Способ молекулярного типирования типичных (o1) и атипичных (ro) нетоксигенных штаммов v. cholerae el tor с помощью пцр в режиме реального времени

Данное изобретение относится к микробиологии и генетической инженерии и может быть использовано в лабораторной диагностике при проведении мониторинга за холерой, планировании противоэпидемических мероприятий и исследований, связанных с изучением особенностей биологии возбудителя. Описан способ молекулярного типирования типичных (O1) и атипичных (RО) нетоксигенных штаммов V. cholerae El Tor с помощью ПЦР в режиме реального времени, включающий выделение ДНК из исследуемого штамма, проведение ПЦР со специфическими праймерами и последующим учетом реакции амплификации. Амплификацию исследуемой ДНК проводят одновременно с пятью парами праймеров, при этом в инкубационную смесь вносят 0,5 мкл интеркалирующего красителя 50Х SYBR Green I для выявления продуктов амплификации по динамике изменения показателя флюоресценции по каналу FAM амплификатора. Учет результатов осуществляют по геометрическому методу, путем регистрации Дельта С_р, отраженному на экране монитора, а именно: при наличии целевого продукта генов ACD-rtxA, tcpA, vce, vspD, vgrG3 формируется амплификон с низким показателем С_р, в пределах (8-15) циклов, подтверждая присутствие тестируемого гена типичных O1 и атипичных (RО) нетоксигенных штаммов V. cholerae O1 El Tor, в случае отсутствия специфической мишени реакция с парами праймеров образует амплификон с более высоким показателем С_р, в пределах (21-29) циклов, подтверждая отсутствие тестируемого гена. Технический результат заключается в создании простого быстрого и достоверного способа молекулярного типирования штаммов с помощью ПЦР с последующим электрофоретическим учетом результатов типичных и атипичных (RО) нетоксигенных штаммов Vibrio cholerae El Tor. 2 з.п. ф-лы, 6 табл., 4 пр.

 

Предполагаемое изобретение относится к области медицинской микробиологии и генетической инженерии и может быть использовано в лабораторной диагностике при проведении мониторинга за холерой, планировании противоэпидемических мероприятий и исследований, связанных с изучением особенностей биологии возбудителя.

При выделении штаммов V. cholerae O1 E1 Tor, а также R - вариант, из водных объектов окружающей среды возникает необходимость проведения оперативного генотипирования изолятов холерных вибрионов O1, R-вариант. Определение сходств/различий с культурами, как вновь выделенными, так и обнаруженными ранее, т.е. установление происхождения (занос/переживание), а также роли таких штаммов в этиологии спорадических случаев и вспышек диарейных заболеваний крайне важно при принятии оперативных управленческих решений, направленных на предотвращение возможных эпидемических осложнений (1).

В настоящее время для изучения молекулярно-генетических свойств штаммов V. cholerae O1 E1 Tor, а также RO применяют методы молекулярного типирования, которые базируются, с одной стороны, как на изучении отдельных генетических детерминант методом ПЦР-типирования, а также локусов генома (MLVA-типирование, VNTR-анализа), так и на анализе спонтанных вставок/делеций (insertion/deletion) нескольких нуклеотидов -INDEL-генотипирование (2). Универсального метода генотипирования нет.

Наиболее современным способом молекулярного типирования является полногеномное секвенирование изучаемого штамма Vibrio cholerae с последующим биоинформационным анализом результатов и сравнением с базами данных с помощью пакета программ (3).

Однако данный прием занимает несколько дней, требует больших финансовых и трудовых затрат на проведение секвенирования (работа высококвалифицированного персонала, амортизация дорогостоящих секвенаторов, использование картриджей, расходных материалов, компьютеров для анализа, беспрепятственного доступа к международным базам данных и результатам сиквенсов и пр.). Поэтому данный прием не может широко применяться при оперативном анализе большого числа культур и при необходимости быстрого получения ответа.

Известен способ выявления токсигенных штаммов О1 Vibrio cholerae «постгаитянской» линии методом ПЦР в режиме реального времени, заключающийся в том, что с выделенной ДНК проводят две реакции амплификации с помощью сконструированных двух пар праймеров, при этом в инкубационную смесь добавляют интеркалирующий краситель, а учет проводят по геометрическому методу путем регистрации Дельта Ср, на экране монитора (4).

