Способ диагностики племенной ценности свиней породы дюрок с использованием разработанной тест-системы по гену mc4r

Изобретение относится к сельскохозяйственной области биотехнологии и животноводству, а именно к способам отбора животных в свиноводстве для диагностики племенной ценности свиней породы дюрок на ранних этапах развития. Способ включает выделение ДНК, амплификацию фрагмента гена с использованием праймеров 5'-TACCCTGACCATCTTGATTG-3', 5'-ATAGCAACAGATGATCTCTTTG-3', рестрикцию амплифицированного фрагмента гена MC4R эндонуклеазой рестрикции TaqI, определение генотипов и отбор свинок с генотипом AA/MC4R, хрячков с генотипом GG. Животные с генотипом AA/MC4R обладают высокими показателями среднесуточного прироста, длины туловища и низкими показателями возраста достижения живой массы 100 кг и толщины шпика. Наличие генотипа GG по гену у хрячков связано с лучшими показателями среднесуточного прироста, длины туловища и толщины шпика. Изобретение позволяет эффективнее проводить диагностику племенной ценности свиней породы дюрок и осуществлять отбор животных с генетически подтвержденной племенной ценностью в раннем возрасте, а также повысить отлаженную точность в селекционной работе и надежность в генетическом потенциале племенных свиней. 1 ил., 2 табл., 1 пр.

 

Изобретение относится к сельскохозяйственной биотехнологии и животноводству, а именно к способам отбора животных в свиноводстве для диагностики племенной ценности свиней породы дюрок на ранних этапах развития.

Существенный научный и практический интерес уделяется разработке способов, позволяющих оценивать продуктивность животных не только по фенотипическому проявлению признаков, но и непосредственно на генетическом уровне.

Известно, что к числу таких способов относится тестирование однонуклеотидных замен (SNP тестирование), которые расположены в генах, имеющих влияния на биохимические и физиологические процессы в организме. Ассоциативные связи между генотипами SNP и продуктивными качествами свиней могут быть использованы в качестве генетических маркеров при отборе и подборе животных. В отцовской породе свиней, используемой в системе гибридизации в целях повышения скороспелости, среднесуточного прироста, длины туловища у товарных гибридов важным является оценка племенной ценности производителей. Поэтому для диагностики племенной ценности свиней породы дюрок, необходимо выделить генетические факторы, влияющие на откормочные и мясные качества животных.

Известен способ оценки плодовитости свиней пород ландрас и крупная белая, включающий выделение ДНК, амплификацию фрагмента гена ZJF с использованием праймеров 5'-ATGTGGATGTGGCCTACGG-3' и 5'GGGAACAAGGTGGTGATGG-3', рестрикцию амплифицированного фрагмента гена LIF эндонуклеазой рестрикции DraIII, определение генотипов и отбор животных с генотипом AA/LIF, причем один фрагмент размером 407 п. н. соответствует генотипу AA, два фрагмента размером 266-и 144 н.п. - генотипу BB, три фрагмента 407-, 266- и 144 н.п. - генотипу AB (Патент РФ №2634404, МПК А01К 67/02, C12Q 1/68, 26.10.2017, Бюл. №30).

Недостаток способа заключается в том, что он разработан для оценки репродуктивных качеств свиней и направлен на повышение их воспроизводительных функций. Также в отличии от предлагаемого нашего способа использовался ген-маркер другого направления оценки продуктивности - воспроизводительной.

Известен способ раннего отбора свиней по толщине шпика на основании комплексного генотипа по ДНК-маркерам, включающий определение количества G аллелей, обуславливающих увеличение толщины шпика, причем при оценке учитывают комплексный генотип по ДНК-маркерам IGF2, MC4R, CCKAR. (Патент РФ №2744594, МПК А01К 67/02, опубл. 11.03.2021, Бюл. №8) - прототип.

