемой в качестве стандартной питательной среды для получения ботулинического токсина, средой PYG (peptone, yeast extract, glucose - пептон, дрожжевой экстракт, глюкоза), содержащей пептон, дрожжевой экстракт, глюкозу и тиогликолят натрия.

При рассмотрении пептона были выбраны различные кандидаты, включая растительный пептон, а среду растительного происхождения, имеющую токсинообразование, аналогичное среде TYPG, в первую очередь выбирали из среды, полученной из сои, и другой среды растительного происхождения.

2-1. Сравнительный пример: приготовление среды TPYG

Фитоновый пептон, триптон, дрожжевой экстракт и тиогликолят натрия взвешивали по 2 г, 1 г, 1 г и 0,1 г, соответственно, используя чашу для взвешивания, 50 мл очищенной воды помещали в химический стакан емкостью 250 мл, в него добавляли взвешенные ингредиенты среды и перемешивали до полного растворения ингредиентов. Величину рН доводили до 7,2 с помощью 1N раствора NaOH, среду из химического стакана переносили в цилиндр емкостью 100 мл, добавляли в него очищенную воду для доведения конечного уровня жидкости до 95 мл, после чего приготовленную среду и магнитный стержень переносили в стеклянную бутыль емкостью 100 мл и закрывали крышкой.

При помощи чаши для взвешивания взвешивали 1 г глюкозы, взвешенную глюкозу помещали в коническую пробирку емкостью 15 мл, содержащую приблизительно 3 мл очищенной воды, и перемешивали на вортексе по существу до растворения глюкозы, после чего в коническую пробирку добавляли очищенную воду для доведения конечного уровня раствора до 5 мл.

Крышку стеклянной бутыли слегка приоткрывали, стеклянную бутыль оборачивали фольгой и стерилизовали в автоклаве при температуре 121°С в течение 20 минут. Стерилизованную среду и глюкозу в достаточной мере охлаждали в BSC, после чего глюкозу переносили в среду и перемешивали.

2-2. Экспериментальный пример: приготовление среды PYG

12 ингредиентов среды, указанных в Таблице 1, взвешивали и растворяли в 50 мл очищенной воды, величину рН доводили до 7,2 с помощью 1N раствора NaOH, добавляли очищенную воду для регулирования конечного уровня жидкости в соответствии с Таблицей 1, приготовленную среду и магнитный стержень переносили в стеклянную бутыль емкостью 100 мл и закрывали ее крышкой.

С помощью чаши для взвешивания взвешивали 13 г глюкозы, взвешенную глюкозу растворяли в 65 мл очищенной воды. Приготовленный раствор глюкозы переносили в стеклянную бутыль емкостью 100 мл и закрывали крышкой.

Приготовленную среду и глюкозу стерилизовали при температуре 121°С в течение 20 минут, простерилизованную среду и глюкозу в достаточной мере охлаждали в BSC, 5 мл раствора глюкозы переносили в каждую среду и перемешивали.

2-3. Выбор пептона

Штамм Clostridium botulinum культивировали в среде, приготовленной в Примере 2-1 или Примере 2-2, таким же образом, как в Примере 1-2, в конце культивирования определяли величину OD₆₀₀ и при помощи ELISA определяли уровень токсинообразования таким же образом, как в Примере 1-3.

Полученные в результате величина OD₆₀₀ и уровень токсинообразования после завершения культивирования показаны в Таблице 2, при этом три среды (PYG1, PYG2 и PYG5) продемонстрировали уровни токсина и максимальное растворение штамма и, соответственно, величину OD₆₀₀ менее 1, аналогичные со средой TPYG. Эти результаты были подтверждены повторными тестами. Как можно видеть из Таблицы 3, PYG1, PYG2 и PYG5 в повторных тестах также продемонстрировали уровни токсинообразования, аналогичные TPYG. Из них среда PYG2, не содержащая ингредиента животного происхождения и основного аллергена, была использована для получения наилучшей композиции среды.

Пример 3

Оптимизация композиции среды

Чтобы найти оптимальные концентрации картофельного пептона, дрожжевого экстракта и глюкозы, определяемые с помощью предварительного отборочного испытания среды, изучали диапазон концентраций, используя методику DoE; оптимальную композицию определяли на основании результатов факторных экспериментов, экспериментов в центральных точках и экспериментов в осевых точках.

3-1. Факторный эксперимент

Факторные эксперименты проводили с использованием ингредиентов среды, включая ингредиенты в 8 диапазонах концентраций, как показано в Таблице 4. Среду готовили таким же образом, как в Примере 2-2, с использованием ингредиентов, включенных в Таблицу 4, штамм Clostridium botulinum культивировали в приготовленной среде таким же образом, как в Примере 1-2, определяли величину OD₆₀₀ в конце культивирования, уровень токсинообразования определяли методом ELISA таким же образом, как в Примере 1-3.