Однако при всей быстроте и простоте постановки при анализе токсигенных штаммов, этот способ не позволяет с его помощью проводить типирование типичных и атипичных(RO) нетоксигенных штаммов V. cholerae E1 Tor поскольку основан на выявлении различий в одном гене rtxA, который кодирует синтез высокомолекулярного цитоксина-антимодулятора MARTX.

За прототип выбран способ идентификации нетоксигенных штаммов холерных вибрионов 01 серогруппы с помощью ПЦР для выделения генетических детерминант (5,6).

Способ основан на постановке ПЦР с последующим электрофоретическим учетом результатов типичных и атипичных (RO) нетоксигенных штаммов V. cholerae с использованием набора праймеров для детекции, состоящего из 14 генов-мишеней: RS-элемента - rstA; гена острова патогенности VPI - tcpA; генов острова патогенности VPI-2 -int, nanH, vce; гена цитотоксического кластера MARTX - rtxC; гена rtxA - кодирующего ACD-домен; генов системы секреции третьего типа T3SS - vcsN2, vspD и шестого типа T6SS - vasK, vgrG3, ACD-VgrG1; генов маннозочувствительных пилей адгезии - mshA и термостабильного токсина - stn/sto, с последующим установлением их генотипов, то есть, выявления сходств/различий со штаммами, как вновь выделенными, так и обнаруженными ранее, а также установление их происхождения (занос/переживание).

Данный прием менее затратен по сравнению с полногеномным секвенированием, занимает меньше времени (до суток) и может быть проведен в отношении большого числа культур.

Однако недостатком этого способа (выявления специфических генов) является необходимость учета продуктов реакции, а именно: выявление специфического ампликона, характерного для выявляемого гена с помощью электрофореза в геле полиакриламида или агарозы. Проведение электрофореза требует дополнительного времени, наличия сложного оборудования (как минимум, печи для плавления агарозы, прибора для проведения электрофореза, источника тока, трансиллюминатора, регистрирующей аппаратуры) и набора расходных материалов (маркеров молекулярного веса, агарозы, буферов) и средств защиты персонала.

Кроме того, в соответствии с действующими нормативными документами (МУ 1.3.2569-09) для учета результатов реакции амплификации нуклеиновых кислот методом электрофореза необходима отдельная рабочая зона 4-1, которая должна быть расположена изолировано от других помещений для предотвращения контаминации продуктами амплификации через воздушный поток.

Кроме того зона 4-1 для проведения электрофореза должна быть оснащена минимальным набором соответствующего лабораторного оборудования, а выполнение работ должно осуществляться отдельным персоналом, не задействованным на других этапах проведения ПЦР анализа. Дополнительной трудностью при проведении работ по использованию электрофореза является необходимость проведения комплекса мероприятий по дегазации образовавшихся отходов (гели и буферы), содержащих крайне опасный интеркалирующий агент - бромистый этидий.

Технической задачей предполагаемого изобретения является разработка простого, быстрого и достоверного способа молекулярного типирования штаммов с помощью ПЦР с последующим электрофоретическим учетом результатов типичных и атипичных (RO) нетоксигенных штаммов Vibrio cholerae El Tor.

Поставленная задача достигается тем, что в способе молекулярного типирования типичных (O1) и атипичных (RO) нетоксигенных штаммов V. cholerae El Tor с помощью ПЦР в режиме реального времени, включающем выделение ДНК из исследуемого штамма, проведение ПЦР со специфическими праймерами и последующим учетом реакции амплификации, отличие заключается в том, что амплификацию исследуемой ДНК проводят одновременно с пятью парами праймеров:

при этом в инкубационную смесь вносят 0,5 мкл интеркалирующего красителя 50Х SYBR Green I для выявления продуктов амплификации по динамике изменения показателя флюоресценции по каналу FAM амплификатора, учет результатов осуществляют по геометрическому методу, путем регистрации Дельта С_р отраженному на экране монитора, а именно: при наличии целевого продукта генов ACD-rtxA, tcpA, vce, vspD, vgrG3 формируется амплификон с низким в пределах (8-15) циклов, подтверждая присутствие тестируемого гена типичных 01 и атипичных (RO) нетоксигенных штаммов V. cholerae 01 El Tor, в случае отсутствия специфической мишени, реакция с парами праймеров образует амплификон с более высоким показателем С_р в пределах (21-29) циклов, подтверждая отсутствие тестируемого гена.

