Линкер для конъюгатов антитело-лекарственное средство и их применение




Владельцы патента RU 2792201:

РЕМЕДЖЕН КО., ЛТД. (CN)

Изобретение относится к линкеру, имеющему структуру, представленную формулой I, в которой каждый из M1’, M2’ выбирают независимо из , M1’, M2’ являются одинаковыми или различными; L1, L2 выбирают, каждый независимо, из C1-C9-алкила; Q выбирают из , N; L3’ выбирают из C (=O) R8C (=O), NH2, OH, и их любой комбинации; X выбирают из Br; Y представляет собой , ; Z выбирают из C; R1 выбирают из H, C1-C6-алкила, R2, R8, R10 выбирают, каждый независимо, из H, C1-C6-алкила. Изобретение также относится к конъюгатам антитело-лекарственное средство, полученным с помощью указанного линкера, а также к применению конъюгатов антитело-лекарственное средство в препарате для лечения рака, связанного с антигеном HER2. Технический результат – получен новый линкер, который способен одновременно соединяться с 2, 3 или 4 тиольными группами антитела, что приводит к однородному и структурно устойчивому продукту сочетания. 7 н. и 12 з.п. ф-лы, 14 ил., 3 табл., 30 пр.

(I)

 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к линкеру для конъюгатов антитело-лекарственное средство и конъюгатам антитело-лекарственное средство, полученным с помощью линкера, а также к применению конъюгатов антитело-лекарственное средство при лечении опухолевых и других заболеваний.

Уровень техники

Конъюгаты антитело-лекарственное средство (ADC) являются классом таргетных терапевтических препаратов, которые используются главным образом для лечения рака, аутоиммунных заболеваний и подобных. Их структура обычно состоит из трех составляющих: антитела или антителоподобного лиганда, составляющей лекарственного средства и линкера, который соединяет антитело или антителоподобный лиганд и лекарственное средство.

Традиционный препарат ADC получают путем соединения лекарственного средства через линкер с лизиновым остатком антитела или цистеиновым остатком, полученным восстановлением межцепной дисульфидной связи антитела. Когда используют лизиновый остаток как место соединения, то так как антитело содержит примерно 40 или больше лизиновых остатков, и реакция сочетания не является селективной, число и место соединений имеют значительную неопределенность, и продукт весьма некачественный по причине неоднородности. Когда используют цистеиновый остаток как место соединения, то хотя антитело (IgG1) имеет только 4 пары межцепных дисульфидных связей, и величина DAR (отношение лекарственного средства к антителу) лекарственного ADC, образовавшегося с помощью цистеинового остатка, полученного восстановлением межцепной дисульфидной связи, является относительно равномерной, этот способ соединения разрушает дисульфидную связь антитела, влияя на стабильность антитела. И в силу плохой селективности существующих восстановителей (DTT, TCEP) в отношении межцепных дисульфидных связей, однородность конечного продукта также плохая. Следовательно, необходимо получить лекарственные ADC с хорошо регулируемым отношением лекарственного средства к антителу.

В последние годы некоторые исследователи использовали технологию генетической инженерии для модификации антител для достижения таргетного сочетания антител и лекарственных средств, и полученные ADC также имеют очень однородные величины DSR. Однако, поскольку технология генетической рекомбинации требует большой работы и множества проектов, чтобы найти подходящее место для присоединения лекарственного средства или модификации полиэтиленгликолем, это является очень трудоемким и обширным при разработке.

Принимая во внимание вышеуказанные недостатки при получении конъюгатов антитело-лекарственное средство на известном уровне техники, в технике существует насущная потребность разработки нового линкера для достижения таргетного сочетания токсичных лекарственных средств с антителами с тем, чтобы получить лекарства ADC с более высокой однородностью продукта и большей устойчивостью.

Сущность изобретения

Для того, чтобы решить вышеуказанные проблемы, настоящее изобретение предлагает линкер для получения конъюгатов антитело-лекарственное средство, и конъюгаты антитело-лекарственное средство, полученные с помощью линкера, а также применение конъюгатов антитело-лекарственное средство в препарате для лечения опухолей. Линкер способен одновременно соединяться с тиольной(ыми) группой(ами) или аминогруппой(ами) антитела или функционального фрагмента антитела, в частности, он способен соединяться с 2, 3 или 4 тиольными группами антитела или функционального фрагмента антитела. Соединенный продукт является однородным и структурно устойчивым.

В первом аспекте настоящее изобретение относится к линкеру, который имеет структуру формулы I:

в которой

каждый из M1', M2' выбирают независимо из , , , , , , , или он отсутствует, M1', M2' являются одинаковыми или различными, но не отсутствуют в одно и то же время;

каждый из X, Y, R1, L1, L2, L3', Q представляет собой произвольную группу.

Кром того, вышеуказанные X, Y, R1, L1, L2, L3', Q могут являться следующими:

L1, L2 выбирают, каждый независимо, из C1-C9-алкила, C2-C9-алкенила, C2-C9-алкинила, арила, гетероарила, C3-C9-циклоалкила, C3-C9-гетероциклила, полиэтиленгликоля, O, S, NR4, C (=O) , C (=O) O, C (=O) NR11, C=NR3, C (=S) O, C (=S) NR12, C (=S) S, NR13 (C=O) , NR14 (C=S) NR5, O (C=O) NR15, S (=O) 2 и их любой комбинации;

Q выбирают из , , N, B, P, арила, гетероарила, циклоалкила, (гетероциклил)алкила;

L3' выбирают из R8 (C=O), C (=O) R8C (=O), полиэтиленгликоля, , NH2, OH, SH, X и их любой комбинации;

X выбирают из F, Cl, Br, I;

Y представляет собой , , ; (в вышеуказанных двух структурах замещение цикла R2 может иметь место в любом положении);

Z выбирают из C, N;

R1, R2, R3, R4, R5, R8, R10, R11, R12, R13, R14, R15 выбирают, каждый независимо, из H, C1-C6-алкила, C2-C6-алкенила, C2-C6-алкинила, арила, гетероарила, C3-C9-циклоалкила, C3-C9-гетероциклила.

Кроме того, еще вышеуказанные X, Y, R1, L1, L2, L3', Q могут являться следующими:

L1, L2 выбирают, каждый независимо, из C1-C4-алкила, C6-C8-арила, C6-C8-гетероарила, C5-C6-циклоалкила, C5-C6-гетероциклила, C2-C12-полиэтиленгликоля, O, S, NR4, C (=O) , C (=O) O, C (=O) NR11, O (C=O) NR15;

Q выбирают из , N, C6-C8-арила, C6-C8-гетероарила, C3-C8-циклоалкила, C3-C8-гетероциклила;

L3' выбирают из R8 (C=O), C (=O) R8C (=O), полиэтиленгликоля, , NH2, OH, SH, X и их любой комбинации;

X представляет собой Br;

Y представляет собой ;

R1, R2, R3, R4, R5, R8, R10, R11, R15 выбирают, каждый независимо, из H, C1-C4-алкила, C6-C8-арила, C6-C8-гетероарила, C5-C6-циклоалкила, C5-C6-гетероциклила.

Кроме того, линкер имеет структуру, представленную формулами

или

или

или

.

Предпочтительно линкер может иметь структуру

A'-1 A'-2 A'-4
A'-5 A'-7 A'-8
A'-9 A'-10 A'-11
A'-12 A'-13 A'-14
A'-15 A'-16 A'-19
A'-20 A'-21 A'-22
A'-24 A'-26 A'-27
A'-28 A'-29 A'-31
A'-33 A'-34 .

Настоящее изобретение также относится к применению вышеуказанного линкера при получении конъюгатов антитело-лекарственное средство.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к конъюгату антитело-лекарственное средство, причем конъюгат антитело-лекарственное средство имеет структуру, представленную формулой II:

,

в которой

Ab представляет собой любое антитело или функциональный фрагмент антитела. Кроме того, антитело включает производное или аналог антитела; «функциональный» фрагмент представляет собой антитело, его фрагмент, производное или аналог, способные узнавать тот же антиген, и способные узнавать фрагменты, производные или аналоги, происходящие от антигена, которые включают, например, но без ограничения, фрагменты F(ab')2, Fab, Fab', Fv и димеры тяжелых и легких цепей антител, или любой из более мелких фрагментов, таких как Fv, или одноцепочечное антитело (фрагмент одноцепочечного антитела/одноцепочечный вариабельный фрагмент scFv). Кроме того, антитело может представлять собой слитый белок антитела. Антитело также может включать модифицированные или немодифицированные (т.е., ковалентно связанные через любую молекулу) аналоги и производные до тех пор, пока такая ковалентная связь позволяет антителу сохранять его антигенсвязывающую иммунологическую специфичность. Включаются, например, но без ограничения, аналоги и производные антитела, включающие дополнительные модификации, такие как гликозилирование, ацетилирование, пегелирование, фосфорилирование, амидирование, дериватизацию через известные защитные/блокирующие группы, расщепление протеазой, связь с единицами клеточных антител или другими белками и подобное. Можно достичь любое большое количество химических модификаций, используя известные методы, включая, но без ограничения, специфическое химическое расщепление, ацилирование, формилирование, метаболический синтез в присутствии туникамецина и т.п.. Кроме того, аналоги или производные могут включать одну или несколько неприродных аминокислот. В некоторых примерах антитела могут иметь модификации (например, замену, делецию или добавление) по некоторым аминокислотным остаткам, которые взаимодействуют с Fc-рецептором. И еще кроме того, антитело выбирают из мышиных антител, антител млекопитающих, химерных антител, гуманизированных антител, человеческих антител, мультиспецифических антител.

Линкерная составляющая включает первую линкерную составляющую А и вторую линкерную составляющую L; первая линкерная составляющая А включает группу, ковалентно соединенную с тиольной группой или аминогруппой Ab.

D представляет собой составляющую лекарственного средства, причем лекарственное средство включает, но без ограничения, цитотоксические лекарственные средства, факторы клеточной дифференцировки, питательные факторы стволовых клеток, стероидные лекарственные средства, лекарственные средства для лечения аутоиммунных заболеваний, противовоспалительные лекарственные средства или лекарственные средства для лечения инфекционных заболеваний. Кроме того, составляющая лекарственного средства D включает, но без ограничения, ингибиторы тубулина или повреждающие ДНК агенты. Ингибиторы тубулина включают, но без ограничения, доластамин, ауристатины, майтанзины; повреждающие ДНК агенты включают, но без ограничения, калихеамицины, дуокамицины, производное антрамицина PBD (пирролобензадиазепин), производное камптотецина SN-38, ингибиторы топоизомеразы I. Лекарственные средства ауристатины включают, но без ограничения, монометилауристатин Е (ММАЕ), монометилауристатин F (MMAF) и ауристатин F (AF) или их производные. Лекарственные средства майтанзины включают, но без ограничения, DM1, DM3, DM4 или их производные (Research Progress on Warhead Molecules of antibody-drug conjugate, Hu Xinyue et al., Chinese Medicinal Biotechnology, Dec., 2017, Vol. 12, No. 6) (Research advance of maytansinoid class antibody drug conjugates, Zhou Lei et al., Chinese Journal of New Drugs, 2016, Vol. 25, No. 22, pages 2521-2530). Составляющая лекарственного средства D также может представлять собой аманитины, антрациклины, баккатины, камптотецины, цемадотины, колхицины, колцимиды, комбрестатины, криптофицины, дискодермолиды, доцетаксел, доксорубицин, эхиномицины, элеутеробины, эпотилоны, эстрамустины, лекситропсины, майтанзины, метотрексат, нетропсины, пуромицины, ризоксины, таксаны, тубулизины или винка-алкалоиды. Составляющая лекарственного средства D также может представлять собой предшественника витамина А, фолиевую кислоту и подобное. Составляющая лекарственного средства D не ограничивается указанными выше категориями, но также включает все лекарственные средства, которые могут применяться в случае ADC.

