Способ лечения болезни альцгеймера посредством ингибрования захвата аминокислот t-клетками

Группа изобретений относится к области медицины, а именно к лечению болезни Альцгеймера. Предложено применение средства для ингибирования захвата аминокислот наивными T-клетками в периферической крови млекопитающего для производства лекарственного средства для лечения болезни Альцгеймера у индивидуума, где аминокислота представляет собой одну или несколько, выбранных из следующих: 4-OH пролин, ацетилорнитин, аланин, альфа-аминоадипиновая кислота, аспарагин, аспарагиновая кислота, асимметричный диметиларгинин, бета-аланин, карнозин, цитруллин, креатинин, ГАМК, глутаминовая кислота, глутамин, глицин, гистидин, гипотаурин, изолейцин, кинуренин, лейцин, лизин, метионин, сульфоксид метионина, орнитин, фенилаланин, пипеколиновая кислота, пролин, путресцин, пироглутаминовая кислота, серин, серотонин, таурин, треонин, триптофан, тирозин и валин. Предложены также способы лечения болезни Альцгеймера, включающие введение средства для ингибирования захвата аминокислот наивными T-клетками в периферической крови млекопитающего пациенту. Изобретение обеспечивает лечение болезни Альцгеймера за счет ингибирования нейровоспаления. 3 н. и 6 з.п. ф-лы, 23 ил., 4 табл., 4 пр.

 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к лечению болезни Альцгеймера (AD). Более конкретно, настоящее изобретение относится к применению ассоциации головной мозг-кишечник для ингибирования прогрессирования болезни Альцгеймера.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Болезнь Альцгеймера (AD) представляет собой прогрессирующее нейродегенеративное заболевание с постепенным развитием. Клинически она характеризуется общей деменцией, такой как ухудшение памяти, афазия, апраксия, агнозия, нарушение зрительно-пространственных навыков, нарушение способности к целенаправленной деятельности и изменения личности и поведения. Двумя патологическими признаками болезни Альцгеймера являются внеклеточные отложения β-амилоида (старческие бляшки) и внутриклеточные нейрофибриллярные клубки (парный спиральный филамент). Отложения β-амилоида и нейрофибриллярные клубки приводят к утрате синапсов и нейронов, которая приводит к тяжелой атрофии поврежденных областей головного мозга, как правило, начинающейся в височной доле. Механизм этого повреждения, вызываемого пептидами β-амилоида и нейрофибриллярными клубками, не до конца понятен.

Олигосахариды маннуроновой кислоты, разработанные исследовательской командой под руководством Geng Meiyu, исследователя в Institute of Pharmaceutical Innovation of the Chinese Academy of Sciences/Shanghai Institute of Materia Medica, представляет собой новое пероральное инновационное лекарственное средство против болезни Альцгеймера (AD) с независимыми правами на интеллектуальную собственность. 17 июля 2018 года результаты клинического испытания фазы III с раскрытыми сведениями продемонстрировали, что олигосахариды маннуроновой кислоты достигали ожидаемых результатов с точки зрения основных индикаторов эффективности для улучшения когнитивной функции, что имеет чрезвычайно значимую статистическую и клиническую значимость. Кроме того, встречаемость неблагоприятных явлений является сравнимой с встречаемостью неблагоприятных явлений в группе плацебо, и они имеют хорошую безопасность и пригодны для долговременного применения. Олигосахариды маннуроновой кислоты стали первым лекарственным средством в глобальной области лечения AD, которое оказалось успешным в клиническом испытании фазы III в течение 16 лет.

Что касается олигосахаридов маннуроновой кислоты, было выдано множество связанных с ними китайских патентов. В CN2017114675966 описана композиция маннуроновой дикислоты. В CN2016100697039 описан способ получения олигоманнуроновой дикислоты. В CN2018107134113 описано применение композиции маннуроновой дикислоты для лечения болезни Паркинсона. В CN2015104243401 описано применение олигосахаридов маннуроновой кислоты с карбоксильной группой в положении 1 от восстанавливающего конца и их производных для лечения болезни Паркинсона. Эти патенты включены в настоящее описание в качестве ссылок в полном объеме.

(олигосахариды маннуроновой кислоты)

В данной области необходимо больше лекарственных средств, которые могут использоваться для лечения болезни Альцгеймера.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В настоящем описании авторы изобретения описывают причинно-следственную связь между дисбиозом микробиоты кишечника и нейровоспалением при прогрессировании AD. В частности, изменения состава микробиоты кишечника могут приводить к периферическому накоплению метаболитов флоры, таких как фенилаланин и изолейцин. Они способствуют пролиферации и дифференцировке периферических провоспалительных T-хелперных клеток 1 типа (Th1) при прогрессировании AD. Периферические иммунные клетки инфильтрируют головной мозг и усиливают нейровоспаление. Важно, что повышение уровней метаболитов, таких как фенилаланин и изолейцин, в периферической крови было подтверждено в двух независимых выборках пациентов с умеренным когнитивным расстройством (MCI), вызванным AD. Авторы изобретения также продемонстрировали, что олигосахариды маннуроновой кислоты, которые демонстрировали неизменное и стабильное улучшение когнитивной функции в клинических испытаниях фазы III в Китае, изменяют равновесие флоры кишечника, снижают накопление аминокислотных метаболитов флоры в крови и ингибируют нейровоспаление. Главным образом, данные авторов изобретения подчеркивают роль нейровоспаления, вызываемого дисбиозом кишечника, при прогрессировании AD, и предлагают новую стратегию для лечения AD путем вмешательства в ось головной мозг-кишечник.

В одном аспекте настоящее изобретение относится применению средства для ингибирования захвата аминокислот наивными T-клетками в периферической крови млекопитающего для производства лекарственного средства для лечения болезни Альцгеймера у индивидуума.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для лечения болезни Альцгеймера у индивидуума, содержащей эффективное количество средства для ингибирования захвата аминокислот наивными T-клетками в периферической крови млекопитающего.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу скрининга лекарственного средства-кандидата, которое может использоваться для лечения болезни Альцгеймера, включающему:

a) введение тестируемого средства моделях in vivo или in vivo с переносчиком SLC7A5, и

b) выбор тестируемого средства, которое ингибирует переносчик SLC7A5, в качестве лекарственного средства-кандидата, которое может использоваться для лечения болезни Альцгеймера.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения пациента, имеющего болезнь Альцгеймера, включающему:

введение пациенту средства для ингибирования захвата аминокислот наивными T-клетками в периферической крови млекопитающего, так чтобы происходила регуляция доли провоспалительных Th1-клеток в CD4+ T-клетках у пациента так, чтобы она была близкой к или достигала соответствующей доли провоспалительных Th1-клеток в CD4+ T-клетках в соответствующей нормальной выборке.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения пациента, имеющего болезнь Альцгеймера, включающему:

введение средства для ингибирования захвата аминокислот наивными T-клетками в периферической крови млекопитающего пациенту, так чтобы происходила регуляция относительного уровня захвата аминокислот наивными T-клетками у пациента так, чтобы он был близким к или достигал соответствующего относительного уровня захвата аминокислот наивными T-клетками в соответствующей нормальной выборке.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фиг.1. Дисбиоз кишечника и изменения иммунных клеток в ходе прогрессирования заболевания у трансгенных (Tg) мышей 5XFAD.

(a) Изменения относительных уровней экспрессии РНК синаптофизина в гиппокампе трансгенных (Tg) мышей 5XFAD через 2, 3, 5, 7 и 9 месяцев и у мышей дикого типа (WT) через 2 месяца (n = 5-12). Данные представлены в качестве среднего значения ± стандартная ошибка среднего значения (среднее значение ± sem) относительно уровня экспрессии актина. *P < 0,05, **P < 0,01 посредством одностороннего ANOVA (F (5, 43) = 2,952).

(b) Изменения во времени относительно из 10⁴ с, затраченных на достижение 80% успеха (см. способы) в тесте для оценки способности к обучению различению у трансгенных (Tg) мышей 5XFAD через 2, 3, 5, 7 и 9 месяцев и у мышей дикого типа (WT) через 2 месяца (n = 4-8). Данные представлены в качестве среднего значения ± стандартная ошибка среднего значения (среднее значение  ±  sem). *P < 0,05 согласно t-критерию Стьюдента. С, секунды.

(c) Анализ главных компонентов (PCA) для состава микробиома кишечника у мышей WT и трансгенных (Tg) мышей 5XFAD на уровне операционной таксономической единицы (OTU) в разные моменты времени (n = 4-10). Формы и цвета точек указывают на образцы от каждой особи и в разные месяцы. Окрашенные овалы указывают на диапазоны доверительного интервала (CI), соответствующего 0,95, в каждой тестируемой группе. M, месяцы.

(d) Относительные изменения содержания операционных таксономических единиц (OTU) в общей популяции микробиома кишечника трансгенных (Tg) мышей 5XFAD в разные месяцы, закрашенные на уровне типа на потоковом графике (n = 4-10). Два наиболее распространенных типа, Bacteroidetes и Firmicutes, обозначены на графике. Цветами указаны различные типы микробиоты кишечника.

(e) Изменения положительной плотности иммунофлуоресцентного окрашивания IBA1, отражающие активацию клеток микроглии в гиппокампе трансгенных (Tg) мышей 5XFAD через 2, 3, 5, 7 и 9 месяцев относительно величин у мышей дикого типа (WT) в возрасте 2 месяцев (n = 2-7). Данные представлены в качестве среднего значения ± стандартная ошибка среднего значения (среднее значение ± sem); линии аппроксимированы посредством кубического сплайна. Величина IBA1 по оси Y представляет собой относительную величину флуоресцентного окрашивания у трансгенного животного в каждый момент времени относительно величины флуоресцентного окрашивания у животного дикого типа в тот же момент времени.

(f) Изменения активированной микроглии типа M1 и M2, выявленное в гомогенатах целого мозга трансгенных (Tg) мышей 5XFAD через 2, 3, 5, 7 и 9 месяцев (n = 4-8). Детекцию микроглии типа M1 (CD45^lowCD11b⁺CX3CR1⁺Siglec-H⁺F4/80⁺CD86⁺) и микроглии типа M2 (CD45^lowCD11b⁺CX3CR1⁺Siglec-H⁺F4/80⁺CD206⁺) проводили посредством проточной цитометрии, и количества этих клеток представлены относительно частоты клеток CD45^lowCD11b⁺. Красные точки и линии: микроглия M1. Зеленые точки и линии: микроглия M2. Данные представлены в качестве среднего значения ± стандартная ошибка среднего значения (mean ± sem); линии аппроксимированы посредством алгоритма кубических сплайнов.

(g) Изменения инфильтрирующих клеток (CD45^high), выявленные в гомогенатах целого мозга трансгенных (Tg) мышей 5XFAD (красные точки и линии) и мышей WT (черные точки и линии) в разные моменты времени при определении посредством проточной цитометрии (мыши Tg: 2 месяца, n=5; 3 месяца, n=4; 5 месяцев, n=4; 7 месяцев, n=7; 9 месяцев, n=3. мыши WT: n=6.). Количества клеток представлены относительно частоты клеток CD45⁺, и они имеют формат среднего значения ± стандартная ошибка среднего значения (среднее значение ± sem). Линии аппроксимированы посредством алгоритма кубических сплайнов.

(h) Изменения клеток CD45^high у трансгенных (Tg) мышей 5XFAD в разные моменты времени (n = 4-8). На столбиковой диаграмме количества клеток представлены относительно частоты клеток CD45^high. Цветами указаны различные подтипы клеток CD45^high: Neu, нейтрофилы; DC, дендритные клетки; NK, натуральные киллеры; Mo/Mϕː моноциты и макрофаги; B, B-клетки; другие, неклассифицированные клетки.

(i) Изменения инфильтрирующих CD4 T-клеток (CD45^highCD4⁺), выявленные в гомогенатах целого мозга трансгенных (Tg) мышей 5XFAD (красные точки и линии) через 2, 3, 5, 7 и 9 месяцев при определении посредством проточной цитометрии (n = 4-8). Количества клеток представлены относительно частоты клеток CD45^high и имеют формат среднего значения ± стандартная ошибка среднего значения (среднее значение ± sem). Линии аппроксимированы посредством кубических сплайнов.

(j) Изменения инфильтрирующих периферических клеток Th1 и Th2, выявленные в гомогенатах целого мозга трансгенных (Tg) мышей 5XFAD через 2, 3, 5, 7 и 9 месяцев (n = 4-8). Детекцию клеток Th1 (CD45^highCD4⁺CXCR3⁺CCR6^-) и клеток Th2 (CD45^highCD4⁺CXCR3⁺CCR6^-CCR4⁺) проводили посредством проточной цитометрии, и результаты представлены относительно частоты CD45^highCD4⁺ T-клеток. Красные точки и линии: Th1-клетки. Зеленые точки и линии: Th2-клетки. Данные представлены в качестве среднего значения ± стандартная ошибка среднего значения (среднее значение ± sem). Линии аппроксимированы посредством кубических сплайнов.

(k) Корреляция лимфоцитов головного мозга и микробиоты кишечника, отраженная на уровне рода, в ходе ассоциированной с Th2/M2 стадии и ассоциированной с Th1/M1 стадии на ранней (2-3 месяца) и поздней фазе (7-9 месяцев), соответственно (левые панели, n = 4-8). Все бактерии, которые значимо коррелировали с количествами лимфоцитов в головном мозге мышей 5XFAD, приведены на правой панели. Квадраты красного цвета (положительная корреляция) или синего цвета (отрицательная корреляция) с желтой звездочкой (*) указывают на значимые корреляции со значениями P  < 0,05, определенными посредством параметрического теста корреляции Пирсона.

Фигура 2. Микробиота кишечника требуется для инфильтрации иммунных клеток и активации микроглии.

(a) Эффекты введения антибиотиков через желудочной зонд в течение трех месяцев на относительную распространенность микроорганизмов в кишечнике у трансгенных (Tg) мышей 5XFAD в возрасте 7 месяцев (n = 6-7). ABX, коктейль смешанных антибиотиков, состоящий из ампициллина (0,1  мг/мл), стрептомицина (0,5  мг/мл) и колистин (0,1  мг/мл). Разные роды микроорганизмов кишечника окрашены по-разному, и их изменения относительного содержания представлены на столбиковой диаграмме.

(b-c) Эффекты введения антибиотиков через желудочной зонд в течение трех месяцев на частоту Th1-клеток (b) и клеток микроглии M1-типа (c) в гомогенате головного мозга трансгенных (Tg) мышей 5XFAD в возрасте 7 месяцев. Количества Th1-клеток (CD45^highCD4⁺CXCR3⁺CCR6^-) представлены относительно частоты CD45^highCD4⁺ клеток (b), в то время как количества клеток микроглии M1-типа (CD45^lowCD11b⁺CX3CR1⁺Siglec-H⁺F4/80⁺CD86⁺) представлены относительно частоты CD45^lowCD11b⁺ клеток (c). В обоих случаях детекцию проводили посредством проточной цитометрии. Данные представлены в качестве среднего значения ± стандартная ошибка среднего значения (среднее значение ± sem).

(d) Относительное содержание микроорганизмов кишечника на уровне рода у мышей WT, совместно содержащихся мышей WT и трансгенных (Tg) мышей 5XFAD (n = 6-7). Во всех трех группах мышей возраст составлял 7 месяцев. Разные цвета соответствуют разным родам. Совместно содержащиеся WT: мыши WT, которых содержали с мышами Tg.

(e-f) Изменения частоты Th1-клеток (e) и микроглии типа M1 (f) в гомогенатах головного мозга совместно содержащихся мышей WT, WT и трансгенных (Tg) мышей 5XFAD в возрасте 7 месяцев (n = 6-7). Th1-клетки (CD45^highCD4⁺CXCR3⁺CCR6^-) представлены относительно частоты CD45^highCD4⁺ клеток (e), в то время как частота клеток микроглии M1-типа (CD45^lowCD11b⁺CX3CR1⁺Siglec-H⁺F4/80⁺CD86⁺) представлена относительно частоты CD45^lowCD11b⁺ клеток (f). В обоих случаях детекцию проводили посредством проточной цитометрии. Данные представлены в качестве среднего значения ± стандартная ошибка среднего значения (среднее значение ± sem). *P < 0,05, **P < 0,01 согласно t-критерию Стьюдента.

(g) Уровни белков-цитокинов в гомогенатах головного мозга мышей WT, совместно содержащихся мышей WT и трансгенных (Tg) мышей 5XFAD в возрасте 7 месяцев при детекции с использованием чипа с антителами к цитокинам (n = 6-7). Во всех трех группах возраст мышей составлял 7 месяцев. Цветами на тепловой карте указаны относительные уровни цитокинов, нормализованные посредством грубой Z-оценки; красным указаны цитокины, уровень которых повышается, и синим указаны цитокины, уровень которых снижается.

Фигура 3. Эффекты OM1 на изменения поведения в моделях на мышах APP/PS1.

(a) Структура OM1. OM1 представляет собой смесь кислых линейных олигосахаридов со степенями полимеризации в диапазоне от димеров до декамеров со средней молекулярной массой приблизительно 1  кДа.

(b) Результаты для латентности спасения в тесте с водным лабиринтом Морриса (MWM) в качестве показателя пространственного обучения и памяти у мышей APP/PS1. Мышам APP/PS1 в возрасте девяти месяцев вводили 50 мг/кг и 100 мг/кг OM1 в течение 3 месяцев до возраста 12 месяцев. Затем проводили тест MWM на способности к пространственному обучению и память в течение 6 дополнительных дней. В ходе теста OM1 вводили постоянно. Латентность начала спасения (секунды) определяли в качестве одного из конечных результатов теста (см. способы). Более высокая латентность показывает, что эти мыши тратят больше времени для достижения цели, что указывает на более тяжело нарушенную способность к пространственному обучению и память (n = 11-14). Данные представлены в качестве среднего значения ± стандартная ошибка среднего значения (среднее значение ± sem). Черными звездочками указано сравнение между группами WT и APP/PS1. Синей звездочкой указано сравнение между группой введения OM1 (100 мг/кг) и группой введения APP/PS1. *P < 0,05, ***P < 0,001 согласно двухстороннему ANOVA.

(c) Количество пересечений областей платформы в тесте MWM в качестве показателя пространственного обучения и памяти у мышей APP/PS1. Мышам APP/PS1 в возрасте девяти месяцев вводили 50 мг/кг и 100 мг/кг OM1 в течение 3 месяцев до возраста 12 месяцев. Затем проводили тест MWM на способность к пространственному обучению и память в течение 6 дополнительных дней. В ходе теста постоянно вводили OM1. Количество пересечений областей платформы определяли в качестве другого результата теста (см. способы). Более высокие количества пересечений областей платформы указывают на менее тяжело сниженную способность к пространственному обучению и памяти (n = 11-17). *P < 0,05, ***P < 0,001 в соответствии с односторонним ANOVA (F (3, 55) = 6,542).

(d) Точность пространственной рабочей памяти при тестировании с использованием Y-лабиринта у мышей APP/PS1. Мышам APP/PS1 в возрасте девяти месяцев вводили 50 мг/кг и 100 мг/кг OM1 в течение 3 месяцев доз возраста 12 месяцев. Затем проводили тест в Y-лабиринте. В ходе теста постоянно вводили OM1. Точность Y-лабиринта представляла собой соотношение между правильным чередованием и общим чередованием (см. "Materials and methods"). Более высокая точность указывает на менее нарушенную способность рабочей памяти (n = 17-20). Данные представлены в качестве среднего значения ± стандартная ошибка среднего значения (среднее значение ± sem). **P < 0,01, ***P < 0,001 в соответствии с односторонним ANOVA (F (3, 71) = 12,39).

Фигура 4. OM1 смягчает нейровоспаление путем реорганизации микробиоты кишечника.

(a) Анализ главных координат (PCoA) для состава микробиома кишечника на уровне операционной таксономической единицы (OTU) на основе расстояния Брея-Кертиса для мышей 5XFAD (Tg) и мышей Tg, которым вводили OM1, в возрасте 7 месяцев (n = 7). Формы и цвета точек указывают на образцы от каждой особи. Окрашенными овалами указаны диапазоны доверительного интервала (CI), соответствующего 0,95, в каждой протестированной группе. PC, главный компонент.

(b) Тепловая карта значимых изменений микробиоты кишечника, представленных на уровне рода между мышами 5XFAD (Tg) и мышами Tg, которым вводили OM1, в возрасте 7 месяцев (n =17). Цветами на цветовой карте указана относительное содержание микробиоты кишечника; красным цветом указаны бактерии, уровень которых повышается, и синим цветом указаны бактерии, уровень которых снижается.

(c) Изменения корреляционных связей между микробиомом кишечника (обозначаемым числами вблизи синих кругов) и лимфоцитами головного мозга (закрашенные круги) до (слева) и после (права) введения через желудочной зонд OM1 мышам 5XFAD (Tg) в возрасте 7 месяцев. С правой стороны приводится наименование каждого кишечного микробиома.

(d) Эффект введения OM1 на частоту Th1-клеток в головном мозге мышей 5XFAD (Tg) в возрасте 7 месяцев (n = 5-7). Количества Th1-клеток (CD45^highCD4⁺CXCR3⁺CCR6^-) представлены относительно количеств CD45^highCD4⁺ T-клеток при определении посредством проточной цитометрии. Данные представлены в качестве среднего значения ± стандартная ошибка среднего значения (среднее значение ± sem). *P < 0,05, ***P < 0,001, в соответствии с t-критерием Стьюдента.

(e) Эффект введения OM1 на плотность положительного сигнала при иммунофлуоресценом окрашивании IBA1, проведенном для срезов гиппокампа мышей 5XFAD (Tg) в возрасте 7 месяцев, отражающий активацию клеток микроглии (n = 4-6). Данные представлены в качестве среднего значения ± стандартная ошибка среднего значения (среднее значение ± sem). *P < 0,05, в соответствии с односторонним ANOVA (F (2, 15) = 21,94).

(f) Эффект введения OM1 на уровни белков-цитокинов в гомогенатах головного мозга мышей 5XFAD (Tg) в возрасте 7 месяцев при детекции посредством чипа с антителами к цитокинам (n = 5-6). Цветами на тепловой карте указаны относительные уровни цитокинов, нормализованные посредством грубой Z-оценки; красным указаны цитокины, уровень которых повышается, и синим указаны цитокины, уровень которых снижается.

(g-h) Эффект OM1 на Aβ-положительную область (g) и тау-положительную область (h) в гиппокампе мышей 5XFAD (Tg) в возрасте 7 месяцев, оцененный в срезах головного мозга (n = 4-7). Данные представлены в качестве среднего значения ± стандартная ошибка среднего значения (среднее значение ± sem). Для анализа Aβ: *P < 0,05, **P < 0,01 (F (2, 14) = 22,78). Для анализа тау: *P < 0,05, ***P < 0,001 (F (2, 15) = 13,06) в соответствии с односторонним ANOVA.

(i) Эффекты OM1 на время относительно 10⁴  секунд (с), затраченных для достижения 80% успеха (см. способы) в тесте для оценки способности к обучению различению у мышей 5XFAD в возрасте 7 месяцев (n = 10-13). Время означает время для достижения уровня эффективности 80% (секунды); чем больше времени требуется, тем тяжелее нарушение (см. способы). *P < 0,05, ***P < 0,001 в соответствии с односторонним ANOVA (F(2,31) = 9,751).

Фигура 5. OM1 ингибирует нейровоспаление путем взятия под контроль метаболизма аминокислот.

(a) Анализ обогащения сигнальных путей для 31 типа фекальных метаболитов мышей 5XFAD (Tg) в возрасте 7 месяцев с введением OM1 или без него и с использованием MBROLE (n = 6-8). Перечень результатов обогащения приведен с модулями KEGG и взаимодействиями ферментов KEGG, скрининг которых проводили с использованием критерия значения P  < 0,05.

(b) Перечни аминокислот крови между группой WT (n=30) и Tg (n=26), которые можно было различить в период прогрессирования заболевания с использованием модели случайного леса (количество деревьев: 500; количество предсказательных факторов: 7; случайность: включена; см. способ).

(c) Изменения уровней гистидина, фенилаланина и изолейцина в фекалиях мышей WT, Tg и мышей Tg, которым вводили OM1 (n = 6-11). Красный, повышенный уровень; синий, сниженный уровень.

(d) Изменения уровней гистидина, фенилаланина и изолейцина в крови мышей WT, Tg и мышей Tg, которым вводили OM1 (n = 6-7). Красный, повышенный уровень; синий, сниженный уровень.

(e) Эффекты OM1 на дифференцировку наивных CD4⁺ T-клеток (Th0 клетки) в Th1-клетки, индуцированную фенилаланином и изолейцином. Наивные CD4⁺ T-клетки культивировали в течение 3 суток с/без OM1 в присутствии фенилаланина (1 мМ) или изолейцина (1 мМ). Частоту Th1-клеток (CD4⁺IFN-γ⁺) тестировали посредством проточной цитометрии. Данные представлены в качестве среднего значения ± стандартная ошибка среднего значения (среднее значение ± sem); n = 3 повторения на группу. Слева, *P < 0,05, **P < 0,01 в соответствии с односторонним ANOVA (F (2, 6) = 15,64). Справа, *P < 0,05, **P < 0,01 в соответствии с односторонним ANOVA (F (2, 6) = 10,35).

(f) Эффекты OM1 на пролиферацию клеток Th1, индуцируемую фенилаланином и изолейцином. Наивные CD4⁺ T-клетки окрашивали CellTrace и культивировали в течение 3 суток с/без OM1 в присутствии фенилаланина (1 мМ) и изолейцина (1 мМ). Плотность флуоресценции CellTrace в клетках Th1 (CD4⁺IFN-γ⁺) тестировали посредством проточной цитометрии (см. способы). Данные представлены в качестве среднего значения ± стандартная ошибка среднего значения (среднее значение ± sem), n = 3. *P < 0,05, ***P < 0,001 в соответствии с односторонним ANOVA (F (4, 9) = 28,34).

(g) Изменения Th1-клеток в крови после внутрибрюшинной (в/б) инъекции в течение 4 суток фенилаланина и изолейцина (n = 6). ***P < 0,001 в соответствии с односторонним ANOVA (F (2, 21) = 101,8).

(h) Классификация на основе случайных деревьев изменений аминокислот у здоровых контролей (HC) и у пациентов с умеренным когнитивным расстройством (MCI) вследствие AD (первая группа, n = 9 для MCI вследствие AD, n = 18 для HC).

(i) Частота Th1-клеток в крови здоровых контролей (HC) и пациентов с умеренным когнитивным расстройством (MCI) вследствие AD (первая группа, n = 8 для MCI вследствие AD, n = 9 для HC). *P < 0,05 согласно t-критерию Стьюдента. По вертикальной оси приведен процент Th1-клеток/CD4⁺ T-клеток.

(j) Уровни фенилаланина и изолейцина в крови здоровых контролей (HC) и пациентов с умеренным когнитивным расстройством (MCI) вследствие AD (вторая группа, n = 22 для обеих групп). *P < 0,05 в соответствии с t-критерием Стьюдента.

Фигура 6. Схематическая диаграмма нейровоспаления при прогрессировании AD и стратегия вмешательства

Изменение микробиоты кишечника в ходе прогрессирования AD вызывает нарушение метаболизма аминокислот. Оно способствует дифференцировке наивных CD4 T-клеток в Th1-клетки в крови. Между тем, аминокислоты и Th1-клетки могут инфильтрировать головной мозг посредством циркуляции крови. Инфильтрация периферических иммунных клеток и активация микроглии приводят к патологическому нейровоспалению в головном мозге, что приводит к снижению когнитивных способностей. Пероральное введение OM1 может восстанавливать микробиоту кишечника, ингибировать аномальное продуцирование аминокислот и снижать инфильтрацию периферическими иммунными клетками головного мозга, и в конечном итоге устранять нейровоспаление.