При этом ПЦР проводят в объеме 25 мкл и реакционная смесь содержит:: 2,5 мкл буфера, 1 Ед Taq ДНК-полимеразы, 0,2 мкМ смеси дНТФ, 0,5 мкл 50Х SYBR Green I, 1,0 мкМ каждого из, праймеров, 5 мкл ДНК - ДНК матрицы, оставшийся объем - вода.

Кроме того ПЦР реакции проводят с соблюдением режимов: денатурация при 94°С - 2 мин (1 цикл); затем 35 циклов: денатурация при 94°С - 8 секунд, отжиг и учет по каналу FAM при 60°С - 12 секунд.

Обоснование выбора праймеров.

С помощью программного обеспечения, разработанного авторами ФКУЗ Ростовского-на-Дону противочумного института Роспотребнадзора, было проанализировано более 50-и генов со специфическими праймерами типичных (О1) и атипичных (RO) нетоксигенных штаммов V. cholerae O1 El Tor.

В результате были выделены пять пар праймеров (см. таблица 1) к генам Vibrio cholerae и RO, используемые для проведения молекулярного типирования.

Критерии наличия генов V. cholerae O1 El Tor, а также RO, используемых для проведения молекулярного типирования с помощью приема ПЦР-РВ сведены в таблицу 2.

При этом по наличию целевого продукта генов ACD-rtxA, tcpA, vceLR, vspD, vgrG3 формируют амплификон с низким Ср, а при отсутствии специфической мишени, реакция с парами праймеров ACD-rtxA, tcpA, vce, vspD, vgrG3 образует амплификат с более высоким показателем Ср.

Важнейшим этапом при разработке ПЦР, обеспечивающим получение корректного результата, является правильный подбор мишеней для посадки праймеров. Основной проблемой при подборе праймеров явилась их унификация, все реакции должны успешно проходить при одинаковых условиях амплификации, что позволяет упростить проведение предлагаемого способа. Часть используемых праймеров была взята из научной литературы (Таблица 1), праймеры для выявления гена vce были сконструированы авторами с помощью комплекса программного обеспечения, разработанного во ФКУЗ Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора (г. Ростов-на-Дону).

Объектом защиты предполагаемого изобретения является набор праймеров ACD-rtxA, tcpA, vce, vspD, vgrG3, способ проведения реакции и учета результатов для молекулярного типирования штаммов V. cholerae O1 El Tor, а также RO, с помощью ПЦР в формате реального времени с использованием интекалирующего красителя SYBR Green I.

Препарат ДНК из исследуемого штамма анализируют с помощью ПЦР-РВ с набором праймеров ACD-rtxA, tcpA, vceLR, vspD, vgrG3. Использование интекалирующего красителя SYBR Green I необходимо для выявления продуктов амплификации по величине Ср регистрируемой по каналу FAM амплификатора.

Дизайн разработанных праймеров делает ненужным использование внутреннего контроля, используемого для оценки присутствия различных ингибиторов. Решаемая задача достигается тем, что при наличии целевого продукта - генов ACD-rtxA, tcpA, vceLR, vspD, vgrG3 формируется ампликон с низким Ср в пределах 8-15 цикла, а при отсутствии специфической мишени реакция происходит с образованием других ампликонов с Ср в диапазоне 21-29 (Таблица 2). Если в пробе присутствует ингибитор амплификации, то нарастания флюоресценции не происходит и показатель Ср не регистрируют.

Способ осуществляется следующим образом.

Перед постановкой ПЦР проводят предварительную подготовку материала (выделение ДНК). Массу бактерий, сформировавших газон на плотной питательной среде, стерильной палочкой перемещают в пробирку, содержащую 3-5 мл физиологического раствора. Доводят плотность суспензии до 10⁹ клеток на мл среды по оптической плотности, после чего выделяют ДНК для постановки ПЦР [7] с помощью любого коммерческого набора для выделения ДНК.

С полученной ДНК проводят реакцию амплификации с набором праймеров ACD-rtxA, tcpA, vceLR, vspD, vgrG3 в присутствии интеркалирующего красителя SYBR Green I.

Условия проведения реакции в формате реального времени.