Недостатком способа является то, что он позволяет осуществлять оценку племенной ценности молодняка только по одному показателю мясной продуктивности - толщине шпика, поэтому он не может считаться достаточно эффективным. Чтобы получить наиболее расширенные результаты для проведения оценки племенной ценности свиней и раннего отбора животных, этого недостаточно. Также в отличие от нашего способа исследования проведены на материнских породах свиней (ландрас и крупная белая порода), нами проведены исследования на отцовской породе свиней (дюрок). Это обуславливает различное наследование признаков продуктивности и различную передачу их потомству. Основной же недостаток прототипа заключается в целенаправленном увеличении показателя толщины шпика, в то время как все свиноводческие компании мира стремятся разводить свиней с повышенной мясностью и сниженной толщиной шпика. Это подкрепляется многочисленными исследованиями в области свиноводства. (Романцова, С.С. Результативность прогноза продуктивности у свиней / С.С. Романцова, Н.С. Крючкова // Лучшая исследовательская работа 2021: сборник статей Международного научно-исследовательского конкурса, Петрозаводск, 13 декабря 2021 года. - Петрозаводск: Международный центр научного партнерства «Новая Наука» (ИП Ивановская И.И.), 2021. - С. 492-501. - EDN YVBNEU; Рудь, А.И. Послеубойная оценка мясных характеристик туш свиней / А.И. Рудь, А.В. Быканов // Свиноводство. - 2011. - №7. - С. 4-7. - EDN OJSPPX; Третьякова, О.Л. Анализ откормочных и мясных качеств чистопородного молодняка / О.Л. Третьякова, В.С. Бондаренко // Вестник Донского государственного аграрного университета. - 2018. - №1-1(27). - С. 23-31. - EDN YOOHJH и др.)

Задача предлагаемого нами изобретения - создание эффективного способа диагностики племенной ценности свиней породы дюрок, генетически предрасположенных к более высоким показателям энергии роста, конверсии корма и выхода мясной части туш.

Задача изобретения достигается применением разработанной тест-системы по гену MC4R на основе SNP тестирования путем определения генетического потенциала племенной ценности (выраженной в способности передавать высокие показатели скороспелости, среднесуточного прироста, длины туловища и низкого показателя толщины шпика потомкам) свиней на основе тестирования SNP, расположенного в 7 экзоне гена гена MC4R (гена меланокортинового рецептора - 4), методом ПЦР-ПДРФ.

Технический результат изобретения достигается путем использования в качестве разработанной тест-системы по гену MC4R на основе SNP тестирования и помогает определять влияние гена MC4R на откормочные и мясные качества свиней породы дюрок, определять и закреплять «желательные» генотипы, связанные с высокими показателями продуктивности, способ позволяет снизить затраты на выращивание племенного молодняка свиней породы дюрок.

Способ разработан для определения аллелей и генотипов гена с помощью полимеразной цепной реакции на основании специфичных праймеров. Предлагаемый нами способ позволяет проводить отбор ремонтного поголовья (ремонтных хрячков и свинок) на этапе от рождения и до получения оценки по собственной продуктивности, помогая оптимизировать затраты на проведение оценки ремонтного поголовья по откормочным и мясным качествам, сокращая расходы на дорогостоящие реагенты и время диагностики.

Ген MC4R - (ген меланокортинового рецептора - 4), представляет особый интерес среди кандидатов сигнальных молекул, участвующих в регулировании энергетического гомеостаза, действуя как эндокринный орган. Точечная мутация в седьмом экзоне гена MC4R приводит к нарушению проведения гормонального сигнала лептина через MC4R и, тем самым, влияет на признаки, определяющие откормочную и мясную продуктивность животного. Ген связан с контролем пищевого поведения (потребления пищи), регуляцией обмена веществ и массы тела. Исследуется для диагностики ожирения.

В процессе работы тест-системы по гену MC4R определяется полиморфизм данного гена в позиции 1426 хромосомы №1 свиньи в участке (SSC1) q22-q27. Известно, что при помощи рестриктазы TaqI замена одного нуклеотида G на A приводит к изменению аминокислотного состава MC4-рецептора. В результате происходит нарушение регуляции секреции клеток жировой ткани и приводит к изменению липидного обмена, что непосредственно влияет на процесс формирования признаков, характеризующих откормочные и мясные качества свиней. Известно также, что в некоторых популяциях свиней однонуклеотидный полиморфизм этого гена достоверно связан с откормочными и мясными качествами, в частности с толщиной спинного сала (толщины шпика).