Фигура 7

(a-b) Изменения Aβ-положительных областей (a) и положительных по фосфорилированному тау (p-тау) областей (b) в срезах гиппокампа трансгенных (Tg) мышей 5XFAD (в возрасте 2, 3, 5, 7 и 9 месяцев) против мышей дикого типа в возрасте 2 месяцев (WT) (n=2-7). Представлены репрезентативные флуоресцентные изображения; масштабная метка соответствует 100 мкм. На линейных графиках обобщенно представлены результаты для всех индивидуальных точек относительно мышей WT, и они представлены в качестве среднего значения ± стандартная ошибка среднего значения (среднее значение±sem). Линии аппроксимированы посредством алгоритма кубических сплайнов. M, месяцы.

(c) Главный компонент (PC) 1 из анализа главных компонентов (PCA) для состава микробиома кишечника на уровне операционной таксономической единицы (OTU) у мышей WT и трансгенных (Tg) мышей 5XFAD (в возрасте 2, 3, 5, 7 и 9 месяцев) (n=4-10). Красные точки и линии, мыши Tg; синие точки и линии, мыши WT. Естественное соединение в линию без аппроксимации. Использование двухсторонннего критерия суммы рангов Уилкоксона (ранговая сумма); * указывает на значимое отличие по сравнению с возрастом 2 месяца в той же группе. *P<0,05, **P<0,01. # указывает на значимое отличие по сравнению с совпадающими по возрасту мышами WT. #P<0,05; ##P<0,01; ###P<0,001.

(d) Изменение относительного содержания микроорганизмов в кишечнике на уровне семейств у трансгенных (Tg) мышей 5XFAD (в возрасте 2, 3, 5, 7 и 9 месяцев) (n=4-10). Различные цвета соответствуют различным семействам.

(e) Кладограмма анализа величины эффекта линейного дискриминантного анализа (LEfSe) для состава кишечного микробиома у трансгенных (Tg) мышей 5XFAD (в возрасте 2, 3, 5, 7 и 9 месяцев) (n=4-10). Бактерии с наиболее высокой дискриминационной способностью обозначены на графике для каждого месяца. Цветами указаны таксоны бактерий, которые обогащались каждый месяц. Круги от внутренних к внешним указывают различные таксономические уровни (от внутреннего к внешнему: тип, класс, порядок, семейство и род). M, месяцы. Verrucomicrobia; AlphaProteobacteria; Bacteroidetes; Prevotellaceae; Erysipelotrichia; Firmicutes; Lachnoclostridium.

(f) Анализ PCA для микробиома кишечника на уровне OTU у трансгенных мышей APP/PS1 в возрасте 3, 6, 8, 9, 12 и 14 месяцев (n=4-12). Цветами и формами указаны данные в разные месяцы. Окрашенные овалы указывают на диапазоны доверительного интервала (CI), соответствующего 0,95, в каждой тестируемой группе. PC, главный компонент.

(g) Изменения относительного содержания микробов кишечника на уровне типа у трансгенных мышей APP/PS1 в возрасте 3, 6, 8, 9, 12 и 14 месяцев (n=4-12). Цвета соответствуют различным типам. M, месяцы.

(h) Репрезентативные флуоресцентные изображения изменений IBA1-положительных областей в срезах гиппокампа трансгенных (Tg) мышей 5XFAD (в возрасте 2, 3, 5, 7 и 9 месяцев) против мышей дикого типа в возрасте 2 месяца (WT) (n=2-7). Масштабная метка соответствует 500 мкм в мелкой рамке (сверху), 250 мкм в крупной рамке (снизу). M, месяцы.

(i) Изменения частоты инфильтрирующих клеток (CD45^high), обнаруженные в гомогенатах целого мозга мышей APP/PS1 в возрасте 3, 6, 9 и 14 месяцев при детекции посредством проточной цитометрии (n=5-8). Количества клеток представлены относительно частоты CD45⁺ клеток, и они имеют формат среднего значения ± стандартная ошибка среднего значения (среднее значение ± sem). Линии аппроксимированы посредством алгоритма кубических сплайнов.

(j) Изменения частоты инфильтрирующих периферических Th1-клеток в гомогенатах целого мозга мышей APP/PS1 в возрасте 3, 6, 9 и 14 месяцев при детекции посредством проточной цитометрии (n=3-8). Th1-клетки (CD45^highCD4⁺CXCR3⁺CCR6^-) представлены относительно частоты CD45^highCD4⁺ T-клеток. Данные представлены в качестве среднего значения ± стандартная ошибка среднего значения (среднее значение ± sem). Линии аппроксимированы посредством алгоритма кубических сплайнов.

Фигура 8. Изменения отличительных признаков AD в пяти моделях на животных и у мышей дикого типа (WT) в возрасте 2, 4, 8 и 18 месяцев из базы данных Mouseac.

(a) Изменение относительной плотности бляшек Aβ или нейрофибриллярных клубков (n=4 для каждой группы). Данные представлены в качестве среднего значения ± стандартная ошибка среднего значения (среднее значение ± sem). Цветами указаны различные модели; линии аппроксимированы с использованием полиномиального алгоритма.

(b) Изменения log₂-нормализованных уровней экспрессии синаптофизина (n=4 для каждой группы). Данные представлены в качестве среднего значения ± стандартная ошибка среднего значения (среднее значение ± sem). Цветами указаны разные модели; линии аппроксимированы с использованием полиномиального алгоритма.

(c-d) Изменения log₂-нормализованных уровней экспрессии CD86 и ARG1, соответствующие изменениям количеств клеток M1 и M2 (n=4 для каждой группы). Данные представлены в качестве среднего значения ± стандартная ошибка среднего значения (среднее значение ± sem). Цветами указаны разные модели; линии аппроксимированы с использованием полиномиального алгоритма.

(e-h) Изменения log₂-нормализованных уровней экспрессии TIPM, CCL3, GATA-3 и MIF, соответствующие изменениям количеств Th1 и Th2 (n=4 для каждой группы). Данные представлены в качестве среднего значения ± стандартная ошибка среднего значения (среднее значение ± sem). Цветами указаны разные модели; линии аппроксимированы с использованием полиномиального алгоритма.

Фигура 9

(a) Эффекты совместного содержания на время из 10⁴ секунд, затраченных на достижение 80% успеха, в тесте для оценки способности к обучению распознаванию образов у мышей WT, совместно содержащихся WT и трансгенных (Tg) мышей 5XFAD в возрасте 7 месяцев (n=5-8). Затраченное время означает время для достижения уровня эффективности 80% (секунды); чем больше времени требуется, тем тяжелее когнитивное нарушение (см. способы).

(b) Эффекты трансплантации фекальной микробиоты (FMT) на количества иммунных клеток в головном мозге (Th1 и Th2) реципиентных мышей WT, которым инъецировали Aβ (см. способы) с использованием фекалий либо мышей WT, либо трансгенных (Tg) мышей 5XFAD. Клетки Th1 (CD45^highCD4⁺CXCR3⁺CCR6^-) и клетки Th2 (CD45^highCD4⁺CXCR3^-CCR6^-CCR4⁺) представлены относительно CD45^highCD4⁺ T-клеток (n=6-8); данные представлены в качестве среднего значения ± стандартная ошибка среднего значения (среднее значение ± sem). *P<0,05, t-критерий Стьюдента.

(c) Эффекты FMT от мышей WT в возрасте 2 месяца на Th1-клетки в головном мозге у трансгенных (Tg) мышей 5XFAD (n=6-7). Данные представлены в качестве среднего значения ± стандартная ошибка среднего значения (среднее значение±sem). *P<0,05, t-критерий Стьюдента.

Фигура 10

(a) Кладограмма анализа величины эффекта линейного дискриминантного анализа (LEfSe) для состава микробиома кишечника трансгенных (Tg) мышей 5XFAD в возрасте 7 месяцев, которым перорально вводили OM1 (n=5-7). Бактерии с наиболее высокой дискриминационной способностью на уровне типов обозначены на графике. Синий, бактерии с увеличенным содержанием у мышей Tg в возрасте 7 месяцев. Красный, бактерии с увеличенным содержанием у Tg мышей в возрасте 7 месяцев, которым вводили OM1. Круги от внутреннего к внешнему указывают на разные таксономические уровни (от внутреннего к внешнему: тип, класс, порядок, семейство и род). M, месяцы

(b-c) Корреляция между микробиотой, имеющей повышенные и сниженные уровни микроорганизмов, вызванные OM1, и частота подтипов иммунных клеток в головном мозге трансгенных (Tg) мышей 5XFAD в возрасте 7 месяцев. Квадраты красного цвета (положительная корреляция) или синего цвета (отрицательная корреляция) с желтой звездочкой (*) имеют значение P < 0,05, определенное посредством параметрического теста корреляции Пирсона, чиста в каждом квадрате представляют собой коэффициент корреляции.

(d) Репрезентативные изображения окрашивания IBA1, отложения Aβ и фосфорилирования тау в гиппокампе головного мозга мышей WT, Tg и мышей Tg, которым вводили OM1. Масштабная метка соответствует 250 мкм. Положительный сигнал визуализировали с использованием субстрата 3,3’-диаминобензидина (DAB), показанного темно-коричневым цветом.

(e) Эффекты FMT из мышей WT, Tg и мышей Tg, которым вводили OM1, на Th1-клетки головного мозга у реципиентных мышей C57 с инъекцией Aβ в гиппокамп (n=4-5). Данные представлены в качестве среднего значения ± стандартная ошибка среднего значения (среднее значение±sem).

(f) Эффекты введения антибиотика (ампициллин (0,1 мг/мл), стрептомицин (0,5 мг/мл) и колистин (0,1 мг/мл) на относительное содержание микробиоты кишечника на уровне рода в модели на трансгенных мышах APP/PS1 в возрасте 6 месяцев, которым перорально вводили OM1 (n=6-8). Цветами указаны разные роды.

(g) Эффекты OM1 на частоту Th1-клеток в головном мозге мышей APP/PS1 в возрасте 6 месяцев, которым вводили антибиотики (см. способы). Th1-клетки (CD45^highCD4⁺CXCR3⁺CCR6^-) представлены относительно CD45^highCD4⁺ T-клеток (n=6-8), и данные представлены в качестве среднего значения ± стандартная ошибка среднего значения (среднее значение ± sem). Слева направо: *P<0,05, t-критерий Стьюдента. NS, нет значимых отличий.

(h) Эффекты OM1 на относительную плотность IBA1-положительного иммунофлуоресцентного окрашивания, выявленного в срезах гиппокампа мышей APP/PS1 в возрасте 6 месяцев, которым вводили антибиотики (n=4-6, см. способы). IBA1-положительная область отражает активацию клеток микроглии. Данные представлены в качестве среднего значения ± стандартная ошибка среднего значения (среднее значение±sem). ***P < 0,0001 в соответствии с t-критерием Стьюдента. NS, нет значимых отличий.

(i) Репрезентативное иммунофлуоресцентное окрашивание IBA1 в головном мозге мышей APP/PS1 и мышей APP/PS1, которым вводили OM1, с антибиотиками или без них. IBA1 визуализировали с использованием конъюгированного с FITC вторичного антитела, как показано зеленым цветом. Ядро окрашивали DAPI, как показано синим цветом. Масштабная метка соответствует 250 мкм.

(j) Эффекты OM1 на уровни цитокинов в гомогенатах головного мозга мышей APP/PS1 в возрасте 7 месяцев при определении посредством чипа с антителами к цитокинам (n=5-6). Цветами на тепловой карте указаны относительные уровни цитокинов, нормализованные посредством грубой Z-оценки; красным указаны цитокины, уровень которых повышается, и синим указаны цитокины, уровень которых снижается.

Фигура 11

(a) Эффект OM1 на дифференцировку наивных CD4⁺ T-клеток, обработанных супернатантом бактерий, в Th1- и Th2-клетки. Наивные CD4 T-клетки культивировали и супернатант из микробиоты мышей 5XFAD добавляли в присутствии/отсутствии OM1 в течение 3 суток. Гейтирование клеток Th1 (CD4⁺IFN-γ⁺) и Th2 (CD4⁺IL-4⁺) проводили посредством проточной цитометрии. Данные представлены в качестве среднего значения ± стандартная ошибка среднего значения (среднее значение ± sem); n=3 повторения на группу.

(b-c) На вулканной диаграмме представлено распределение метаболитов из первичных данных метаболомики фекалий кишечника мышей WT и 5XFAD (Tg) в возрасте 7 месяцев (n=6-8) (b) и мышей Tg в возрасте 7 месяцев, которым вводили или не вводили OM1 (n=6) (c). Красными точками указаны значимые изменения метаболитов. Значимость определяют как значение P < 0,05 в соответствии с t-критерем Стьюдента и кратность изменений (FC) < 0,83 или > 1,2 между (T) и диким типом (WT). По оси x представлен log₂FC, и по оси y представлен -log₁₀P.

(d-e) Тепловая карта для семисот восемьдесят шести метаболитов, которые дифференциально регулировались между мышами Tg и WT (d), а также 149 метаболитов между мышами Tg, которому вводили OM1 и не вводили его (e) (n=6-8). Эти метаболиты идентифицированы и аннотированы посредством сопоставления данных молекулярной массы (m/z) значимых пиков с онлайн-базой данных METLIN.

(f) На диаграмме Венна представлены метаболиты фекалий кишечника, уровни которых часто снижаются при сравнении мышей Tg и WT (T_W) и мышей Tg, которым вводили OM1 или не вводили его (Ttreat_T) (n=6-8). Сто двадцать четыре метаболита имели реверсию паттернов среди двух сравнений, т.е. метаболиты, которые являются либо в обоих случаях высокими для T_W и низкими для Ttreat_T, либо в обоих случаях низкими для T_W и высокими для Ttreat_T.

(g) На тепловой карте представлен 31 идентифицированный метаболит с дифференциальной регуляцией среди групп WT, Tg и Tg с введением OM1 (n=6-8), которые могут быть сопоставлены со всеми тремя базами данных (Human Metabolites Database (HMDB), METLIN, Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG)). Красный, повышение уровня; синий, снижение уровня.

(h) кривую операционных характеристик приемника (ROC) и величину площади под кривой (AUC) для всех аминокислот в ходе прогрессирования заболевания вычисляют с использованием алгоритма случайного леса.

(i) Эффекты трансплантации фекального микробиома (FMT) на уровни фенилаланина и изолейцина в крови. Фекалии мышей WT в возрасте 2 месяцев трансплантировали мышам Tg в возрасте 7 месяцев (n=6-7). Для фенилаланина ***P < 0,001((F (2, 17)=26,59)). Для изолейцина, **P <0,01 (Tg против WT), **P <0,01 (Tg+FMT против Tg) в соответствии с односторонним ANOVA (F (2, 17)=8,181).

(j) Уровни аминокислот в образцах крови мышей WT, совместно содержащихся WT и Tg в разные месяцы (M) возраста. Красный, повышенный уровень; синий, сниженный уровень.

(k) Поглощение фенилаланина наивными CD4 T-клетками. Наивные CD4 T-клетки культивировали с/без ¹³C-меченного фенилаланина в течение 0,5 ч. Проводили масс-спектрометрию родственных фенилаланину соединений. ¹³C-Фенилаланин вводили в концентрации 5 ммоль/л, и он захватывается переносчиком аминокислот L-типа.

Фигура 12. JPH203, 50 мг/кг, эффективно ингибирует часть Th1-клеток в головном мозге.

Фигура 13. Тенденция к изменению уровней OTU в энтеробактериях после введения OM1 по сравнению с контролем - анализ PCoA эффекта деградирующих фенилаланин бактерий на содержание фенилаланина в фекалиях через 1 неделю после трансплантации.

Фигура 14. Тенденция к изменению относительного содержания энтеробактерий после введения OM1 по сравнению с контролем. Эффект деградирующих фенилаланин бактерий на долю Th1-клеток в крови через одну неделю после трансплантации.

Фигура 15. Изменение тенденции содержания цитокинов в головном мозге по сравнению с контролем после введения OM1.

Фигура 16. Изменение распределения микробов кишечника до и после применения средств, используемых для регуляции относительного содержания микроорганизмов в кишечнике: OM1 или фекальные бактерии (комплекс микроорганизмов кишечника).

Фигура 17. Различия между уровнем типа и уровнем рода для AD и HC, частично приведенные подробно. AD: пациенты с AD; HC: здоровые контроли.

Фигура 18. Часть значимо измененной флоры у AD и HC (на уровне рода и вида). AD: пациенты с AD; HC: здоровые контроли.

Фигура 19. Перечень аминокислот, связанных с AD. Многопараметрический поисковый анализ (Explorer) на основе ROC-кривой использовали для анализа аминокислот в крови мышей дикого типа и мышей 5XFAD в возрасте, соответствующем разному количеству месяцев, и он осуществлял поиск потенциальных комбинаций аминокислот в качестве маркеров для отличения мышей дикого типа от мышей 5XFAD. Ниже приводится перечень первых 15 аминокислот, отсортированных по частоте отбора и всем типам.

Фигура 20. Мыши 5XFAD в возрасте 6,5 месяцев после введения 100 мг/кг OM1 в течение 1 месяца имеют уровни аминокислот в крови, которые имеют тенденцию к восстановлению до уровней аминокислот у мышей дикого типа.

Фигура 21. Мыши 5XFAD в возрасте 6,5 месяцев после введения 100 мг/кг OM1 в течение 1 месяца имеют уровни фекальных аминокислот, которые имеют тенденцию к восстановлению до уровней аминокислот у мышей дикого типа.

Фигура 22. Перечень цитокинов, уровни которых восстановились после введения OM1. Мышам 5XFAD в возрасте 6,5 вводили 100 мг/кг OM1 в течение 1 месяца, и они имели цитокины в головном мозге, которые имеют тенденцию к восстановлению до уровней цитокинов у мышей дикого типа.

Фигура 23. Тенденция к изменению клеток M1 головного мозга у мышей APP/PS1 в возрасте, соответствующем разному количеству месяцев.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Далее описаны определенные иллюстративные варианты осуществления для обеспечения полного понимания принципов структуры, функции, получения и применения продуктов, способов и применений, описанных в настоящем описании. Один или несколько примеров этих осуществлений проиллюстрированы ниже. Специалистам в данной области будет понятно, что продукты, способы и применения, конкретно описанные в настоящем описании и конкретно проиллюстрированные на прилагаемых чертежах, представляют собой неограничивающие иллюстративные варианты осуществления, и объем настоящего изобретения ограничивается только формулой изобретения. Признаки, проиллюстрированные или описанные вместе в одном иллюстративном варианте осуществления, можно комбинировать с признаками других вариантов осуществления. Подразумевается, что такие модификации и изменения включены в объем настоящего изобретения. Все цитированные публикации, патенты и патентные заявки включены в настоящее описание в качестве ссылок в полном объеме.

В контексте описания настоящего изобретения (особенно в контексте прилагаемой ниже формулы изобретения), если в настоящем описании нет иных указаний или если контекст явно этому не противоречит, термины в форме единственного числа следует интерпретировать как охватывающие и единственное число, и множественное число. Если нет иных указаний, термины "содержащий", "имеющий", "включающий" и "охватывающий" следует интерпретировать как открытые термины (т.е. "включая, но не ограничиваясь ими"), однако они также включают частично закрытые или закрытые термины "по существу состоящий из" и "состоящий из". Если в настоящем описании нет иных указаний, описание числового диапазона в настоящем описании предназначено для применения только в качестве способа сокращения для независимого указания на каждую индивидуальную величину, входящую в данной диапазон, и каждая индивидуальная величина включена в настоящее описание, как если бы она была независимо приведена в настоящем описании. Если в настоящем описании нет иных указаний или если контекст этому явно не противоречит, все способы, описанные в настоящем описании, могут быть выполнены в любом подходящем порядке. Если нет иных указаний, применение любых и всех примеров или иллюстративной формулировки (например, "такой как"), приведенных в настоящем описании, предназначено только для лучшей иллюстрации настоящего изобретения и не ограничивает объем настоящего изобретения. Никакую формулировку в настоящем описании не следует истолковывать как указывающую на то, что какой-либо не заявленный в формуле изобретения элемент является необходимым для применения настоящего изобретения на практике. Все проценты представляют собой проценты по массе, и все проценты по массе основаны на общей массе композиции (с какой-либо необязательной концентрацией и/или разведением). Выражение "один или несколько" включает "два или более" и "три или более" и т.п.

Предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения описаны в настоящем описании. После прочтения вышеуказанного описания изменения предпочтительных вариантов осуществления могут стать очевидными специалистам в данной области. Автор изобретения полагает, что специалисты в данной области будут надлежащим образом использовать такие изменения, и автор изобретения предполагает, что настоящее изобретение будет осуществляться способом, отличным от способа, конкретно указанного в настоящем описании. Таким образом, настоящее изобретение включает все модификации и эквиваленты объекта, описанного в прилагаемой формуле изобретения, допустимые применяемым законом. Более того, если в настоящем описании нет иных указаний или если контекст этому явно не противоречит, настоящее изобретение охватывает любую комбинацию всех возможных вариантов вышеупомянутых элементов.

Когда в настоящей заявке приводится последовательность величин, следует понимать, что любая приведенная величина может представлять собой верхний или нижний предел числового диапазона. Также должно быть понятно, что настоящее изобретение охватывает все такие числовые диапазоны, т.е. диапазон, имеющий комбинацию верхнего предела и нижнего предела, где соответствующие величины верхнего предела и нижнего предела могут представлять собой любые из числовых величин, приведенных настоящем описании. Следует понимать, что диапазон, приведенный в настоящем описании. включает все величины, входящие в диапазон. Например, следует понимать, что 1-10 включает все из величин 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 и 10, и включает дробные величины в соответствующих случаях. Диапазон, выражаемый посредством "вплоть до" определенной величины (например, вплоть до 5) следует понимать как все величины (включая верхний предел диапазона), такие как 0, 1, 2, 3, 4 и 5, и он включает дробные величины в соответствующих случаях. Следует понимать, что "не более одной недели" или "в пределах недели" включает 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7 суток. Аналогично, следует понимать, что диапазон, определяемый посредством "по меньшей мере", включает приведенные более низкие величины и все более высокие величины.

Если нет иных указаний, все проценты представляют собой проценты масса/масса.

Как используют в рамках настоящего изобретения, под "приблизительно/примерно" следует понимать включение в пределы трех стандартных отклонений от средней величины или в стандартный диапазон допустимости в конкретной области. В определенных вариантах осуществления под "приблизительно" следует понимать отклонение не более чем на 0,5. "Приблизительно/примерно" модифицирует все перечисленные величины после них. Например, "приблизительно 1, 2, 3" означает "приблизительно 1", "приблизительно 2", "приблизительно 3".

Если контекст явно не указывает на иное, термин "или" используют в инклюзивном значении в настоящем описании, означающем термин "и/или", и они могут использоваться в настоящем описании взаимозаменяемо.

Термин "такой как/например/к примеру" используют в настоящем описании для указания на выражение "такой как/например/к примеру, но не ограничиваясь ими", и они могут использоваться в настоящем описании взаимозаменяемо.

Специалистам в данной области должно быть понятно, что технические признаки, описанные в различных вариантах осуществления выше, могут использоваться отдельно или в комбинации с техническими решениями различных аспектов настоящего изобретения.

Авторы изобретения использовали модель на трансгенных (Tg) мышах 5XFAD, широко используемую в исследовании AD, вследствие ее тяжелого и ускоренного снижения когнитивных способностей. Посредством анализа энтеротипа мышей Tg и мышей WT на различных стадиях прогрессирования AD, было обнаружено, что микробиота кишечника мышей Tg является в высокой степени динамичной (фиг.1d). В возрасте 2-3 месяца Bacteroidetes, Firmicutes и Verrucomicrobia являются тремя наиболее распространенными типами бактерий (46,8%, 32,3% и 12,6%, соответственно), в то время как в возрасте 7-9 месяцев преобладающими бактериями становятся Firmicutes, в то время как содержание Bacteroidetes и Verrucomicrobia значительно снижается. Это резко расходится с микробиотой кишечника мышей WT.

Авторы изобретения также проанализировали периферические иммунные клетки Th1 и Th1 и клетки микроглии M1 и M2 и обнаружили, что два основных подтипа CD4+ клеток (инфильтрирующие Th1- и Th2-клетки) продемонстрировали сходную динамику с двумя основными подтипами клеток микроглии (клетки микроглии M1 и M2) (фиг.1f и фиг.1j). На ранней стадии они в основном представляют собой клетки Th2 и нейропротекторные клетки микроглии M2, и на поздней стадии они в основном представляют собой клетки Th1 и провоспалительные клетки микроглии M1. Авторы изобретения полагают, что по мере изменения паттернов микробиоты кишечника популяция иммунных клеток имеет тенденцию к достижению статуса преобладания Th1 и M1.

Авторы изобретения также проанализировали корреляцию между содержанием микробиоты кишечника и клетками головного мозга у мышей Tg, и также отметили, что бактериальный состав на ранней стадии (2-3 месяца) в высокой степени коррелирует с количествами клеток M2 и Th2 в головном мозге (фиг.1k, верх), в то время как на поздней стадии (7-9 месяцев) изменения бактериального паттерна в высокой степени коррелируют с клетками M1 и Th1 (фиг.1k, низ). В целом, эти результаты указывают на то, что в ходе прогрессирования AD кишечные бактерии ассоциированы с инфильтрацией периферических иммунных клеток и нейровоспалением.

Более того, авторы изобретения обнаружили, что дисбиоз микробиоты кишечника требуется для инфильтрации различных периферических иммунных клеток (включая CD4+ и CD8+ T-клетки, B-клетки, натуральные киллеры (NK), нейтрофилы, дендритные клетки (DC) и моноциты) в головной мозг. Среди них, особенно примечательными являются клетки Th1, поскольку они тесно связаны с активацией клеток микроглии M1 в ходе прогрессирования AD. Ввиду общепризнанной функциональной взаимосвязи Th1 и клеток микроглии M1 в головном мозге, авторы изобретения предположили, что дисбиоз кишечника способствует инфильтрации Th1-клеток, обеспечивая локальное взаимодействие с микроглией M1, тем самым запуская дифференцировку микроглии в провоспалительное состояние. Посредством серии открытий, полученных в ходе данного исследования, понимание этого механизма возросло. Во-первых, динамические изменения состава микробиоты кишечника в ходе прогрессирования AD на значимом уровне связаны с повышением инфильтрации клеток Th1. Во-вторых, сокращение микробиоты кишечника посредством введения антибиотиков блокировало инфильтрацию Th1-клеток и последующую активацию микроглии M1 у мышей с AD (фиг.2a-c). В третьих, длительное воздействие фекальных бактерий (эксперимент с совместным содержанием) и трансплантация фекальной микробиоты от мышей AD значительно усиливали как инфильтрацию Th1-клеток (фиг.2e), так и активацию микроглии M1, у мышей WT, в то время как трансплантация фекальной микробиоты мышей WT мышам Tg снижала уровни Th1-клеток у реципиентных мышей Tg (фиг.9c). Результаты исследования автора изобретения в целом указывают на то, что микробиота кишечника является пусковым фактором, способствующим нейровоспалению, вызываемому Th1/микроглией M1, при прогрессировании AD.