Инкубационная смесь объемом 25 мкл содержит: 2,5 мкл буфера, 1 Ед Taq ДНК-полимеразы, 0,2 мкМ смеси дНТФ, 0,5 мкл 50Х SYBR Green I (производства ЗАО Евроген, Москва), 1,0 мкМ каждого из пары праймеров, 5 мкл ДНК - ДНК матрицы, оставшийся объем - вода.

Амплификация и последующее плавление ампликонов проводят в амплификаторе, например, (DTlite5 производства НПФ ДНК-технология), по следующей схеме: денатурация при 94°С - 2 мин (1 цикл); затем 35 циклов: денатурация при 94°С - 8 секунд, отжиг и учет по каналу FAM при 60°С - 12 секунд. Учет реакции проводят по каналу FAM.

Сущность изобретения поясняется следующими примерами.

Все штаммы взяты из коллекции живых культур ФКУЗ Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора.

Пример 1. ПЦР-типирование семи культур V. cholerae O1 El Tor, а также RO выделенных из водных объектов г. Ростова-на-Дону.

Результат ПЦР типирования семи штаммов V. cholerae O1 El Tor, выделенных из реки Темерник в период 2005-2020 годов с помощью ПЦР в режиме реального времени, представлены в таблице 3.

Осуществляли типирование штаммов V. cholerae O1 El Tor №№18776, 18903, 19092, 19430, 20000, 20430, 20570, которые были выделены из реки Темерник в период 2005-2020 годов. Последние хранятся в коллекции ФКУЗ Ростовский-на-Дону противочумного институт Роспотребнадзора.

Суточные агаровые культуры суспендировали в дистиллированной воде до 1 × 10⁹ микробных клеток в 1 мл и обеззараживали прогреванием при 99°С в течении 15 минут. Затем клетки осаждают центрифугированием при 10 тыс.об./мин. в течение 5 минут. Затем проводят постановку Real-Time ПЦР с выделенной ДНК в амплификаторе ДТ-Lite (ДНК-технология, Россия) с использованием предложенных нами праймеров. Амплификацию проводят в амплификаторе, например, (DTlite5 производства НПФ ДНК-технология), по следующей схеме: денатурация при 94°С - 2 мин (1 цикл); затем 35 циклов: денатурация при 94°С - 8 секунд, отжиг и учет по каналу FAM при 60°С - 12 секунд. Учет реакции проводили по каналу FAM.

При анализе полученных данных штаммы были сгруппированы в соответствии с их генетической характеристикой.

Из данных Таблицы 3 следует, что из р. Темерник в период с 2005 г. по 2020 г. были выделены штаммы как с идентичной генетической характеристикой, а именно с генотипом (ACD-rtxA+; tcpA-; vce-; vspD+; vgrG3-) в период 2005, 2009 и 2013 гг.; с генотипом (ACD-rtxA-; tcpA-; vce-; vspD+; vgrG3-) - в 2006 и 2020 годах. В то же время в 2016 г. и в 2018 г. были выделены штаммы с уникальными генотипами, которые в данной выборке не встречались ранее - (ACD-rtxA-; tcpA-; vce+; vspD+; vgrG3+) и (ACD-rtxA+; tcpA+; vce+; vspD-; vgrG3+) соответственно.

Таким образом, полученные результаты ПЦР типирования семи штаммов V. cholerae O1 El Tor, выделенных из реки Темерник в период 2005-2020 годов с помощью ПЦР в режиме реального времени позволяют сделать вывод о том что в р. Темерник циркулируют штаммы холерных вибрионов различных генотипов. В то же время, штаммы с определенной генетической характеристикой стабильно выявлялись на протяжении нескольких лет, что может говорить о способности к переживанию в водных объектах окружающей среды в течение определенного времени. Что не исключает наличие штаммов с уникальной генетической характеристикой, которые, по всей видимости, имели завозной характер.

Пример 2. ПЦР-типирование 10 культур V. cholerae O1 El Tor, выделенных из водных объектов Республики Калмыкия.

Получение препаратов ДНК, приготовление реакционных смесей, проводят с помощью ПЦР в режиме реального времени и учет результатов осуществляют как в примере 1.

Результат ПЦР типирования десяти штаммов V. cholerae O1 El Tor, выделенных из реки Элистинка в период 2003-2015 годов с помощью ПЦР в режиме реального времени отображены в таблице 4.