В вышеуказанной формуле II

n равен 1, 2, 3 или 4.

Линкерная составляющая отличается тем, что первая линкерная составляющая А имеет структуру, представленную формулой III:

,

в которой

M1, M2 ковалентно связаны с тиольной группой или аминогруппой антитела или составляющей функционального фрагмента антитела (которое представлено Ab), которые выбирают, каждый независимо, из , , , , , , , , , ,или отсутствуют, M1 и M2 являются одинаковыми или различными, но не могут отсутствовать одновременно;

L1, L2 выбирают, каждый независимо, из C1-C9-алкила, C2-C9-алкенила, C2-C9-алкинила, арила, гетероарила, C3-C9-циклоалкила, C3-C9-гетероцилила, полиэтиленгликоля, O, S, NR4, C (=O) , C (=O) O, C (=O) NR11, C=NR3, C (=S) O, C (=S) NR12, C (=S) S, NR13 (C=O) , NR14 (C=S) NR5, O (C=O) NR15, S (=O) 2 и их любой комбинации;

Q выбирают из , , N, B, P, арила, гетероарила, циклоалкила, (гетероциклил)алкила;

L3 ковалентно связан со второй линкерной составляющей L, и его выбирают из R2 (C=O) , C (=O) R2C (=O) , полиэтиленгликоля, , NR9, O, S и их любой комбинации, или отсутствует;

R1 представляет собой произвольную группу или отсутствует, R2, R3, R4, R5, R9, R10, R11, R12, R13, R14, R15 выбирают, каждый независимо, из H, C1-C6-алкила, C2-C6-алкенила, C2-C6-алкинила, арила, гетероарила, C3-C9-циклоалкила, C3-C9-гетероциклила;

вторая линкерная составляющая L представляет собой любой отщепляемый линкер или неотщепляемый линкер или отсутствует, когда L отсутствует, L3 непосредственно связывется ковалентно с составляющей лекарственного средства D.

Кроме того, еще вышеуказанные L1, L2, L3, Q, R1 также могут являться соответственно следующими:

L1, L2 выбирают, каждый независимо, из C1-C4-алкила, C6-C8-арила, C6-C8-гетероарила, C5-C6-циклоалкила, C5-C6-гетероциклила, C2-C12-полиэтиленгликоля, O, S, NR4, C (=O) , C (=O) O, C (=O) NR11, O (C=O) NR15;

Q выбирают из , N, C6-C8-арила, C6-C8-гетероарила, C3-C8-циклоалкила, C3-C8-гетероциклила;

L3 выбирают из R2 (C=O) , C(=O)R2C(=O), полиэтиленгликоля, , NR9, O, S и их любой комбинации или отсутствует;

R1 выбирают из H, C1-C6-алкила, C2-C6-алкенила, C2-C6-алкинила, арила, гетероарила, C3-C9-циклоалкила, C3-C9-гетероциклила.

Кроме того, еще первая линкерная составляющая имеет структуру

(A-1') (A-1'')
(A-1''')

(A-2')		 (A-2'') (A-2''')
(A-2'''')
(A-3')
(A-3'')

(A-3''')
(A-3'''')		 (A-4')

(A-4'')
(A-4''')
(A-5')

(A-5'')
(A-5''')		 (A-5'''')

(A-6')
(A-6'')
(A-6''')
(A-7') (A-7'')
(A-8')

(A-8'')

Кроме того, еще антитело или функциональный фрагмент антитела специфически связывается с рецепторами клеточной поверхности или связанными с опухолями антигенами.

Кроме того, еще первая линкерная составляющая А включает группу, которая ковалентно связывается с тиольной группой или аминогруппой Ab.

Кроме того, еще первая линкерная составляющая А может иметь структуру

A-1 A-2 A-4
A-5 A-6 A-7
A-10 A-11 A-12
A-13 A-15 A-16
A-17 A-18 A-19
A-20 A-21 A-23
A-24 A-25 A-28
A-29 A-31 A-33
A-34 .

Кроме того, еще вторая линкерная составляющая может представлять собой C1-C9-алкил, C2-C9-алкенил, C2-C9-алкинил, арил, гетероарил, C3-C9-циклоалкил, C3-C9-гетероциклил, , O, S, NR6, C (=O) , C (=O) O, C (=O) NR6, C=NR6, C (=S) O, C (=S) NR6, C (=S) S, NR6 (C=O) , NR6 (C=S) NR7, O (C=O) NR6, S (=O) 2, Val-Val-PAB, Val-Cit-PAB, Val-Ala-PAB, Val-Lys (Ac)-PAB, Phe-Lys-PAB, Phe-Lys (Ac)-PAB, D-Val-Leu-Lys, Gly-Gly-Arg, Ala-Ala-Asn-PAB, Ala-PAB, PAB и их любую комбинацию, или отсутствует, причем R6, R7 выбирают, каждый независимо, из H, C1-C6-алкила, C2-C6-алкенила, C2-C6-алкинила, арила, гетероарила, C3-C9-циклоалкила, C3-C9-гетероциклила, e равен 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8.

Предпочтительно вторая линкерная составляющая L может представлять собой

Кроме того, еще составляющую лекарственного средства выбирают из цитотоксических лекарственных средств, факторов клеточной дифференцировки, питательных факторов стволовых клеток, стероидных лекарственных средств, лекарственных средств для лечения аутоиммунных заболеваний, противовоспалительных лекарственных средств или лекарственных средств для лечения инфекционных заболеваний.

Кроме того, еще составляющая лекарственного средства включает, но без ограничения, ингибиторы тубулина или повреждающие ДНК агенты.

Кроме того, еще ингибитор тубулина включает, но без ограничения, доластатины, ауристатины, майтансины; повреждающий ДНК агент включает, но без ограничения, калихеамицины, дуокамицины, производное антрамицина PBD, производные камптотецина (предпочтительно производное камптотецина SN-38), ингибиторы топоизомеразы I (т.е., Dxd).

Кроме того, еще составляющая лекарственного средства включает, но без ограничения, аманитины, антрациклины, баккатины, камптотецины, цемадотины, колхицины, колцимиды, комбрестатины, криптофицины, дискодермолиды, доцетаксел, доксорубицин, эхиномицины, элеутеробины, эпотилоны, эстрамустины, лекситропсины, майтансины, метотрексат, нетропсины, пуромицины, ризоксины, таксаны, тубулизины или винка-алкалоиды, предшественника витамина А, фолиевую кислоту, производные камптотецина SN-38, ингибиторы топоизомеразы I (т.е., Dxd).

Предпочтительно составляющая лекарственного средства D может представлять собой

В некоторых предпочтительных примерах конъюгат антитело-лекарственное средство имеет структуру

ADC1
ADC2
ADC3
ADC4
ADC5
ADC6
ADC7
ADC8
ADC9
ADC10
ADC11
ADC12
ADC13
ADC14
ADC15
ADC16,

в которой

антитело или функциональный фрагмент антитела Ab является антителом против рецепторов клеточной поверхности и связанных с опухолями антигенов;

n1, n2, n3 выбирают, каждый независимо, из 0, 1, 2, 3, 4; n1, n2, n3 не равны 0 в одно и то же время, и n1+n2+n3≤4;

n4, n5, n6, n7 выбирают, каждый независимо, из 0, 1, 2, 3, 4; n4, n5, n6, n7 не равны 0 в одно и то же время, и n4+n5+n6+n7≤4;

n8, n9 выбирают, каждый независимо, из 0, 1, 2, 3, 4; n8, n9 не равны 0 в одно и то же время, и n8+n9≤4;

m1, m2, m3 выбирают, каждый независимо, из 0, 1, 2; по меньшей мере один из m1, m2, m3 равен 0, но m1, m2, m3 не равны 0 в одно и то же время, и m1+m2+m3≤2;

m4, m5 выбирают, каждый независимо, из 0, 1, 2; m4, m5 не равны 0 в одно и то же время, и m4+m5≤2.

Кроме того, конъюгат антитело-лекарственное средство имеет структуру

ADC17
ADC18
ADC19
ADC20
ADC21
ADC22
ADC23
ADC24
ADC25
ADC26
ADC27
ADC28
ADC29
ADC30
ADC31
ADC32

в которой

Ab является антителом против рецепторов клеточной поверхности и связанных с опухолями антигенов;

n10 равен 0, 1, 2, 3 или 4;

m6 равен 0, 1 или 2.

Кроме того, конъюгат антитело-лекарственное средство имеет структуру

ADC33
ADC34
ADC35
ADC36
ADC37
ADC38
ADC39
ADC40
ADC41
ADC42
ADC43
ADC44
ADC45
ADC46
ADC47
ADC48

в которой

Ab является антителом против рецепторов клеточной поверхности и связанных с опухолями антигенов;

n11 равен 0, 1, 2, 3 или 4;

m7 равен 0, 1 или 2.

Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции, которая включает любой конъюгат антитело-лекарственное средство, описанный в настоящем изобретении, и фармацевтически приемлемый носитель.

Настоящее изобретение также относится к применению любого линкера, описанного в настоящем изобретении, при получении конъюгата антитело-лекарственное средство.

Настоящее изобретение также относится к применению любого конъюгата антитело-лекарственное средство, описанного в настоящем изобретении, или любой фармацевтической композиции, описанной в настоящем изобретении, при получении препарата для лечения рака, аутоиммунных заболеваний, воспалительных заболеваний или инфекционных заболеваний.

Описание фигур

Фигура 1А показывает хроматограмму HIC-HPLC конъюгата антитело-лекарственное средство Her2-A'-7-Val-Cit-PAB-MMAE (молярное отношение лекарственного средства к тиольной группе антитела, добавленного во время сочетания, составляет 5:1).

Фигура 1В показывает хроматограмму HIC-HPLC конъюгата антитело-лекарственное средство Her2-A'-11-Val-Cit-PAB-MMAE (молярное отношение лекарственного средства к тиольной группе антитела, добавленного во время сочетания, составляет 5:1).

Фигура 1С показывает хроматограмму HIC-HPLC конъюгата антитело-лекарственное средство Her2-A'-10-Val-Cit-PAB-MMAE (молярное отношение лекарственного средства к тиольной группе антитела, добавленного во время сочетания, составляет 5:1).

Фигура 1D показывает хроматограмму HIC-HPLC конъюгата антитело-лекарственное средство Her2-575DZ-Val-Cit-PAB-MMAE (молярное отношение лекарственного средства к тиольной группе антитела, добавленного во время сочетания, составляет 5:1).

Фигура 2А показывает картины электрофореза в SDS-PAGE Her2-A'-11-Val-Cit-PAB-MMAE (буферы для сочетания соответственно имеют pH 8,5, 9,0, 7,4), Her2-A'-7-Val-Cit-PAB-MMAE (буферы для сочетания соответственно имеют pH 8,5, 9,0, 7,4), Her2-A'-10-Val-Cit-PAB-MMAE (буферы для сочетания соответственно имеют pH 8,5, 9,0, 7,4) (буфер для сочетания имеет pH 9,0).