Причинно-следственная взаимосвязь между дисбиозом микробиоты кишечника и нейровоспалением при AD все еще неясна. В этом исследовании авторы изобретения обнаружили, что более 100 метаболитов были на значимом уровне изменены у мышей с AD по сравнению с мышами WT. Среди них, наиболее выраженные изменения происходили среди аминокислот, особенно аминокислот в связанном с фенилаланином каскаде. Авторы изобретения смогли подтвердить, что содержание фенилаланина и изолейцина было повышенным в фекалиях и крови мышей AD относительно мышей WT. Функциональная оценка как in vitro, так и in vivo, продемонстрировала роль фенилаланина и изолейцина в способствовании дифференцировке и пролиферации периферических воспалительных Th1-клеток. Использование антибиотиков для сокращения микробиоты кишечника приводило к одновременному снижению уровней фенилаланина и изолейцина в крови, инфильтрации Th1-клеток и активации клеток M1. Эти данные подчеркивают роль аномального продуцирования фенилаланина и изолейцина в микробиоте кишечника в стимуляции нейровоспаления, определяемого Th1-клетками. В соответствии с этой точкой зрения, авторы изобретения обнаружили, что концентрация фенилаланина/изолейцина и количество Th1-клеток в крови пациентов с MCI, вызванным AD, являются более высокими, чем в группе здоровых контролей.

Новые появившиеся данные показывают, что полисахариды или олигосахариды имеют преимущество регуляции микробиоты кишечника. Олигосахариды маннуроновой кислоты представляют собой лекарственные средства против AD на углеводной основе. В клиническом испытании фазы III, недавно завершенном в Китае, было показано, что они улучшают когнитивные способности у пациентов с AD от мягкой до умеренной. Олигосахариды маннуроновой кислоты хорошо переносятся и имеют безопасность, сходную с плацебо-контролями. В этом испытании авторы изобретения обнаружили, что OM1 эффективно восстанавливает микробиоту кишечника (фиг.4a-b; фиг.10a), снижает количество фенилаланина и изолейцина в фекалиях и крови (фиг.5c-d), и снижает обусловленное Th1 нейровоспаление (фиг.4g-i). Следует отметить, что фекалии Tg, которым вводили OM1, могут в значительной степени имитировать терапевтический эффект самого лечения OM1, и лечение антибиотиками устраняет их терапевтический эффект. Эти данные обеспечивают важное доказательство того, что терапевтический эффект OM1 в основном опосредуется восстановлением микробиоты кишечника. Таким образом, OM1 может обеспечить привлекательный подход для стратегий лечения AD, сфокусированных на микробиоте, что заслуживает дальнейшего исследования.

Все эти данные позволяют авторам изобретения сделать предположение о концептуальном прорыве в понимании патогенеза AD. AD является не только локальным опосредуемым Aβ заболеванием головного мозга, но ее развитие также требует системных взаимодействий между кишечником, головным мозгом и промежуточными воспалительными факторами (фиг.6). В случае отложения Aβ измененный состав микробиоты кишечника в ходе прогрессирования AD вызывает аномальное повышение уровней аминокислот (особенно фенилаланина и изолейцина). Эти аминокислоты способствуют инфильтрации периферических Th1-клеток в головной мозг через кровоток. Инфильтрирующие периферические Th1-клетки могут локально взаимодействовать с микроглией M1 в головном мозге, что приводит к патологическому нейровоспалению и снижению когнитивной функции. Эти данные о патогенезе AD могут использоваться для восстановления микробиоты кишечника для способствования ответу, направленному против нейровоспаления, и предоставления новых терапевтических решений.

Результаты исследования автора изобретения могут иметь революционное значение для диагностики и лечения AD. Композиция конкретных бактерий (например, связанные с Th1/M1 бактерии), аминокислот (например, фенилаланин и изолейцин) и инфильтрирующих головной мозг иммунных клеток (например, преобладание Th1-клеток) или комбинация одного или нескольких из них могут использоваться в качестве ранних диагностических биомаркеров для пациентов с MCI, вызванным AD, и это заслуживает дальнейшего подтверждения на большой выборке пациентов с AD.

Более важно, установленный эффект OM1 против AD, сфокусированный на микробиоте, откроет новые терапевтические подходы для лечения AD путем реорганизации микробиоты кишечника, и определит развитие эффективных способов терапии в будущем путем изучения в высокой степени неисследованной химии сахаров.

Каждый из идентифицированных авторами изобретения многочисленных характерных микроорганизмов кишечника, аминокислот, иммунных клеток и цитокинов, связанных с осью головной мозг-кишечник составляет микробный профиль кишечника, профиль аминокислот, профиль иммунных клеток и профиль цитокинов. Один или несколько из этих профилей (таких как микробный профиль кишечника) демонстрируют различия между нормальными и заболевшими индивидуумами. Настоящее изобретение нацелено на выявление или регуляцию состояния индивидуума путем выявления или регуляции одного или нескольких из этих профилей (таких как микробный профиль кишечника). В некоторых вариантах осуществления для диагностических целей профиль (например, микробный профиль кишечника) индивидуума может быть определен для сравнения с профилем (например, микробный профиль кишечника) с нормальными характеристиками соответствующего нормального индивидуума и/или профилем (например, микробный профиль кишечника) с характеристиками заболевания соответствующего заболевшего индивидуума, чтобы определить является ли состояние индивидуума нормальным или болезненным, тем самым диагностируя индивидуума. В некоторых вариантах осуществления для терапевтических целей профиль индивидуума с характеристиками заболевания может регулироваться до профиля соответствующего нормального индивидуума, так что болезненное состояние индивидуума может регулироваться до нормального состояния, тем самым осуществляя лечение индивидуума.

Таким образом, в одном аспекте настоящее изобретение относится к применению средства для ингибирования захвата аминокислот наивными T-клетками в периферической крови млекопитающего для производства лекарственного средства для лечения у индивидуума болезни Альцгеймера.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для лечения болезни Альцгеймера у индивидуума, содержащей эффективное количество средства для ингибирования захвата аминокислот наивными T-клетками в периферической крови млекопитающего.

В некоторых вариантах осуществления аминокислота представляет собой одну или несколько аминокислот, выбранных из следующих: 4-OH пролин, ацетилорнитин, аланин, альфа-аминоадипиновая кислота, аспарагин, аспарагиновая кислота, асимметричный диметиларгинин, бета-аланин, карнозин, цитруллин, креатинин, ГАМК, глутаминовая кислота, глутамин, глицин, гистидин, гипотаурин, изолейцин, кинуренин, лейцин, лизин, метионин, сульфоксид метионина, орнитин, фенилаланин, пипеколиновая кислота, пролин, путресцин, пироглутаминовая кислота, серин, серотонин, таурин, треонин, триптофан, тирозин и валин; предпочтительно одну или несколько, выбранных из фенилаланина, изолейцина, серотонина, гистидина и ацетилорнитина; более предпочтительно фенилаланин и/или изолейцин; наиболее предпочтительно фенилаланин.

В некоторых вариантах осуществления средство ингибирует захват аминокислот наивными T-клетками посредством ингибирования транспорта аминокислоты в наивную T-клетку переносчиком.

В некоторых вариантах осуществления переносчиком является SLC7A5.

В некоторых вариантах осуществления средство включает одно или несколько, выбранных из JPH 203, BCH и KMH-233.

В некоторых вариантах осуществления средство снижает долю провоспалительных Th1-клеток среди CD4+ T-клеток в образце от индивидуума приблизительно на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% или более; и/или делает долю провоспалительных Th1-клеток в CD4+ T-клетках близкой к или достигающей соответствующей доли провоспалительных Th1-клеток в CD4+ T-клетках соответствующего нормального индивидуума.

В некоторых вариантах осуществления средство снижает относительный уровень захвата аминокислот наивными T-клетками приблизительно на 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295, 300 или более; и/или делает относительный уровень захвата аминокислот наивными T-клетками близким или достигающим соответствующий относительный уровень захвата аминокислот наивными T-клетками соответствующего нормального индивидуума.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу скрининга лекарственного средства-кандидата, которое может использоваться для лечения болезни Альцгеймера, включающему:

a) введение тестируемого средства в моделях in vivo или in vitro с переносчиком SLC7A5, и

b) выбор тестируемого средства, которое ингибирует переносчик SLC7A5, в качестве лекарственного средства-кандидата, которое может использоваться для лечения болезни Альцгеймера.

В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает введение JPH 203 в качестве положительного контроля в модели in vivo или in vitro с переносчиком SLC7A5, предпочтительно выбирая тестируемое средство, которое ингибирует переносчик SLC7A5 по существу сопоставимо с JPH 203.

В некоторых вариантах осуществления модель представляет собой модель in vivo.

В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает введение выбранного тестируемого средства в модели in vivo с переносчиком SLC7A5 для подтверждения, где выбранное тестируемое вещество снижает долю провоспалительных Th1-клеток среди CD4+ T-клеток образца из модели in vivo приблизительно на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% или более; и/или делает долю провоспалительных Th1-клеток среди CD4+ T-клеток близкой к или достигающей соответствующей доли провоспалительных Th1-клеток среди CD4+ T-клеток в соответствующей нормальной модели in vivo.

В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает введение выбранного тестируемого вещества в модели in vivo или in vitro с переносчиком SLC7A5 для подтверждения, где выбранное тестируемое вещество снижает относительный уровень захвата аминокислот наивными T-клетками приблизительно на 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295, 300 или более; и/или делает относительный уровень захвата аминокислот наивными T-клетками близким к или достигающим соответствующего относительного уровня захвата аминокислот наивными T-клетками в соответствующей нормальной модели in vivo или in vitro.

В некоторых вариантах осуществления аминокислота представляет собой одну или несколько, выбранных из следующих: 4-OH пролин, ацетилорнитин, аланин, альфа-аминоадипиновая кислота, аспарагин, аспарагиновая кислота, асимметричный диметиларгинин, бета-аланин, карнозин, цитруллин, креатинин, ГАМК, глутаминовая кислота, глутамин, глицин, гистидин, гипотаурин, изолейцин, кинуренин, лейцин, лизин, метионин, сульфоксид метионина, орнитин, фенилаланин, пипеколиновая кислота, пролин, путресцин, пироглутаминовая кислота, серин, серотонин, таурин, треонин, триптофан, тирозин и валин; предпочтительно одну или несколько, выбранных из фенилаланина, изолейцина, серотонина, гистидина и ацетилорнитина; более предпочтительно, фенилаланина и/или изолейцина; наиболее предпочтительно, фенилаланина.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения пациента, имеющего болезнь Альцгеймера, включающему:

введение средства для ингибирования захвата аминокислот наивными T-клетками в периферической крови млекопитающего пациенту, так чтобы происходила регуляция доли провоспалительных Th1-клеток среди CD4+ T-клеток у пациента так, чтобы она была близкой к или достигала соответствующей доли провоспалительных Th1-клеток среди CD4+ T-клеток в соответствующей нормальной выборке.

В следующем аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения пациента, имеющего болезнь Альцгеймера, включающему:

введение пациенту средства для ингибирования захвата аминокислот наивными T-клетками в периферической крови млекопитающего, так чтобы происходила регуляция относительного уровня захвата аминокислот наивных T-клеток у пациента так, чтобы он был близким или достигал соответствующего относительного уровня захвата аминокислот наивными T-клетками в соответствующей нормальной выборке.

В некоторых вариантах осуществления углеводное лекарственное средство представляет собой OM1.

В некоторых вариантах осуществления углеводное лекарственное средство не является OM1.

В некоторых вариантах осуществления олигосахарид маннуроновой кислоты представляет собой OM1.

В некоторых вариантах осуществления олигосахарид маннуроновой кислоты не является OM1.

Структура и способ получения олигосахаридов маннуроновой кислоты описаны во многих документах уровня техники. В патенте уровня техники CN2016100697039 описан способ получения олигоманнуроновой кислоты, в патенте уровня техники CN2017107964853 описан способ определения средневзвешенной молекулярной массы и количества маннуроновых кислот, в патенте уровня техники CN2017114675966 описана композиция маннуроновой кислоты и ее получение, все из них включены в настоящее описание в качестве ссылок в полном объеме. OM1, используемая в рамках настоящего описания, представляет собой композицию A согласно CN2018107213276 ("олигосахаридная композиция альгиновой кислоты "), который включен в настоящее описание в качестве ссылки.

Микробиота

В настоящем описании описаны способы и композиции, которые включают изменение микробиоты кишечного тракта индивидуума. Термин "микробиота" используют для указания на одно или несколько бактериальных сообществ, которые могут быть найдены или существуют (колонизируют) в кишечном тракте организма. Он может использоваться взаимозаменяемо с "микробами/микроорганизмами" или "кишечными микробами/микроорганизмами" в настоящем описании. При указании на более чем одну микробиоту, микробиоты могут быть одного типа (штамма) или могут представлять собой смесь групп, таких как Bacteroidetes, Proteobacteria и/или Firmicutes, или их подгрупп (класс, порядок, семейство, род, вид). Микробиота может представлять собой смесь микроорганизмов на одном уровне, таких как Bacteroidetes, Proteobacteria и/или Firmicutes; она также может представлять собой смесь различных уровней микроорганизмов, таких как Bacteroidetes и Proteobacteria.

В некоторых вариантах осуществления кишечные микробы выбраны из одного или нескольких, выбранных из типа, класса, порядка, семейства рода или вида, приведенных в таблице 1, или их комбинации.

В некоторых вариантах осуществления кишечные микробы выбраны из одного или нескольких, выбранных из типа, класса, порядка, семейства, рода или вида, приведенных в таблице 2, или их комбинации.

В некоторых вариантах осуществления кишечные микробы выбраны из одного или нескольких, выбранных из Firmicutes, Bacteroidetes, Proteobacteria, Actinobacteria, Fusobacteria, Cyanobacteria, Verrucomicrobia или их комбинации.

В некоторых вариантах осуществления кишечные микробы представляют собой один или несколько, выбранных из типа, приведенного в таблице ниже, или их комбинации:

тип	Firmicutes
тип	Bacteroidetes
тип	Proteobacteria
тип	Actinobacteria
тип	Fusobacteria
тип	Cyanobacteria
тип	Verrucomicrobia

В некоторых вариантах осуществления кишечные микробы представляют собой один или несколько, выбранных из классов, приведенных в следующей таблице, или их комбинаций:

класс	Bacteroidia
класс	Clostridia
класс	GammaProteobacteria
класс	Bacilli
класс	Negativicutes
класс	Actinobacteria
класс	Fusobacteriia
класс	BetaProteobacteria
класс	AlphaProteobacteria

В некоторых вариантах осуществления кишечные микробы представляют собой один или несколько, выбранных из порядков, приведенных в таблице ниже, или их комбинаций:

порядок	Bacteroidales
порядок	Clostridiales
порядок	Enterobacterials
порядок	Selenomonadales
порядок	Lactobacillales
порядок	Bifidobacterials
порядок	Fusobacterials
порядок	Burkholderiales
порядок	Bacillales

В некоторых вариантах осуществления кишечный микроорганизм представляет собой один или несколько, выбранных из семейств, приведенных в таблице ниже, или их комбинаций:

семейство	Rikenellaceae
семейство	Ktedonobacteraceae
семейство	Nannocystaceae

В некоторых вариантах осуществления кишечные микробы представляют собой один или несколько, выбранных из родов, приведенных в таблице ниже, или их комбинаций:

род	Lachnospiraceae_NK4A136_group
род	Alistipes
род	Ruminococcus_1
род	Ruminococcaceae_UCG-002
род	Ruminococcaceae_UCG-005
род	Coprococcus_2
род	Tyzzerella_4
род	Lachnospiraceae_UCG-001
род	Anaerotruncus
род	Cloacibacterium
род	norank_f__Ktedonobacteraceae
род	Nannocystis
род	norank_f__Hydrogenophilaceae

В некоторых вариантах осуществления кишечные микробы представляют собой один или несколько, выбранных из следующих видов или их комбинаций:

вид	unclassified_g__Subdoligranulum
Вид	unclassified_g__Alistipes
Вид	uncultured_organism_g__Parasutterella
Вид	unclassified_g__Tyzzerella_4
Вид	uncultured_organism_g__Ruminococcaceae_UCG-005
Вид	uncultured_organism_g__Anaerotruncus
Вид	uncultured_Alistipes_sp._g__Alistipes
Вид	Lachnospiraceae_bacterium_TF01-11
Вид	unclassified_g__Anaerotruncus
Вид	unclassified_g__norank_o__Mollicutes_RF9
Вид	uncultured_bacterium_g__Family_XIII_AD3011_group
Вид	uncultured_bacterium_g__norank_f__Christensenellaceae
Вид	uncultured_bacterium_g__Cloacibacterium
Вид	uncultured_organism_g__Peptococcus
Вид	Mycobacterium_celatum_g__Mycobacterium
Вид	unclassified_g__Oceanobacillus
Вид	Alistipes_putredinis_DSM_17216
Вид	Prevotella_loescheii
Вид	uncultured_bacterium_g__norank_o__MBA03
Вид	Eubacterium_brachy
Вид	uncultured_bacterium_adhufec108
Вид	uncultured_Clostridiales_bacterium_g__norank_f__Ktedonobacteraceae
Вид	Nannocystis_pusilla
Вид	bacterium_2013Ark19i
Вид	Auxenochlorella_protothecoides_g__norank
Вид	uncultured_Bacteroidetes_bacterium_g__Dinghuibacter

Авторы изобретения обнаружили, что множество кишечных микробов вовлечено в ось головной мозг-кишечник в соответствии с настоящим изобретением. Как показано в примерах, между мышами WT и мышами TG уровни некоторых кишечных микробов были изменены и после введения, например, OM1, уровни этих кишечных микробов восстанавливались до уровней у мышей WT. Такие кишечные микробы составляют профиль кишечных микробов. Как упоминалось ранее, такой профиль может использоваться для диагностических и/или терапевтических целей.

В некоторых вариантах осуществления изменение (например, повышение или снижение) уровня одного или нескольких (т.е. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66 или 67) кишечных микробов, выбранных из приведенной выше таблицы, у индивидуума относительно уровня соответствующих кишечных микробов у соответствующего нормального индивидуума указывает на то, что индивидуум имеет риск AD или имеет AD. В одном варианте осуществления изменение (например, повышение или снижение) уровня 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% кишечных микробов в профиле кишечных микробов, состоящем из кишечных микробов типа, класса, порядка, семейства, рода и вида, приведенных в таблице выше, у индивидуума относительно уровня соответствующих кишечных микробов у соответствующего нормального индивидуума указывает на то, что индивидуум имеет риск AD или имеет AD.

В некоторых вариантах осуществления изменение (например, повышение или снижение) уровня одного или нескольких (т.е. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66 или 67) кишечных микробов, выбранных из типа, класса, порядка, семейства, рода и вида из приведенной выше таблицы у индивидуума с AD до уровня соответствующих кишечных микробов у соответствующего нормального индивидуума относительно уровня соответствующих кишечных микробов у соответствующего нормального индивидуума указывает на то, что индивидуум получает надлежащее лечение. В одном варианте осуществления изменение (например, повышение или снижение) уровня 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% кишечных микробов в профиле кишечных микробов, состоящем из кишечных микробов типа, класса, порядка, семейства, рода и вида, приведенных в таблице выше, у индивидуума с AD до уровня соответствующих кишечных микробов у соответствующего нормального индивидуума относительно уровня соответствующих кишечных микробов у соответствующего нормального индивидуума указывает на то, что индивидуум получает надлежащее лечение.

Относительное содержание кишечных микробов можно изменять с использованием композиции или способа по настоящему изобретению следующим образом: введение композиции, содержащей соответствующую микробиоту или введение композиции, содержащей одно или несколько соединений, которые значительно повышают и/или снижают относительное содержание соответствующих кишечных микробов.

Bacteroidetes включают три основных класса бактерий: Bacteroidia, Flavobacteria и Sphingobacteria. Они распространены в окружающей среде, включая почву, ил, морскую воду и кишечник и кожу животных.

Proteobacteria являются наиболее крупным типом бактерий. Эти организмы демонстрируют чрезвычайно высокое метаболическое разнообразие и отражают медицинскую, промышленную и сельско-хозяйственную важность большинства известных бактерий. Это является важным с эволюционноной, геологической и экологической точки зрения. Все бактерии Proteobacteria являются грамотрицательными и их внешняя стенка состоит из липополисахарида. Многие из них имеют газовые везикулы, жгутики или могут передвигаться путем скольжения; они могут иметь стебельки, другие отростки или обладают способности формировать многоклеточные плодовые тела. Большинство являются факультативными или облигатно-анаэробными, аутотрофными и гетеротрофными, однако существуют исключения. Некоторые виды способны к фотосинтезу, другие запасают серу внутри или снаружи клетки.

Firmicutes являются типом в основном грамположительных бактерий. Однако некоторые имеют пористые псевдонаружные мембраны, которые делают их грамотрицательными. Ученые однажды классифицировали Firmicutes как включающих грамположительные бактерии, однако недавно определили их как основную группу с родственной формой, называемой формой с низким-G+C. Они в основном представляют собой округлые клетки, называемые кокками (единичные кокки), или являются палочковидными (бациллы). Многие Firmicutes продуцируют эндоспоры, которые являются устойчивыми к осушению и могут выжить в экстремальных условиях, что позволяет им выжить в различных условиях внешней среды.

Способ изменения микробиоты также может включать измерение относительного содержания одного или нескольких микроорганизмов кишечника в образце от индивидуума. В ходе секвенирования последнего поколения множество последовательностей определяют для каждого образца. После предварительной обработки используют алгоритмы кластеризации последовательностей для объединения последовательностей со сходством более 97% с получением OTU. Затем может быть получена таблица OTU_table, которая представляет собой матрицу, в которой указано сколько чтений содержит каждая OTU в каждом образце, т.е. каждый образец соответствует числу чтений последовательностей в каждой OTU. Относительное содержание соответствует 100% для каждого образца (каждый ряд), и вычисляют процент числа чтений в каждой OTU относительно числа всех чтений в образце. Таким образом, относительное содержание относится к относительному проценту числа последовательностей каждого микроорганизма в образце. Относительное содержание может быть обнаружено способом, описанным в настоящем описании, или способом, известным в данной области, который может использоваться для его детекции, таким как детекция гена 16S рРНК.

Относительное содержание кишечных микробов можно определять путем получения образцов от индивидуума. Образец может представлять собой слюну, фекалии и содержимое желудка, кишечника и/или прямой кишки; образцы тканей пищеварительного тракта (такие как ткань полости рта, пищевода, желудка, тонкой кишки, подвздошной кишки, слепой кишки, толстой кишки и/или прямой кишки); асцитную жидкость в желудочно-кишечных тканях; и любые другие образцы, которые могут использоваться индивидуумами, знакомыми с анализом микробиоты.

Относительное содержание одного или нескольких видов кишечных микроорганизмов можно сравнивать с нормальным относительным содержанием соответствующих кишечных микробов. Нормальное относительное содержание может представлять собой содержание у одного или нескольких индивидуумов сходного возраста, пола, расы и т.п. Нормальное относительное содержание может представлять собой содержание у здоровых индивидуумов сходного возраста, пола, расы и т.д., которые отвечали на или продемонстрировали благоприятные результаты лечения или терапевтического вмешательства. В конкретном варианте осуществления нормальное относительное содержание представляет собой относительное содержание кишечных микробов у здоровых индивидуумов.

Способы и композиции по изобретению могут вовлекать изменение относительного содержания одного или нескольких кишечных микробов. Иллюстративные варианты осуществления могут вовлекать способы или композиции для изменения относительного содержания кишечных микробов путем введения кишечных микробов индивидууму. В зависимости от желаемого результата (например, снижение уровня метаболитов, снижение лимфоцитарной инфильтрации в головном мозге, снижение активации микроглии, снижение нейровоспаления, улучшение когнитивной функции и облегчение симптомов болезни Альцгеймера) и конкретных индивидуумов, относительное содержание кишечных микробов можно регулировать на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99-100% или более, или на диапазон, состоящий из конечных точек вышеупомянутых величин или любых величин между ними, такой как от приблизительно 7% до приблизительно 28% и т.п., или приблизительно на 7%, 14%, 21%, 28% и т.п..; и/или можно обеспечивать относительное содержание кишечных микробов у индивидуума, близкое или достигающее относительное содержание соответствующих кишечных микробов у соответствующего нормального индивидуума.

Как описано в настоящем описании, настоящее изобретение направлено на регуляцию показателя, который отличается от соответствующего показателя у соответствующего нормального индивидуума, в направлении соответствующего показателя у соответствующего нормального индивидуума, так чтобы показатель после регуляции был близким или достигал соответствующего показателя у соответствующего нормального индивидуума. Эта регуляция применима к различным показателям, подлежащим регулированию или регулируемым, как описано в настоящем описании. Очевидно, является идеальным достижение соответствующего показателя у соответствующего нормального индивидуума, однако также является желательным приближение к соответствующему показателю у соответствующего нормального индивидуума. Таким образом, настоящее изобретение направлено на получение одного или нескольких показателей у индивидуума, у которого намереваются регулировать один или несколько показателей, чтобы они были близкими или достигли соответствующих показателей у соответствующих нормальных индивидуумов. Как используют в рамках изобретения, термин "близок к или достигает" означает, что различие между показателем до регуляции и соответствующим показателем у соответствующего нормального индивидуума снижается на величину, превышающую или равную приблизительно 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 100%, или на диапазон, состоящий из конечных точек вышеупомянутых величин или любых величин между ними, такой как от приблизительно 7% до приблизительно 28% и т.п. относительно различия после регуляции. Когда различие между показателем до регуляции и соответствующим показателем у соответствующего нормального индивидуума снижается приблизительно на 100% относительно различия после регуляции, регулируемый показатель достигает соответствующего показателя у соответствующего нормального индивидуума. Специалистам в данной области понятно, что конкретная величина различия зависит, например, от объекта регуляции, типа показателя, способа измерения и т.п.

Средство, способное регулировать один или несколько показателей у индивидуума, чтобы они были близкими или достигали соответствующих показателей у соответствующего нормального индивидуума, является терапевтически желательным. Выбор таких средств может быть основан, например, на средствах (таких как OM1), которые служат в качестве положительного контроля. Предпочтительно, выбирают тестируемое вещество, которое регулирует соответствующий показатель по существу сопоставимо со средством, используемым в качестве положительного контроля (например, OM1).

С другой стороны, один или несколько показателей индивидуума, у которого требуется регуляция одного или нескольких показателей, по существу сопоставимы с эталонным показателем (например, эталонный показатель для диагностики болезни Альцгеймера или идентификации чувствительных к углеводным лекарственным средствам пациентов у пациентов с болезнью Альцгеймера), который может указывать на то, что индивидуум имеет риск болезни Альцгеймера или имеет болезнь Альцгеймера.

Как используют в рамках изобретения, термин "по существу такой же" относится к стандартизации тестируемого показателя относительно эталонного показателя (т.е. эталонный показатель принимают за 100%), разность между тестируемым показателем и эталонным показателем является меньшей или равной приблизительно 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% или диапазону, состоящему из конечных точек вышеупомянутых величин или любых величин между ними, например, от приблизительно 7% до приблизительно 28%, и т.п., или приблизительно 7%, 14%, 21%, 28% и т.п. Специалистам в данной области понятно, что конкретная величина разности будет зависеть, например, от подлежащего регуляции объекта, типа показателя, способа измерения и т.п.