В результате были определены величина OD₆₀₀ и уровни токсина, как показано в Таблице 5. Анализ нормального распределения, основанного на полученных данных, включающий взаимодействия первого и второго порядка, но исключающий трехкомпонентные взаимодействия, показал, что остальные факторы, за исключением взаимодействия пептонглюкоза, в членах первого и второго порядка пептона, дрожжей и глюкозы, являются значимыми для уровня токсинообразования (Фиг. 1), при этом анализ по Парето показал те же результаты, что и анализ нормального распределения (Фиг. 2).

3-2. Эксперимент в центральных точках

В качестве среды для экспериментов в центральных точках взвешивали с помощью чаши для взвешивания картофельный пептон Е210, дрожжевой экстракт и тиогликолят натрия по 24,5 г, 8,75 г и 0,7 г, соответственно, 550 мл очищенной воды помещали в химический стакан емкостью 1 л и взвешенные ингредиенты перемешивали в ней до полного растворения. Величину рН доводили до 7,2 с помощью 1N раствора NaOH, среду из химического стакана переносили в цилиндр емкостью 1 л, добавляли в него очищенную воду для доведения конечного уровня жидкости до 656,25 мл, после чего конечную жидкость переносили в химический стакан емкостью 1 л и перемешивали в течение приблизительно 5 минут. По 93,75 мл среды переносили в каждую из 6 стеклянных бутылей емкостью по 100 мл, в стеклянную бутыль помещали магнитный стержень и закрывали ее крышкой, каждую среду обозначали любой из центральных точек с 1 по 6.

С помощью чаши для взвешивания взвешивали 8 г глюкозы, взвешенную глюкозу полностью растворяли в 40 мл очищенной воды.

Приготовленную среду и глюкозу стерилизовали при температуре 121°С в течение 20 минут, простерилизованную среду и глюкозу в достаточной мере охлаждали в BSC, после чего 6,25 мл раствора глюкозы переносили и смешивали с каждой средой.

Штамм Clostridium botulinum культивировали в полученной среде таким же образом, как в Примере 1-2, определяли величину OD₆₀₀ в конце культивирования и при помощи ELISA определяли уровень токсинообразования таким же образом, как в Примере 1-3.

Эксперимент в центральных точках для одной концентрации повторяли 6 раз, результаты показаны в Таблице 6. При определении наличия или отсутствия кривой на графике на основании результатов экспериментов в центральных точках р-значение составляло 0,001, т.е. было меньше 0,05, что является критерием, определяемым, как значимый. Это означает наличие кривой, поэтому проводили дополнительный тест для выполнения анализа поверхности.

3-3. Эксперимент в осевых точках

Для эксперимента в осевых точках взвешивали 6 ингредиентов среды, как показано в Таблице 8, и растворяли в 50 мл очищенной воды, величину рН доводили до 7,2 с помощью 1N раствора NaOH, добавляли очищенную воду для регулирования конечного уровня жидкости в соответствии с Таблицей 8. Каждую приготовленную среду и магнитный стержень переносили в стеклянную бутыль емкостью 100 мл и закрывали крышкой.

С помощью чаши для взвешивания взвешивали 8 г глюкозы, взвешенную глюкозу полностью растворяли в 40 мл очищенной воды. Приготовленную среду и глюкозу стерилизовали в автоклаве при температуре 121°С в течение 20 минут, простерилизованную среду и глюкозу в достаточной мере охлаждали в BSC, после чего раствор глюкозы добавляли в каждую среду в количестве, указанном в Таблице 8.

Штамм Clostridium botulinum культивировали в полученной среде таким же образом, как в Примере 1-2, в конце культивирования определяли величину OD₆₀₀ и при помощи ELISA определяли уровень токсинообразования таким же образом, как в Примере 1-3. В результате было установлено значение осевых точек, как показано в Таблице 9.

3-4. Анализ оптимальной концентрации при помощи анализа поверхности

Анализ поверхности проводили на основании результатов факторного эксперимента, эксперимента в центральных точках и эксперимента в осевых точках. Для анализа пригодности модели были проанализированы графики нормальной вероятности, гистограммы, графики остатков в зависимости от подобранных значений и графики остатков в зависимости от порядка. График нормальной вероятности был определен в виде прямой линии, гистограмма имела форму нормального распределения, а для графиков остатков в зависимости от подобранных значений и графиков остатков в зависимости от порядка закономерность отсутствовала. На основании этого выбранная модель была признана пригодной (Фиг. 3).

Для определения культуральной композиции анализировали результаты при помощи анализа поверхности, результат показан на Фиг. 4, на основании полученного результата было рассчитано оптимальное соотношение, как показано на Фиг. 5, оптимальная концентрация, полученная исходя из оптимального соотношения, представлена в Таблице 10.