Фигура 2В показывает картины электрофореза в SDS-PAGE Her2-A'-7-Val-Cit-PAB-MMAE, Her2-575DZ-Val-Cit-PAB-MMAE, Her2-A'-10-Val-Cit-PAB-MMAE (буфер для сочетания имеет pH 9,0).

Фигура 3 показывает кривые аффинности к антигену конъюгатов антитело-лекарственное средство (причем конъюгатами антитело-лекарственное средство являются Her2-A'-7-Val-Cit-PAB-MMAE и Her2-A'-10-Val-Cit-PAB-MMAE; причем антитело Her2 и Her2-Mc-Val-Cit-PAB-MMAE являются отрицательным и положительным контролями), определенной методом ELISA, где на оси абсцисс показана концентрация, и на оси ординат оптическая плотность, поглощение.

Фигура 4А показывает кривые степени ингибирования пролиферации клеток рака молочной железы человека SK-BR-3 конъюгатами антитело-лекарственное средство (Her2-A'-11-Val-Cit-PAB-MMAE, Her2-A'-10-Val-Cit-PAB-MMAE).

Фигура 4В показывает кривые степени ингибирования пролиферации клеток рака молочной железы человека SK-BR-3 конъюгатами антитело-лекарственное средство (Her2-A'-8-Val-Cit-PAB-MMAE, Her2-A'-7-Val-Cit-PAB-MMAE).

Фигура 5 показывает результаты сочетания конъгатов (Ab-A) антитела (Ab) и первой линкерной составляющей (А), причем №№ 1,2, 3 относятся к Her2-A'-7, буферы для сочетания соответственно имеют pH 8,5, 9,0, 7,4; №№. 4, 5, 6 относятся к Her2-A'-8, буферы для сочетания соответственно имеют pH 8,5, 7,4, 9,0; №№ 7, 8, 9 относятся к Her2-A'-10, буферы для сочетания соответственно имеют pH 8,5, 9,0, 7,4; №№ 10, 11, 12 относятся к Her2-A'-11, буферы для сочетания соответственно имеют pH 9,0, 7,4, 9,5; №№ 13, 14, 15 относятся к Her2-A'-12, буферы для сочетания соответственно имеют pH 7,4, 9,0, 8,5; №№ 16, 17, 18 относятся к Her2-A'-20, буферы для сочетания соответственно имеют pH 8,5, 9,0, 7,4; №№ 19, 20, 21 относятся к Her2-A'-28, буферы для сочетания соответственно имеют pH 9,0, 8,5, 7,4; №№ 22, 23, 24 относятся к Her2-A'-31, буферы для сочетания соответственно имеют pH 7,4, 8,5, 9,0.

Фигура 6А показывает спектр ЖХ-МС «голого» антитела (антитело к клаудину 18.2).

Фигура 6В показывает спектр ЖХ-МС клаудин 18.2-A'-7-VC-PAB-MMAE .

Фигура 7А показывает карту размещения изоэлектрических точек «голого» антитела (антитело к клаудину 18.2).

Фигура 7В показывает карту размещения изоэлектрических точек клаудин 18.2-A'-7-VC-PAB-MMAE .

Варианты осуществления изобретения

Ниже с помощью конкретных примеров подробно описываются воплощения настоящего изобретения, но в любом случае их не следует рассматривать как ограничивающие настоящее изобретение.

[Определения]

Если не определяются иначе, научные и технологические термины, используемые в настоящем описании, имеют те же значения, которые им обычно придают специалисты в данной области техники.

Хотя численные интервалы и приблизительные величины параметров показаны в широком объеме настоящего изобретения, численные значения, показанные в конкретных примерах, регистрируются настолько точно, насколько возможно. Однако любое численное значение по своей сути неизбежно содержит определенную ошибку, которая вызывается стандартным отклонением при измерении. Кроме того, все интервалы, раскрытые в настоящем описании, следует понимать как перекрывающие любые и все подинтервалы, содержащиеся в них. Например, записанный интервал «1-10» следует понимать как перекрывающий любые и все подинтервалы, содержащиеся между минимальным значением 1 и максимальным значением 10 (включая конечные точки), т.е., все подинтервалы, начинающиеся с минимального значения 1 или больше, например, 1-6,1, и все подинтервалы, заканчивающиеся максимальным значением 10 или меньше, например, 5,5-10. Кроме того, любую ссылку, обозначенную как «включенная в настоящее описание», следует понимать как полностью включенную.

Символ «», используемый в настоящем изобретении, означает, что группа, содержащая «», соединена в этом месте с другими группами через химическую связь.

Термин «антитело» в настоящем изобретении используется в самом широком смысле и перекрывает различные структуры антител, включая, но без ограничения, моноклональное антитело, поликлональное антитело, мультиспецифическое антитело (такое как биспецифическое антитело), и фрагменты антитела. В частности, «антитело» при использовании в настоящем описании относится к белку, содержащему по меньшей мере две тяжелых (Н) цепи и две легких (L) цепи, взаимосвязанные дисульфидными связями. Каждая тяжелая цепь включает вариабельный участок тяжелой цепи (сокращенно VH) и константный участок тяжелой цепи. Константный участок тяжелой цепи включает три домена СН1, СН2 и СН3. Каждая легкая цепь включает вариабельный участок легкой цепи (сокращенно VL) и константный участок легкой цепи. Константный участок легкой цепи включает один домен CL. VL и VH участки могут дополнительно подразделяться на несколько участков с высокой вариабельностью, называемых определяющими комплементарность участками (CDR), перемежающимися с более консервативными участками, называемыми каркасными участками (FR). Каждый VH и VL состоит из трех CDR и четырех FR, расположенных в следующем порядке от аминоконца к карбоксиконцу: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Эти вариабельные участки тяжелой цепи и легкой цепи содержат домены связывания, которые взаимодействуют с антигенами. Константный участок антитела может опосредовать связывание иммуноглобулинов с тканями или факторами хозяина, включая различные клетки (такие как эффекторные клетки) иммунной системы и первый компонент (Clq) классической системы комплемента. Химерные или гуманизированные антитела также включаются в антитела согласно настоящему изобретению.

Термин «гуманизированное антитело» относится к антителу, которое содержит участок CDR, происходящий от не-человеческого антитела, а другая часть молекулы антитела происходит из одного или нескольких человеческих антител. Кроме того, для сохранения аффинности связывания возможно модифицировать некоторые остатки каркасных участков (называемых FR) (Jones et al., Nature, 321: 522-525, 1986; Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536, 1988; Riechmann et al., Nature, 332: 323-327, 1988). Гуманизированное антитело или его фрагменты согласно настоящему изобретению можно получить методами, известными специалистам в данной области техники (например, методами, описанными в документах Singer et al., J. Immun. 150: 2844-2857, 1992; Mountain et al., Biotechnol. Genet. Eng. Rev., 10: 1-142, 1992; или Bebbington et al., Bio/Technology, 10: 169-175, 1992).

Термин «химерное антитело» относится к антителу, в котором последовательность вариабельного участка является последовательностью от одного вида, а последовательность константного участка является последовательностью от другого вида. Например, последовательность вариабельного участка является последовательностью из мышиного антитела, а последовательность константного участка является последовательностью из человеческого антитела. Химерное антитело или его фрагменты можно получить с использованием генетической рекомбинантной технологии. Например, химерное антитело можно получить клонированием рекомбинантной ДНК, и рекомбинантная ДНК включает промотор и последовательность, кодирующую вариабельные участки не-человеческого, в частности мышиного, антитела, согласно настоящему изобретению, и последовательность, кодирующую константные участки человеческого антитела. Химерное антитело по настоящему изобретению, кодированное этим рекомбинатным геном, будет представлять собой, например, химеру мышь-человек. Специфичность этого антитела определяется вариабельным участком, происходящим из мышиной ДНК, и изотип определяется константным участком, происходящим из ДНК человека. Как к способу получения химерного антитела, например, можно обратиться к документу Verhoeyn et al. (BioEssays, 8: 74, 1988).

Термин «моноклональное антитело» относится к продуктам, полученным из молекул антитела одной молекулярной композиции. Композиция моноклонального антитела показывает одну специфичность связывания и аффинность в отношении специфического эпитопа.

Термин «функциональный фрагмент» в настоящем изобретении означает, что фрагмент антитела состоит из, или включает, частичную последовательность тяжелой или легкой вариабельной цепи антитела, из которой она получена, и частичной последовательности достаточно для сохранения такой же специфичности связывания, как у антитела, из которого она получена, и достаточной аффинности, предпочтительно по меньшей мере равной 1/100 аффинности антитела, из которого она получена, и предпочтительнее по меньшей мере равной 1/10. Этот функциональный фрагмент будет содержать минимум 5 аминокислот, предпочтительно 10, 15, 20, 50 и 100 последовательных аминокислот из последовательности антитела, из которой он получен.

Термин «DAR», также называемый отношением лекарственного средства к антителу, в настоящем изобретении является уникальным атрибутом качества конъюгата антитело-лекарственное средство. Высокая величина DAR может влиять на безопасность ADC, и терапевтическое окно у него узкое. Низкая величина DAR может привести к снижению эффективности ADC, но его безопасность значительная, и терапевтическое окно у него широкое. Наилучший интервал средних величин DAR составляет 2-4.

Термин «линкер» в настоящем изобретении относится к соединению, которое может действовать как «мостик» для соответствующего взаимодействия антитела/функционального фрагмента и лекарственного средства и соединять их. «Линкер», включенный в настоящее изобретение, включает первую линкерную составляющую и вторую линкерную составляющую. Термин «первая ликерная составляющая» в настоящем изобретении включает две соединяющие группы, которые являются одинаковыми или различными. Соединяющие группы способны одновременно ковалентно соединяться с межцепной(ыми) тиольной(ыми) группой(ами) или аминогруппой(ами) антитела/функционального фрагмента антитела, и соединяющие группы являются любыми функциональными группами, способными ковалентно соединяться с тиольной(ыми) группой(ами) или аминогруппой(ами). Термин «вторая ликерная составляющая» в настоящем изобретении используется для сочетания с лекарственным средством, и она представляет собой любой расщепляемый или нерасщепляемый линкер. Расщепляемый линкер высвобождает токсины в зависимости от внутриклеточных процессов, таких как процесс интрацитоплазматического восстановления, воздействии на кислую среду в лизосоме или расщепление с помощью внутриклеточной специфической протеазы. Нерасщепляемый линкер может высвобождать лекарственное средство только после разрушения белка составляющей антитела ADC.

Термин «лекарственное средство» в настоящем изобретении обычно относится к любому соединению, которое имеет нужную биологическую активность и имеет реакционноспособную функциональную группу для получения конъюгата по настоящему изобретению. Нужная биологическая активность включает диагностику, излечивание, облегчение, лечение, предупреждение болезней человека или другого животного. По мере постоянных открытий и разработки новых лекарственных средств, эти новые лекарственные средства также должны включаться в лекарственные средства по настоящему изобретению. Конкретно, лекарственные средства включают, но без ограничения, цитотоксические лекарственные средства, факторы клеточной дифференцировки, стероидные лекарственные средства, лекарственные средства для лечения аутоиммунных заболеваний, противовоспалительные лекарственные средства или лекарственные средства для лечения инфекционных заболеваний. Конкретнее, лекарственные средства включают, но без ограничения, ингибиторы тубулина или агенты, повреждающие ДНК, РНК.