В некоторых вариантах осуществления средство для регуляции относительного содержания кишечных микробов включает комплекс кишечных микробов. В некоторых вариантах осуществления комплекс кишечных микробов включает микроорганизмы, происходящие из фекального материала или бактериальной библиотеки. В некоторых вариантах осуществления фекальный материал происходит из нормального индивидуума или пациента с болезнью Альцгеймера.

Определение бактериальной библиотеки: для получения информации о классификации видов, соответствующей каждой OTU, используют байесовский алгоритм классификации RDP для проведения таксономического анализа на уровне сходства 97% репрезентативных последовательностей OTU и состав сообщества для каждого образца подсчитывают на каждом уровне классификации (домен, царство, тип, класс, порядок, семейство, род, вид). Таксономическая сравнительная база данных видов, используемая для анализа 16S бактериальной флоры, представляет собой silva132/16S:silva132/16S (http://www.arb-silva.de).

Вовлеченные метаболиты

Автор изобретения обнаружил, что некоторые метаболиты кишечных микробов, такие как аминокислоты, вовлечены в ось головной мозг-кишечник при AD, исследованную в рамках настоящего изобретения. Эти аминокислоты могут представлять собой, например, одну или несколько, выбранных из следующей таблицы; предпочтительно одну или несколько, выбранных из фенилаланина, изолейцина, серотонина, гистидина и ацетилорнитина; более предпочтительно фенилаланина и/или изолейцина; наиболее предпочтительно фенилаланина.

4-OH пролин

Ацетилорнитин

Аланин

Альфа-аминоадипиновая кислота

Аспарагин

Аспарагиновая кислота

Асимметричный диметиларгинин

Бета-аланин

Карнозин

Цитруллин

Креатинин

ГАМК

Глутаминовая кислота

Глутамин

Глицин

Гистидин

Гипотаурин

Изолейцин

Кинуренин

Лейцин

Лизин

Метионин

Сульфоксид метионина

Орнитин

Фенилаланин

Пипеколиновая кислота

Пролин

Путресцин

Пироглутаминовая кислота

Серин

Серотонин

Таурин

Треонин

Триптофан

Тирозин

Валин

Авторы изобретения обнаружили, что различные аминокислоты вовлечены в ось головной мозг-кишечник в соответствии с настоящим изобретением. Как показано в примерах, между мышами WT и мышами TG уровни некоторых аминокислот были изменены и после введения, например, OM1, уровни этих аминокислот восстанавливались в направлении уровней у мышей WT. Такие аминокислоты составляют профиль аминокислот. Как упоминалось ранее, такой профиль может использоваться для диагностических и/или терапевтических целей. В некоторых вариантах осуществления изменение (например, повышение или снижение) уровня одной или нескольких (т.е. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 или 36) аминокислот, выбранных из приведенной выше таблицы, у индивидуума относительно уровня соответствующих аминокислот у соответствующего нормального индивидуума указывает на то, что индивидуум имеет риск AD или имеет AD. В одном варианте осуществления изменение (например, повышение или снижение) уровня 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% аминокислот в профиле аминокислот, состоящем из аминокислот в приведенной выше таблице, у индивидуума относительно уровня соответствующей аминокислоты у соответствующего нормального индивидуума указывает на то, что индивидуум имеет риск наличия AD или имеет AD.

В некоторых вариантах осуществления изменение (например, повышение или снижение) уровня одной или нескольких (т.е. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 или 36) аминокислот, выбранных из приведенной выше таблицы, у индивидуума, имеющего AD, относительно уровня соответствующей аминокислоты у соответствующего нормального индивидуума в направлении уровня соответствующей аминокислоты у соответствующего нормального индивидуума указывает на то, что индивидууму проводят надлежащее лечение. В одном варианте осуществления изменение (например, повышение или снижение) уровня 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% аминокислот в профиле аминокислот, состоящем из аминокислот в приведенной выше таблице, у индивидуума, имеющего AD, относительно уровня соответствующих аминокислот у соответствующего нормального индивидуума, в направлении уровня соответствующих аминокислот у соответствующего нормального индивидуума, указывает на то, что индивидууму проводят надлежащее лечение.

Авторы изобретения обнаружили, что уровень одной или нескольких аминокислот в приведенной выше таблице у индивидуума не соответствует соответствующему уровню аминокислот у соответствующего нормального индивидуума, что может быть обусловлено болезненным состоянием индивидуума. Когда уровень аминокислоты у индивидуума является более низким, чем соответствующий уровень аминокислоты у соответствующего нормального индивидуума, считают, что произошло повышение регуляции уровня аминокислоты. Когда уровень аминокислоты у индивидуума является более высоким, чем соответствующий уровень аминокислоты у соответствующего нормального индивидуума, считают, что произошло снижение регуляции уровня аминокислоты.

В некоторых вариантах осуществления уровень одной или нескольких аминокислот в приведенной выше таблице является более низким, чем соответствующий уровень аминокислоты у соответствующего нормального индивидуума. В некоторых вариантах осуществления уровень одной или нескольких аминокислот в приведенной выше таблице является более высоким, чем соответствующий уровень аминокислоты у соответствующего нормального индивидуума. В некоторых вариантах осуществления уровень одной или нескольких аминокислот в приведенной выше таблице является более низким, чем соответствующий уровень аминокислоты у соответствующего нормального индивидуума, в то время как уровень другой одной или нескольких аминокислот является более высоким, чем соответствующий уровень аминокислоты у соответствующего нормального индивидуума. Повышение регуляции или снижение регуляции может зависеть, например, от подлежащего регуляции объекта, типа показателя, способа измерения и т.п.

В некоторых вариантах осуществления уровень глутамина является более низким, чем соответствующий уровень этой аминокислоты у соответствующего нормального индивидуума. В некоторых вариантах осуществления уровень метионина является более низким, чем соответствующий уровень этой аминокислоты у соответствующего нормального индивидуума. В некоторых вариантах осуществления уровни как глутамина, так и метионина, являются более низкими, чем соответствующие уровни этих аминокислот у соответствующего нормального индивидуума.

В некоторых вариантах осуществления уровень глутамина является более высоким, чем соответствующий уровень этой аминокислоты у соответствующего нормального индивидуума. В некоторых вариантах осуществления уровень метионина является более высоким, чем соответствующий уровень этой аминокислоты у соответствующего нормального индивидуума. В некоторых вариантах осуществления уровни как глутамина, так и метионина, являются более высокими, чем соответствующие уровни этих аминокислот у соответствующего нормального индивидуума.

В некоторых вариантах осуществления уровень одной, двух, трех, четырех или пяти из фенилаланина, изолейцина, серотонина, гистидина и ацетилорнитина является более высоким, чем соответствующий уровень этих аминокислот у соответствующего нормального индивидуума. В некоторых вариантах осуществления уровень фенилаланина и/или изолейцина является более высоким, чем соответствующий уровень этих аминокислот у соответствующего нормального индивидуума. В некоторых вариантах осуществления уровень фенилаланина является более высоким, чем соответствующий уровень этой аминокислоты у соответствующего нормального индивидуума.

В некоторых вариантах осуществления уровни как глутамина, так и метионина, являются более низкими, чем соответствующие уровни этих аминокислот у соответствующего нормального индивидуума, в то время как уровень одного или нескольких из 4-OH пролина, ацетилорнитина, аланина, альфа-аминоадипата, аспарагина, аспарагиновой кислоты, асимметричного диметиларгинина, бета-аланина, карнозина, цитруллина, креатинина, ГАМК, глутаминовой кислоты, глицина, гистидина, гипотаурина, изолейцина, кинуренина, лейцина, лизина, сульфоксида метионина, орнитина, фенилаланина, пипеколиновой кислоты, пролина, путресцина, пироглутаминовой кислоты, серина, серотонина, таурина, треонина, триптофана, тирозина и валина является более высоким, чем соответствующий уровень этих аминокислот у соответствующего нормального индивидуума.

В некоторых вариантах осуществления уровень одного или нескольких из 4-OH пролина, ацетилорнитина, аланина, альфа-аминоадипата, аспарагина, аспарагиновой кислоты, асимметричного диметиларгинина, бета-аланина, карнозина, цитруллина, креатинина, ГАМК, глутаминовой кислоты, глутамина, глицина, гистидина, гипотаурина, изолейцина, кинуренина, лейцина, лизина, метионина, сульфоксида метионина, орнитина, фенилаланина, пипеколиновой кислоты, пролина, путресцина, пироглутаминовой кислоты, серина, серотонина, таурина, треонина, триптофана, тирозина и валина является более высоким, чем соответствующий уровень этих аминокислот у соответствующего нормального индивидуума.

В некоторых вариантах осуществления уровень одной или нескольких аминокислот из приведенной выше таблицы повышается. В некоторых вариантах осуществления уровень одной или нескольких аминокислот из приведенной выше таблицы снижается. В некоторых вариантах осуществления уровень одной или нескольких аминокислот из приведенной выше таблицы повышается, в то время как уровень другой одной или нескольких аминокислот снижается. В некоторых случаях повышение или снижение уровня может зависеть, например, под подвергаемого регуляции объекта, типа показателя, способа измерения и т.п.

В некоторых вариантах осуществления уровень глутамина повышается. В некоторых вариантах осуществления уровень метионина повышается. В некоторых вариантах осуществления уровень как глутамина, так и метионина повышается.

В некоторых вариантах осуществления уровень глутамина снижается. В некоторых вариантах осуществления уровень метионина снижается. В некоторых вариантах осуществления уровень как глутамина, так и метионина, снижается.

В некоторых вариантах осуществления уровень одной, двух, трех, четырех или пяти из фенилаланина, изолейцина, серотонина, гистидина и ацетилорнитина снижается. В некоторых вариантах осуществления уровень фенилаланина и/или изолейцина снижается. В некоторых вариантах осуществления уровень фенилаланина снижается.

В некоторых вариантах осуществления уровень как глутамина, так и метионина, повышается, в то время как уровень одного или нескольких их 4-OH пролина, ацетилорнитина, аланина, альфа-аминоадипата, аспарагина, аспарагиновой кислоты, асимметричного диметиларгинина, бета-аланина, карнозина, цитруллина, креатинина, ГАМК, глутаминовой кислоты, глицина, гистидина, гипотаурина, изолейцина, кинуренина, лейцина, лизина, сульфоксида метионина, орнитина, фенилаланина, пипеколиновой кислоты, пролина, путресцина, пироглутаминовой кислоты, серина, серотонина, таурина, треонина, триптофана, тирозина и валина снижается.

В некоторых вариантах осуществления уровень одного или нескольких из 4-OH пролина, ацетилорнитина, аланина, альфа-аминоадипата, аспарагина, аспарагиновой кислоты, асимметричного диметиларгинина, бета-аланина, карнозина, цитруллина, креатинина, ГАМК, глутаминовой кислоты, глутамина, глицина, гистидина, гипотаурина, изолейцина, кинуренина, лейцина, лизина, метионина, сульфоксида метионина, орнитина, фенилаланина, пипеколиновой кислоты, пролина, путресцина, пироглутаминовой кислоты, серина, серотонина, таурина, треонина, триптофана, тирозина и валина снижается. Автор изобретения обнаружил, что иммунные клетки, такие как наивные T-клетки или недифференцированные T-клетки, захватывают аминокислоты (как иллюстрируется фенилаланином и изолейцином) в некоторых случаях, и, например, дифференцируются в определенные типы T-клеток, такие как Th1-клетки, посредством определенных переносчиков, таких как SLC7A5 в качестве примера. Авторы изобретения обнаружил, что предотвращение дифференцировки в Th1-клеки, которое приводит к состоянию доминирования Th1, различными способами может лечить обусловленные доминированием Th1 заболевания. Такие меры включают, но не ограничиваются ими, снижение уровня соответствующих аминокислот, предупреждение захвата иммунными клетками соответствующих аминокислот и т.п.

SLC7A5 называют переносчиком 1 аминокислот L-типа (LAT1), и он принадлежит суперсемейству APC. Он образует гетеродимерный переносчик аминокислот, который взаимодействует с гликопротеином CD98 (SLC3A2), через консервативные дисульфидные связи. CD98 (4F2hc, SLC3A2) является гликопротеином типа II, который выступает в качестве белка-шаперона для LAT1, стабилизирующего и способствующего его перемещению на плазматическую мембрану. Этот комплекс отвечает за захват незаменимых аминокислот в ключевых областях организма, таких как плацента и гематоэнцефалический барьер. Субстрат включает серию крупных нейтральных аминокислот, таких как тирозин, лейцин, изолейцин, валин и фенилаланин, а также лекарственных средств, включающих L-DOPA и габапентин.

Различные агенты (такие как ферменты) можно использовать для деградации аминокислот для снижения уровня соответствующих аминокислот, тем самым уменьшая дифференцировку наивных T-клеток в Th1-клетки. Ферменты, представленные в таблице ниже, можно использовать для деградации соответствующих аминокислот, таких как фенилаланин и изолейцин. Представленные ферменты можно доставлять в соответствующие области у индивидуума различными способами, например, в кишечник или периферический кровоток (такой как периферическая кровь), для деградации аминокислот. Например, фермент можно доставлять в соответствующую область путем доставки микроорганизма (например, Escherichia coli), экспрессирующего фермент, в соответствующую область для экспрессии фермента в соответствующей области. Микроорганизм может экспрессировать один или несколько из указанных ферментов. Специалистам в данной понятно, что для доставки фермента может использоваться любой микроорганизм, который может быть доставлен в соответствующую область различными путями (например, пероральный) без утраты способности экспрессировать фермент в соответствующей области. Например, Escherichia coli, модифицированные способами инженерии для экспрессии фермента для деградации фенилаланина, использовали в качестве деградирующей фенилаланин бактерии, которую перорально вводили мышам для снижения содержания фенилаланина у мышей (как показано путем определения содержания фенилаланина в фекалиях) и снижения доли Th1-клеток (как показано путем детекции доли Th1-клеток в периферической крови).

Ферменты, которые могут быть использованы для деградации фенилаланина

	Конвертируемые продукты	Метаболичские ферменты
1	Тирозин	Фенилаланин-4-гидроксилаза, PAH，предпочтительный
2	2-фенилацетамид	Фенилаланин-2-монооксигеназа, PAO
		Каталаза-пероксидаза, katG
3	Фенилацетальдегид	Фенилацетальдегидсинтаза, PAAS
4	Фенилэтиламин	Декарбоксилаза ароматических L-аминокислот/L-триптофана, DDC，Предпочтительный
		Фенилаланиндекарбоксилаза, AADC
5	N-ацетил-L-фенилаланин	Фенилаланин-N-ацетилтрансфераза
6	Фенилпируват	Аспартатаминотрансфераза, AST，предпочтительный
		Тирозинаминотрансфераза, TAT，предпочтительный
		Оксидаза L-аминокислот, IL4I1，предпочтительный
		Фенилаланиндегидрогеназа
		Трансаминаза ароматических аминокислот
		Гистидинол-фосфат-аминотрансфераза
		Аминотрансфераза II ароматических аминокислот, AR09
7	D-фенилаланин	Фенилаланинрацемаза
8	Транс-циннамат	Фенилаланин-аммиак-лиаза, PAL
		Фенилаланин/тирозин-аммиак-лиаза, PTAL

Ферменты, которые можно использовать для деградации изолейцина

	Конвертируемые продукты	Метаболические ферменты
1	(S)-3-метил-2-оксопентаноат	Аминотрансфераза аминокислот с разветвленной цепью
		Оксидаза L-аминокислот, IL4I1

Ингибиторы переносчиков можно использовать для предотвращения захвата иммунными клетками соответствующих аминокислот посредством ингибирования захвата наивными T-клетками соответствующей аминокислоты путем ингибирования переносчика (например, общий переносчик SLC7A5 для фенилаланина и изолейцина), тем самым снижая дифференцировку наивных T-клеток в Th1-клетки. Ингибиторы, которые могут использоваться для ингибирования переносчика SLC7A5, включают, но не ограничиваются ими, JPH 203, BCH и KMH-233, известные в данной области. Например, как показано в примере 4, введение ингибитора SLC7A5 JPH 203 мышам значительно снижает долю Th1-клеток в головном мозге мыши.

JPH203 представляет собой химически синтезированное низкомолекулярное соединение, доступное от J-Pharma of Japan (http://www.j-pharma.com/b3_e.html), которое селективно ингибирует LAT1, с номером CAS 1037592-40-7 (https: //www.medkoo.com/products/9544).

BCH представляет собой известный ингибитор LAT1 с номером CAS 20448-79-7 (https://www.tocris.com/cn/products/bch_5027).

KMH-233 представляет собой известный ингибитор LAT1 с номером CAS 1941174-13-5 (https://www.medkoo.com/products/9545).

Специалистам в данной области понятно, что способы, которые можно использовать для предотвращения дифференцировки наивных T-клеток в Th1-клетки, не ограничиваются этим. Любые способы, которые могут использоваться для предотвращения влияния кишечных микробов и/или их метаболитов на дифференцировку наивных T-клеток в Th1-клетки, можно использовать для снижения доли Th1, и облегчения или обращения вспять Th1-доминантного состояния, как описано в настоящем описании.

Авторы изобретения обнаружили, что различные цитокины вовлечены в ось головной мозг-кишечник в соответствии с настоящим изобретением. Как показано в примерах, между мышами WT и мышами TG уровни некоторых цитокинов изменялись и после введения, например, OM1, уровни этих цитокинов восстанавливались до уровней у мышей WT. Такие цитокины составляют профиль цитокинов. Как упоминалось ранее, такой профиль может использоваться для диагностических и/или терапевтических целей.

В некоторых вариантах осуществления изменение (например, повышение или снижение) уровня одного или нескольких (т.е. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 или 31) цитокинов, выбранных из следующих: OPG, резистин, TARC, VEGF, хемерин, IL-9, MMP-2, VEGF-D, TCA-3, gp130, MMP-10, 6Ckine, VEGF-B, IL-22, IL-1a, IFNg R1, гранзим B, LIX, CT-1, CD27L, эндоглин, TRANCE, MCSF, 4-1BB, лептин R, CD36, TremL 1, VEGF R2, TGFb1, IL-3 Rb, H60 у индивидуума относительно уровня соответствующего цитокина у соответствующего нормального индивидуума указывает на то, что индивидуум имеет риск AD или имеет AD. В одном варианте осуществления изменение (например, повышение или снижение) уровня 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% цитокинов в профиле цитокинов, состоящем из цитокинов, выбранных из следующих: OPG, резистин, TARC, VEGF, хемерин, IL-9, MMP-2, VEGF-D, TCA-3, gp130, MMP-10, 6Ckine, VEGF-B, IL-22, IL-1a, IFNg R1, гранзим B, LIX, CT-1, CD27L, эндоглин, TRANCE, MCSF, 4-1BB, лептин R, CD36, TremL 1, VEGF R2, TGFb1, IL-3 Rb, H60 у индивидуума относительно уровня соответствующего цитокина у соответствующего нормального индивидуума указывает на то, что индивидуум имеет риск AD или имеет AD.

В некоторых вариантах осуществления изменение (например, повышение или снижение) уровня одного или нескольких (т.е. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 или 31) цитокинов, выбранных из следующих: OPG, резистин, TARC, VEGF, хемерин, IL-9, MMP-2, VEGF-D, TCA-3, gp130, MMP-10, 6Ckine, VEGF-B, IL-22, IL-1a, IFNg R1, гранзим B, LIX, CT-1, CD27L, эндоглин, TRANCE, MCSF, 4-1BB, лептин R, CD36, TremL 1, VEGF R2, TGFb1, IL-3 Rb, H60 у индивидуума с AD до уровня соответствующих цитокинов у соответствующего нормального индивидуума относительно уровня соответствующих цитокинов у соответствующего нормального индивидуума указывает на то, что индивидууму проводят надлежащее лечение. В одном варианте осуществления изменение (например, повышение или снижение) уровня 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% цитокинов в профиле кишечных микробов, состоящем из цитокинов, выбранных из следующих: OPG, резистин, TARC, VEGF, хемерин, IL-9, MMP-2, VEGF-D, TCA-3, gp130, MMP-10, 6Ckine, VEGF-B, IL-22, IL-1a, IFNg R1, гранзим B, LIX, CT-1, CD27L, эндоглин, TRANCE, MCSF, 4-1BB, лептин R, CD36, TremL 1, VEGF R2, TGFb1, IL-3 Rb, H60 у индивидуума с AD до уровня соответствующих кишечных микробов у соответствующего нормального индивидуума указывает на то, что индивидууму проводят надлежащее лечение.

Настоящее изобретение относится к композиции, которая может прямо или непрямо изменять относительное содержание кишечных микробов до заданного уровня (такого как терапевтический уровень) в течение заданного периода времени (например, до применения следующей дозы). Заданный уровень может быть получен путем измерения относительного содержания микробиоты, которое привело к терапевтическому ответу (например, снижение уровней метаболитов, снижение инфильтрации лимфоцитов в головной мозг, снижение активации микроглии, снижение нейровоспаления, улучшение познавательных способностей, облегчение симптомов болезни Альцгеймера).

В некоторых вариантах осуществления способа, средство или композиция по настоящему изобретению могут содержать достаточно очищенные или обогащенные кишечные микробы, так что средство или композиция может содержать по меньшей мере приблизительно 5 масс.%, 10 масс.%, 20 масс.%, 30 масс.%, 40 масс.%, 50 масс.%, 60 масс.%, 70 масс.%, 80 масс.%, 85 масс.%, 90 масс.%, 95 масс.%, 99 масс.% или более желаемых кишечных микробов в расчете на массу средства или композиции, и/или менее чем приблизительно 40 масс.%, 30 масс.%, 20 масс.%, 15 масс.%, 14 масс.%, 13 масс.%, 12 масс.%, 11 масс.%, 10 масс.%, 9 масс.%, 8 масс.%, 7 масс.%, 6 масс.%, 5 масс.%, 4 масс.%, 3 масс.%, 2 масс.%, 1 масс.% или менее нежелательных кишечных микробов в расчете на массу средства или композиции.

Средства и композиции, которые регулируют относительное содержание кишечных микробов в соответствии с настоящим изобретением, могут приводить к изменению метаболических функций. Например, измененная метаболическая функция может включать регуляцию уровня аминокислот среди микробных метаболитов.

В некоторых вариантах осуществления при проведении детекции в образце периферической крови индивидуума, способы, средства и композиции по настоящему изобретению могут регулировать уровень аминокислот приблизительно на 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295, 300 мкМ или более, или на диапазон, определяемый конечными точками из вышеупомянутых величин, или на любую величину между ними; и/или делать уровень аминокислот близким к или достигать соответствующего уровня аминокислот у соответствующего нормального индивидуума.

В некоторых вариантах осуществления при проведении детекции в образце фекалий индивидуума, способы, средства и композиции по настоящему изобретению могут регулировать уровень аминокислот приблизительно на 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900, 3000 мкмоль/г мкМ или более, или на диапазон, определяемый конечными точками из вышеупомянутых величин, или на любую величину между ними; и/или делать уровень аминокислот близким к или достигать соответствующего уровня аминокислот у соответствующего нормального индивидуума.

В некоторых вариантах осуществления способы, средства и композиции по настоящему изобретению могут вызывать измененную инфильтрацию иммунными клетками головного мозга. Например, доля провоспалительных Th1-клеток среди CD4+ T-клеток снижается. В некоторых вариантах осуществления средства и композиции по настоящему изобретению могут снижать долю провоспалительных Th1-клеток относительно CD4+ T-клеток в образце индивидуума приблизительно на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% или более; и/или делать долю провоспалительных Th1-клеток относительно CD4+ T-клеток близкой или достигающей доли соответствующих провоспалительных Th1-клеток относительно CD4+ T-клеток у соответствующего нормального индивидуума.

В некоторых вариантах осуществления способы, средства и композиции по настоящему изобретению могут снижать относительный захват аминокислот наивными T-клетками. В некоторых вариантах осуществления средства и композиции по настоящему изобретению могут снижать относительный захват аминокислот наивными T-клетками приблизительно на 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295, 300 или более; и/или делать относительный уровень захвата аминокислот наивными T-клетками близким или достигающим относительный уровень захвата аминокислот соответствующими наивными T-клетками у соответствующего нормального индивидуума.

В некоторых вариантах осуществления способы, средства и композиции по настоящему изобретению могут приводить к измененной активации микроглии в головном мозге. Например, измененная активация микроглии в головном мозге может включать повышение или снижение активации микроглии в головном мозге. Активация микроглии в головном мозге может повышаться или снижаться приблизительно на 1-100%, например, приблизительно на 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% , 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99% или 100%, или на любой диапазон, определяемый конечными точками из вышеупомянутых величин, или на любую величину между ними например, на от приблизительно 7% до приблизительно 28% и т.п., или приблизительно на 7%, 14%, 21%, 28% и т.п.

В некоторых вариантах осуществления способы, средства и композиции по изобретению могут приводить к измененным уровням IBA1. Например, изменение уровня IBA1 может включать повышение или снижение уровня IBA1. Уровень IBA1 может быть повышен или снижен на от приблизительно 0 до приблизительно 3000 относительных уровней, например, на относительный уровень, составляющий приблизительно 0, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550, 1600, 1650, 1700, 1750, 1800, 1850, 1900, 1950, 2000, 2050, 2100, 2150, 2200, 2250, 2300, 2350, 2400, 2450, 2500, 2550, 2600, 2650, 2700, 2750, 2800, 2850, 2900, 2950, 3000 относительных уровней, или на диапазон, определяемый конечными точками из вышеупомянутых величин, или на любую величину между ними, например, на от приблизительно 500 до приблизительно 3000, или приблизительно на 500, 1000, 1500 и т.п.

Составы

Средство или фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может содержать кишечные микробы, которые могут регулировать относительное содержание кишечных микробов у индивидуума. Кишечные микробы могут быть жизнеспособными (живыми), покоящимися, неактивными или погибшими бактериями. Средство или фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может содержать соединение или средство, которые могут регулировать относительное содержание кишечных микробов у индивидуума. Для изменения микробиоты у индивидуума можно использовать одно или несколько соединений. Такие соединения или средства могут включать, но не ограничиваться ими, антибиотики и/или антибактериальные средства, пребиотики, такие как компоненты клеточной стенки бактерий, бактериальные нуклеиновые кислоты (такие как ДНК и РНК), компоненты бактериальных мембран и структурные компоненты бактерий (такие как белки, углеводы, липиды и их комбинации, такие как липопротеины, сложные эфиры сахаров и гликопротеины), органические кислоты, неорганические кислоты, щелочи, белки и пептиды, ферменты и коферменты, аминокислоты и нуклеиновые кислоты, сахара, липиды, гликопротеины, липопротеины, сложные эфиры сахаров, витамины, биологически активные соединения, метаболиты, содержащие неорганические компоненты, низкомолекулярные соединения, такие как азотсодержащие молекулы или содержащие сернистую кислоту молекулы, стойкий крахмал, картофельный крахмал или крахмал с высоким содержанием амилозы, модифицированный крахмал (в том числе карбоксилированный крахмал, ацетилированный крахмал, пропионированный крахмал и бутилированный крахмал), не усваиваемые олигосахариды, такие как фруктоолигосахарид, олигодекстроза, ксилоолигосахарид, галактоолигосахарид, арабиноксилан, арабиногалактан, полисахариды галактоманнана, полидекстроза, олигофруктоза, инулин и их производные, однако другие олигосахариды, другие растворимые волокна и их комбинация, которые могут играть пребиотическую роль, не исключены. Сахар может быть выбран из моносахаридов, дисахаридов, олигосахаридов, полисахаридов или их производных, их комбинации и/или их производных; предпочтительно олигосахаридов и полисахаридов; более предпочтительно олигосахариды маннуроновой кислоты.