В результате исследований выявлено, что наличие у свинок генотипа АА по гену MC4R связано с лучшей скороспелостью, среднесуточными приростами, длиной туловища. У хрячков высокие показатели продуктивности толщины шпика, длины туловища и среднесуточного привеса связаны с генотипом GG по гену MC4R. Результаты этого исследования показывают, что выявлено положительное влияние гена MC4R/TaqI на продуктивные качества свиней, что позволяет использовать разработанный метод в качестве тест-системы, как способ диагностики племенной ценности свиней породы дюрок.

Особенностью заявленного нами изобретения является применение способа непосредственно для мясных пород дюрок путем определения генотипов по SNP, влияющих на мясные и откормочные качества животных.

Многолетняя селекция породы дюрок на повышение откормочной и мясной продуктивности, привела к формированию у них некоторых морфофизиологических особенностей, которые отличают их от других пород. Установлено, что количество энергии в жире у свиней породы дюрок откладывается меньше, чем у свиней крупной белой породы. Датская порода дюрок получил широкое распространение во многих странах мира. Животные характеризуются компактным туловищем, окорок широкий, уши средней величины, оброслость нормальная. Животные крепкой конституции и достаточно устойчивы к различным неблагоприятным факторам внешней среды, хорошо приспособлены к условиям содержания. Свиней данной породы используют в системах гибридизации на заключительном этапе скрещивания.

Способ осуществляется следующим образом. По результатам молекулярно-генетических тестов (SNP тестирования), проводимых методом ПЦР с последующим рестрикционным анализом продуктов амплификации (метод ПЦР-ПДРФ), определяют аллельные варианты и генотипы SNP гена MC4R. Для этого выделяют ДНК из пробы ткани с ушной раковины животного с применением набора реагентов DIAtom DNA Prep 100 (ООО «НПФ Генлаб») или любым другим стандартным методом. Возможно использование других тканей или клеток животного (кровь, волосяные луковицы, сперма и др.). Проводят амплификацию интересующего фрагмента (226 п.н.) гена MC4R с использованием специализированных праймеров 5'-TACCCTGACCATCTTGATTG-3',5'-ATAGCAACAGATGATCTCTTTG-3' в следующем режиме: предварительная денатурация - 5 мин при 94°С; 35 циклов, денатурация 94°С - 30 с, отжиг 62°С - 30 с, элонгация 72°С - 30 с, заключительная элонгация при 72°С - 7 мин.

Рестрикцию амплифицированного фрагмента гена MC4R производят с применением эндонуклеазы рестрикции TaqI. Размер полученных рестрикционных фрагментов определяют методом электрофореза в 2%- ном агарозном геле с добавлением бромистого этидия, и в зависимости от длины фрагментов устанавливают генотип индивидуально у каждого животного. Один фрагмент размером 226 н.п, что соответствует генотипу AA, два фрагмента размером 156- и 70 н.п.- генотипу GG, три фрагмента 226-, 156- и 70 н.п. - генотипу AG. (чертеж) Результаты SNP- MC4R теста вносят в электронную базу племенного учета и при оценке плодовитости в качестве дополнительного критерия используют генотип AA/MC4R, наличие которого свидетельствует о генетической предрасположенности свинок к более высоким показателям скороспелости, среднесуточного прироста, длины туловища. Наличие генотипа GG по гену MC4R у хрячков связано с лучшими показателями среднесуточного прироста, длины туловища и толщины шпика. По результатам теста можно проводить оценку откормочных и мясных качеств свиней породы дюрок и отбирать животных, генетически предрасположенных к более высоким показателям племенной ценности в раннем возрасте. Что позволяет сократить экономические затраты.

Таким образом, представленный способ SNP- MC4R тестирования позволяет более эффективно проводить диагностику племенной ценности свиней, т.к. учитывает генетические факторы, влияющие на откормочные и мясные функции организма. Изобретение иллюстрируется следующим примером.

Пример. Контрольное использование предложенного способа по разработанной тест-системе для определения полиморфизма гена MC4R было проведено и апробировано в ЗАО «Племзавод-Юбилейный» Ишимского района Тюменской области на 55 свиньях породы дюрок. Для проведения молекулярно-генетических исследований у животных были отобраны образцы ткани с ушной раковины площадью 1 см² (ушные выщипы). Влияние генотипов на откормочные и мясные качества оценивали по показателям скороспелости (дн), толщине шпика (мм), длине туловища (см) и среднесуточному приросту (г) по результатам контрольного выращивания до живой массы 100 кг согласно «Инструкции по бонитировке» от 2009 года.