В некоторых воплощениях настоящего изобретения лекарственное средство выбирают из соединений майтанзина, ингибиторов V-АТФазы, проапоптозных агентов, ингибиторов Ве 12, ингибиторов McL1, ингибиторов HSP90, ингибитора IAP, ингибиторов mTOr, стабилизаторов микротубулина, дестабилизаторов микротубулина, ауристатина, доластатина, MetAP (метионинаминопептидаза), ингибиторов ядерного экспорта белка CRM1, ингибиторов DPPIV, ингибиторов протеасом, ингибиторов реакции переноса фосфорила в митохондриях, ингибиторов синтеза белков, ингибиторов киназ, ингибиторов CDK2, ингибиторов CDK9, ингибиторов кинезина, ингибиторов HDAC, повреждающих ДНК агентов, ДНК-алкилирующих агентов, интеркаляторов ДНК, агента, связывающего минорные желобки ДНК, ингибиторов DHFR, а также пептида доластатина, предшественников витамина A, фолиевой кислоты, производных камптотецина.

В некоторых предпочтительных воплощениях настоящего изобретения лекарственное средство представляет собой цитотоксическое лекарственное средство (такое как антиметаболиты, противоопухолевые антибиотики, алкалоиды), иммуностимулятор или радиоизотоп. Предпочтительно лекарственное средство можно выбрать из аманитинов, антрациклинов, баккатинов, камптотецинов, цемадотинов, колхицинов, колцимидов, комбретастатинов, криптофицинов, дисодеромолидов, доцетаксела, доксорубицина, эхиномицинов, элеутеробинов, эпотилонов, эстрамустинов, текситропсинов, майтансинов, метотрексата, нетропсинов, пуромицинов, ризоксинов, таксанов, тубулизинов или винка-алкалоидов. Предпочтительнее «лекарственное средство» выбирают из MMAD (мнометилауристатин D) и его производных, MMAE (мнометилауристатин E) и его производных, MMAF (мнометилауристатин F) и его производных, производных майтансина DM1 (производного мертансина M1), производных майтансина DM4 (производного мертансина M4), дуокармицина и его производных, калихеамицина и его производных, PBDA (пирролобензодиазепины), доксорубицина, винка-алкалоидов, метотрексата, винбластина, даунорубицина и его производных, тубулизинов и их производных, производного камптотецина SN-38, ингибиторов топоизомеразы I (т.е., Dxd).

В некоторых конкретных воплощениях «лекарственное средство» может представлять собой перечисленные далее вещества и их производные.

Майтансин:

Maytansine - Майтансин

Производные майтансина:

Производные ансамитоцина:

A is C=O, (C=O)NR4, and C=O(O) - А представляет собой C=O, (C=O)NR4 и C=O(O)

Y is a substituent group - Y представляет собой группу-заместитель

Ansamitocin derivatives - Производные ансамитоцина

Аланинилмайтансинол:

Alaninylmaytansinol - Аланинилмайтансинол:

MMAE:
MMAD:

MMAD

MMAF:

Тубулизин D:

Tubulysin D - Тубулизин D

Калихеамицин:

Calicheamicin - Калихеамицин

Доксорубицин:

Doxorubicin - Доксорубицин

Производные пирролобензодиазепина:

Предшественник витамина А:

Фолиевая кислота:

Ингибитор топоизомеразы I (т.е., Dxd):

Термин «конъюгат антитело-лекарственное средство» в настоящем изобретении относится к соединению, полученному путем соединения антитела/функционального фрагмента антитела, линкера (первой линкерной составляющей, второй линкерной составляющей) и составляющей лекарственного средства через химическую реакцию. Хотя конъюгат антитело-лекарственное средство в настоящем изобретении еще представляет собой смесь, по сравнению с конъюгатом, полученным традиционным путем, его интервал распределения DAR является очень узким, и наилучший конъюгат антитело-лекарственное средство имеет интервал средних величин DAR 2-4. В отношении получения конъюгата антитело-лекарственное средство согласно настоящему изобретению, то когда конъюгат (A-L-D) первой линкерной составляющей (A) и конъюгатом вторая линкерная составляющая-лекарственное средство (L-D) сочетается с антителом (таким как антитело к клаудину 18.2, представленным в примере), он может гидролизоваться в мягких условиях гидролиза, и место гидролиза находится в малеимидной группе первого линкера. Если взять за пример Ab-A'-7-VC-PAB-MMAE (и в случае, когда одно антитело сочетается с 4 лекарственными средствами), когда конъюгат Ab-A'-7-VC-PAB-MMAE претерпевает 4 гидролиза, изображение структуры имеет вид

или

.

Когда конъюгат Ab-A'-7-VC-PAB-MMAE претерпевает 7 гидролизов, изображение структуры имеет вид

Когда конъюгат Ab-A'-7-VC-PAB-MMAE претерпевает 8 гидролизов, изображение структуры имеет вид

Термин «фармацевтическая композиция» в настоящем изобретении относится к комбинации по меньшей мере одного лекарственного средства и, необязательно, фармацевтически приемлемого носителя или эксципиента, которые комбинируют для достижения определенной цели. В некоторых воплощениях фармацевтическая композиция включает комбинацию ингредиентов, которые разделены во времени и/или пространстве, до тех пор, пока они работают вместе для достижения цели настоящего изобретения. Например, ингредиенты, содержащиеся в фармацевтической композиции, можно вводить субъекту как целое или раздельно. Когда ингредиенты, содержащиеся в фармацевтической композиции, вводят субъекту раздельно, ингредиенты могут вводиться субъекту одновременно или последовательно. Предпочтительно фармацевтически приемлемым носителем является вода, забуференный водный раствор, изотоничный солевой раствор, такой как PBS (фосфатный буфер), раствор глюкозы, маннита, декстроглюкозы, лактозы, крахмала, стеарата магния, целлюлозы, карбоната магния, 0,3% глицерина, гиалуроновой кислоты, этанола или полиалкиленгликоля, такого как полипропиленгликоль, триглицеридов и т.п. Тип используемого фармацевтически приемлемого носителя, зависит, в частности, от того, составлена ли композиция по настоящему изобретению для перорального, назального, интрадермального, подкожного, внутримышечного или внутривенного введения. Композиция согласно настоящему изобретению может содержать в качестве добавок смачиватели, эмульгаторы или буферные вещества.

Фармацевтическая композиция, вакцина или фармацевтический препарат по настоящему изобретению можно вводить любым подходящим путем, таким как пероральное, назальное, интрадермальное, подкожное, внутримышечное или внутривенное введение.

Термин «алкил» в настоящем изобретении относится к линейному или разветвленному насыщенному углеводороду (т.е., свободному от двойных или тройных связей). Алкильная группа может иметь 1-9 атомов углерода (при появлении в настоящем изобретении численный интервал «1-9» относится к любому целому числу в этом интервале, например, «1-9 атомов углерода» означает, что алкильная группа может содержать 1 атом углерода, 2 атома углерода, 3 атома углерода, … до 9 атомов углерода; в то же время определение «алкил» также включает алкильные группы без заданной длины цепи). Алкильная группа может представлять собой алкильную группу среднего размера, содержащую 1-9 атомов углерода. Типичная алкильная группа включает, но без ограничения, метил, этил, пропил, изопропил, бутил, изобутил, трет-бутил, пентил, гексил и т.п..

Термин «алкенил» в настоящем изобретении относится к линейному или разветвленному углеводороду, содержащему одну или несколько двойных связей. Алкенильная группа может иметь 2-9 атомов углерода и также включает алкенильные группы без заданной длины цепи. Алкенильная группа может представлять собой алкенильную группу среднего размера, содержащую 2-9 атомов углерода. Алкенильная группа также может представлять собой алкенильную группу небольшого размера, содержащую 2-4 атомов углерода. Алкенильную группу можно изобразить как «С2-4-алкенил» или подобными изображениями. Например, «С2-4-алкенил» означает, что в алкенильной цепи присутствуют 2-4 атома углерода, т.е., алкенильную цепь можно выбрать из этенила, пропен-1-ила, пропен-3-ила, бутен-1-ила, бутен-2-ила, бутен-3-ила, бутен-4-ила, 1-метилпропен-1-ила, 2-метилпропен-1-ила, 1-этилэтен-1-ила, 2-метилпропен-3-ила, бута-1,2-диенила, бута-1,2-диен-4-ила. Типичный алкенил включает, но без ограничения, этенил, пропенил, бутенил, пентенил, гексенил и т.п..

Термин «алкинил» в настоящем изобретении относится к линейному или разветвленному углеводороду, содержащему одну или несколько тройных связей. Алкинильная группа может иметь 2-9 атомов углерода и также включает алкинильные группы без заданной длины цепи. Алкинильная группа может представлять собой алкинильную группу среднего размера, содержащую 2-9 атомов углерода. Алкинильная группа также может представлять собой низшую алкинильную группу, содержащую 2-4 атома углерода. Алкинильную группу можно изобразить как «С2-4-алкинил» или подобными изображениями. Например, «С2-4-алкинил» означает, что в алкинильной цепи присутствуют 2-4 атома углерода, т.е., алкинильную цепь можно выбрать из этинила, пропин-1-ила, пропин-2-ила, бутин-1-ила, бутин-2-ила, бутин-3-ила и 2-бутинила. Типичный алкинил включает, но без ограничения, этинил, пропинил, бутинил, пентинил, гексинил и т.п..

Термин «арил» в настоящем изобретении относится к циклической системе с сопряженной системой π-электронов и включает карбоциклический арил (такой как фенил) и гетероциклический арил (такой как пиридин). Термин включает группы с одном циклом или несколькими конденсированными циклами (т.е., циклами, которые имеют общую пару соседних атомов), и вся циклическая система является ароматической.

Термин «гетероарил» в настоящем изобретении относится к ароматическому циклу или циклической системе (т.е. двум или большему числу конденсированных циклов, разделяющих пару соседних атомов), содержащим один или несколько гетероатомов. Иными словами, кроме углерода, циклический каркас включает, но без ограничения, азот, кислород, серу и другие элементы. Когда гетероарил является циклической системой, каждый цикл в системе является ароматическим. Гетероарил может иметь 5-18 членов цикла (т.е., число атомов, составляющих циклический каркас, включая атомы углерода и гетероатомы). Текущее определение также включает гетероарильные группы без заданного размера цикла. Примеры гетероарила включают, но без ограничения, фурил, тиенил, фталазинил, пирролил, оксазолил, тиазолил, имидазолил, пиразолил, изоксазолил, изотиазолил, триазолил, тиадиазолил, пиридил, пиридазинил, пиримидинил, пиразинил, триазинил, хинолинил, изохинолинил, бензимидазолил, бензоксазолил, бензотиазолил, индолил, изоиндолил, бензотиенил.

Термин «циклоалкил» в настоящем изобретении относится к полностью насыщенной карбоциклической или циклической системе. Примеры включают, но без ограничения, циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил.