Средство или фармацевтическая композиция по настоящему изобретению также могут включать, например, аминокислоты, аминосахара, спирты сахаров, белки, углеводы, моносахариды, дисахариды, олигосахариды, полисахариды, нуклеиновые кислоты, буферы, поверхностно-активные вещества, липиды, липосомы, другие эксципиенты и их смеси. Другие пригодные ингредиенты могут включать стероиды, противовоспалительные средства, нестероидные противовоспалительные средства, болеутоляющие средства, клетки, противовоспалительные средства, факторы роста, фрагменты факторов роста, низкомолекулярные стимуляторы заживления ран, гормоны, цитокины, пептиды, антитела, ферменты, выделенные клетки, тромбоциты, иммунодепрессанты, нуклеиновые кислоты, типы клеток, вирусы, вирусные частицы, незаменимые питательные вещества, минералы, металлы или витамины, и их комбинацию. Кроме того, средства и композиции по настоящему изобретению могут включать разбавители, такие как вода, солевой раствор или буфер.

Средство или фармацевтическая композиция по настоящему изобретению могут быть составлены в качестве фармацевтической композиции, включающей фармацевтически приемлемый носитель. Как используют в рамках изобретения, "фармацевтически приемлемый носитель" включает любые и все физиологически совместимые растворители, диспергаторы, покрытия, антибактериальные и противогрибковые средства, обеспечивающие изотоничность и замедляющие всасывание средства и т.п. В одном варианте осуществления средство или фармацевтическая композиция по изобретению могут быть включены в фармацевтическую композицию, пригодную для доставки индивидууму. Фармацевтическая композиция также может включать фармацевтически приемлемый носитель. Как используют в рамках изобретения, "фармацевтически приемлемый носитель" включает любые и все физиологически совместимые растворители, дисперсионные среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые средства, обеспечивающие изотоничность и замедляющие всасывание средства и т.п. Примеры фармацевтически приемлемых носителей включают один или несколько из следующих: вода, солевой раствор, фосфатно-солевой буфер, глюкоза, глицерин, этанол и т.д., и их комбинацию. Во многих случаях предпочтительно включать в композиции обеспечивающие изотоничность средства, такие как сахара, многоатомные спирты, такие как маннит, сорбит или хлорид натрия.

Фармацевтическая композиция может быть составлена в различных формах. Они включают, например, жидкие, полутвердые и твердые формы препарата, такие как жидкие растворы (такие как инъекционные и инфузионные растворы), дисперсии или суспензии, таблетки, пилюли, порошки, липосомы, суппозитории и другие составы. Фармацевтическая композиция может быть составлена для высокой концентрации лекарственного средства. Фармацевтическая композиция, кроме того, может быть стерильной и стабильной в условиях производства и хранения. Стерильные инъекционные растворы можно получать путем включения в них одного из ингредиентов, перечисленных выше, или их комбинации (при необходимости) в подходящем растворителе в требуемом количестве с последующей фильтрацией и стерилизацией.

Иллюстративная форма фармацевтической композиции может зависеть от предполагаемого способа доставки и терапевтического применения. В одном варианте осуществления фармацевтическую композицию составляют для пероральной доставки. Некоторые композиции могут быть в форме доставки на основе пилюль (как описано в патентной заявке США № 12/976648 под названием "pill catchers", поданной 22 октября 2010 года) и иметь пролонгированное высвобождение. В одном варианте осуществления доставка на основе пилюль может быть частью системы, которая позволяет доставку в конкретное положение в кишечном тракте. В другом варианте осуществления фармацевтическая композиция может быть составлена в качестве состава с замедленным высвобождением. В другом варианте осуществления фармацевтическая композиция может быть заключена в покрытие, которое не начинает деградировать до тех пор, пока не покинет желудок. В другом варианте осуществления фармацевтическая композиция может быть получена с носителем, который защищает композицию от быстрого высвобождения, например, в случае состава с замедленным или контролируемым высвобождением, включая имплантаты, трансдермальные пластыри и микроинкапсулированные системы доставки. Можно использовать биодеградируемые биосовместимые полимеры, такие как этиленвинилацетат, полиангидриды, полигликолевая кислота, коллаген, сложные полиортоэфиры и полимолочная кислота. Для многих способов получения таких составов были выданы права на патент, или они хорошо известны специалистам в данной области. См., например, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978. "Замедленное высвобождение" относится к высвобождению композиции или ее активного соединения на протяжении пролонгированного периода времени относительно высвобождения, достигаемого посредством доставки общепринятого состава композиции.

Другой тип фармацевтической композиции включает активируемую форму, как например, составление композиции с микробиотой в покоящемся или неактивном состоянии (например, в лиофилизированном состоянии). В комбинированной композиции микробиота может присутствовать в покоящемся или неактивном состоянии, или соединение или агент, в котором культивируется микробиота, может быть неактивным. В одном иллюстративном варианте осуществления фармацевтическая композиция может быть составлена так, чтобы включать по меньшей мере один тип покоящейся или неактивной микробиоты и неактивное соединение или вещество, которое культивирует микробиоту.

Описанные фармацевтические композиции и комбинированные фармацевтические композиции также могут быть составлены в форме продуктов питания, напитков, пищевых добавок и/или дополнительных веществ. Такие композиции представляют собой композиции, пригодные для употребления человеком и/или животным. Специалистам в данной области могут быть хорошо известны конкретные составы микробиоты, которые могут использоваться в пероральных или принимаемых внутрь составах, и они считаются пригодными для введения человеку и/или животному. Множество композиций используется для производства пищи или пищевых добавок/дополнительных веществ; таким образом, другим важным аспектом является предоставление человеку или животному продуктов питания или пищевых добавок/дополнительных веществ, включающих микробиоту, для регуляции кишечных микробов у индивидуума.

Пригодная для употребления композиция может быть составлена так, чтобы она включала подсластители, стабилизаторы или связующие вещества, увлажнители и/или натуральные и/или искусственные вкусовые добавки. Композиция также может включать натуральные и/или искусственные красители и консерванты. В одном варианте осуществления композиция может включать моносахариды, дисахариды и полисахариды, такие как, но не ограничиваясь ими, сахароза (сахар), декстроза, мальтоза, декстрин, ксилоза, рибоза, глюкоза, манноза, галактоза, сукромальт, фруктоза (левоза), инвертированный сахар, кукурузный сироп, мальтодекстрин, олигофруктозный сироп, частично гидролизованный крахмал, сухая кукурузная патока, полидекстроза, растворимое волокно, нерастворимое волокно, натуральный сок сахарного тростника, желатин, лимонная кислота, молочная кислота, натуральные красители, натуральные вкусовые добавки, фракционированное кокосовое масло, карнаубский воск или их комбинация.

Дозировка

Средство или композиция по настоящему изобретению может содержать "терапевтически эффективное количество" или "эффективное количество" ингредиентов. "Терапевтически эффективное количество" относится к количеству, которое является эффективным для достижения желаемого терапевтического результата в требуемой дозе и в течение некоторого периода времени. Терапевтически эффективное количество средства или фармацевтической композиции может варьировать в зависимости от различных факторов, таких как болезненное состояние индивидуума, возраст, пол и состояние головного мозга, и способность композиции вызывать желаемый ответ у индивидуума. Терапевтически эффективное количество также представляет собой количество, в котором терапевтически благоприятные эффекты средства или фармацевтической композиции превышают токсические или вредоносные эффекты средства или фармацевтической композиции. В иллюстративном варианте осуществления терапевтически эффективное количество средства или фармацевтической композиции представляет собой количество, в котором относительное содержание одного или нескольких кишечных микробов возрастает. Например, терапевтически эффективное количество средства для регуляции относительного содержания кишечных микробов повышает относительное содержание одного или нескольких кишечных микробов у индивидуума.

Как используют в рамках изобретения, термин "лечение", главным образом, относится к достижению желаемого фармакологического и/или физиологического эффекта. Эффект может быть профилактическим с точки зрения полного или частичного предупреждения заболевания или его симптомов; и/или он может быть терапевтическим с точки зрения частичной или полной стабилизации или лечения заболевания и/или побочных эффектов заболевания. "Лечение", как используют в рамках изобретения, охватывает любое лечение заболевания пациента, включая: (a) предупреждение заболеваний или симптомов, которые возникают у пациентов, которые являются предрасположенными к заболеваниям или симптомам, но у которых еще не диагностировано заболевание; (b) ингибирование симптомов заболевания, например, ингибирование прогрессирования заболевания и предупреждение развития заболевания; или (c) облегчение симптомов заболевания, т.е. обеспечение угасания заболевания или симптомов.

Показания

Путем исследования в рамках настоящего изобретения авторы изобретения обнаружили, что аномальный кишечный микробный паттерн вызывал сверхдифференцировку наивных T-клеток в Th1-клетки, и уровень Th1-клеток в периферической крови возрастал аномальным образом. Повышенные уровни периферических Th1-клеток вызывают инфильтрацию большего количества Th1-клеток в головной мозг, вызывая заболевания, такие как болезнь Альцгеймера. Путем восстановления кишечной микробиоты, дифференцировка наивных T-клеток в Th1-клетки может быть снижена, и аномально повышенный уровень Th1-клеток в периферической крови может быть снижен, тем самым осуществляя лечение заболевания. Таким образом, настоящее изобретение относится к способу лечения заболеваний, связанных с высокими уровнями Th1-клеток в периферической крови у индивидуума, причем способ включает регуляцию относительного содержания кишечных микробов у индивидуума, как описано в настоящем описании, снижение уровня аминокислот в периферической крови, как описано в настоящем описании, или ингибирование захвата наивными T-клетками аминокислоты в периферической крови, как описано в настоящем описании.

Термины "доминантность Th1" и "доминантность клеток Th1" используют в настоящем описании взаимозаменяемо. В некоторых случаях, доминантность Th1 может быть представлена высокими уровнями Th1-клеток в периферической крови. Высокий уровень Th1-клеток в периферической крови может относиться к уровню Th1-клеток в периферической крови индивидуума, на 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 150%, 200%, 250%, 300%, 350%, 400%, 450%, 500%, 550%, 600%, 650%, 700%, 750%, 800%, 850%, 900%, 950%, 1000% или превышающему уровень у подходящего контроля (например, нормальный контроль, такой как выборка здоровых людей), или на диапазон, определяемый конечными точками из вышеупомянутых величин, или на любую величину между ними, например, на от приблизительно 7% до приблизительно 28% и т.п., или на приблизительно 7%, 14%, 21%, 28% и т.п. Такие заболевания включают, но не ограничиваются ими, рассеянный склероз, болезнь Крона, диабет 1 типа, ревматоидный артрит, тиреоидит Хашимото, витилиго, синдром Шегрена, поликистоз яичника (PCOS), целиакию и болезнь Грэйвса.

Как используют в рамках изобретения, термин "индивидуум" относится к любому живому организму, включая, но не ограничиваясь ими, людей, не являющихся человеком приматов, таких как шимпанзе и другие человекообразные обезьяны и мартышки, сельскохозяйственных животных, таких как коровы, овцы, свиньи, козы и лошади, домашние млекопитающие, такие как собаки и кошки, лабораторные животные, включая грызунов, таких как мыши, крысы, кролики, морские свинки и т.п. Термин не указывает на конкретный возраст и пол. В одном варианте осуществления индивидуумом является человек. В контексте настоящего изобретения термины "субъект", "индивидуум" и "пациент" используются взаимозаменяемо.

В одном варианте осуществления относительное содержание одного или нескольких кишечных микроорганизмов у индивидуума превышает их относительное содержание у здорового индивидуума. В одном варианте осуществления относительное содержание одного или нескольких кишечных микроорганизмов у индивидуума является более низким, чем у здорового индивидуума. В одном варианте осуществления относительное содержание одного или нескольких кишечных микроорганизмов у индивидуума превышает их относительно содержание у здорового индивидуума, и относительное содержание другого одного или нескольких микроорганизмов является более низким, чем у здорового индивидуума.

Дозировка может зависеть от типа микробиоты, присутствующей в средстве или фармацевтической композиции по изобретению. Дозировка также может быть определена на основе относительного содержания одного или нескольких типов микробиоты, присутствующих у индивидуума.

В одном варианте осуществления средство или фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может эффективно изменять относительное содержание одного или нескольких типов микробиоты. В другом варианте осуществления средство или фармацевтическая композиция может эффективно повышать или снижать относительное содержание микробиоты у индивидуума. В одном варианте осуществления средство или фармацевтическая композиция может повышать или снижать относительное содержание конкретных микроорганизмов микробиоты у индивидуума и снижать относительное содержание других конкретных микроорганизмов микробиоты у индивидуума.

В другом варианте осуществления средство или фармацевтическая композиция по настоящему изобретению также может эффективно изменять микробиоту у индивидуума, так что после введения средства или фармацевтической композиции микробиота у индивидуума имитирует микробиоту, присутствующую у индивидуума, отвечающего на процесс лечения болезни Альцгеймера. Средство или фармацевтическая композиция может эффективно изменять микробиоту для имитации микробиоты у нормальных и здоровых индивидуумов со сходным состоянием головного мозга, возрастом, полом, расой и т.п.

Режим дозирования можно корректировать для обеспечения наиболее подходящего желаемого ответа (такого как терапевтический ответ или профилактический ответ). Например, можно доставлять однократный болюс, можно доставлять множество разделенных доз с течением времени или дозу можно снижать или повышать пропорционально необходимости ситуации лечения. Особенно преимущественным является составление парентеральных композиций в виде единичной дозированной формы для облегчения доставки и единообразия дозировок. Единичная дозированная форма, как используют в рамках изобретения, относится к физически дискретной единице, пригодной в качестве однократной дозы для млекопитающего, подвергаемого лечению; каждая единица содержит заданное количество активного соединения, вычисленное для достижения желаемого терапевтического эффекта, в комбинации с требуемым фармацевтическим носителем. Характеристики единичной дозированной формы, используемой в рамках настоящего изобретения, определяются или прямо зависят от следующих: (a) уникальные свойства активного соединения и конкретного терапевтического или профилактического эффекта, подлежащего достижению; и (b) ограничения, присущие области комбинирования этого активного соединения для индивидуальной терапии.

При применении для способов, предусматриваемых в рамках настоящего изобретения, иллюстративный диапазон дозировок для средства или фармацевтической композиции по настоящему изобретению может составлять от приблизительно 0,001 до приблизительно 100 мг/кг массы тела в сутки, от приблизительно 0,01 до приблизительно 50 мг/кг массы тела в сутки, как например, от приблизительно 0,05 до приблизительно 10 мг/кг массы тела в сутки, доставляемые за одну или несколько доз, например, 1-3 дозы. Точная дозировка зависит от частоты и способа доставки, пола, возраста, массы тела и общего состояния индивидуума, подвергаемого лечения, природы и тяжести состояния, подвергаемого лечению, любых сопутствующих заболеваний, которые будут подвергаться лечению, и других факторов, известных специалистам в данной области.

В одном варианте осуществления средство или фармацевтическая композиция по настоящему изобретению содержит микробиоту, такую как Verrucomicrobia, имеющую общую концентрацию в диапазоне от приблизительно 0,001 мг/кг до приблизительно 100 мг/кг. В другом варианте осуществления средство или фармацевтическая композиция содержит микробиоту, такую как Verrucomicrobia, имеющую общую концентрацию в диапазоне от приблизительно 0,1 мг/кг до приблизительно 50 мг/кг. В следующем варианте осуществления средство или фармацевтическая композиция содержит микробиоту, такую как Verrucomicrobia, имеющую общую концентрацию в диапазоне от приблизительно 1 мг/кг до приблизительно 10 мг/кг.

В некоторых аспектах средства, композиции или наборы, описанные в настоящем описании, вводят в дозах в расчете на массу тела индивидуума. В некоторых вариантах осуществления средства, композиции или наборы, описанные в настоящем описании, содержат одно или несколько средств, упоминаемых в настоящем описании, в количестве в расчете на массу тела индивидуума.

В некоторых вариантах осуществления количество одного или нескольких средств, упоминаемых в настоящем описании, в средствах, композициях или наборах, описанных в настоящем описании, находится в диапазоне от приблизительно 1,0 до приблизительно 50,0 мг/кг или более, предпочтительно приблизительно от 5,0 до 40,0 мг/кг, более предпочтительно приблизительно от 10,0 до 30,0 мг/кг, в расчете на массу тела индивидуума. В некоторых вариантах осуществления количество одного или нескольких средств, упоминаемых в настоящем описании, в средствах, композициях или наборах, описанных в настоящем описании, составляет приблизительно 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5, 10,0, 10,5, 11,0, 11,5, 12,0, 12,5, 13,0, 13,5, 14,0, 14,5, 15,0, 15,5, 16,0, 16,5, 17,0, 17,5, 18,0, 18,5, 19,0, 19,5, 20,0, 20,5, 21,0, 21,5, 22,0, 22,5, 23,0, 23,5, 24,0, 24,5, 25,0, 25,5, 26,0, 26,5, 27,0, 27,5, 28,0, 28,5, 29,0, 29,5, 30,0, 30,5, 31,0, 31,5, 32,0, 32,5, 33,0, 33,5, 34,0, 34,5, 35,0, 35,5, 36,0, 36,5, 37,0, 37,5, 38,0, 38,5, 39,0, 39,5, 40,0, 40,5, 41,0, 41,5, 42,0, 42,5, 43,0, 43,5, 44,0, 44,5, 45,0, 45,5, 46,0, 46,5, 47,0, 47,5, 48,0, 48,5, 49,0, 49,5, 50,0 мг/кг или более, или любой диапазон, определяемый конечными точками из вышеупомянутых величин, или любую величину между ними, как например, приблизительно от 1,1 до 1,4 мг/кг и т.п., или приблизительно 1,1, 1,2, 1,3, 1,4 мг/кг и т.п. в расчете на массу тела индивидуума.

В других аспектах средства, композиции или наборы, описанные в настоящем описании, вводят в фиксированных дозах. В некоторых вариантах осуществления средства, композиции или наборы, описанные в настоящем описании, содержат фиксированное количество одного или нескольких средств, упомянутых в настоящем описании.

В некоторых вариантах осуществления количество одного или нескольких средств, упоминаемых в настоящем описании, в средствах, композициях или наборах, описанных в настоящем описании в каждом случае независимо составляет 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200 мг или более, или диапазон, определяемый конечными точками из вышеупомянутых величин, или любую величину между ними, например, приблизительно от 1,1 до 1,4 мг и т.п. или приблизительно 1,1, 1,2, 1,3, 1,4 и т.п.

В других аспектах некоторые из компонентов средств, композиций или наборов, описанных в настоящем описании, вводят в дозах по массе индивидуума, как описано выше, в то время как другие компоненты вводят в фиксированных дозах, как описано выше. В некоторых вариантах осуществления количества некоторых из компонентов в средствах, композициях или наборах, описанных в настоящем описании. представляют собой количества на основе массы индивидуума, как описано выше, а другие компоненты представляют собой фиксированные количества, как описано выше.

Доставка

Средство или фармацевтическая композиция по настоящему изобретению можно доставлять или вводить различными способами, известными в данной области. Термины "доставка", "доставлять", "вводить" и "применять" используются в настоящем описании взаимозаменяемо. Как будет понятно специалистам в данной области, путь и/или способ доставки варьируется в зависимости от желаемого результата. В одном варианте осуществления средство или фармацевтическую композицию по изобретению доставляют перорально. В другом варианте осуществления средство или фармацевтическую композицию по изобретению доставляют перорально. В другом варианте осуществления средство или фармацевтическая композиция по изобретению доставляют назальным путем. Другой способ доставки может включать способы и комбинации для доставки в кишечник.

Средство или фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно доставлять в заданную область и/или структуру у индивидуума. Область, на которую может быть осуществлено нацеливание в кишечнике, может включать, но не ограничивается ими, желудок, билиарно-панкреатическую ветвь (сегмент), ветвь Ру, общую ветвь, подвздошную кишку, слепую кишку или ободочную кишку. Они могут быть нацелены на структуру, которая составляет область с индивидуализированной средой с конкретным диапазоном pH, температурой, влажности и содержанием метаболитов. Заболевания или состояния, ассоциированные с измененной генеалогией микробиоты, могут демонстрировать присутствие новых микроорганизмов, отсутствие нормальных микроорганизмов или изменение соотношения микроорганизмов.

Доставка средства или фармацевтической композиции по настоящему изобретению может быть нацелена на одну или несколько областей у индивидуума. Область может включать, но не ограничивается ими, область в кишечнике. В иллюстративном варианте осуществления доставка нацелена на полость рта, желудок, билиарно-панкреатическую ветвь, ветвь Ру, общую ветвь, тонкую кишку, подвздошную кишку, слепую кишку, толстую кишку или ободочную кишку в кишечнике. Доставка также может быть нацелена на одну или несколько тканей индивидуума. Ткань может включать любую ткань в кишечнике, такую как ткань желудка, билиарно-панкриатической ветви, ветви Ру, общей ветви, тонкой кишки, подвздошной кишки, слепой кишки, толстой кишки или ободочной кишки.

Компоненты средства или фармацевтической композиции по настоящему изобретению могут быть составлены по отдельности, или часть из них может быть составлена вместе. В одном варианте осуществления средство или фармацевтическая композиция по настоящему изобретению могут быть составлены в виде средства или фармацевтической композиции, пригодных для однократного или многократного введения.

Компоненты средства или фармацевтической композиции по настоящему изобретению могут быть введены по отдельности, или часть или все из них могут быть введены вместе. Средства или компоненты фармацевтической композиции по настоящему изобретению могут быть введены по существу в разные моменты времени, или некоторые или все из них могут быть введены по существу одновременно.

Каждое из средств или компонентов фармацевтической композиции по настоящему изобретению может быть независимо введено различными подходящими путями, включая, но не ограничиваясь ими, пероральный или парентеральный (внутривенный, внутримышечный, местный или подкожный пути). В некоторых вариантах осуществления каждый из компонентов средств или фармацевтической композиции по настоящему изобретению может быть независимо введен пероральным путем или посредством инъекции, например, посредством внутривенной инъекции или внутрибрюшинной инъекции.

Каждый из компонентов средства или фармацевтической композиции по настоящему изобретению может независимо представлять собой подходящую дозированную форму, включая, но не ограничиваясь ими, дозированные формы таблеток, лепешек, пилюль, капсул (например, твердые капсулы, мягкие капсулы, покрытые кишечно-растворимой оболочкой капсулы, микрокапсулы), эликсиров, гранул, сиропов, инъекционных форм (внутримышечные, внутривенные, внутрибрюшинные), гранул, эмульсий, суспензий, растворов, дисперсий и препаратов замедленного высвобождения для перорального или парентерального введения.

Каждое из средств или компонентов фармацевтической композиции по настоящему изобретению может независимо содержать фармацевтически приемлемый носитель и/или эксципиент.

Средства по настоящему изобретению или компоненты фармацевтической композиции можно вводить независимо каждые 1 сутки, каждые 2 суток, каждые 3 суток, каждые 4 суток, каждые 5 суток, каждые 6 суток, каждую неделю, каждые 2 недели, каждые 3 недели или каждый месяц или с меньшей частотой.

Средства по настоящему изобретению или компоненты в фармацевтической композиции могут быть введены независимо 1 раз, 2 раза, 3 раза, 4 раза, 5 раз, 6 раз, 7 раз, 8 раз, 9 раз или 10 раз или более в сутки.

Средства по настоящему изобретению или компоненты фармацевтической композиции можно вводить независимо в течение 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 последовательных суток или более.

Один из компонентов средства или фармацевтической композиции по настоящему изобретению может быть введен за 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 или более суток до или после введения другого компонента. Например, в одном варианте осуществления средство или компонент 1 фармацевтической композиции по настоящему изобретению вводят на 1 сутки, и средство или компонент 2 фармацевтической композиции по настоящему изобретению вводят через 2 суток (т.е. на 3 сутки), и средство или компонент 1 фармацевтической композиции по настоящему изобретению вводят через другие трое суток (т.е. на 6 сутки).

Доставку средства или фармацевтической композиции по настоящему изобретению также можно повторять один или несколько раз. Повторная доставка средства или фармацевтической композиции по настоящему изобретению может быть осуществлена один или несколько раз до и/или после лечения заболевания. Повторная доставка может быть осуществлена аналогичным образом с первоначальной доставкой.

Средство или фармацевтическую композицию по настоящему изобретению также можно вводить вместе со средством, которое может включать терапевтическое, профилактическое или диагностическое средство. Терапевтическое, профилактическое или диагностическое средство выбрано из низкомолекулярных соединений, нуклеиновых кислот, белков, таких как полипептидные пребиотики, включая бактериальные компоненты (такие как компоненты клеточной стенки бактерий (такие как пептидогликан), бактериальная нуклеиновая кислота (такая как ДНК и РНК), компоненты бактериальной мембраны и структурные компоненты бактерий (такие как белки, углеводы, липиды и их комбинации, такие как липопротеины, сложные эфиры сахаров и гликопротеин)), бактериальные метаболиты, органические кислоты, неорганические кислоты, основания, белки и пептиды, ферменты и коферменты, аминокислоты и нуклеиновые кислоты, углеводы, липиды, гликопротеины, липопротеины, сложные эфиры сахаров, витамины, биологически активные соединения, метаболиты, содержащие неорганические компоненты, низкомолекулярные соединения (например, азотсодержащие молекулы или содержащие сернистую кислоту молекулы), стойкий крахмал, картофельный крахмал или крахмал с высоким содержанием амилозы, модифицированный крахмал (включая карбоксилированный крахмал, ацетилированный крахмал, пропионированный крахмал и бутилированный крахмал), усваиваемые олигосахариды, такие как фруктоолигосахариды, декстроза, ксилоолигосахарид, галактоолигосахарид, арабиноксилан, арабиногалактан, полисахариды галактоманнан, полидекстран, олигофруктоза, инулин и их производные (однако другие олигосахариды, которые могут играть роль пребиотиков, не исключены), другие растворимые волокна и их комбинация. В одном варианте осуществления доставляемое средство представляет собой доставляемое низкомолекулярное соединение, которое имеет низкую пероральную биодоступность и действует на область микроорганизмов в кишечнике хозяина. Низкая биодоступность обычно является нежелательной в медицине, поскольку кишечное всасывание является целью большинства пероральных способов лечения.

Средство или фармацевтическую композицию по настоящему изобретению также можно вводить в той же композиции, что и вышеупомянутое средство, или их можно вводить отдельно от средства, вводимого до, одновременно и/или после средства или фармацевтической композиции по настоящему изобретению. Средство или фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно вводить по меньшей мере приблизительно за 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 или более суток до введения средства. Средство или фармацевтическую композицию по настоящему изобретению также можно вводить по меньшей мере приблизительно через 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 или более суток после введения средства.

Средство или фармацевтическую композицию по изобретению также можно доставлять посредством по меньшей мере частично имплантируемой системы. Имплантируемая система может представлять собой любую систему, известную и используемую в данной области. Система может включать программируемые насосы (такие как насосы, часто используемые для доставки инсулина пациентам с диабетом). Один или несколько этих компонентов могут быть модульными или соединены с трансдермальной системой доставки, которая может включать отверстия, иглы, пластыри и т.п. В иллюстративном варианте осуществления имплантируемая система включает резервуар и отверстие. Резервуар может включать заправляемый или перезагружаемый контейнер для вмещения композиции. В другом варианте осуществления система может включать катетер. В другом варианте осуществления имплантируемая система представляет собой транслюминальный катетер. Система также может быть организована для доставки композиции в назначаемой дозе и/или с назначаемым интервалом. Назначаемая доза и/или назначаемый интервал могут быть определены специалистами в данной области.