3-5. Определение оптимального соотношения композиции

Оптимальная концентрация, полученная с помощью метода анализа поверхности, была основана на уровне токсинообразования, при этом конечной целью являлось получение композиции, имеющей самый высокий уровень токсинообразования и концентрацию OD₆₀₀ после инкубации, равную 1 или меньше. Таким образом, оптимальную культуральную композицию получали, изменяя концентрацию глюкозы, оказывающей, как полагают, наибольшее влияние на уровень токсинообразования и OD₆₀₀, до 0,75, 1, 1,25, 1,5%, результаты представлены в Таблице 11 и на Фиг. 6. В качестве оптимальной была признана композиция среды, содержащая 3% картофельного пептона, 1% дрожжевого экстракта и 1% глюкозы.

Пример 4

Эксперимент по культивированию штамма в соответствии с оптимальной культуральной композицией

Один флакон, содержащий штамм Clostridium botulinum хранящийся в криогенном морозильном аппарате, размораживали в инкубаторе при температуре 37°С в течение 30 минут. Штамм Clostridium botulinum гомогенизировали от 3 до 5 раз в BSC, 1 мл гомогенизированного штамма Clostridium botulinum инокулировали в 100 мл среды PYG в мешок для клеток емкостью 2 л и затем культивировали при температуре 34 плюс/минус 1°С в инкубаторе (WAVE25). 100 мл культуры штамма инокулировали в 5 л среды PYG перед автолизом штамма в период от 10 до 24 ч. Затем измеряли изменение с течением времени оптической плотности при длине волны 600 нм и уровня токсина. Из каждого образца с помощью антибактериального фильтра 0,2 мкм извлекали только культуральный раствор и измеряли уровень токсина таким же образом, как в Примере 1-3.

Результаты измерения изменения OD и уровня токсинообразования с течением времени при культивировании в культуральной композиции, как описана выше, показали, что культуральная композиция в соответствии с настоящим изобретением позволяет достичь максимального значения OD₆₀₀ культуры штамма в течение приблизительно от 14 до 15 ч, благодаря чему можно значительно сократить время культивирования по сравнению с традиционной композицией среды Clostridium botulinum, при этом максимальный уровень токсинообразования достигается приблизительно через 28 ч при температуре 35°С и через 37 ч при температуре 33°С.

Пример 5

Сравнение культивирующего действия оптимальной культуральной композиции и других культуральных композиций

Определяли культивирующее действие при использовании соевого пептона и диапазона, отличного от оптимального соотношения композиции, полученного в Примере 3. С этой целью каждую культуральную среду готовили в виде композиции с соотношением, указанным в Таблице 12, и определяли ее культивирующее действие. В результате, как можно видеть из Таблицы 13, Экспериментальная группа имела преимущество с точки зрения уровня токсинообразования или времени культивирования клеток по сравнению со Сравнительным примером. В частности, при использовании в Сравнительном примере 1 картофельного пептона время, необходимое для достижения максимальной клеточной массы, значительно сокращалось, однако при этом было обнаружено, что максимальное токсинообразование при соответствующем соотношении композиции было значительно ниже, чем в Экспериментальной группе. С другой стороны, было обнаружено, что при использовании в Сравнительном примере 2 соевого пептона время, необходимое для достижения максимальной клеточной массы, было значительно больше, чем в Экспериментальной группе.

Пригодность для промышленного применения

Согласно настоящему изобретению, при введении в организм человека ботулинического токсина, полученного в соответствии с настоящим изобретением, благодаря получению ботулинического токсина без использования ингредиентов животного происхождения и основных аллергенов можно предотвратить трансмиссивную губчатую энцефалопатию, вызываемую накоплением аномальных прионных белков, и неблагоприятные побочные реакции, обусловленные аллергическими реакциями (крапивница, ангионевротический отек, атопический дерматит, анафилаксию). Кроме того, при использовании картофельного пептона для исключения ингредиентов животного происхождения и основных аллергенов можно достичь максимального уровня роста штамма, продуцирующего ботулинический токсин, в течение короткого времени, тем самым сокращая время производства и снижая производственные затраты в процессе получения ботулинического токсина.

Несмотря на подробное описание конкретных конфигураций настоящего изобретения, специалистам в данной области будет понятно, что это описание представлено для изложения предпочтительных вариантов осуществления в иллюстративных целях и его не следует рассматривать, как ограничивающее объем настоящего изобретения. Вследствие этого, действительный объем настоящего изобретения определяется прилагаемой формулой изобретения и ее эквивалентами.

1. Способ получения ботулинического токсина, включающий в себя:

(a) получение ботулинического токсина путем культивирования Clostridium botulinum типа А в композиции среды для культивирования Clostridium botulinum типа А, содержащей от 2 до 5 мас./об.% картофельного пептона, от 0,5 до 2 мас./об.% дрожжевого экстракта и от 0,75 до 1,5 мас./об.% глюкозы; и

(b) извлечение ботулинического токсина.

2. Способ по п. 1, где композиция среды для культивирования не содержит продукта животного происхождения и аллергена.

3. Способ по п. 1, где композиция среды содержит 3 мас./об.% картофельного пептона, 1 мас./об.% дрожжевого экстракта и 1 мас./об.% глюкозы.

4. Способ по п. 3, где ботулинический токсин извлекают в течение 40 ч после начала культивирования на стадии (b).