Термин «(гетероциклил)алкил» в настоящем изобретении относится к гетероциклилу как заместителю, соединенному с другими группами через алкилен. Примеры включают, но без ограничения, имидазолинилметил и индолинилэтил. Термин «гетероциклил» относится к неароматическому циклу или циклической системе, содержащей по меньшей мере один гетероатом в своем скелете. Гетероциклил может быть соединен в форме конденсированных циклов, мостиковых циклов или спироциклов. По меньшей мере один цикл в гетероциклильной системе является не-ароматическим, и он может иметь любую степень насыщения. Гетероатом может располагаться в не-ароматическом или ароматическом цикле циклической системы. Гетероциклил может иметь 3-20 циклических атомов (т.е., число атомов, составляющих циклический скелет, включая число атомов углерода и гетератомов). Текущее определение также включает гетероциклильные группы без заданного интервала членов цикла. Гетероциклильная группа также может быть гетероциклильной группой среднего размера, содержащей 3-10 циклических атомов. Гетероциклильная группа также может быть гетероциклильной группой небольшого размера, содержащей 3-6 циклических атомов. Примеры гетероциклильной группы включают, но без ограничения, азепинил, акридинил, карбазолил, циннолинил, диоксоланил, имидазолинил, имидазолидинил, морфолинил, оксиранил, оксепанил, тиетанил, пиперидинил, пиперазинил, пиразолинил, пиразолидинил, 1,3-диоксинил, 1,3-диоксанил, 1,4-диоксинил, 1,4-диоксанил, 1,3-оксатианил, 1,4-оксатианил, 1,4-оксатианил, 2Н-1,3-диоксоланил, 1,3-дитиоланил, 1,3-дитиоланил, изоксазолинил, изоксазолидинил, оксазолинил, оксазолидинил, оксазолидинон, оксазолидинон, тиазолидинил, 1,3-оксатиолил, индолинил, изоиндолинил, тетрагидрофуранил, тетрагидропиранил, тетрагидротиенил, тетрагидротиопиранил, тетрагидро-1,4-тиазинил, тиоморфолинил, дигидробензофуранил, бензимидазолидинил и тетрагидрохинолинил.

[Примеры]

Общая процедура А: общий способ синтеза броммалеимидного линкера

Amines and their salts or Boc protected derivatives - Амины и их соли или Вос-защищенные производные

Bromomaleic anhydride - Броммалеиновый ангидрид

Амины и их соли или Вос-защищенное производное (1 экв.) и безводный ацетат натрия (2,5 экв.) растворяют в уксусной кислоте (1 ммоль/2 мл) и нагревают до 50-100°С, затем быстро добавляют броммалеиновый ангидрид (2,5 экв.), и проводят реакцию при 50-100°С в течение ночи. Реакционный раствор охлаждают до 45°С, концентрируют при пониженном давлении, к остатку добавляют этилацетат, затем промывают, сушат и концентрируют, и получают сырой продукт реакции. Сырой продукт очищают нормально-фазовой колоночной хроматографией или обращенно-фазовой препаративной жидкостной хроматографией, и получают целевой продукт.

Общая процедура В: общий способ синтеза тиофенолмалеимидного линкера

DMF - ДМФА, Sodium thiophenolate _ Тиофенолят натрия

Броммалеимидный линкер (1,0 экв.) растворяют в безводном ДМФА (1 ммоль/5 мл), к раствору добавляют пиридин (3,0 экв.) и затем перемешивают при комнатной температуре в течение 5-10 мин. Растворяют тиофенолят натрия (2,1 экв.) в безводном ДМФА (1 ммоль/1 мл) и добавляют по каплям к реакционному раствору. После этого продолжают перемешивание при комнатной температуре в течение 0,5-5 час. По завершении реакции к смеси добавляют 5-кратный объем дистиллированной воды, твердые вещества выпадают в осадок, и затем путем фильтрации, промывки, сушки и концентрирования получают сырой продукт реакции. Сырой продукт очищают нормально-фазовой колоночной хроматографией или обращенно-фазовой препаративной жидкостной хроматографией, и получают целевой продукт.

Пример 1. Синтез A'-1

Bromomaleic anhydride - Броммалеиновый ангидрид

Согласно общей процедуре А, добавляют 300 мг соединения 1 (т.е., 3,5-диаминобензойной кислоты), добавляя в то же время другие материалы в молярных соотношениях. Реакцию выполняют при 70°С в течение ночи. Реакционный раствор очищают препаративной жидкостной хроматографией, и получают целевое соединение A'-1. ЖХ-МС (ESI+) 468,9 [M+H]+.

Пример 2. Синтез A'-4

Sodium thiophenolate _ Тиофенолят натрия

Согласно общей процедуре В, добавляют 100 мг соединения A'-1, в то время как другие материалы добавляют в молярных соотношениях. Реакционный раствор очищают препаративной жидкостной хроматографией, и получают целевое соединение A'-4. ЖХ-МС (ESI+) 529,0 [M+H]+.

Пример 3. Синтез A'-2

Bromomaleic anhydride - Броммалеиновый ангидрид, DMF - ДМФА

Соединение 2 (1 моль) растворяют в смеси этанола и воды, перемешивают, к раствору в один прием добавляют восстановленный порошок железа (5 моль), хлорид аммония (3 моль), и затем проводят реакцию при 80°С в течение 1 часа. По завершении реакции реакционный раствор охлаждают до комнатной температуры, фильтруют для удаления твердых веществ и перегоняют при пониженном давлении для удаления растворителя, и получают соединение 3. ЖХ-МС m/z (ES+) 154,05 (M+H)+.

Согласно общей процедуре А, добавляют соединение 3 (1 моль), добавляя в то же время другие материалы в молярных соотношениях. Реакцию выполняют при 80°С в течение ночи. Реакционный раствор очищают препаративной жидкостной хроматографией, и получают целевое соединение A'-2. ЖХ-МС m/z (ES+) 471,85 (M+H)+.

Пример 4. Синтез A'-7

Bromomaleic anhydride - Броммалеиновый ангидрид

Соединение 5 (Вос-имидазол, 2,37 г, 14,1 ммоль) растворяют в 30 мл толуола, и к раствору при комнатной температуре добавляют соединение 4 (диэтилентриамин, 0,66 г, 6,41 ммоль) с последующим перемешиванием при нагревании при 60°С в течение 6 час. По завершении реакции реакционный раствор перегоняют при пониженном давлении, и получают маслянистый сырой продукт реакции. Сырой продукт растворяют в 40 мл дихлорметана, промывают водой (40 мл × 3), раствор сушат, фильтруют и концентрируют, и получают 1,84 г соединения 6 с выходом 95%. ЖХ-МС (ESI+) 304,2 [M+H]+.

Соединение 6 (3,3 г, 10,89 ммоль) растворяют в 30 мл безводного толуола, и к раствору добавляют соединение 7 (янтарный ангидрид, 1,3 г, 13 ммоль) с последующим перемешиванием при нагревании при 60°С в течение ночи. По завершении реакции реакционный раствор перегоняют при пониженном давлении для удаления толуола, остаток растворяют в 20 мл дихлорметана, промывают водой (20 мл × 2), раствор промывают насыщенным раствором NaCl (20 мл × 1), сушат, фильтруют и перегоняют при пониженном давлении, и получают 3,5 г соединения 8 с выходом 80%. ЖХ-МС (ESI+) 404,3 [M+H]+.

Согласно общей процедуре А, добавляют 100 мг соединения 8, добавляя в то же время другие материалы в молярных соотношениях. Реакцию выполняют при 70°С в течение ночи. Реакционный раствор очищают препаративной жидкостной хроматографией, и получают 25,8 г целевого соединения A'-7 с выходом 20%. ЖХ-МС (ESI+) 519,9 [M+H]+.

Пример 5. Синтез A'-8

THF - ТГФ, Bromomaleic anhydride - Броммалеиновый ангидрид

Соединение 9 (1,3-диаминопропанол, 5,0 г, 55,47 ммоль) при перемешивании растворяют в 50 мл ТГФ и 20 мл воды. При комнатной температуре добавляют по каплям раствор Boc2O (25,4 г, 116,5 ммоль, 2,1 экв.) в 30 мл ТГФ. После этого реакционный раствор перемешивают при комнатной температуре в течение ночи. По завершении реакции раствор концентрируют при пониженном давлении. Остаток, к которому добавляют 30 мл петролейного эфира, перемешивают при комнатной температуре в течение 20 мин, в осадок выпадает белое твердое вещество, которое отфильтровывают и сушат, и получают 14,7 г белого соединения 10 с выходом 91%. ЖХ-МС (ESI+) 291,2 [M+H]+.

Соединение 10 (14,7 г, 50,64 ммоль) растворяют при перемешивании в 100 мл безводного ТГФ с последующим охлаждением на ледяной бане. Затем добавляют по частям NaH (4,8 г, 202,55 ммоль, 4 экв.) с последующим перемешиванием в течение 10 мин. Добавляют по каплям раствор соединения 11 (трет-бутилбромацетат, 24,7 г, 126,6 ммоль, 2,5 экв.) в 50 мл ТГФ. После этого реакционный раствор греют при 40°С и перемешивают в течение ночи. По завершении реакции реакционный раствор охлаждают до комнатной температуры, разбавляют 250 мл этилацетата, к полученной смеси добавляют постепенно смесь воды со льдом до тех пор, пока образуются пузырьки в большом количестве, и затем жидкость разделяют. Водную фазу экстрагируют этилацетатом, органические фазы объединяют, промывают, сушат и концентрируют. Остаток, к которому добавляют 50 мл петролейного эфира, перемешивают при комнатной температуре в течение 20 мин, и в осадок выпадает белое твердое вещество, которое отфильтровывают и сушат, и получают 12,1 г белого соединения 12 с выходом 60%. ЖХ-МС (ESI+) 404,1 [M+H]+.

Соединение 12 (12,1 г, 30,0 ммоль) растворяют при перемешивании в 120 мл безводного DCM, затем к раствору добавляют раствор (4М, 45 мл, 180 ммоль) хлороводорода в 1,4-диоксане с последующим перемешиванием при комнатной температуре в течение ночи. По завершении реакции реакционный раствор концентрируют при пониженном давлении. Остаток диспергируют с помощью ультразвука в 30 мл метил-трет-бутилового эфира, центрифугируют для удаления супернатанта и затем диспергируют в 30 мл петролейного эфира с удалением супернатанта. Твердое вещество выдерживают при пониженном давлении для удаления растворителя, и получают 7,7 г белого соединения 13 с выходом 100%. ЖХ-МС (ESI+) 148,1 [M+H]+.

Согласно общей процедуре А, добавляют 1,2 г соединения 13, добавляя в то же время другие материалы в молярных соотношениях. Реакцию выполняют при 85°С в течение 5 час. Реакционный раствор очищают препаративной жидкостной хроматографией, и получают 890 мг целевого соединения A'-8 с выходом 35%. ЖХ-МС (ESI+) 464,9 [M+H]+.

Пример 6. Синтез A'-9

Compound - Соединение, Bromomaleic anhydride - Броммалеиновый ангидрид

Согласно общей процедуре А, добавляют 500 мг соединения 14, добавляя в то же время другие материалы в молярных соотношениях. Реакцию выполняют при 70°С в течение ночи. Реакционный раствор очищают нормально-фазовой колоночной хроматографией, и получают 240 мг целевого соединения A'-9 с выходом 23%. ЖХ-МС (ESI+) 420,9 [M+H]+.