Некоторые варианты осуществления изобретения проиллюстрированы в следующих неограничивающих примерах.

ПРИМЕР

Материалы и способы

Животные. Мышей Tg и совместно содержащихся мышей WT (соответствующих мышам WT, полученных путем скрещивания мышей Tg и мышей C57) содержали в одной клетке после рождения. Мышей WT (C57) содержали в отдельных клетках во избежание перекрестного переноса микробиоты. Всех мышей держали в помещении при 23°C с 12-часовым (ч) циклом на свету/в темноте. Мышей случайным образом распределяли в различные группы перед лечением. На протяжении анализа мышей Tg, самцов и самок мышей Tg умерщвляли в возрасте 2, 3, 5, 7 и 9 месяцев. Головной мозг извлекали и окрашивали для анализа иммунных клеток и анализа цитокинов. Перед умерщвлением мышей фекалии собирали для анализа микробиоты. Для введения OM1 в возрасте 6,5 месяцев на основе 450 мг b.i.d. (два раза в сутки) в испытании фазы III, мышам Tg вводили 100 мг/кг OM1 посредством перорального введения один раз в сутки в течение одного месяца. Для мониторинга когнитивной активности после последнего введения проводили поведенческие тесты. Затем головной мозг и фекалии мышей использовали для различных анализов. Для поведенческого тестирования мышей Tg и мышей WT в разные месяцы и подвергаемых лечению мышей тестировали посредством обучения различению, как описано ранее. Все движения мышей, которые происходили в Phenotyper (HomeCage) регистрировали посредством компьютеризованной системы отслеживания, которая вычисляет время и количество вхождений, требуемых для достижения 80% стандарта эффективности (Noldus, Ethovision). Для внутрибрюшинной инъекции фенилаланина и изолейцина мышам C57 в возрасте 4 месяцев вводили 50 мг/кг фенилаланина или изолейцина в течение 4 суток. Для инъекции в гиппокамп фенилаланина и изолейцина мышам C57 в возрасте 4 месяцев инъецировали 3 мкл фенилаланина или изолейцина в дозе 120 мл/л. Через 10 суток у этих мышей проводили анализ образца крови и поведенческое тестирование с использованием FACS.

Для анализа мышей APP/PS1 в разные моменты времени, мышей и совпадающих по возрасту мышей дикого типа умерщвляли в возрасте 3, 9 и 14 месяцев. Головной мозг и кровь мышей собирали для различных анализов. Перед умерщвлением фекалии мышей собирали для анализа микробиоты. Для введения мышам APP/PS1 мышам в возрасте 6 месяцев проводили введение с антибиотиками или без них в течение 3 месяцев 50 мг/кг OM1 через желудочный зонд один раз в сутки. Поведенческие тесты проводили для мониторинга когнитивной активности после последнего введения. Эксперимент на животных был одобрен этическим комитетом Shanghai SIPPR-Bk Lab Animal Co., Ltd (No.: 2016002).

Экстракция ДНК из образца фекалий и амплификация способом ПЦР. Все образцы фекалий замораживали при -80°C перед экстракцией ДНК и анализом. Микробную ДНК экстрагировали из фекальных образцов с использованием E.Z.N.A.® Soil DNA Kit (Omega Bio-Tek, Norcross, GA, U.S.) в соответствии с протоколами изготовителя. Конечную концентрацию и чистоту ДНК определяли с использованием спектрофотометра УФ и видимой области спектра NanoDrop 2000 (Thermo Scientific, Wilmington, США), и качество ДНК проверяли посредством 1% агарозного гель-электрофореза. Гипервариабельные области V3-V4 гена бактериальной 16S рРНК амплифицировали с использованием праймеров 338 F (5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′) и 806 R (5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′) посредством системы термоциклера ПЦР (GeneAmp 9700, ABI, США). Реакции ПЦР проводили с использованием следующей программы: 3  минуты (мин) денатурации при 95°C, 27 циклов из 30 секунд (с) при 95°C, отжиг в течение 30 с при 55°C, и элонгация в течение 45 с при 72°C, и конечное удлинение при 72°C в течение 10 мин. Реакции ПЦР проводили в трех экземплярах в 20 мкл смеси, содержавшей 4 мкл 5 × буфера  FastPfu, 2  мкл 2,5  ммоль/л dNTP, 0,8 мкл каждого праймера (5  мкмоль/л), 0,4 мкл полимеразы FastPfu и 10 нг ДНК-матрицы. Полученные продукты ПЦР экстрагировали из 2% агарозного геля и далее очищали с использованием набора AxyPrep DNA Gel Extraction Kit (Axygen Biosciences, Union City, CA, США) и количественно определяли с использованием QuantiFluor™-ST (Promega, США) в соответствии с протоколом изготовителя. Вырожденный праймер относится к смеси различных последовательностей, которые отражают все различные возможности оснований для кодирования одной аминокислоты. Для повышения специфичности можно обратиться к таблице использования кодонов для уменьшения вырожденности в соответствии с предпочтениями использования оснований у различных организмов. В дополнение к нормальным обозначениям четырех оснований A, T, G и C, другие буквы, такие как R, Y, M, K и т.п., присутствуют в нуклеотидной цепи, где R=A/G, Y=C/T, M=A/C, K=G/T, S=C/G, W= A/T, H= A/C/T, B= C/G /T, V=A/C/G, D=A/G /T, N=A/C/G/T.

Секвенирование с использованием Illumina MiSeq. В соответствии со стандартным протоколом Majorbio Bio-Pharm Technology Co. Ltd. (Shanghai, Китай), очищенные ампликоны объединяли в эквимолярных количествах и подвергали секвенированию спаренных концов (2×300) на платформе Illumina MiSeq (Illumina, San Diego, США).

Обработка данных секвенирования. Исходные файлы fastq подвергали демультиплексинованию, фильтрации качества посредством Trimmomatic и объединению посредством FLASH на основе следующих критериев: (i) Чтения укорачивали в любом участке, который получал средний показатель качества  < 20 на протяжении окна скольжения 50 п.н. (ii) Проводили точный подбор праймеров, допуская несоответствие 2 нуклеотидов, и чтения, содержавшие неоднозначные основания, удаляли. (iii) Последовательности с перекрыванием более 10 п.н. объединяли в соответствии с их последовательностью перекрывания. Операционные таксономические единицы (OTU) подвергали кластеризации с порогом сходства 97% с использованием UPARSE (версия 7.1 http://drive5.com/uparse/), и химерные последовательности идентифицировали и удаляли с использованием UCHIME. Таксономию каждой последовательности гена 16S рРНК анализировали посредством алгоритма RDP Classifier (http://rdp.cme.msu.edu/) против базы данных 16S рРНК Silva (SSU123) с использованием порогового значения достоверности 70%.

Получение образцов метаболитов. Образцы, хранившиеся при -80°C, отбирали и размораживали при комнатной температуре. В эксперименте использовали образцы массой 50  мг и также добавляли 400 мкл смеси метанол-вода (4:1, об./об.) для гомогенизации образца с использованием гомогенизатора в течение 10 секунд. Раствор подвергали ультразвуковой экстракции на льду в течение 10  мин и хранили при -20°C в течение 30  мин, затем центрифугировали в течение 15  мин при 13000  об/мин при 4°C. Для анализа LC-MS использовали 200 мкл супернатанта.

Параметры анализа LC/MS. LC-MS проводили на масс-спектрометрической системе AB Sciex TripleTOF 5600TM (AB SCIEX, USA). Условия LC: колонка: Acquity BEH C18 (100  мм × 2,1  мм i.d., 1,7 мкм; Waters, Milford, США). Растворитель: колонку поддерживали при 40°C и разделения достигали с использованием следующего градиента: 5% B-30% B на протяжении 0-3 мин, 30% B-95% B на протяжении 3-9 мин, 95% B-95% B на протяжении 9-13,0 мин; 95% B-5% B на протяжении 13,0-13,1  мин, и удержание в течение 13,1-16  мин при 5% B; скорость потока составляет 0,40  мл/мин, где B представляет собой ацетонитрил:изопропанол 1:1 (0,1% (об./об.) муравьиная кислота) и A представляет собой водный раствор муравьиной кислоты (0,1% (об./об.) муравьиная кислота). Объем инжектирования составил 20 мкл. Данные масс-спектрометрии получали с использованием масс-спектрометрической системы AB Sciex TripleTOF 5600TM, оборудованной источником электрораспылительной ионизации (ESI), действующем либо режиме положительных ионов, либо в режиме отрицательных ионов, с капиллярным напряжением 1,0  кВ, пробоотборным конусом, 40  В, энергией столкновений 6  эВ. Температура источника была установлена на 120°C, с потоком газа десольватации 45  л/ч. Центроидные данные получали при от 50 до 1000  m/z с разрешением 30000.

Получение образца метаболитов QC. Образец QC получали путем смешения аликвот всех образцов с получением объединенного образца, а затем анализировали с использованием одного и того же способа с аналитическими образцами. QC инжектировали с регулярными интервалами (каждые 10 образцов) на протяжении аналитической серии с получением набора данных, из которых может быть оценена повторяемость.

Дифференцировка in vitro наивных CD4 в Th1 и Th2, индуцируемая супернатантом фекалий мышей. Наивные CD4⁺ T-клетки отделяли от спленоцитов самок мышей C57BL/6 в возрасте 8 месяцев с использованием набора для выделения наивных CD4⁺ T-клеток (Stem Cell, #19765). Как описано выше, получали супернатант фекалий мышей в возрасте 7 месяцев. Всего 0,5×10⁶ клеток/лунка в 0,5  мл среды RPMI-1640 высевали в 48-луночные планшеты, покрытые антителом против CD3 и антителом против CD28, и культуральную среду дополняли цитокинами и блокирующими антителами. Th0: 20  нг/мл mIL-2; Th1: 20  нг/мл mIL-2, 10 мкл супернатанта, 5000  нг/мл 11B11; Th2: 20  нг/мл mIL-2, 10 мкл супернатанта, 5000  нг/мл XMG1.2. OM1 добавляли в обозначенные лунки до конечной концентрации 100 мкг/мл. После инкубации при 37°C в 5% CO₂ в течение 5 суток клетки получали на цитометре BD Aria III, и данные анализировали с использованием программного обеспечения FlowJo.

Иммуногистохимия. Для окрашивания с проявкой 3,30-диаминобензидином (DAB срезы подвергали иммунному окрашиванию с использованием Leica BOND-RX Autostainer (Leica Microsystems) и Coverslipper CV5030 (Leica Microsystems) в соответствии с протоколом IHC изготовителя. В кратком изложении срезы подвергали индуцированной нагреванием демаскировке эпитопов с использованием раствора Epitope Retrieval solution 2 (ER2, AR9640, Leica Biosystems) в течение 20 мин. Активность эндогенной пероксидазы блокировали 3%-4% (об./об.) пероксидом водорода (часть DS9800, Leica Biosystems) в течение 10 мин. Затем срезы инкубировали с блокирующим буфером (10% NGS в PBS с 0,3% Triton x-100) в течение 60  мин. Наконец, проводили окрашивание с использованием системы Bond Polymer Refine Detection System (DS9800, Leica Biosystems) в соответствии с протоколом изготовителя. Время инкубации с первичным антителом составляло 30  мин. Срезы окрашивали в отношении активированной микроглии с использованием антитела кролика против IBA1 (1:1000, каталожный номер № 019-19741, Wako), отложений амилоида с использованием антитела мыши против Aβ42 (1:1000; каталожный номер № 803003, Biolegend) и фосфорилирования тау с использованием антитела мыши anti-PHF-Tau & tangles-Thr231 antibody (1:300, каталожный номер № MN1040, Thermo Fisher). Окрашенные срезы автоматически сканировались посредством высокопроизводительного светлопольного сканера (NanoZoomer 2.0HT, Hamamatsu), и изображения получали с использованием программного обеспечения NDP.scan 3.2 (Hamamatsu). Для флуоресцентного окрашивания предметные стекла блокировали блокирующим буфером (10% NGS в PBS с 0,3% Triton x-100) при к.т. в течение 1 ч, а затем инкубировали в растворе первичного антитела (Iba-1 1:1000, Aβ42 1:1000, тау 1:300) в течение ночи при 4°C. После промывания предметные стекла инкубировали с флуоресцентным вторичным антителом против антител кролика или против антител мыши (1:1000, Invitrogen) в течение 60  мин при к.т. и далее промывали 3 раза в PBS. Наконец, предметные стекла подвергали контрастному окрашиванию с DAPI (1:10000 в PBS, Sigma) в течение 5  мин при к.т., промывали, запечатывали и хранили при 4°C для получения изображений. Репрезентативные флуоресцентные изображения получали посредством прямого флуоресцентного микроскопа Zmager-m2 (Zeiss, Germany) под 10× объективом с использованием программного обеспечения Zen (Zeiss).

Тест нейротоксичности. Клетки SH-SY5Y (ATCC, США) высевали на белый полистироловый 96-луночный планшет (Corning Inc., США) с плотностью 5000 клеток/лунка и культивировали в инкубаторе с увлажнением при 37℃ и 5% CO₂ в модифицированной способом Дульбекко среде Игла (DMEM) (Corning Inc., США), дополненной 10% эмбриональной телячьей сывороткой (FBS), 100 единиц/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина. Через 24 часа клетки обрабатывали L-фенилаланином или L-изолейцином (Sigma) в конечных концентрациях 10 мМ, 1 мМ и 0,1 мМ, соответственно. Для детекции жизнеспособности клеток через 24 часа использовали CellTiter-Glo (Promega Inc., США). Для регистрации люминесцентного сигнала использовали устройство Cytation5 (BioTek).

Детекция аминокислот. Набор растворов стандартных смесей аминокислот получали в диапазоне концентраций 100-2000  мкмоль/л. Часть объемом 10 мкл каждого раствора стандартной смеси или образца плазмы вносили пипеткой в нижнюю часть пробирки, а затем добавляли 70 мкл буфера на основе бората натрия (200  ммоль/л при pH 8,8). Добавляли 20 мкл 6-аминохинолил-N-гидроксисукцинимидилкарбамата (AQC) (4  мг/мл в ацетонитриле), пробирку закрывали и нагревали в течение 10  мин при 55 °C с получением AQC-аминокислоты. Затем раствор охлаждали до комнатной температуры и часть каждого раствора объемом 2 мкл инжектировали в систему UPLC-ESI-MS для анализа аминокислот без дальнейшей очистки.

Люди

Проводили сбор крови пациентов с MCI вследствие AD и здоровых контролей в пилотном испытании. MCI вследствие AD определяли в соответствии с клиническими и научными диагностическими критериями NIA-AA 2011 для MCI вследствие AD. Пациенты с MCI вследствие AD в этом испытании должны удовлетворять следующим критериям. Первым фактором является изменение когнитивной функции. Вторым является нарушение одного или нескольких когнитивных доменов. Третьим является сохранение независимости функциональных способностей. Четвертым является отсутствие деменции (клинические критерии NIA-AA 2011 диагноза MCI вследствие AD). Всех участников подвергали процессу скрининга, который включал изучение их медицинского анамнеза, физикальное и неврологическое обследование, лабораторные тесты и изображения МРТ. Клиническая оценка умеренного когнитивного расстройства или деменции включала нейропсихологические тесты, а также поведенческие и психиатрические опросы, проводимые лечащими врачами. Для пациентов с AD регистрировали показатели < 4 по шкале ишемии Хачинского, и у них отсутствовали в анамнезе значительные системные или психиатрические состояния или травматические повреждения головного мозга, которые могли нарушить функцию головного мозга. Для всех участников проводили клиническую оценку деменции (CDR) и Монреальскую оценку когнитивных функций (MoCA). На основе данной оценки авторы изобретения оставляли индивидуумов с MCI вследствие AD, а других исключали, таких как индивидуумы, которые имели нарушение единичного домена, не относящегося к памяти (подтип MCI с единичным доменом, не относящимся к памяти), и индивидуумы, которые имели нарушение двух или более доменов (множество доменов, подтип MCI со слабым нарушением). Нормальные контрольные индивидуумы не имели снижения когнитивных способностей в анамнезе, неврологических нарушений или неконтролируемых системных медицинских нарушений. Все индивидуумы, включенные в это испытание, имели ишемию не более двух лакун (диаметром < 1  см) при определении посредством последовательности МРТ в режиме инверсионного восстановления с подавлением сигнала от жидкости (FLAIR).

Размер выборки для первой группы (фиг.5h, i) составляет 9 пациентов с MCI вследствие AD и 18 здоровых индивидуумов. Размер выборки для второй группы (фиг.5j) составляет 22 пациента с MCI вследствие AD и 22 здоровых индивидуумов. Диагноз MCI был основан на следующих критериях, которые были адаптированы из диагностических критериев Петерсена для MCI: (1) жалобы на память, предпочтительно подтвержденные супругом или родственником; (2) объективное нарушение памяти; (3) нормальная общая когнитивная функция; (4) интактная повседневная активность и (5) отсутствие деменции. Этический комитет Shanghai Mental Health Centre Institutional Review Board одобрил испытание (номер: 2016-22R1). От всех индивидуумов и опекунов индивидуумов было получено информированное согласие. Информация о возрасте и поле и т.д. приведена ниже.

Первая группа:

Тип	ID образца	Возраст	Пол
Здоровый	HC-01	75	Ж
Здоровый	HC-02	71	Ж
Здоровый	HC-04	69	Ж
Здоровый	HC-05	73	Ж
Здоровый	HC-08	63	М
Здоровый	HC-09	62	М
Здоровый	HC-10	68	М
Здоровый	HC-11	61	М
Здоровый	HC-12	68	М
Здоровый	HC-13	75	Ж
Здоровый	HC-14	70	Ж
Здоровый	HC-15	68	М
Здоровый	HC-16	62	М
Здоровый	HC-17	75	М
Здоровый	HC-18	65	Ж
Здоровый	HC-19	64	Ж
Здоровый	HC-20	64	Ж
Здоровый	HC-22	63	Ж
MCI вследствие AD	MCI-02	61	Ж
MCI вследствие AD	MCI-03	79	М
MCI вследствие AD	MCI-04	71	Ж
MCI вследствие AD	MCI-05	72	Ж
MCI вследствие AD	MCI-06	80	Ж
MCI вследствие AD	MCI-07	65	М
MCI вследствие AD	MCI-09	61	М
MCI вследствие AD	MCI-10	69	М
MCI вследствие AD	MCI-14	77	М

Вторая группа:

Тип	ID образца	Возраст	Пол
Здоровый	HC-0149	73	М
Здоровый	HC-0150	70	Ж
Здоровый	HC-0153	63	Ж
Здоровый	HC-0156	67	М
Здоровый	HC-0158	71	Ж
Здоровый	HC-0165	61	Ж
Здоровый	HC-0168	62	Ж
Здоровый	HC-0172	70	Ж
Здоровый	HC-0176	71	Ж
Здоровый	HC-0187	73	Ж
Здоровый	HC-0191	65	М
Здоровый	HC-0013	70	Ж
Здоровый	HC-0043	81	М
Здоровый	HC-0050	64	Ж
Здоровый	HC-0051	66	М
Здоровый	HC-0056	75	М
Здоровый	HC-0068	67	Ж
Здоровый	HC-0074	57	Ж
Здоровый	HC-0076	60	Ж
Здоровый	HC-0081	71	Ж
Здоровый	HC-0089	57	Ж
Здоровый	HC-0090	76	Ж
MCI вследствие AD	MCI-0169	65	Ж
MCI вследствие AD	MCI-0175	61	Ж
MCI вследствие AD	MCI-0211	69	М
MCI вследствие AD	MCI-0229	65	М
MCI вследствие AD	MCI-0240	59	Ж
MCI вследствие AD	MCI-0244	64	Ж
MCI вследствие AD	MCI-0257	61	Ж
MCI вследствие AD	MCI-0260	60	Ж
MCI вследствие AD	MCI-0282	66	Ж
MCI вследствие AD	MCI-0284	64	Ж
MCI вследствие AD	MCI-0287	75	Ж
MCI вследствие AD	MCI-0303	62	Ж
MCI вследствие AD	MCI-0319	63	Ж
MCI вследствие AD	MCI-0332	67	Ж
MCI вследствие AD	MCI-0374	61	М
MCI вследствие AD	MCI-0385	68	Ж
MCI вследствие AD	MCI-0401	57	Ж
MCI вследствие AD	MCI-0414	64	Ж
MCI вследствие AD	MCI-0001	75	М
MCI вследствие AD	MCI-0043	55	Ж
MCI вследствие AD	MCI-0061	63	Ж
MCI вследствие AD	MCI-0091	78	Ж

Дифференцировка и пролиферация in vitro, индуцированная фенилаланином и изолейцином. Наивные CD4⁺ T-клетки отделяли от спленоцитов самок мышей C57BL/6 в возрасте 8 месяцев с использованием набора для выделения наивных CD4⁺ T-клеток (Stem Cell, #19765), и клетки окрашивали посредством CellTrace (Thermo Fisher, #C34557). Всего 1×10⁵ клеток/лунка в 0,2  мл среды RPMI-1640 высевали в 96-луночные планшеты и культуральную среду дополняли цитокинами или блокирующими антителами. Th0: 10 нг/мл mIL-2; Th1:10 нг/мл mIL-2, 5000 нг/мл 11B11. В указанные лунки добавляли фенилаланин (конечная концентрация, 2 ммоль/л), изолейцин (конечная концентрация, 2 ммоль/л) и OM1 (конечная концентрация, 100 мкг/мл), соответственно. После инкубации при 37°C в 5% CO₂ в течение 5 суток клетки получали на цитометре BD Fortessa и данные анализировали с использованием программного обеспечения FlowJo.

Захват фенилаланина. Наивные CD4⁺ T-клетки отделяли от спленоцитов самок мышей C57BL/6 в возрасте 8 месяцев с использованием набора для выделения наивных CD4⁺ T-клеток (Stem Cell, каталожный номер 19765) и индуцировали к дифференцировке в Th1 посредством 20 нг/мл IL-12. Через 3 суток всего 5×10⁵ Th1-клеток и Th0-клеток/лунка в 0,5 мл среды RPMI-1640 высевали в 48-луночные планшеты. В указанные лунки добавляли ¹³C-меченный фенилаланин и 5  мМ ингибитор переносчика аминокислот BCH. Через 0,5 ч клетки собирали и промывали два раза ледяным D-PBS. Добавляли 50 мкл деионизированной воды и клетки лизировали посредством замораживания и размораживания два раза при -80°C. Клеточный лизат центрифугировали при 12000×g в течение 10  мин и ¹³C-меченный фенилаланин в супернатанте анализировали посредством масс-спектрометрии.

Обработка антибиотиком. Мышам проводили введение путем добавления в стерильную питьевую воду раствора антибиотика (ATB), содержавшего ампициллин (0,1  мг/мл, конечная концентрация в питьевой воде), стрептомицин (0,5  мг/мл, конечная концентрация в питьевой воде) и колистин (0,1  мг/мл, конечная концентрация в питьевой воде) (Sigma-Aldrich). Растворы и бутылки заменяли 3 раза и один раз в неделю, соответственно. Активность антибиотика подтверждали посредством секвенирования гена 16S рРНК. Типы бактерий с относительным содержанием менее 0,01 удаляли для группы Tg. Длительность введения ABX несколько различалась, исходя из условий эксперимента. В контексте экспериментов с трансплантацией фекальной микробиоты, мышам проводили введение ATB в течение 3 суток перед проведением трансплантации фекальной микробиоты на следующий день через желудочный зонд с использованием игл для кормления животных.

Эксперименты по трансплантации фекальной микробиоты (FMT). FMT проводили путем размораживания фекального материала. Затем 200 мкл суспензии переносили посредством желудочного зонда каждому из реципиентов, которым вводили ATB. FMT проводили 3 раза за 5 суток. Мышам C57 в возрасте двенадцати месяцев сначала вводили коктейль антибиотиков в питьевой воде в течение 3 суток, а затем 40  мг смешанного стула, суспендированного в PBS, вводили через желудочный зонд каждой мыши 3 раза с интервалом 2 суток между введениями. Через 3 суток проводили инъекцию 4,2  мкг олигомера Aβ 1-40 в обе стороны гиппокампа. Через 3 суток мышей умерщвляли и использовали для разных анализов.

Биоинформатический анализ. Анализ сигнальных путей и анализ обогащения биологических функций проводили с использованием Kyoto Encyclopedia of Gene Genotype (KEGG). Обогащение данных проводили с использованием R-пакета "DOSE", "GO.db", "GSEABase" и "ClusterProfiler". Отображались только каскады со значением p с поправкой на частоту ложноположительных результатов (FDR)  < 0,05. Для анализа корреляций использовали R-пакет "ggcorrplot". R-пакет "igraph" использовали для построения круговых диаграмм корреляций. R-пакеты "ggalluvial" и "networkD3" использовали для получения блок-схем для бактерий и диаграмм Сэнки. R-пакет "Mfuzz" использовали для кластерного анализа тенденций. Другие способы биоинформатического анализа проводили с использованием онлайн-платформы Majorbio I-Sanger Cloud (www.i-sanger.com). Анализ биомаркеров ROC и классификацию на основе случайного леса проводили с использованием MetaboAnalyst 4.0 (https://www.metaboanalyst.ca/).

Получение образцов для проточной цитометрии и анализ. Мышей подвергали анестезии, проводили взятие образцов крови в содержавшие EDTA пробирки и эритроциты удаляли с использованием 1× буфера для лизиса эритроцитов. Перед сбором тканей головной мозг подвергали перфузии ледяным PBS, чтобы избежать попадания циркулирующих иммунных клеток крови, и головной мозг извлекали, нарезали на фрагменты и проводили диссекцию в соответствии с инструкцией к набору Adult Brain Dissociation Kit (Miltenyi, каталожный номер № 130-107-677) с использованием диссоциатора gentleMACS (Miltenyi Biotec). Гомогенат головного мозга фильтровали через 70-мкм клеточное сито и центрифугировали при 300×g в течение 5 мин при 4°C. Клеточный осадок ресуспендировали в холодном буфере PBS и вновь центрифугировали при 300×g в течение 5  мин при 4°C. Все образцы подсчитывали и доводили до плотности 2-3×10⁶/100  мкл, метили с использованием набора Live/Dead Kit в течение 30  мин, а затем центрифугировали при 500×g в течение 3  мин при 4°C. Клетки ресуспендировали в 100 мкл буфера PBS, блокировали антителом против CD16/32 (Biolegend, каталожный номер № 101320) в течение 10 мин, и инкубировали с антителом в соответствии с протоколами изготовителей при 4°C в течение 30  мин. Следующие антитела использовали для FACS-анализа: CD45（30-F11）-APC-Cy7（103116，Biolegend），CD11b（M1/70）-FITC（101205，Biolegend），CX3CR1（SA011F11）-PE-Dazzle 594（149014，Biolegend），F4/80（BM8）-BV421（123132，Biolegend），CD86（IT2,2）-PE（305438，Biolegend），CD206（15-2）-APC（321110，Biolegend），CD206（15-2）-BV785（321142，Biolegend），CD11c（N418）-PE-Cy7（117318，Biolegend），CD8（53-6,7）-Percp-Cy5.5（100734，Biolegend），Ly-6C（HK1.4）-PE-Dazzle 594（128044，Biolegend），Gr-1（RB6-8C5）-Percp-Cy5,5（108428，Biolegend），B220（RA3-6B2）-BV421（103240，Biolegend），CD19（6D5）-PE（115508，Biolegend），CD49b（DX5）-PE-Cy7（108922，Biolegend），CD4（GK1,5）-PE-Cy7（100422，Biolegend），CD4（GK1,5）-FITC（100406，Biolegend），CXCR3（CXCR3-173）-BV421（126522，Biolegend），CCR4（L291H4）-PE-Cy7（359410，Biolegend），CCR6（29-2L17）-APC（129814，Biolegend），CD127（A019D5）-PE（351304，Biolegend），CD25（3C7）-Percp-Cy5,5（101912，Biolegend），Live/Dead（423104，Biolegend）. Клетки добавляли к 500 мкл буфера PBS, центрифугировали при 500×g в течение 3  мин при 4°C и ресуспендировали в 200  мкл подвижного буфера. Соответствующий отрицательный контроль, контроль Fluorescence Minus One (FMO) и каждый образец для компенсации флуоресценции использовали для внесения поправки на компенсацию флуоресценции и идентификации представляющих интерес популяций. Клетки обрабатывали на цитометре BD Aria III и данные анализировали с использованием программного обеспечения FlowJo.