ДНК выделяли с применением набора реагентов DIAtom DNA Prep 100 (ООО «НПФ Генлаб»). Анализ проводился методом ПЦР-ПДРФ (полимеразной цепной реакции - полиморфизм длин рестрикционных фрагментов). ПЦР проводили на амплификаторе «Терцик».

Амплификацию фрагмента (226 п.н., включающего 7 экзон) гена MC4R проводили с использованием прямого и обратного праймеров 5'-TACCCTGACCATCTTGATTG-3', 5'-ATAGCAACAGATGATCTCTTTG-3' соответственно, в следующем режиме: предварительная денатурация - 5 мин при 94°С; 35 циклов, денатурация 94°С - 30 с, отжиг 62°С - 30 с, элонгация 72°С - 30 с, заключительная элонгация при 72°С - 7 мин.

Размер полученных рестрикционных фрагментов и генотипы определяли методом электрофореза в 2%-ном агарозном геле с добавлением бромистого этидия (чертеж). Визуализацию электрофореграмм проводили на трансиллюминаторе в УФ свете (чертеж). Статистическую обработку данных проводили в М. Excel «Пакет анализа» по стандартным методикам. Исследование выявило частоту генотипов у свинок 51,1 (AG), 40,0 (AA) и 8,9 (GG)% и у хрячков 50, 40 и 10% соответственно.

В результате проведенных нами исследований по откормочным и мясным качествам свинок породы дюрок в зависимости от генотипов гена MC4R установлено наличие достоверного влияния MC4R на наследование комплексных признаков: скороспелости, толщины шпика, длины туловища и среднесуточного прироста (табл. 1).

Свинки породы дюрок с генотипом AA/MC4R достоверно отличались лучшими показателями в сравнении с другими генотипами GG и AG: по толщине шпика - на 1,5 мм, по длине туловища - на на 1 и 5,9 см и по среднесуточному приросту - на 50,8 и 37,2 г соответственно.

Хрячки породы дюрок, имеющие «желательный» генотип GG (табл. 2) достоверно отличаются лучшими показателями по толщине шпика от животных с генотипами AG и AA на 2,6 и 1,7 мм, по длине туловища - на 4,2 и 1,6 см и по среднесуточному привесу - на 92,2 и 100,4 г, соответственно.

Таким образом, разработанный способ может быть использован для выявления животных, являющихся носителями желательных генотипа AA у свинок гена MC4R ассоциированного с мясными и откормочными качествами свиней породы дюрок. У хрячков установлен «желательный» генотип GG. Предложенный способ применим в генетике сельскохозяйственных животных для выявления полиморфизма гена MC4R свиней, с целью последующего использования полученных результатов в разведении и селекции свиней на повышение показателей откормочных и мясных качеств. Способ позволяет повысить отлаженную точность в селекционной работе и надежность в генетическом потенциале племенных свиней.

Способ подбора свиней по данной тест - системе апробирована на предприятии ЗАО «Племзавод-Юбилейный».

Полученные результаты дают основание для применения разработанных методик в племенных свиноводческих хозяйствах в качестве тест-систем для диагностики племенной ценности свиней. Селекционное давление на стадо в племенных предприятиях позволяет получать новое поколение ремонтных хрячков с улучшенными показателями по основным селекционным признакам: скороспелости, среднесуточному привесу, длине туловища и меньшей толщине шпика. Для качественного улучшения стада хряков-производителей необходимо как можно раньше провести оценку и отбор ремонтного молодняка.

Способ диагностики племенной ценности свиней породы дюрок с использованием разработанной тест-системы по гену-маркеру MC4R, включающий определение аллелей, влияющих на наследование племенных качеств, отбор молодняка свиней на раннем этапе, отличающийся тем, что оценку проводят на отцовской породе свиней дюрок по комплексу селекционных показателей, причем при оценке свинок используют генотип AA/MC4R, а хрячков - генотип GG/MC4R.