Пример 7. Синтез A'-10

Sodium thiophenolate _ Тиофенолят натрия

Согласно общей процедуре В, добавляют 104 мг соединения A'-7, добавляя в то же время другие материалы в молярных соотношениях. Реакцию выполняют при комнатной температуре в течение 2,5 час. Реакционный раствор очищают препаративной жидкостной хроматографией, и получают 27,7 мг целевого соединения A'-10 с выходом 24%. ЖХ-МС (ESI+) 596,1 [M+H]+.

Пример 8. Синтез A'-11

Sodium thiophenolate _ Тиофенолят натрия

Согласно общей процедуре В, добавляют 600 мг соединения A'-8, добавляя в то же время другие материалы в молярных соотношениях. Реакцию выполняют при комнатной температуре в течение 2,5 час. Реакционный раствор очищают препаративной жидкостной хроматографией, и получают 203 мг целевого соединения A'-11 с выходом 30%. ЖХ-МС (ESI+) 525,1 [M+H]+.

Пример 9. Синтез A'-12

Sodium thiophenolate _ Тиофенолят натрия

Согласно общей процедуре В, добавляют 120 мг соединения A'-9, добавляя в то время другие материалы добавляют в молярных соотношениях. Реакцию выполняют при комнатной температуре в течение 0,7 час. Реакционный раствор очищают препаративной жидкостной хроматографией, и получают 30 мг целевого соединения A'-12 с выходом 22%. ЖХ-МС (ESI+) 481,0 [M+H]+.

Пример 10. Синтез A'-13

Compound - Соединение, Bromomaleic anhydride - Броммалеиновый ангидрид

Согласно общей процедуре А, добавляют 500 мг соединения 15 (L-лизин), добавляя в то же время другие материалы в молярных соотношениях. Реакцию выполняют при 70°С в течение ночи. Реакционный раствор очищают нормально-фазовой колоночной хроматографией, и получают 410 мг целевого соединения A'-13 с выходом 26%. ЖХ-МС (ESI+) 462,9 [M+H]+.

Пример 11. Синтез A'-14

Bromomaleic anhydride - Броммалеиновый ангидрид

Соединение 16 (500 мг, 2,03 ммоль) растворяют при перемешивании, добавляя 1 мл ТГФ и 1 мл водного раствора NaHCO3 с последующим перемешиванием на ледяной бане в течение 5 мин. Затем постепенно, порциями, добавляют соединение 17 (724,4 г, 4,67 ммоль) с последующим перемешиванием на ледяной бане в течение 40 мин, и затем перемешивают при комнатной температуре в течение 2,5 час. По завершении реакции реакционный раствор подвергают выпариванию на роторном испарителе для удаления ТГФ, разбавляют 1 мл метанола и разделяют препаративной жидкостной хроматографией, и получают 245 мг соединения 18 с выходом 37%. ЖХ-МС (ESI+) 327,1 [M+H]+.

Согласно общей процедуре А, добавляют 245 мг соединения 18, добавляя в то же время другие материалы добавляют в молярных соотношениях. Реакцию выполняют при 70°С в течение ночи. Реакционный раствор очищают нормально-фазовой колоночной хроматографией, и получают 67 мг целевого соединения A'-14 с выходом 23%. ЖХ-МС (ESI+) 462,9 [M+H]+.

Пример 12. Синтез A'-15

Compound - Соединение, Bromomaleic anhydride - Броммалеиновый ангидрид

Согласно общей процедуре А, добавляют 56,1 мг соединения 19 (Вос-4-амино-L-фенилаланин), добавляя в то же время другие материалы в молярных соотношениях. Реакцию выполняют при 70°С в течение ночи. Реакционный раствор очищают нормально-фазовой колоночной хроматографией, и получают 17,9 мг целевого соединения A'-15 с выходом 18%. ЖХ-МС (ESI+) 496,9 [M+H]+.

Пример 13. Синтез A'-16

Sodium thiophenolate _ Тиофенолят натрия

Согласно общей процедуре В, добавляют 218 мг соединения A'-13, добавляя в то же время другие материалы в молярных соотношениях. Реакцию выполняют при комнатной температуре в течение 0,7 час. Реакционный раствор очищают препаративной жидкостной хроматографией, и получают 65 мг целевого соединения A'-16 с выходом 26%. ЖХ-МС (ESI+) 523,1 [M+H]+.

Пример 14. Синтез A'-19

Bromomaleic anhydride - Броммалеиновый ангидрид

Соединение 20 (140 мг, 0,5 ммоль) растворяют в 3 мл дихлорметана, и добавляют триэтиламин (210 мкл, 1,5 ммоль) с последующим перемешиванием на ледяной бане. Соединение 21 (62,5 мкл, 0,75 ммоль) растворяют в 2 мл DCM, и раствор добавляют по каплям к реакционному раствору с последующим перемешиванием на ледяной бане в течение 0,5 часа, и перемешивают при комнатной температуре в течение 2 час. По завершении реакции реакционный раствор концентрируют. Остаток растворяют в ацетонитриле и разделяют препаративной жидкостной хроматографией, и получают 93,5 мг соединения 22 с выходом 56,1%. ЖХ-МС (ESI+) 335,2 [M+H]+.

Согласно общей процедуре А, добавляют 33,4 мг соединения 22, добавляя в то же время другие материалы в молярных соотношениях. Реакцию выполняют при 70°С в течение ночи. Реакционный раствор очищают нормально-фазовой колоночной хроматографией, и получают 7,5 мг целевого соединения A'-19 с выходом 19,1%. ЖХ-МС (ESI+) 393,0 [M+H]+.

Пример 15. Синтез A'-20

Соединение 23 (230 мг, 1 ммоль) растворяют в 3 мл ТГФ, и добавляют броммалеиновый ангидрид (354 мг, 2 ммоль) с последующим перемешиванием при комнатной температуре в течение 3 час. По завершении реакции реакционный раствор подвергают выпариванию на роторном испарителе для удаления ТГФ, и получают сырой продукт реакции соединение 24. Соединение 24 растворяют в 3 мл уксусного ангидрида, и добавляют ацетат натрия (41 мг, 0,5 ммоль) с последующим перемешиванием при 70°С в течение 8 час. По завершении реакции реакционный раствор подвергают выпариванию на роторном испарителе для удаления растворителя. Остаток растворяют в 4 мл смеси ацетонитрил/вода (1:1), очищают препаративной жидкостной хроматографией, и получают 70 мг соединения 25 с выходом 18%. ЖХ-МС (ESI+) 389,0 [M+H]+.

К соединению 25 (99,2 мг, 0,32 ммоль) добавляют 2 мл раствора (4М, 8 ммоль) хлороводорода в 1,4-диоксане с последующим перемешиванием на ледяной бане в течение 2 час. По завершении реакции реакционный раствор подвергают выпариванию на роторном испарителе для удаления растворителя. Остаток промывают диэтиловым эфиром (5 мл × 3) и сушат, и получают 64,1 мг соединения 26 с выходом 95,3%. ЖХ-МС (ESI+) 289,0 [M+H]+.

Соединение 26 (21 мг, 0,1 ммоль) растворяют в 1 мл дихлорметана, и добавляют триэтиламин (42 мкл, 0,3 ммоль) с последующим перемешиванием на ледяной бане. Соединение 21 (12,5 мкл, 0,15 ммоль) растворяют в 1 мл DCM, и раствор добавляют по каплям к реакционному раствору с последующим перемешиванием на ледяной бане в течение 0,5 часа и перемешиванием при комнатной температуре в течение 2 час. По завершении реакции реакционный раствор концентрируют. Остаток растворяют в ацетонитриле и разделяют препаративной жидкостной хроматографией, и получают 18,2 мг A'-20 с выходом 69,1%. ЖХ-МС (ESI+) 343,0 [M+H]+.

Пример 16. Синтез A'-26

THF - ТГФ, DMF - ДМФА, dioxane - диоксан

Bromomaleic anhydride - Броммалеиновый ангидрид

Соединение 27 (150 мг, 0,63 ммоль, 1,0 экв.) растворяют в 5 мл безводного ТГФ и затем охлаждают до -5°С под защитой Ar, и к раствору добавляют осторожно ВН3-ТГФ (1N, 2,5 ммоль, 4,0 экв.) с последующим перемешиванием в течение 10 мин и последующим перемешиванием в течение 10 мин при комнатной температуре. После этого раствор постепенно нагревают до 65°С, и проводят реакцию в течение ночи. По завершении реакции реакционный раствор охлаждают до 0°С, и к реакционному раствору постепенно по каплям добавляют 5 мл метанола с последующим перемешиванием в течение 30 мин и последующим перемешиванием в течение 10 мин при комнатной температуре. После этого реакционный раствор нагревают до 60°С, перемешивают в течение 3 час и концентрируют при пониженном давлении, и получают сырой продукт реакции 140 мг соединения 28 в виде маслянистой жидкости, которую без очистки передают непосредственно на следующую стадию. ЖХ-МС (ESI+) 167,1 [M+H]+.

Сырой продукт соединение 28 (140,0 мг, 0,58 ммоль, 1,0 экв.) растворяют в 5 мл ТГФ, добавляют 3 мл воды и затем добавляют по каплям раствор ВоС2О (255,5 г, 1,17 ммоль, 2,0 экв.) в 2,5 мл ТГФ с последующим перемешиванием при комнатной температуре в течение ночи. По завершении реакции реакционный раствор концентрируют при пониженном давлении. Остаток, к которому добавляют 30 мл ЕА, промывают, сушат, концентрируют и очищают, и получают 185 мг соединения 29 в виде белого твердого вещества с выходом 72%. ЖХ-МС (ESI+) 367,1 [M+H]+.

Соединение 29 (94,0 мг, 0,25 ммоль, 1,0 экв.) растворяют в 3 мл ДМФА, к раствору добавляют К2СО3 (71,0 мг, 0,51 ммоль, 2,0 экв.) и затем добавляют по каплям раствор соединения 11 (75,0 мг, 0,38 ммоль, 1,5 экв.) в 1 мл ДМФА с последующим нагреванием до 55°С и перемешиванием в течение ночи. По завершении реакции к реакционному раствору добавляют 20 мл ЕА. Доводят рН реакционного раствора 30% лимонной кислотой до рН=3, раствор экстрагируют, промывают, сушат и концентрируют, и получают 108 мг соединения 30 в виде не совсем белого твердого вещества с выходом 88%. ЖХ-МС (ESI+) 481,1 [M+H]+.

Соединение 30 (108 мг, 0,22 ммоль, 1,0 экв.) растворяют в 5 мл безводного DCM, затем к раствору добавляют раствор (4М, 1,5 мл, 6,0 ммоль, 27,0 экв.) HCl в 1,4-диоксане с последующим перемешиванием при комнатной температуре в течение 3 час. По завершении реакции реакционный раствор концентрируют при пониженном давлении. Остаток диспергируют с помощью ультразвука в 10 мл метил-трет-бутилового эфира, центрифугируют для удаления супернатанта и затем диспергируют в 10 мл петролейного эфира и центрифугируют с удалением супернатанта. Твердое вещество выдерживают при пониженном давлении для удаления растворителя, и получают 66,6 мг соединения 31 в виде белого твердого вещества с выходом 100%. ЖХ-МС (ESI+) 225,1,1 [M+H]+.