Чип с антителами. Гомогенаты головного мозга (из 20  мг ткани) анализировали с использованием чипа для цитокинов с антителами на основе предметного стекла, включавшего 200 белков (RayBiotech, GSM-CAA-4000-1). В каждую лунку добавляли 100 мкл разбавителя для образца и инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин. Затем буфер заменяли другими 100 мкл образца и инкубировали при комнатной температуре в течение 2 ч. Образцы удаляли и промывали 5 раз (по 5  мин каждый раз) с использованием 150 мкл 1×промывочного буфера I и 2 раза (по 5  мин каждый раз) с использованием 150 мкл 1× промывочного буфера II при комнатной температуре при осторожном качании. В каждую лунку добавляли 80 мкл коктейля антител для детекции и инкубировали при комнатной температуре в течение 2 ч. Предметное стекло промывали 5 раз (по 5 мин каждый раз) посредством 150 мкл 1× буфера для промывания I, а затем 2 раза (по 5  мин каждый раз) посредством 150 мкл 1× буфера для промывания II при комнатной температуре при осторожном качании. В каждую лунку добавляли восемьдесят микролитров стрептавидина, конъюгированного с эквивалентным Cy3 красителем, и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч. После 5 промываний (по 5  мин каждый раз), сигнал визуализировали посредством лазерного сканера. Затем данные визуализировали посредством диаграммы тепловой карты (www.metaboanalyst.ca).

Получение срезов головного мозга. Мышам проводили транскардиальную перфузию 0,9% NaCl после глубокой анестезии пентобарбиталом (100 мг/кг, в/б). Ткани головного мозга быстро извлекали, замораживали и хранили при -70 °C. Получали серийные фронтальные срезы головного мозга (толщиной 12 мкм) с использованием нарезающего на срезы замораживающего микротома (Leica Microsystems), помещали на предметные стекла и сушили в течение ночи на воздухе при комнатной температуре. Срезы тканей хранили при -70°C использовали сразу.

Лазерная микродиссекция и анализ с использованием к-ПЦР. Замороженные образцы головного мозга мыши нарезали на срезы и собирали на предметных стеклах с мембраной из PEN (Leica, 11600288). Гиппокамп извлекали посредством микроскопии с лазерной диссекцией (Leica Microsystems, LMD6). РНК экстрагировали с использованием набора RNeasy Micro Kit (Qiagen, 74004) и подвергали обратной транскрипции в кДНК (Takara, PrimeScript RT Master Mix, RR036A). К-ПЦР проводили с использованием системы ABI 7500 способом SYBR (Takara, SYBR Premix Ex Taq II). Использовали следующие праймеры: синаптофизин-прямой: CAGTTCCGGGTGGTCAAGG; синаптофизин-обратный: ACTCTCCGTCTTGTTGGCAC; актин-прямой: GCTCTTTTCCAGCCTTCCTT; актин-обратный: AGGTCTTTACGGAT GTCAACG.

Статистический анализ. В поведенческом тесте животных случайным образом распределяли на различные группы. Для сравнений двух групп использовали непарный двухсторонний t-критерий Стьюдента. Для сравнения более чем двух групп выполняли односторонний ANOVA или двухсторонний ANOVA с последующим тестом Даннета. Все данные с планками погрешностей представлены в качестве среднего значения ± sem. Статистически значимым считали P < 0,05. Большинство данных анализировали в GraphPad Prism. Для количественного определения изображений Iba-1-положительные, Aβ42-положительные и положительные по фосфорилированному тау клетки анализировали посредством ImageJ v1.8.0 с регистрацией "площади".

Поведенческие тесты. Проводили следующие поведенческие тесты: водный лабиринт Морриса (водный лабиринт Морриса, MWM), Y-лабиринт и приподнятый крестообразный лабиринт (EPM). Все перемещения регистрировали с использованием камеры и программное обеспечение (Jiliang) использовали для вычисления соответствующих параметров.

Тест MWM используют для определения пространственного обучения и памяти в соответствии с протоколом, опубликованным ранее. В кратком изложении, мышей подвергали экспериментам для получения данных в течение 6 суток, и для каждой мыши проводили 3 испытания каждый день. Животных выпускали в воду в желаемом стартовом положении и определяли латентность поиска платформы. На 7-е сутки платформу удаляли и мышам позволяли плавать в течение 60 секунд. Траекторию и количество пересечений областей платформ регистрировали с использованием видеокамеры.

Рабочую память оценивали посредством Y-лабиринта в соответствии с литературой с некоторыми модификациями. Y-состоял из трех идентичных звеньев (A, B, C) с разными ключами. Мышей помещали в стартовое звено (A) и регистрировали последовательность исследованных звеньев (такую как ABCBA). Общее количество вхождений в звенья и изменения поведения регистрировали с использованием видеокамеры. Точность в Y-лабиринте представляла собой соотношение между правильным чередованием и общим чередованием.

Тест EPM широко используется для оценки тревожности у животных и состоит из двух открытых звеньев (30 см × 6 см), двух закрытых звеньев (30 см × 6 см × 22 см) и центральной области (6 см × 6 см). Каждую мышь помещали в центр лабиринтом в сторону закрытого звена, и позволяли исследовать лабиринт в течение 5 минут. Траекторию регистрировали и вычисляли частоту посещений открытого звена, которая негативно коррелировала с тревожностью мышей.

Примеры

Пример 1: Прогрессирование AD ассоциировано с изменением кишечной микробиоты и инфильтрацией иммунных клеток

Для оценки роли изменения кишечной микробиоты в патогенезе AD авторы изобретения использовали модель с трансгенными мышами (Tg) 5XFAD, которая широко используется в исследованиях AD вследствие ее быстрого начала и правдоподобного воспроизведения множества ассоциированных с AD патологических признаков и клинических фенотипов. Она демонстрирует нарушение памяти на 4-м месяце после рождения, поведенческие изменения на 7-м месяце и утрату нейронов на 9-м месяце. В качестве контролей использовали совпадающих по возрасту мышей дикого типа (WT) из той же линии, выращенных в тех же условиях. В соответствии с предшествующими сообщениями, авторы изобретения выявили изменения отложения бляшек Aβ, фосфорилирования тау, экспрессии синаптофизина, поведения и т.п. В частности, отложение бляшек Aβ в коре и гиппокампе быстро накапливается, начиная с 3-го месяца после рождения (фиг.7a). Фосфорилирование тау в головном мозге мышей Tg сначала было обнаружено на 5-месяце, и оно постепенно возрастало с увеличением возраста (фиг.7b); уровень экспрессии синаптофизина в гиппокампе значительно снижался с 7-го по 9-й месяцы, что указывает на синаптическую дегенерацию (фиг.1a). Поведенческий тест у мышей Tg продемонстрировало значительное ухудшение обучения различению в возрасте 9 месяцев (фиг.1b). Следует отметить, что ранние (2-3 месяца) и поздние (7-9 месяцев) стадии у мышей Tg в рамках настоящего изобретения имеют не тот же принцип, что и поздние стадии клинической AD у человека. Поздняя стадия у мышей Tg является симптоматически сравнимой с умеренным когнитивным расстройством (MCI) вследствие AD у человека. Таким образом, в рамках настоящего изобретения пациентов с MCI вследствие AD используют в качестве индивидуумов для проведения исследований у человека.

Заметный сдвиг композиции микробиоты кишечника в ходе прогрессирования AD у мышей Tg был выявлен при дальнейшем анализе главных компонентов (PCA) для серии моментов времени, в то время как практически никаких изменений не наблюдали у мышей WT с течением времени (фиг.1c; фиг.7c).

С использованием OTU для отслеживания динамики содержания различных бактериальных типов у мышей Tg авторы изобретения обнаружили два характерных изменения профилей кишечной микробиоты у мышей Tg в ходе прогрессирования заболевания. В возрасте 2-3 месяцев Bacteroidetes, Firmicutes и Verrucomicrobia были тремя из наиболее распространенных типов бактерий (46,8%, 32,3% и 12,6%, соответственно). В возрасте 7-9 месяцев Firmicutes стали преобладающими бактериями, в то время как содержание Bacteroidetes и Verrucomicrobia значительно снижалось, что указывает на изменение типов бактерий (фиг.1d). Авторы изобретения далее исследовали репрезентативные бактерии из мышей Tg в каждый момент времени (фиг.7d, фиг.7e). Эти результаты показали, что кишечная микробиота мышей Tg была в высокой степени динамичной, что в значительной степени отличается от мышей WT. Сходные результаты также были получены в модели на дважды трансгенных мышах APP/PS1, другой широко используемой модели для исследования AD (фиг.7f, фиг.7g).

Авторы изобретения предположили, что наблюдаемое изменение кишечной микробиоты в ходе прогрессирования AD может быть ассоциировано с нейровоспалением. Для тестирования этой гипотезы авторы изобретения оценили воспалительный статус у мышей Tg. Иммунное окрашивание на IBA1, являющегося характерным признаком активации микроглии, в срезах головного мозга мышей с AD продемонстрировало две очевидных стадии активации микроглии, на 3-м месяце и 7-9-м месяцах, соответственно (фиг.1e). Учитывая, что активация микроглии может быть отнесена к двум противоположным типам, провоспалительный подтип M1 и нейропротективный подтип M2, авторы изобретения также тщательно охарактеризовали фенотипы M1 и M2. На ранней стадии в возрасте 2-3 месяцев происходило повышение уровня как клеток M1, так и клеток M2 микроглии. В следующие месяцы уровень клеток подтипа M1 продолжал возрастать и достигал пика через 7-9 месяцев, в то время как уровень клеток микроглии типа M2 снижалось с 3 по 5 месяцы и оставалось на низком уровне после этого (фиг.1f). Можно видеть, что, по мере прогрессирования AD мышей Tg с течением времени провоспалительный подтип микроглии M1 в головном мозге изменялся от сравнимого с нейропротективным подтипом микроглии M2 (фиг.1f, 2-3 месяца) до преобладающего в микроглии (фиг.1f, 5-9 месяцев) и происходило повышение общей активации микроглии (фиг.1e, 5-9 месяцев).

В дополнение к активации микроглии, известно, что AD-ассоциированное нейровоспаление вовлекает инфильтрацию периферических иммунных клеток. Таким образом, авторы изобретения также проанализировали инфильтрацию периферических иммунных клеток в головной мозг в ходе прогрессирования AD. Было обнаружено, что уровень CD45^high клеток в головном мозге был значимо более высоким у мышей Tg, чем у мышей WT, аналогично результату окрашивания IBA1 (фиг.1g). Подтипы клеток CD45^high в ходе серии моментов времени далее анализировали в ходе прогрессирования AD, что продемонстрировало изменение CD4⁺ T-клеток, поскольку основная часть CD45^high клеток имеет сходную тенденцию к изменению с IBA1 (фиг.1h-i). На протяжении периода времени, исследованного авторами изобретения, инфильтрирующие Th1- и Th2-клетки, два основных подтипа CD4⁺ клеток, демонстрировали сходную динамику с клетками микроглии M1 и M2 (фиг.1j). Можно видеть, что при прогрессировании AD у мышей Tg с течением времени Th1 изменялись от сравнимых с Th2 (фиг.1j, 2-3 месяца) до преобладающих в CD4⁺ T-клетках (фиг.1j, 5-9 месяцев) и происходило общее повышение уровня CD4⁺ T-клеток (фиг.1i, 5-9 месяцев).

Таким образом, авторы изобретения поняли, что, поскольку паттерн кишечной микробы изменялся, популяция иммунных клеток имела тенденцию к изменению на Th1- и M1-преобладающее состояние, особенно поразительным является значение этих изменений с течением времени (фиг.1d-j). Сходные результаты также были обнаружены в модели на мышах APP/PS1 (фиг.8, фиг.7i, фиг.7j, фиг.23). Следует отметить, что модель на мышах APP/PS1 и модель на трансгенных мышах (Tg) 5XFAD отличаются в отношении прогрессирования AD с течением времени. Мыши Tg имеют очевидное отложение Aβ в возрасте 5 месяцев (фиг.7a), в то время как мыши APP/PS1 не имеют очевидных отложений Aβ в возрасте 5 месяцев (фиг.8a). Изменения кишечных микробов в этих двух моделях с течением времени (фиг.1d, фиг.7g) не являются полностью устойчивыми, что отражает внутривидовое и межиндивидуальное прогрессирование AD и отличия кишечных микробов, однако все они демонстрируют корреляцию между изменениями паттернов кишечных микробов и изменениями иммунных клеток с течением времени.

Авторы изобретения также проанализировали корреляцию между содержанием кишечной микробиоты и частотой иммунных клеток в головном мозге, и отметили, что ранняя (2-3 месяца) бактериальная композиция в высокой степени коррелирует с количествами клеток M2 и Th2 в головном мозге (фиг.1k, верх), однако изменения бактериального паттерна в высокой степени коррелировали с клетками M1 и Th1 (фиг.1k, низ). Бактерии, которые были в значительной степени взаимосвязаны с иммунными клетками, приведены на правой панели фиг.1k, вновь подтверждая корреляцию между паттерном кишечной микробиоты и иммунными клетками, особенно Th1 и M1.

В целом, эти результаты показали, что кишечные бактерии ассоциированы с инфильтрацией периферических иммунных клеток и возникновением нейровоспаления в ходе прогрессирования AD, исследование которых описано далее.

Пример 2: Изменения кишечной микробиоты приводят к чрезмерной инфильтрации Th1-клеток и чрезмерной активации клеток микроглии M1 в головном мозге

Для определения того, требуется ли изменение кишечной микробиоты для запуска инфильтрации периферических иммунных клеток и в свою очередь нейровоспаления при прогрессировании AD, авторы изобретения использовали коктейль антибиотиков, содержавший ампициллин (0,1  мг/мл), стрептомицин (0,5  мг/мл) и колистин (0,1  мг/мл) у мышей Tg на поздней стадии (в возрасте 7 месяцев) для сокращения кишечной микробиоты. Введение антибиотика у мышей Tg на поздней стадии (в возрасте 7 месяцев) приводило к выраженному сокращению как микробного разнообразия, так и содержания в кишечнике (фиг.2a).

Вместе с этим изменением авторы изобретения выявили снижение уровня как инфильтрирующих провоспалительных Th1-клеток (фиг.2b), так и клеток M1 (фиг.2c) в головном мозге. Это предварительно показывает, что, посредством препятствования распределению кишечных микробов у мышей AD может быть изменено преобладающее состояние Th1 и M1 у мышей с AD поздней стадии, что указывает на причинно-следственную взаимосвязь между изменениями кишечных микробов и изменениями иммунных клеток.

Кроме того, эти данные были подтверждены посредством эксперимента с совместным содержанием. Мышей WT совместно содержали с мышами Tg того же возраста в течение 7 месяцев с рождения. Совместно содержащиеся мыши WT демонстрировали снижение обучения различению, сравнимое с мышами Tg (фиг.9a). Для установления причин этого, анализ изменения кишечной микробиоты у этих мышей в возрасте 7 месяцев показал, что композиция кишечной микробиоты была довольно сходной между совместно содержащимися мышами WT и мышами Tg на поздней стадии (в возрасте 7 месяцев), но значительно отличалась от мышей WT того же возраста, содержащихся отдельно (фиг.2d), что указывает на то, что длительное воздействие на мышей WT бактерий Tg (т.е. модель кишечных микробов при AD у мышей Tg) вызывало сдвиг композиции кишечной микробиоты у мышей WT в направлении мышей Tg, и в то же время вызывало снижение когнитивных функций. Это позволяет предложить стратегию для создания модели AD, которая отличается от общепринятой схемы, т.е. посредством регуляции паттерна кишечной микробиоты модели WT для изменения на микробиоту модели AD.

Более того, уровни инфильтрирующих Th1-клеток между совместно содержащимися мышами WT и Tg также были сравнимыми, что в обоих случаях значительно превышало уровни у отдельно содержащихся мышей WT (фиг.2e). Между тем, уровни клеток M1 возрастали у совместно содержащихся мышей WT (фиг.2f). Одновременно с изменением иммунных клеток экспрессия цитокинов в головном мозге продемонстрировала выраженное сходство между совместно содержащимися мышами WT и Tg, но отличалась от их экспрессии у мышей WT (фиг.2g).

Таким образом, приведенное выше описание подтвердило, что путем изменения кишечной микробиоты мышей WT на кишечную микробиоту мышей Tg, клетки Th1 и M1 мышей WT преобразовывались в состояние, сходное с состоянием у мышей Tg, что приводило к сходному снижению когнитивных способностей, и также подтверждению причинно-следственной взаимосвязи между изменениями кишечной микробиоты и изменением иммунных клеток, а также когнитивной функции.

Более того, авторы изобретения использовали мышей C57BL/6WT для создания модели для демонстрации терапевтической ценности описанного выше способа. Авторы изобретения провели эксперименты по трансплантации фекальной микробиоты (FMT) с использованием мышей C57BL/6 WT, и результаты представлены в столбцах 6-10 фиг.16.

Мышам C57BL/6WT вводили антибиотики для обеспечения первоначальной среды для последующей трансплантации фекальной микробиоты. Агрегированный Aβ инъецировали в их гиппокамп, а затем перорально вводили фекальные бактерии от мышей Tg в возрасте от 7 до 9 месяцев ("Receptor_C57_ Receiving TG Fecal Bacteria") или фекальные бактерии от мышей WT мышей ("Receptor_C57_Receive WT Fecal Bacteria") в качестве контроля. Это приводило к значительному повышению уровня Th1-клеток и значительному снижению уровня Th2 в головном мозге по сравнению с контролем (фиг.9b), что согласовывалось с изменениями у мышей Tg, описанными выше. Это доказало, что трансплантация фекалий Tg может приводить к изменению паттерна кишечных микроорганизмов у мышей WT, что также приводит к изменению паттерна иммунных клеток.

С другой стороны, напротив, трансплантация фекалий от мышей WT с нормальным паттерном распределения кишечных микроорганизмов снижала уровень Th1-клеток в головном мозге реципиентных мышей Tg (фиг.9c). Это показало, что паттерн кишечных микробов мышей Tg изменяется относительно паттерна кишечных микробов у мышей WT, и также изменяется паттерн иммунных клеток.

Эти результаты вновь подтвердили причинно-следственную взаимосвязь между изменениями кишечной микробиоты и изменениями иммунных клеток головного мозга (особенно Th1/M1) и когнитивной функции при прогрессировании AD. Для лечения AD была предложена и подтверждена стратегия использования оси головной мозг-кишечник.

Взятые вместе, эти данные указывают на то, что изменение кишечной микробиоты запускает инфильтрацию периферических иммунных клеток и нейровоспалительную активацию при прогрессировании AD. Путем введения средств (например, фекалий WT с нормальными паттернами распределения кишечных микроорганизмов или OM1, проиллюстрированного ниже), регулирующих относительное содержание кишечных микробов, мышам Tg, распределение кишечных микробов которых демонстрирует связанный с заболеванием паттерн, происходила реорганизация распределения кишечных микроорганизмов у мышей Tg в направлении раннего и нормального распределения кишечных микроорганизмов. Это эффективно обращало вспять паттерн иммунных клеток с преобладанием Th1/M1 у мышей Tg, тем самым улучшая когнитивную функцию и осуществляя лечение AD. Это обеспечивает надежное основание и убедительные доказательства для дальнейшего улучшения когнитивной функции и лечения AD путем реорганизации распределения кишечных микроорганизмов у людей-пациентов с AD (например, стратегия использования средств для регуляции относительного содержания кишечных микроорганизмов) для обращения вспять паттерна иммунных клеток; а также для применения распределения кишечных микроорганизмов и/или статуса иммунных клеток (например, статуса Th1 (например, доля в популяции), статуса M1 (например, доля в популяции)) в качестве маркеров прогрессирования AD.

Пример 3 OM1 облегчает нейровоспаление посредством регуляции кишечной микробиоты

Незаменимая роль кишечной микробиоты при прогрессировании AD, показанная в настоящем описании, может указывать на терапевтические последствия вмешательства в микробиоту кишечника. Чтобы вновь это подтвердить, авторы изобретения использовали OM1, который является клинически одобренным лекарственным средством против AD, экстрагированным из коричневых водорослей. OM1 представляет собой смесь кислых линейных олигосахаридов со степенью полимеризации в диапазоне от димера до декамера со средней молекулярной массой приблизительно 1 кДа (фиг.3a).

У модельных мышей с APP/PS1 поздней стадии AD в возрасте от 9 месяцев до 12 месяцев, которым вводили OM1 в течение 3 месяцев, OM1 демонстрировал выраженный эффект смягчения когнитивного расстройства, как показано посредством усиленного пространственного обучения, и характеристик памяти у мышей APP/PS1 как в обучающем испытании (фиг.3b), так и в пробном испытании (фиг.3c) в задании с водным лабиринтом Морриса (MWM). OM1 также значительно улучшал результаты мышей в Y-лабиринте (фиг.3d). Недавно OM1 показал терапевтический эффект в отношении обращения вспять нарушения состояния у пациентов с AD в 36-недельном мультицентровом рандомизированном двойном слепом плацебо-контролируемом клиническом испытании фазы 3 (код клинического испытания: CTR20140274) в Китае. Авторы изобретения интересовались пониманием того, демонстрирует ли OM1 эффект улучшения когнитивной функции путем влияния на микробиоту пациентов с AD.

Интересно, что пероральное введение OM1 в течение одного месяца мышам Tg на поздней стадии, начиная в возрасте 7 месяцев изменяло состав кишечной микробиоты (фиг.4a-b; фиг.10a), восстанавливая его в направлении паттерна WT (фиг.13-14; фиг.16).

Наряду с изменением кишечной микробиоты, введение OM1 мышам Tg нарушало корреляцию между количествами лимфоцитов в головном мозге и изменением кишечных бактерий (фиг.4c; фиг.10b и c), снижало уровни Th1-клеток в головном мозге (фиг.4d), значительно снижало активацию микроглии до уровней, сходных с мышами WT (фиг.4e) и снижало уровни цитокинов в головном мозге (фиг.4f), восстанавливая их в направлении паттерна WT (фиг.15). Параллельно, введение OM1 значимо снижало отложение бляшек Aβ, фосфорилирование тау и снижение обучения различению, наблюдаемое у мышей Tg (фиг.4g-i). Это вновь подтвердило стратегию восстановления распределения кишечных микробов, например, с использованием средств для регуляции относительного содержания кишечных микробов, для обращения вспять паттерна иммунных клеток, тем самым улучшая состояния и осуществляя лечение AD.

Далее авторы изобретения провели трансплантацию фекальной микрофлоры (FMT), трансплантируя фекалии мышей Tg, которым вводили OM1, реципиентным мышам C57BL/6 WT, которым проводили внутрижелудочковую инъекцию агрегированного Aβ. Фекалии мышей Tg, которым вводили OM1, приводили к снижению уровня Th1-клеток головного мозга реципиентных мышей по сравнению с мышами Tg без введения OM1 (фиг.10e). Можно видеть, что фекалии мышей Tg, которым вводили OM1, и фекалии мышей WT, проверенные в примере 2, имеют сходный эффект на восстановления распределения кишечных микробов и снижение Th1, что подтверждает эффект восстановления OM1 на кишечные микробы мышей Tg. В соответствии с этим, введение антибиотиков снижало эффект OM1 на клетки Th1, уровни IBA1 и экспрессию цитокинов в модели на мышах APP/PS1 (фиг.10f-j). Все эти данные показали, что OM1 может облегчать нейровоспаление и снижение когнитивной функции посредством модулирования дисбиоза кишечника.

Как правило, приведенные выше эксперименты на мышах in vivo полностью подтвердили изменения кишечных микробов и их тенденцию к регуляции преобладания иммунных клеток Th1/M1 и его обращения вспять при когнитивных нарушениях, таких как AD, и их улучшениях, для каскадов регуляции оси головной мозг-кишечник при AD и способов лечения с вмешательством в них. Кроме того, такие регуляторные каскады и вмешательства стабильно демонстрируются в различных моделях на мышах (модель на трансгенных (Tg) 5XFAD, модель на мышах APP/PS1, модель на мышах C57BL/6), хотя существуют определенные внутривидовые и межиндивидуальные различия в первоначальном состоянии и переходе процесса для кишечных микробов среди этих мышей. Таким образом, общность таких регуляторных каскадов и вмешательств у различных индивидуумов полностью подтверждается. Таким образом, предлагается стратегия улучшения когнитивной функции и лечения AD посредством регуляции кишечных микробов для восстановления кишечных микробов к нормальному и здоровому состоянию с целью обращения вспять состояния опосредуемого иммунными клетками заболевания.

Авторы изобретения использовали данные для пациентов с AD и здоровых контролей для сравнения и анализа связанных с осью головной мозг-кишечник при AD микроорганизмов, которые различаются между этими двумя моделями, как приведено в таблицах 1-2 и как проиллюстрировано на фиг.17-18, в качестве мишени для регуляции. При применении вышеупомянутой стратегии лечения, направленной на ось головной мозг-кишечник при AD для людей, в дополнение к межвидовым различиям кишечных микробов между протестированными мышами в качестве грызунов и людьми в качестве приматов, протестированных в рамках настоящего изобретения, внутривидовые и межиндивидуальные различия кишечных микроорганизмов между пациентами AD также должны полностью учитываться. Таким образом, типы кишечных микроорганизмов мышей, конкретно показанные в приведенных выше экспериментах, являются только инструктирующими, и не должны жестко и механически применяться для пациентов-людей с AD.

Пример 4: OM1 ингибирует нейровоспаление посредством регуляции метаболизма аминокислот

В рамках настоящего изобретения также исследована промежуточная связь между изменением кишечной микробиоты и изменением иммунных клеток или вмешательством в него.

Причинно-следственная связь между метаболитами кишечных микробов и дифференцировкой наивных T-клеток в Th1/Th2, и вмешательство в них

Для тестирования возможного вовлечения метаболитов в иммунное модулирование супернатант культивируемых фекалий in vitro от мышей Tg в возрасте 7 месяцев добавляли к культуре наивных CD4⁺ T-клеток, что стимулировало дифференцировку наивных CD4⁺ T-клеток в Th1- и Th2-клетки. Напротив, фекальный супернатант мышей Tg, которым вводили OM1, способствовал дифференцировке в Th2 и ингибировал дифференцировку в Th1 (фиг.11a), что указывает на то, что метаболиты микробов кишечника влияют на дифференцировку наивных T-клеток в Th1- и Th2-клетки.