Типирование штаммов V. cholerae O1 El Tor №№18626, 18620, 19275, 19274, 19337, 19306, 19438, 19717, 19768, 141 были взяты из коллекции ФКУЗ Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора. Исследование проводили как в примере 1. Программа и условия проведения амплификации идентичнысходные.

Полученные данные были представлены в таблице 4. При анализе полученных данных штаммы были сгруппированы в соответствии с их генетической характеристикой.

Таким образом, было установлено, что из р. Элистинка в период с 2003 г. по 2015 г. были выделены штаммы с идентичной генетической характеристикой, а именно с генотипом (ACD-rtxA+; tcpA+; vce+; vspD-; vgrG3+) выделены в 2003 и 2012 гг.; с генотипом (ACD-rtxA+; tcpA-; vce-; vspD+; vgrG3+) выделены в 2011 г. и 2015 г.; с генотипом (ACD-rtxA-; tcpA-; vce+; vspD-; vgrG3-) выделены в 2012 г. и 2014 г.; с генотипом (ACD-rtxA+; tcpA+; vce-; vspD-; vgrG3+) выделены в 2013 г. и 2015 г. В то же время в 2003 г. и в 2011 г. были выделены штаммы с уникальными генотипами которые в данной выборке (ACD-rtxA+; tcpA+; vce+; vspD+; vgrG3-) и (ACD-rtxA+; tcpA+; vce-; vspD+; vgrG3+).

Таким образом, полученные результаты ПЦР типирования десяти штаммов V. cholerae O1 с помощью ПЦР в режиме реального времени позволяют сделать вывод о том что в р. Элистинка циркулируют штаммы холерных вибрионов O1 El Тог с различной генетической характеристикой. В то же время штаммы с определенной генетической характеристикой выявлялись на протяжении нескольких лет, что может говорить о том, что изученные штаммы, обладали способностью к переживанию в водных объектах окружающей среды в течение определенного времени. Что в свою очередь не исключает наличие штаммов с уникальной генетической характеристикой, которые, по всей видимости, имели завозной характер.

Пример 3. ПЦР-типирование восьми культур V. cholerae O1 El Tor выделенных из водного объекта Республики Калмыкия.

Получение препаратов ДНК, приготовление реакционных смесей, проведение с помощью ПЦР в режиме реального времени и учет результатов проводят как в примере 1.

Результат ПЦР типирования восьми штаммов V. cholerae O1 El Tor выделенных из пруда Колонский (Республика Калмыкия) в период 2012-2016 годов с помощью ПЦР в режиме реального времени отражены в таблице 5.

Типирование штаммов V. cholerae O1 El Tor Ms 68, 69, 19439, 19668, 19719, 19767, 79, 91 были взяты из коллекции ФКУЗ Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора. Исследование проводили как в примере 1. Программа и условия проведения амплификации сходные.

При анализе полученных данных штаммы были сгруппированы в соответствии с их генетической характеристикой.

Таким образом, обнаружено что из пруда Колонский в период с 2012 г. по 2016 г. были выделены штаммы как с одинаковой генетической характеристикой (у которых генетическая характеристика совпадала), а именно с генотипом {ACD-rtxA-; tcpA-; vce-; vspD-; vgrG3-) были выделены штаммы в 2012, 2013 и 2015 гг.; с генотипом (ACD-rtxA-; tcpA-; vce-; vspD+; vgrG3-) были выделены штаммы в 2014 г.; с генотипом (ACD-rtxA+; tcpA-; vce-; vspD-; vgrG3+) были выделены штаммы в 2016 г.

Таким образом, полученные результаты ПЦР типирования восьми штаммов V. cholerae O1 с помощью ПЦР в режиме реального времени позволяют сделать вывод о том что в пруду Колонский циркулируют (встречаются) штаммы холерных вибрионов O1 серогруппы с различной генетической характеристикой. В то же время штаммы с определенной генетической характеристикой обнаруживались (встречались) на протяжении нескольких лет, что может говорить о том, что изученные штаммы, обладали способностью к переживанию в водных объектах окружающей среды в течение определенного времени. Что не исключает наличие штаммов с уникальной генетической характеристикой, которые, по всей видимости, имели завозной характер.