Согласно общей процедуре А, добавляют 66,6 мг соединения 31, добавляя в то же время другие материалы в молярных соотношениях. Реакцию выполняют при 70°С в течение ночи. Реакционный раствор очищают нормально-фазовой колоночной хроматографией, и получают 40 мг целевого соединения A'-26 с выходом 33%. ЖХ-МС (ESI+) 540,9 [M+H]+.

Пример 17. Синтез A'-27

Sodium thiophenolate _ Тиофенолят натрия

Соединение A'-26 (40,0 мг, 0,074 ммоль, 1,0 экв.) растворяют в 1,0 мл безводного ТГФ, и к раствору добавляют раствор ТЕА (22,5 мг, 0,22 ммоль, 3,0 экв.) в 500 мкл ТГФ с последующим перемешиванием при комнатной температуре в течение 5 мин. Соединение 32 (20,5 мг, 0,16 ммоль, 2,2 экв.) растворяют в 500 мкл ДМФА, и раствор добавляют по каплям к реакционному раствору с последующим перемешиванием при комнатной температуре в течение ночи. По завершении реакции к реакционному раствору добавляют 15 мл этилацетата. Реакционный раствор промывают 15% раствором лимонной кислоты, промывают водой, промывают насыщенным раствором NaCl, сушат, концентрируют и очищают, и получают 12 мг соединения A'-27 в виде белого твердого вещества с выходом 26%. ЖХ-МС (ESI+) 629,1 [M+H]+.

Пример 18. Синтез A'-28

Dioxane - диоксан, DMF - ДМФА

Bromomaleic anhydride - Броммалеиновый ангидрид

Соединение 33 (150 мг, 2 ммоль, 1,0 экв.) растворяют в 5 мл диоксана, добавляют 3 мл насыщенного водного раствора бикарбоната натрия и затем добавляют по каплям раствор ВоС2О (523 мг, 2,40 ммоль, 1,2 экв.) в 2,5 мл диоксана с последующим перемешиванием при комнатной температуре в течение 2 час. Реакционный раствор концентрируют при пониженном давлении. Остаток, к которому добавляют 30 мл ЕА, доводят до рН=3 30% лимонной кислотой, экстрагируют, промывают, сушат, концентрируют, диспергируют в 15 мл РЕ, фильтруют и сушат, и получают 344 мг соединения 34 с выходом 62%. ЖХ-МС (ESI+) 176,1 [M+H]+.

Соединение 34 (350 мг, 2,0 ммоль, 1,0 экв.) растворяют в 4 мл ДМФА и охлаждают до -15°С в атмосфере Ar, к раствору добавляют раствор ТЕА (606,0 мг, 6,00 ммоль, 3,0 экв.) в 1 мл ДМФА с последующим перемешиванием в течение 5 мин, и затем добавляют раствор Т3Р (700,0 мг, 2,20 ммоль, 1,1 экв.) в 1 мл ДМФА с последующим перемешиванием в течение 1,5 час. К реакционному раствору добавляют по каплям раствор соединения 35 (135,0 мг, 1,00 ммоль, 0,5 экв.) в 1 мл ДМФА с последующим перемешиванием в течение ночи. Доводят рН реакционного раствора, к которому добавлены 30 мл ЕА, до рН=3 30% лимонной кислотой, экстрагируют, промывают, сушат и концентрируют, и получают 350 мг соединения 36 в виде маслянистой жидкости, которую без очистки передают непосредственно на следующую стадию. ЖХ-МС (ESI+) 449,2 [M+H]+.

Соединение 36 (350 мг, 0,78 ммоль, 1,0 экв.) растворяют при перемешивании в 5 мл безводного DCM, и затем к раствору добавляют раствор (4М, 2,0 мл, 8,0 ммоль, 10,2 экв.) HCl в 1,4-диоксане с последующим перемешиванием при комнатной температуре в течение 2 час. Реакционный раствор концентрируют при пониженном давлении. Остаток диспергируют с помощью ультразвука в 20 мл метил-трет-бутилового эфира, центрифугируют с удалением супернатанта и затем диспергируют в 20 мл петролейного эфира и центрифугируют с удалением супернатанта. Твердое вещество выдерживают при пониженном давлении для удаления растворителя, и получают 254 мг соединения 37 с выходом 100%. ЖХ-МС (ESI+) 249,1,1 [M+H]+.

Согласно общей процедуре А, добавляют 195 мг соединения 37, добавляя в то же время другие материалы в молярных соотношениях. Реакцию выполняют при 70°С в течение ночи. Реакционный раствор очищают нормально-фазовой колоночной хроматографией, и получают 58 мг целевого соединения A'-28 в виде светло-желтого твердого вещества с выходом 17%. ЖХ-МС (ESI+) 564,9 [M+H]+.

Пример 19. Синтез A'-29

Sodium thiophenolate _ Тиофенолят натрия

Согласно общей процедуре В, добавляют 58 мг соединения 38, добавляя в то же время другие материалы в молярных соотношениях. Реакцию выполняют при комнатной температуре в течение 0,7 час. Реакционный раствор очищают нормально-фазовой колоночной хроматографией, и получают 14,1 мг целевого соединения A'-29 с выходом 22%. ЖХ-МС (ESI+) 625,1 [M+H]+.

Пример 20. Синтез A'-31

Bromomaleic anhydride - Броммалеиновый ангидрид

Соединение 43 (342 мг, 3,00 ммоль, 1,0 экв.) растворяют в 15 мл безводного ТГФ, и добавляют по каплям броммалеиновый ангидрид (1110,0 мг, 6,30 ммоль, 2,1 экв.) с последующим перемешиванием при комнатной температуре в течение ночи. По завершении реакции реакционный раствор фильтруют. Остаток на фильтре промывают DCM и сушат, и получают 1160 мг соединения 44 в виде белого твердого вещества с выходом 83%. ЖХ-МС (ESI+) 466,9 [M+H]+.

К соединению 45 (300 мг, 0,64 ммоль, 1,0 экв.) и безводному ацетату натрия (158,0 мг, 1,93 ммоль, 3,0 экв.) добавляют 6 мл уксусной кислоты с последующим перемешиванием при 85°С и реагированием в течение ночи. Реакционный раствор охлаждают до 45°С и концентрируют при пониженном давлении. Остаток, к которому добавлены 20 мл ацетонитрила, фильтруют. Фильтрат очищают препаративной жидкостной хроматографией, и получают 15 мг светло-желтого твердого вещества (т.е., соединения A'-31) с выходом 5%. ЖХ-МС (ESI+) 430,9 [M+H]+.

Пример 21. Синтез A'-33

Согласно общей процедуре А, добавляют соединение 48 (95 мг, 0,5 ммоль) и соединение 8 (80,6 мг, 0,2 ммоль), и получают 10,9 мг соединения A'-33 с выходом 10,1%. ЖХ-МС (ESI+) 548,0 [M+H]+.

Пример 22. Синтез A'-34

Bromomaleic anhydride - Броммалеиновый ангидрид

Согласно общей процедуре А, добавляют соединение 49 (2-амино-6-хлоризоникотиновая кислота, 85 мг, 0,5 ммоль), и получают 21,3 мг соединения A'-34 с выходом 13%. ЖХ-МС (ESI+) 330,9 [M+H]+.

Пример 23. Синтез конъюгата (Ab-A) антитела (Ab) и первой линкерной составляющей (А)

Для сочетания с антителом в конъюгате антитело-лекарственное средство используют главным образом линкер (т.е., первую линкерную составляющую А) по настоящему изобретению. Для того, чтобы подтвердить способность к сочетанию линкера по настоящему изобретению с антителом, линкеры, синтезированные в приведенных выше примерах, по отдельности вводят в сочетание с антителом. Используемый способ сочетания описан далее.

1) Получение маточных растворов восстановителя и защитного агента. Маточные растворы восстановителя и защитного агента - 1~20 мМ ТСЕР (трис-2-карбоксиэтилфосфин) (восстановитель) и 1~20 мМ DTPA (диэтилентриаминпентауксусная кислота) (защитный агент) - получают соответственно с очищенной водой.

2) Реакция восстановления антитела. Маточные растворы DTPA и ТСЕР добавляют к раствору моноклонального антитела (например, 5-30 мг/мл), соответственно. Маточный раствор DTPA смешивают с раствором моноклонального антитела (например 5-30 мг/мл) согласно определенному объемному соотношению (1~5:10), и молярное отношение ТСЕР к моноклональному антителу составляет 0,5~6,0:1. После добавления восстановителя и защитного агента реакцию выполняют при 25°С при перемешивании в течение 1 часа.

3) Получение раствора первой линкерной составляющей (А). Первую линкерную составляющую (А) растворяют в 25% ДМСО (диметилсульфоксид) с образованием раствора первой линкерной составляющей (А) концентрации 5 мМ.

4) Реакция сочетания между первой линкерной составляющей (А) и антителом. Раствор первой линкерной составляющей (А), полученный на стадии 3), постепенно добавляют к раствору восстановленного моноклонального антитела, полученного на стадии 2), и, согласно фактической потребности, причем молярное отношение первой линкерной составляющей (А) к тиогруппе антитела регулируется в интервале 0,3~5:1, реакцию выполняют при 25°С при перемешивании в течение 4 час.

5) Стадии очистки и детекции. После завершении реакции на стадии 4) реакционный раствор центрифугируют и подвергают ультрафильтрации 3 раза с буфером PBS для очистки и удаления оставшихся непрореагировавших химикатов и свободных небольших молекул, таких как ДМСО, и результат сочетания определяют с помощью электрофореза в SDS-PAGE.

Результат сочетания конъюгат антитело-линкер анализируют электрофорезом в SDS-PAGE. Используют следующий способ: для детекции в SDS-PAGE используют гелевую пластинку NUPAGE 4-12%, 1,5 мкл образца помещают в 1,5-мл EP пробирку, добавляют 2,5 мкл буфера, затем добавляют 1,5 мкл восстановителя, и добавляют воду до получения объема 10 мкл. Смесь перемешивают на осцилляторе и греют в микроволновой печи в течение 1 мин. После загрузки образца выполняют гель-электрофорез. По завершении гель-электрофореза гель извлекают и помещают в пенал для хранения в свежем состоянии, в который добавляют 50 мл быстрого красителя, греют в микроволновой печи в течение 5 мин и затем сушат на вибростенде в течение 5 мин. Краситель сливают, и затем добавляют 100 мл очищенной воды, греют на индукционной плите в течение 5 мин и обесцвечивают на вибростенде в течение 1 часа. Эту операцию повторяют 3 раза.

Используемым антителом является моноклональное антитело Her2 (что касается информации о последовательности антитела, пожалуйста, обратитесь к абзацам 41,42, 43 описания в публикации заявки на патент Китая № CN105008398B), и линкерами являются

A'-7 A'-8 A'-10
A'-11 A'-12 A'-20
A'-28 A'-31 .