Причинно-следственная связь между аминокислотами в метаболитах кишечных микробов и дифференцировкой наивных T-клеток в Th1/Th2, и вмешательство в них

Авторы изобретения далее использовали способ нецелевой метаболомики для охарактеризации фекального метаболома. Всего 11289 метаболитов было идентифицировано в фекальных образцах от мышей WT, Tg и мышей Tg, которым вводили OM1 (фиг.11b-c). Среди этих метаболитов содержание 124 метаболитов, аннотированных в базе данных METLIN, значительно изменялось, снижалось или повышалось у мышей Tg относительно мышей WT, что указывает на то, что они связаны с AD. Поразительно, все эти изменения метаболитов могут быть в значительной степени обращены вспять посредством обработки OM1 (фиг.11d-f), что указывает на то, что лечение AD восстанавливало аномальное состояние этих связанных с AD метаболитов. Эти измененные метаболиты далее аннотировали с использованием базы данных Human Metabolome Database (HMDB) и Kyoto Encyclopaedia of Genes and Genomes (KEGG) с получением всего 31 метаболита, которые дифференциально регулировались у мышей WT, Tg и мышей Tg, которым вводили OM1, которые могли быть сопоставлены со всеми тремя базами данных (HMDB, METLIN, KEGG). Анализ обогащения каскадов для этих метаболитов с использованием MBROLE или MetaboAnalyst далее продемонстрировал значимые изменения связанных с аминокислотами метаболических каскадов и ферментов, особенно связанных с фенилаланином каскадов (фиг.5a).

Таким образом, авторы изобретения решили сфокусироваться на аминокислотах для дальнейшего испытания. Проводили скрининг концентраций в плазме всего 36 аминокислот (таблица 3) как у мышей WT, так и у мышей Tg. Для классификации этих аминокислот использовали алгоритм случайного леса, и некоторые из них были отсортированы, как показано на фиг.19 и представлено в таблице 4. Фенилаланин был оценен в качестве наивысшего результата, за которым следовали изолейцин, серотонин, гистидин и ацетилорнитин. Многопараметрический поисковый анализ этих пяти аминокислот выявил значимые различия между мышами WT и Tg в соответствии с кривой операционных характеристик приемника (ROC) (фиг.5b; фиг.11h), что указывает на то, что они являются тесно связанными с прогрессированием заболевания. Затем авторы изобретения исследовали концентрацию выбранных аминокислот в образцах фекалий и крови в мышей Tg, которым вводили OM1 или не проводили введение, и сравнили ее с мышами WT. Ссылаясь на фиг.20 и фиг.21, авторы изобретения обнаружили, что OM1 влиял на различные аминокислоты, и они восстанавливались от паттерна Tg к паттерну дикого типа. В частности, концентрации фенилаланина и изолейцина были значимо более высокими в фекалиях мышей Tg, чем в фекалиях мышей WT, и введение OM1 значимо снижало их концентрации до уровня, сравнимого с уровнем у мышей WT (фиг.5c). Сходные изменения содержания фенилаланина и изолейцина были обнаружены в крови (фиг.5d). Следует отметить, что фенилаланин и изолейцин являются типичными представителями метаболитов кишечных микробов, которые изменяются при прогрессировании заболевания и обращаются вспять посредством OM1. Кроме того, авторы изобретения также обнаружили, что после введения OM1 цитокины мышей имеют тенденцию к восстановлению до паттерна дикого типа (фиг.22). Это соответствует статусу цитокинов у мышей WT, имеющему тенденцию к изменению до паттерна у мышей Tg, как показано на фиг.2g, при совместном содержании с мышами Tg.

Для тестирования того, было ли повышение уровня этих аминокислот результатом изменения кишечной микробиоты, тем самым обеспечивающего вмешательство в аминокислоты путем препятствования кишечной микробиоте, авторы изобретения исследовали концентрацию аминокислот в исследовании FMT. Фекалии мышей WT в возрасте 2 месяцев могли значительно снижать уровень фенилаланина и изолейцина у мышей Tg (фиг.11i). Аналогично, у совместно содержащихся мышей WT, описанных на фиг. 2, концентрации фенилаланина и изолейцина в крови также повышались, что было сравнимым с мышами Tg (фиг.11j). Таким образом, можно было определить, что, когда мышей WT совместно содержали с мышами Tg для преобразования их собственного паттерна кишечных микробов WT в паттерн Tg, происходило аномальное продуцирование фенилаланина и изолейцина и уровень фенилаланина и изолейцина возрастал. Напротив, трансплантация фекалий мышей WT, содержавших нормальную кишечную микробиоту WT, мышам Tg вызывала сдвиг кишечной микробиоты мышей Tg в сторону паттерна WT, что приводило к восстановлению аномального продуцирования фенилаланина и изолейцина, и уровень фенилаланина и изолейцина снижался. Это подтверждало, что уровни метаболитов кишечных микробов фенилаланина и изолейцина могут быть восстановлены путем восстановления кишечной микробиоты мышей Tg.

Подтверждение того, что фенилаланин и изолейцин влияют на дифференцировку наивных T-клеток в Th1/Th2, и вмешательство в них

Для оценки эффектов фенилаланина и изолейцина на клетки, эти два соединения добавляли непосредственно в культуру наивных CD4⁺ T-клеток. Происходило повышение как дифференцировки Th0-клеток в Th1-клетки (фиг.5e), так и пролиферации Th1-клеток (фиг.5f). Напротив, введение OM1 может ингибировать дифференцировку Th1, индуцированную фенилаланином и изолейцином и стимуляцию пролиферации Th1-клеток, что указывает на то, что OM1 не только влияет на кишечные микробы, но также прямо влияет на саму их аминокислоту-метаболит. Кроме того, авторы изобретения проводили мышам WT внутрибрюшинную инъекцию фенилаланина и изолейцина и обнаружили, что количество Th1-клеток в крови значительно возрастало (фиг. 5g), подтверждая, что аминокислоты способствуют дифференцировке Th0 в Th1 in vivo. Эти результаты указывают на то, что накопление фенилаланина и изолейцина может повышать количество Th1-клеток в крови.

Вмешательство в дифференцировку наивных T-клеток путем препятствования захвату аминокислот наивными T-клетками

Аминокислоты могут захватываться иммунными клетками через специализированные переносчики. Авторы изобретения далее исследовали уровни экспрессии SLC7A5, переносчика фенилаланина и изолейцина, в наивных CD4⁺ T-клетках и обнаружили, что SLC7A5 экспрессировался в CD4⁺ T-клетках. Инкубация CD4⁺ T-клеток с ¹³C-меченным фенилаланином продемонстрировала захват фенилаланина CD4⁺ T-клетками, который мог блокироваться фармакологическим ингибитором SLC7A5, JPH 203 (фиг.11k), указывая на то, что он способен ингибировать захват аминокислот иммунными клетками посредством ингибирования переносчиков аминокислот. Авторы изобретения далее протестировали полученное изменение соотношения Th1-клеток. Мышам 5XFAD в возрасте 6 месяцев вводили 50 мг/кг JPH 203 или контроль в виде носителя посредством внутрибрюшинной инъекции каждые сутки. Через один месяц после введения мышей умерщвляли и долю провоспалительных Th1-клеток в головном мозге мышей в контрольной группе и группе введения JPH 203 анализировали посредством проточной цитометрии. Это было репрезентативным, отражая нейровоспаление в головном мозге. Результаты представлены на фиг.13. По сравнению с группой контроля в виде носителя, введение JPH203 в течение одного месяца значительно снижало долю провоспалительных Th1-клеток в головном мозге мыши, демонстрируя, что посредством ингибирования переносчика аминокислот поглощение аминокислот иммунными клетками ингибируется, тем самым предотвращая способствование аминокислотами дифференцировке иммунных клеток и снижая нейровоспаление в головном мозге.

Подтверждение аномальных уровней фенилаланина и изолейцина у людей с AD

Наконец, автор изобретения подтверждает это у человека, исследуя, могут ли указанные выше данные быть воспроизведены у пациентов с MCI вследствие AD (см. способ, использованный в этом исследовании для определения MCI, использованного в этом исследовании). Действительно, концентрации фенилаланина и изолейцина, а также количества Th1-клеток в крови индивидуумов с MCI вследствие AD (n=9) были значимо более высокими, чем у совпадающих по возрасту здоровых индивидуумов (n=18) (фиг.5h, i). Повышенные уровни как фенилаланина, так и изолейцина в крови также были подтверждены в другой небольшой группе с MCI вследствие AD (фиг.5j), таким образом обеспечивая планирование стратегий диагностики и лечения у человека на основе этого.

В общем, авторы изобретения обнаружили, что несколько метаболитов кишечных микробов вовлечено в последующий переход иммунных клеток в состояние преобладания Th1. Авторы изобретения, в частности, исследовали аминокислоты в метаболитах, особенно фенилаланин и изолейцин, и подтвердили причинно-следственную взаимосвязь между изменениями состава кишечной микробиоты, аномальным продуцированием фенилаланина и изолейцина, и чрезмерной дифференцировкой в Th1 наивных T-клеток. Посредством введения фекальных бактерий WT и OM1, для которых выше подтверждено, что они восстанавливают аномальную микробиоту мышей Tg в сторону нормальной кишечной микробиоты WT, аномально высокие уровни фенилаланина и изолейцина снижались и восстанавливались до нормального уровня. Более того, дифференцировка Th0 клеток в Th1-клетки ингибировалась, обращая вспять болезненное состояние с преобладанием Th1, подтверждая, что метаболиты кишечных микробов являются мостиком между аномальным составом микробиоты кишечника и аномальным состоянием иммунных клеток, и они являются частью взаимосвязей в оси головной мозг-кишечник при AD. Авторы изобретения также протестировали другие способы препятствования метаболитам, такие как снижение уровня метаболитов или препятствование поглощению метаболитов иммунными клетками, для вмешательства в последующее аномальное состояние иммунных клеток посредством метаболитов кишечных микробов, и, таким образом, в когнитивное состояние.

Хотя принцип настоящего изобретения описан выше применительно к предпочтительным вариантам осуществления, должно быть хорошо понятно, что описание приводится только в качестве примера, и не для ограничения объема настоящего изобретения.

Таблица 1. Перечень измененной флоры у пациентов с AD или мышей

Классификация	Наименование на английском языке	Соответствующее наименование
Тип	Actinobacteria	p__Actinobacteria
Тип	Bacteroidetes	p__Bacteroidetes
Тип	Firmicutes	p__Firmicutes
Тип	Proteobacteria	p__Proteobacteria
Тип	Tenericutes	p__Tenericutes
Класс	BetaProteobacteria	c__BetaProteobacteria
Порядок	Burkholderiales	o__Burkholderiales
Семейство	Bacteroidaceae	f__Bacteroidaceae
Семейство	Bifidobacteriaceae	f__Bifidobacteriaceae
Семейство	Burkholderiaceae	f__Burkholderiaceae
Семейство	Clostridiaceae	f__Clostridiaceae
Семейство	Desulfovibrionaceae	f__Desulfovibrionaceae
Семейство	Erysipelotrichaceae	f__Erysipelotrichaceae
Семейство	Fusobacteriaceae	f__Fusobacteriaceae
Семейство	Gemellaceae	f__Gemellaceae
Семейство	Helicobacteriaceae	f__Helicobacteraceae
Семейство	Lachnospiraceae	f__Lachnospiraceae
Семейство	Mogibacteriaceae	f__Mogibacteriaceae
Семейство	norank_Bacteroidales_S24-7_group	f__Bacteroidales_S24-7_group
Семейство	Peptostreptococcaceae	f__Peptostreptococcaceae
Семейство	Prevotellaceae	f__Prevotellaceae
Семейство	Rikenellaceae	f__Rikenellaceae
Семейство	Ruminococcaceae	f__Ruminococcaceae
Семейство	Staphylococcaceae	f__Staphylococcaceae
Семейство	Turicibacteraceae	f__Turicibacteraceae
Семейство	Turicibacteriaceae	f__Turicibacteriaceae
Род	Actinobacillus_actinomycetemcomitans	g__Actinobacillus_actinomycetemcomitans
Род	Actinobacteria	g__Actinobacteria
Род	Adlercreutzia	g__Adlercreutzia
Род	Alistipes	g__Alistipes
Род	Alternaria	g__Alternaria
Род	Bacteroides	g__Bacteroides
Род	Bifidobacteria	g__Bifidobacteria
Род	Bifidobacterium	g__Bifidobacterium
Род	Bilophila	g__Bilophila
Род	Blautia	g__Blautia
Род	Botrytis	g__Botrytis
Род	Candida	g__Candida
Род	cc115	g__cc115
Род	Clostridium	g__Clostridium
Род	Dialister	g__Dialister
Род	E_coli_K99	g__E_coli_K99
Род	Escherichia	g__Escherichia
Род	Eubacterium_rectale	g__[Eubacterium]_rectale
Род	Fusarium	g__Fusarium
Род	Gemella	g__Gemella
Род	Lactobacilli	g__Lactobacilli
Род	Malassezia	g__Malassezia
Род	Phascolarctobacterium	g__Phascolarctobacterium
Род	Shigella	g__Shigella
Род	SMB53	g__SMB53
Род	Sutterella	g__Sutterella
Род	Tannerella_forsythia	g__Tannerella_forsythia
Род	Turicibacter	g__Turicibacter
Род		g__Escherichia-Shigella

Таблица 2. Перечень флоры со значительными отличиями относительного содержания кишечных бактерий между пациентами с AD и здоровыми контролями (HC)

Класси-фикация	Родовое наименование	AD -среднее значение (%)	HC - среднее значение (%)	Кратность изменений при AD по сравнению с HC	Повышение или снижение регуляции при AD по сравнению с HC
Тип	p__Firmicutes	39,41	44,07	0,8942591	Снижение регуляции
Тип	p__Bacteroidetes	38,03	39,9	0,9531328	Снижение регуляции
Тип	p__Proteobacteria	12,85	8,086	1,5891665	Повышение регуляции
Тип	p__Actinobacteria	5,065	3,522	1,4381034	Повышение регуляции
Тип	p__Fusobacteria	2,028	1,001	2,025974	Повышение регуляции
Тип	p__Cyanobacteria	0,7771	1,227	0,6333333	Снижение регуляции
Тип	p__Verrucomicrobia	0,2726	0,7585	0,3593935	Снижение регуляции
Класс	c__Bacteroidia	37,38	39,51	0,9460896	Снижение регуляции
Класс	c__Clostridia	25,5	32,33	0,7887411	Снижение регуляции
Класс	c__GammaProteobacteria	10,19	4,734	2,1525137	Повышение регуляции
Класс	c__Bacilli	5,575	6,606	0,8439298	Снижение регуляции
Класс	c__Negativicutes	6,319	4,507	1,4020413	Повышение регуляции
Класс	c__Actinobacteria	5,791	3,522	1,6442362	Повышение регуляции
Класс	c__Fusobacteriia	2,379	1,001	2,3766234	Повышение регуляции
Класс	c__BetaProteobacteria	1,298	1,438	0,9026426	Снижение регуляции
Класс	c__AlphaProteobacteria	1,104	1,349	0,818384	Снижение регуляции
Порядок	o__Bacteroidales	37,38	39,51	0,9460896	Снижение регуляции
Порядок	o__Clostridiales	25,43	32,24	0,7887717	Снижение регуляции
Порядок	o__Enterobacteriales	8,983	3,453	2,6015059	Повышение регуляции
Порядок	o__Selenomonadales	6,319	4,507	1,4020413	Повышение регуляции
Порядок	o__Lactobacillales	4,803	5,774	0,8318324	Снижение регуляции
Порядок	o__Bifidobacteriales	3,887	1,304	2,9808282	Повышение регуляции
Порядок	o__Fusobacteriales	2,379	1,001	2,3766234	Повышение регуляции
Порядок	o__Burkholderiales	1,012	1,158	0,8739206	Снижение регуляции
Порядок	o__Bacillales	0,7707	0,8287	0,9300109	Снижение регуляции
Семейство	f__Rikenellaceae	0,5028	1,018	0,4939096	Снижение регуляции
Семейство	f__Ktedonobacteraceae	0,000187	0,001769	0,1057094	Снижение регуляции
Семейство	f__Nannocystaceae	0	0,001947	0	Снижение регуляции
Род	g__Lachnospiraceae_NK4A136_group	0,5582	1,478	0,3776725	Снижение регуляции
Род	g__Alistipes	0,4237	0,9265	0,4573125	Снижение регуляции
Род	g__Ruminococcus_1	0,2783	0,9167	0,303589	Снижение регуляции
Род	g__Ruminococcaceae_UCG-002	0,4232	0,6621	0,6391784	Снижение регуляции
Род	g__Ruminococcaceae_UCG-005	0,2549	0,5889	0,4328409	Снижение регуляции
Род	g__Coprococcus_2	0,1136	0,6677	0,1701363	Снижение регуляции
Род	g__Tyzzerella_4	0,4165	0,08026	5,1893845	Повышение регуляции
Род	g__Lachnospiraceae_UCG-001	0,04241	0,1747	0,242759	Снижение регуляции
Род	g__Anaerotruncus	0,08045	0,1342	0,5994784	Снижение регуляции
Род	g__Cloacibacterium	0,005284	0,001851	2,8546731	Повышение регуляции
Род	g__norank_f__Ktedonobacteraceae	0,000187	0,001769	0,1057094	Снижение регуляции
Род	g__Nannocystis	0	0,001947	0	Снижение регуляции
Род	g__norank_f__Hydrogenophilaceae	0,001435	0,0002894	4,9585349	Повышение регуляции
Вид	s__unclassified_g__Subdoligranulum	0,1108	0,7963	0,1391435	Снижение регуляции
Вид	s__unclassified_g__Alistipes	0,2412	0,6416	0,3759352	Снижение регуляции
Вид	s__uncultured_organism_g__Parasutterella	0,09518	0,4442	0,2142729	Снижение регуляции
Вид	s__unclassified_g__Tyzzerella_4	0,4165	0,08026	5,1893845	Повышение регуляции
Вид	s__uncultured_organism_g__ Ruminococcaceae_UCG-005	0,1649	0,1728	0,9542824	Снижение регуляции
Вид	s__uncultured_organism_g__Anaerotruncus	0,02364	0,05794	0,4080083	Снижение регуляции
Вид	s__uncultured_Alistipes_sp._g__Alistipes	0,02727	0,04977	0,5479204	Снижение регуляции
Вид	s__Lachnospiraceae_bacterium _TF01-11	0,009628	0,05391	0,178594	Снижение регуляции
Вид	s__unclassified_g__Anaerotruncus	0,01064	0,01785	0,5960784	Снижение регуляции
Вид	s__unclassified_g__norank_o__Mollicutes_RF9	0,003794	0,01637	0,2317654	Снижение регуляции
Вид	s__uncultured_bacterium_g__Семейство_XIII_AD3011_group	0,008094	0,007951	1,0179852	Повышение регуляции
Вид	s__uncultured_bacterium_g__norank_f__Christensenellaceae	0,007214	0,007841	0,9200357	Снижение регуляции
Вид	s__uncultured_bacterium_g__Cloacibacterium	0,005284	0,001851	2,8546731	Повышение регуляции
Вид	s__uncultured_organism_g__Peptococcus	0	0,006374	0	Снижение регуляции
Вид	s__Mycobacterium_celatum_g__Mycobacterium	0,00115	0,005163	0,2227387	Снижение регуляции
Вид	s__unclassified_g__Oceanobacillus	0,004827	0,001018	4,7416503	Повышение регуляции
Вид	s__Alistipes_putredinis_DSM_17216	0,000187	0,003568	0,0524103	Снижение регуляции
Вид	s__Prevotella_loescheii	0,002635	0,0004672	5,6399829	Повышение регуляции
Вид	s__uncultured_bacterium_g__norank_o__MBA03	0,002428	0,0004532	5,3574581	Повышение регуляции
Вид	s__Eubacterium_brachy	0,002443	0,0001614	15,136307	Повышение регуляции
Вид	s__uncultured_bacterium_adhufec108	0	0,002173	0	Снижение регуляции
Вид	s__uncultured_Clostridiales_bacterium_g__norank_f__Ktedonobacteraceae	0,000187	0,001769	0,1057094	Снижение регуляции
Вид	s__Nannocystis_pusilla	0	0,001947	0	Снижение регуляции
Вид	s__bacterium_2013Ark19i	0,001435	0,0002894	4,9585349	Повышение регуляции
Вид	s__Auxenochlorella_protothecoides_g__norank	0,001463	0,0001447	10,110574	Повышение регуляции
Вид	s__uncultured_Bacteroidetes _bacterium_g__Dinghuibacter	0	0,0009268	0	Снижение регуляции

Таблица 3. В приведенном ниже перечне приводится наименование аминокислот, выявленных в крови мышей WT (2-9 месяцев) и Tg (2-9 месяцев). Связана с фиг.5b.

[01] Наименование аминокислот

глицин

аланин

серин

валин

4-OH пролин

аспарагин

глутамин

тирозин

гипотаурин

сульфоксид метионина

бета-аланин

треонин

лейцин

орнитин

аспарагиновая кислота

метионин

гистидин

фенилаланин

аргинин

пролин

таурин

изолейцин

глутаминовая кислота

цитруллин

триптофан

кинуренин

ГАМК

лизин

пироглутаминовая кислота

ацетилорнитин

асимметричный диметиларгинин

альфа-аминоадипиновая кислота

карнозин

креатинин

путресцин

серотонин

Таблица 4. ROC-анализ всех аминокислотных маркеров в крови мышей WT и мышей Tg по порядку частоты выбора

Аминокислота	Ранговая частота	WT	Tg
фенилаланин	0,42	низкий	высокий
изолейцин	0,4	низкий	высокий
Серотонин	0,36	низкий	высокий
гистидин	0,34	низкий	высокий
ацетилорнитин	0,32	высокий	низкий
Кинуренин	0,32	низкий	высокий
триптофан	0,28	низкий	высокий
лейцин	0,28	низкий	высокий
глутаминовая кислота	0,26	низкий	высокий
пироглутаминовая кислота	0,22	низкий	высокий
валин	0,2	низкий	высокий
глутамин	0,2	низкий	высокий
бета-аланин	0,2	низкий	высокий
гипотаурин	0,18	низкий	высокий
тирозин	0,12	низкий	высокий
асимметричный диметиларгинин	0,12	высокий	низкий
глицин	0,1	низкий	высокий
Карнозин	0,08	низкий	высокий
4-OH пролин	0,08	низкий	высокий
аспарагиновая кислота	0,06	высокий	низкий
треонин	0,06	низкий	высокий
альфа-аминоадипиновая кислота	0,04	низкий	высокий
орнитин	0,04	низкий	высокий
Креатинин	0,04	низкий	высокий
аланин	0,04	низкий	высокий
ГАМК	0,02	низкий	высокий
сульфоксид метионина	0,02	низкий	высокий
пролин	0,02	низкий	высокий

1. Применение средства для ингибирования захвата аминокислот наивными T-клетками в периферической крови млекопитающего для производства лекарственного средства для лечения болезни Альцгеймера у индивидуума, где аминокислота представляет собой одну или несколько, выбранных из следующих: 4-OH пролин, ацетилорнитин, аланин, альфа-аминоадипиновая кислота, аспарагин, аспарагиновая кислота, асимметричный диметиларгинин, бета-аланин, карнозин, цитруллин, креатинин, ГАМК, глутаминовая кислота, глутамин, глицин, гистидин, гипотаурин, изолейцин, кинуренин, лейцин, лизин, метионин, сульфоксид метионина, орнитин, фенилаланин, пипеколиновая кислота, пролин, путресцин, пироглутаминовая кислота, серин, серотонин, таурин, треонин, триптофан, тирозин и валин.

2. Применение по п.1, где аминокислота представляет собой одну или несколько, выбранных из фенилаланина, изолейцина, серотонина, гистидина и ацетилорнитина; более предпочтительно фенилаланина и/или изолейцина; наиболее предпочтительно фенилаланина.

3. Применение по п.1, где средство ингибирует захват аминокислот наивными T-клетками путем ингибирования транспорта аминокислот в наивную T-клетку посредством переносчика.

4. Применение по п.3, где переносчиком является SLC7A5.

5. Применение по п.4, где средство включает одно или несколько, выбранных из JPH 203, BCH и KMH-233.

6. Применение по п.1, где средство снижает долю провоспалительных Th1-клеток среди CD4+ T-клеток в образце от индивидуума приблизительно на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% или более; и/или делает долю провоспалительных Th1-клеток в CD4+ T-клетках близкой к или достигающей соответствующей доли провоспалительных Th1-клеток в CD4+ T-клетках соответствующего нормального индивидуума, где близко к означает, что разница между индексом до корректировки и соответствующим индексом соответствующего нормального субъекта уменьшается более чем или ровно на 10%.

7. Применение по п.1, где средство снижает относительный уровень захвата аминокислот наивными T-клетками приблизительно на 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295, 300 или более; и/или делает относительный уровень захвата аминокислот наивными T-клетками близким или достигающим соответствующий относительный уровень захвата аминокислот наивными T-клетками соответствующего нормального индивидуума, где близко к означает, что разница между индексом до корректировки и соответствующим индексом соответствующего нормального субъекта уменьшается более чем или ровно на 10%.

8. Способ лечения пациента, имеющего болезнь Альцгеймера, включающий:

введение средства для ингибирования захвата аминокислот наивными T-клетками в периферической крови млекопитающего пациенту, так чтобы происходила регуляция доли провоспалительных Th1-клеток среди CD4+ T-клеток у пациента так, чтобы она была близкой к или достигала соответствующей доли провоспалительных Th1-клеток среди CD4+ T-клеток в соответствующей нормальной выборке, где близко к означает, что разница между индексом до корректировки и соответствующим индексом соответствующего нормального субъекта уменьшается более чем или ровно на 10%,

где аминокислота представляет собой одну или несколько, выбранных из следующих: 4-OH пролин, ацетилорнитин, аланин, альфа-аминоадипиновая кислота, аспарагин, аспарагиновая кислота, асимметричный диметиларгинин, бета-аланин, карнозин, цитруллин, креатинин, ГАМК, глутаминовая кислота, глутамин, глицин, гистидин, гипотаурин, изолейцин, кинуренин, лейцин, лизин, метионин, сульфоксид метионина, орнитин, фенилаланин, пипеколиновая кислота, пролин, путресцин, пироглутаминовая кислота, серин, серотонин, таурин, треонин, триптофан, тирозин и валин.

9. Способ лечения пациента, имеющего болезнь Альцгеймера, включающий:

введение пациенту средства для ингибирования захвата аминокислот наивными T-клетками в периферической крови млекопитающего, так чтобы происходила регуляция относительного уровня захвата аминокислот наивных T-клеток у пациента так, чтобы он был близким или достигал соответствующего относительного уровня захвата аминокислот наивными T-клетками в соответствующей нормальной выборке,

где близко к означает, что разница между индексом до корректировки и соответствующим индексом соответствующего нормального субъекта уменьшается более чем или ровно на 10%,

где аминокислота представляет собой одну или несколько, выбранных из следующих: 4-OH пролин, ацетилорнитин, аланин, альфа-аминоадипиновая кислота, аспарагин, аспарагиновая кислота, асимметричный диметиларгинин, бета-аланин, карнозин, цитруллин, креатинин, ГАМК, глутаминовая кислота, глутамин, глицин, гистидин, гипотаурин, изолейцин, кинуренин, лейцин, лизин, метионин, сульфоксид метионина, орнитин, фенилаланин, пипеколиновая кислота, пролин, путресцин, пироглутаминовая кислота, серин, серотонин, таурин, треонин, триптофан, тирозин и валин.