Пример 4. ПЦР-типирование пяти культур V. cholerae выделенных из водных объектов России.

Получение препаратов ДНК, приготовление реакционных смесей, проведение помощью ПЦР в режиме реального времени и учет результатов проводят как в примере 1.

Результат ПЦР типирования пяти штаммов типичных (01) и атипичных (R-вариант) штаммов V. cholerae, выделенных из р. Ушаковка Иркутская область в период с 2017-2020 гг. с помощью ПЦР в режиме реального времени отражены в таблице 6.

Типирование типичных (O1) - V. cholerae №№20371, 20375 и атипичных (RO) штаммов V. cholerae №№20450, 20559, 2-20, выделенных из оз. Соленое с точно установленной видовой принадлежностью были взяты из коллекции ФКУЗ Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора. Исследование проводили как в примере 1. Программа и условия проведения амплификации сходные. При анализе полученных данных штаммы были сгруппированы в соответствии с их генетической характеристикой.

Из данных Таблицы 6 следует, что из р. Ушаковка в период с 2017 г. по 2020 г. были выделены штаммы с идентичной генетической характеристикой, а именно с генотипом (ACD-rtxA+; tcpA-; vceLR-; vspD-; vgrG3+) - в 2017, 2019 и 2020 гг. В то же время в 2017 г. и в 2018 г. были выделены штаммы с уникальными генотипами, которые в данной выборке не встречались ранее - (ACD-rtxA-; tcpA-; vceLR-; vspD-; vgrG3+) и (ACD-rtxA-; tcpA-; vceLR+; vspD-; vgrG3+) соответственно.

Таким образом, полученные результаты ПЦР типирования пяти штаммов V. cholerae O1 El Tor, выделенных из реки Ушаковка в период 2017-2020 годов с помощью ПЦР в режиме реального времени позволяют сделать вывод о том что в р. Ушаковка циркулируют штаммы холерных вибрионов различных генотипов. В то же время штаммы с определенной генетической характеристикой стабильно выявлялись на протяжении нескольких лет, что может говорить о способности к переживанию в водных объектах окружающей среды в течение определенного времени. Это не исключает наличие штаммов с уникальной генетической характеристикой, которые, по всей видимости, имели завозной характер.

Использование предполагаемого изобретения позволяет за счет сконструированного набора реагентов, включающего 5 пар подобранных праймеров, проводить типирование представителей вида V. cholerae O1 El Tor методом полимеразной-цепной реакции в режиме реального времени (Real-Time PCR). Это позволит достоверно, быстро и эффективно проводить их генотипирование.

Кроме того, простое в исполнении тестирование, невысокая себестоимость, специфичность данных праймеров, отсутствие необходимости в импортных реактивах даст возможность применять их в практике бактериологических лабораторий центров гигиены и эпидемиологии, лечебно-профилактических, противочумных и других учреждений.

Источники информации

1. Dzeijman, М. Genomic characterization of non-O1, non-O139 Vibrio cholerae reveals genes for a type III secretion system [Text] / M. Dzeijman, D. Serrato, V.C. Tam et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2005 - Vol.102, N 9 - P.3465-3470.

2. Монахова, E.B. Факторы патогенности нехолерогенных штаммов Vibrio cholerae: Автореф. дис…доктора биол. наук / Монахова Елена Владимировна. - Саратов, 2012 - 48 с.

3. Водопьянов, СО. Разработка способа выявления гена tcpA холерного вибриона биотипа эльтор и сероварианта O139 Бенгал с помощью полимеразной цепной реакции [Текст] / С.О. Водопьянов, Б.Н. Мишанькин, И.П. Олейников // Биотехнология. - 1999 -№6 - С.19.

4. Способ выявления токсигенных штаммов O1 Vibrio cholerae «постгаитянской» линии методом ПЦР в режиме реального времени, Патент №2766192, кл. C12N 15/10, опубл. 09.02.2022, Бюл.№4.

5. Способ идентификации нетоксигенных штаммов холерных вибрионов O1 серогруппы с помощью ПЦР для выделения генетических детерминант, Патент №2665542, кл. C12Q 1/686, опубл. 30.08.2018, Бюл №25.

6. Кругликов, В.Д., Левченко Д.А., Водопьянов А.С., Непомнящая Н.Б. ПЦР-генотипирование нетоксигенных штаммов холерных вибрионов как один из подходов их актуализации в плане эпидназора за холерой. Эпидемиология и инфекционные болезни. Актуальные вопросы. 2018; 2:28-35.

7. Panicker G., Bej A.K. Real-time PCR detection of Vibrio vulnificus in oysters: comparison of oligonucleotide primers and probes targeting vvhA // J. Appl. Environ. Microbiol. - 2005. - Vol.71, №10. - P. 5702-5709

8. Полимеразная цепная реакция в микробиологии. Учебно-методическое пособие. / Д.П. Гладин, И.В. Дробот, A.M. Королюк. - СПб.: СПб.: СПбГПМУ, 2020 - 32 с.

Нуклеотидные последовательности прямого и обратного праймеров.

ген ACD-rtxA - TCAACCAACGGGTCAACTGGC

GCGGGATCATCCAACGTGGT

ген tcpA - GAAGAAGTTTGTAAAAGAAGAACAC

GAAAGCACCTTCTTTCACGTTG

ген vce -TTCTGATCACCGGTTCCACA

CCGTTGGTAGATTGTCGCTG

ген vspD -ATCGTCTAGAACTCGAAGAGCAGAAAAAAGC

ATCGGTCGACCTTCCCGCTTTTGATGAAATG

ген vgrG3 - GTGGCCGAAGAGAAAACACCGG

GGGCCTCTTCCTGCCGACTCAT

< 110> Ростовский-на-Дону противочумный институт

<120> Способ молекулярного типирования типичных (O1) и атипичных (RO) нетоксигенных штаммов V. cholerae El Tor с помощью ПЦР в режиме реального времени.

<400> 10

ген ACD-rtxA - TCAACCAACGGGTCAACTGGC (21)

GCGGGATCATCCAACGTGGT (20)

ген tcpA - GAAGAAGTTTGTAAAAGAAGAACAC (25)

GAAAGCACCTTCTTTCACGTTG (22)

ген vce -TTCTGATCACCGGTTCCACA (20)

CCGTTGGTAGATTGTCGCTG (20)

ген vspD -ATCGTCTAGAACTCGAAGAGCAGAAAAAAGC (31)

ATCGGTCGACCTTCCCGCTTTTGATGAAATG (31)

ген vgrG3 - GTGGCCGAAGAGAAAACACCGG (22)

GGGCCTCTTCCTGCCGACTCAT (22)

<141> 2022-04-18

1. Способ молекулярного типирования типичных (O1) и атипичных (RО) нетоксигенных штаммов V. cholerae El Tor с помощью ПЦР в режиме реального времени, включающий выделение ДНК из исследуемого штамма, проведение ПЦР со специфическими праймерами и последующим учетом реакции амплификации, отличающийся тем, что амплификацию исследуемой ДНК проводят одновременно с пятью парами праймеров:

при этом в инкубационную смесь вносят 0,5 мкл интеркалирующего красителя 50Х SYBR Green I для выявления продуктов амплификации по динамике изменения показателя флюоресценции по каналу FAM амплификатора, учет результатов осуществляют по геометрическому методу, путем регистрации Дельта С_р, отраженному на экране монитора, а именно: при наличии целевого продукта генов ACD-rtxA, tcpA, vce, vspD, vgrG3 формируется амплификон с низким показателем С_р, в пределах (8-15) циклов, подтверждая присутствие тестируемого гена типичных О1 и атипичных (RO) нетоксигенных штаммов V. cholerae O1 El Tor, в случае отсутствия специфической мишени реакция с парами праймеров образует амплификон с более высоким показателем С_р, в пределах (21-29) циклов, подтверждая отсутствие тестируемого гена.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что ПЦР проводят в объеме 25 мкл и реакционная смесь содержит: 2,5 мкл буфера, 1 Ед Taq ДНК-полимеразы, 0,2 мкМ смеси дНТФ, 0,5 мкл 50Х SYBR Green I, 1,0 мкМ каждого из праймеров, 5 мкл ДНК - ДНК матрицы, оставшийся объем - вода.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что ПЦР реакции проводят с соблюдением режимов: денатурация при 94°С - 2 мин (1 цикл); затем 35 циклов: денатурация при 94°С - 8 секунд, отжиг и учет по каналу FAM при 60°С - 12 секунд.