Результаты сочетания показаны на фигуре 5. На фигуре 5 №№ 1, 2, 3 относятся к Her2-A'-7, буферы для сочетания соответственно имеют pH 8,5, 9,0, 7,4; №№ 4, 5, 6 относятся к Her2-A'-8, буферы для сочетания соответственно имеют pH 8,5, 7,4, 9,0; №№ 7, 8, 9 относятся к Her2-A'-10, буферы для сочетания соответственно имеют pH 8,5, 9,0, 7,4; №№ 10, 11, 12 относятся к Her2-A'-11, буферы для сочетания соответственно имеют pH 9,0, 7,4, 9,5; №№ 13, 14, 15 относятся к Her2-A'-12, буферы для сочетания соответственно имеют pH 7,4, 9,0, 8,5; №№ 16, 17, 18 относятся к Her2-A'-20, буферы для сочетания соответственно имеют pH 8,5, 9,0, 7,4; №№ 19, 20, 21 относятся к Her2-A'-28, буферы для сочетания соответственно имеют pH 9,0, 8,5, 7,4; №№ 22, 23, 24 относятся к Her2-A'-31, буферы для сочетания соответственно имеют pH 7,4, 8,5, 9,0.

И-за применения восстановительного электрофореза выставлены все тиогруппы в антителах. Поэтому на фигуре 5 25 кДа представляют молекулярную массу одной легкой цепи антитела, 50 кДа представляют молекулярную массу одной тяжелой цепи, и 75 кДа представляют молекулярную массу одной легкой цепи и одной тяжелой цепи (т.е., один линкер ковалентно связывается с тиогруппой между одной тяжелой цепью и одной легкой цепью), 100 кДа представляют молекулярную массу двух тяжелых цепей (т.е., один линкер ковалентно связывается с тиогруппой между двумя тяжелыми цепями), 125 кДа представляют молекулярную массу одной легкой цепи и двух тяжелых цепей (т.е., один линкер ковалентно связывается с тиогруппами между двумя тяжелыми цепями и одной легкой цепью), 150 кДа представляют молекулярную массу двух тяжелых цепей и двух легких цепей (т.е., один линкер ковалентно связывается с тиогруппами между двумя тяжелыми цепями и двумя легкими цепями).

Результаты показывают, что вышеописанные конъюгаты антитело-линкер имеют, каждый, линкеры, которые одновременно ковалентно связываются с тиогруппами соответственно между одной тяжелой цепью и одной легкой цепью, между двумя тяжелыми цепями, между двумя тяжелыми цепями и одной легкой цепью или между двумя тяжелыми цепями и двумя легкими цепями. И в большинстве конъюгатов антитело-линкер имеются полосы 150-75 кДа, которые подтверждают, что 4 пары дисульфидных связей в антителе полностью или частично образуют мостики, и эффект мостиковой связи более хороший. Из фигуры 5 также можно видеть, что результат сочетания в среде буфера с рН=9,0 лучше, чем в средах с рН=8,5 и 7,4.

С учетом более хорошего эффекта мостиковой связи линкера по настоящему изобретению с антителом, для получения конъюгатов антитело-лекарственное средство выбирают A'-7, A'-8, A'-10, A'-11, A'-28. Используемым антителом является моноклональное антитело Her2 (такое же, как выше), и используемыми лекарственными средствами являются MMAE, MMAF, MMAD, CBI, DM1, DM4.

Что касается MMAE и MMAD, получение конъюгата антитело-лекарственное средство, включенного в настоящее изобретение, обычно подразделяется на три стадии: первой стадией является получение конъюгата L-D второго линкера L и лекарственного средства D; второй стадией является получение конъюгата А-L-D первого линкера А и L-D; и третьей стадией является получение конъюгата антитела Ab и А-L-D, т.е., конъюгата антитело-лекарственное средство Ab-А-L-D.

Что касается MMAF, CBI, DM1, DM4, получение конъюгата антитело-лекарственное средство, включенного в настоящее изобретение, обычно подразделяется на две стадии: первой стадией является получение конъюгата А-D первого линкера А и лекарственного средства D; и второй стадией является получение конъюгата антитела Ab и А-D, т.е., конъюгата антитело-лекарственное средство Ab-А-D.

Конкретный способ получения показан в примерах 26-29.

Пример 24. Синтез конъюгата (L-D) второй линкерной составляющей (L) и лекарственного средства (D)

Общий способ синтеза (L-D). Вторую линкерную составляющую L растворяют в подходящем количестве ДМФА, к полученному раствору под защитой газа азота добавляют лекарственное средство (D), HOBt, DIPEA и пиридин в соответствующих количествах, и затем смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 25 час, используя ТСХ для контроля за развитием реакции. По завершении реакции реакционный раствор очищают препаративной высокоэффективной жидкостной хроматографией, полученный раствор лиофилизуют, и получают конъюгат (L-D) второй линкерной составляющей и лекарственного средства.

Val-Cit-PAB-MMAE получают общим способом, описанным выше, а путь синтеза показан ниже.

Соединение 53 (т.е., Fomc-Val-Cit-PAB-PNP, 995,4 мг, 1,3 ммоль) и HOBt (67,6 мг, 0,65 ммоль) помещают в колбу для реакции и растворяют в 5 мл безводного ДМФА, и к полученному раствору добавляют DIPEA (258,5 мг, 2 ммоль) с последующим перемешиванием при комнатной температуре в течение 10 мин. Соединение 54 (т.е., MMAE, 717 мг, 1 ммоль) растворяют в 5 мл безводного ДМФА и добавляют по каплям к реакционному раствору с последующим перемешиванием при комнатной температуре в течение ночи. По завершении реакции реакционный раствор фильтруют. Органическую фазу концентрируют. Остаток разделяют препаративной жидкостной хроматографией, и получают 636,2 мг соединения 55 (т.е., Fmoc-Val-Cit-PAB-MMAE) в виде белого твердого вещества с выходом 47,3%, ЖХ-МС (ESI+) 1345,8 [M+H]+.

Соединение 55 (270 мг, 0,2 ммоль) добавляют к 3 мл 20% раствора пиперидина в ацетонитриле (об./об.) с последующим перемешиванием при комнатной температуре в течение 2,5 час для постепенного растворения твердого вещества. По завершении реакции реакционный раствор перегоняют при пониженном давлении для удаления растворителя. Остаток разделяют препаративной жидкостной хроматографией, и получают 214 мг соединения 62 (т.е., Val-Cit-PAB-MMAE) с выходом 95%, ЖХ-МС (ESI+) 1123,7 [M+H]+.

Синтез с использованием линкерной составляющей (L) и лекарственного средства (D) является общим способом для синтеза других соединений L-D, таких как Val-Cit-PAB-MMAD.

Пример 25. Синтез конъюгата (А-L-D) первой линкерной составляющей (А) и конъюгата вторая линкерная составляющая-лекарственное средство (L-D)

Общий способ синтеза А-L-D. Первую линкерную составляющую, EDCI, HOBt в соответствующих количествах растворяют в подходящем количестве безводного ДМФА и перемешивают при комнатной температуре в течение 2 час. Соответствующее количество полученного выше L-D растворяют в подходящем количестве безводного ДМФА и постепенно по каплям добавляют к реакционному раствору с последующим перемешиванием при комнатной температуре в течение 4 час. По завершении реакции реакционный раствор разбавляют ацетонитрилом и затем разделяют препаративной жидкостной хроматографией. Элюент лиофилизуют, и получают конъюгат первой линкерной составляющей (A) и конъюгата вторая линкерная составляющая-лекарственное средство (L-D).

Конъюгат A'-7 и соединения 56 (Val-Cit-PAB-MMAE) синтезируют с использованием описанного выше общего способа. Путь синтеза показан ниже.

DMF - ДМФА

Соединение A'-7 (27,8 мг, 0,053 ммоль), EDCI (11,2 мг, 0,058 ммоль), HOBt (1,4 мг, 0,01 ммоль) растворяют в 0,3 мл безводного ДМФА и перемешивают при комнатной температуре в течение 2 час. Соединение 56 (i.e., Val-Cit-PAB-MMAE, 40 мг, 0,035 ммоль) растворяют в 0,2 мл безводного ДМФА и добавляют по каплям к реакционному раствору с последующим перемешиванием при комнатной температуре в течение 4 час. По завершении реакции реакционный раствор разбавляют 2 мл ацетонитрила и затем разделяют препаративной жидкостной хроматографией. Элюент лиофилизуют, и получают 8,6 мг соединения 57 (т.е., A'-7-Val-Cit-PAB-MMAE) в виде светло-желтого твердого вещества с выходом 15%. ЖХ-МС (ESI+) 1624,6 [M+H]+.

С использованием описанного выше общего способа синтеза синтезируют другие конъюгаты первой линкерной составляющей и соединения L-D, такие как A'-8-Val-Cit-PAB-MMAE, A'-10-Val-Cit-PAB-MMAE, A'-11-Val-Cit-PAB-MMAE, A'-11-Val-Cit-PAB-MMAD, A'-28-Val-Cit-PAB-MMAE и подобные.

Для сравнения, в настоящем описании также описывается получение конъюгата 575DZ-Val-Cit-PAB-MMAE соединения 6 (это соединение определено в настоящем описании как 575DZ), раскрытого на странице 7 формулы изобретения патента Китая № CN103933575A, со второй линкерной составляющей (Val-Cit-PAB) и составляющей лекарственного средства (MMAE).

Пример 26. Синтез конъюгата (А-D) первой линкерной составляющей (А) и лекарственного средства (D)

(1) Синтез A'-7-MMAF

Соединение A'-7 (51,8 мг, 0,1 ммоль), EDCI (21,1 мг, 0,11 ммоль), HOBt (2,7 мг, 0,01 ммоль) растворяют в 2 мл безводного ДМФА и перемешивают при комнатной температуре в течение 2 час. Соединение 58 (т.e., MMAF, 48,8 мг, 0,066 ммоль) растворяют в 0,8 мл безводного ДМФА и добавляют по каплям к реакционному раствору с последующим перемешиванием при комнатной температуре в течение 4 час. По завершении реакции реакционный раствор разбавляют 4 мл ацетонитрила и затем разделяют препаративной жидкостной хроматографией. Элюент лиофилизуют, и получают 25,9 мг соединения A'-7-MMAF в виде светло-желтого твердого вещества с выходом 21%. ЖХ-МС (ESI+) 1233,4 [M+H]+.

(2) Синтез A'-8-CBI

Способ синтеза такой же, как синтеза A'-7-MMAF. Добавляют A'-8 (22,0 мг, 0,047 ммоль, 1,0 экв.) и соединение 59 (т.e., CBI, 14,0 мг, 0,020 ммоль, 0,7 экв.), и получают 6,0 мг белого твердого вещества A'-8-CBI с выходом 21%. ЖХ-МС (ESI+) 868,0 [M+H]+.

(3) Синтез A'-8-DM1

Соединение 60 (45,0 мг, 0,21 ммоль, 1,0 экв.) растворяют в 2 мл безводного ТГФ, добавляют 1 мл насыщ. водного раствора NaHCO3, и добавляют по каплям раствор DM1 (61, 150,0 мг, 0,21 ммоль, 1,0 экв.) в 1 мл ДМФА с последующим перемешиванием при комнатной температуре в течение 2 час. Реакционный раствор разбавляют 10 мл воды и экстрагируюь ЕА. Доводят рН водной фазы до рН=3 15% раствором лимонной кислоты, экстрагируют 15 мл ЕА, экстракт промывают насыщенным раствором NaCl, сушат и концентрируют, и получают 165,7 мг соединения 62 в виде белого твердого вещества с выходом 85%. ЖХ-МС (ESI+) 949,3 [M+H]+.

A'-8 (150,0 мг, 0,33 ммоль, 1,0 экв.) растворяют в 5 мл ДМФА, охлаждают до -15°С в атмосфере Ar, и к полученному раствору добавляют раствор ТЕА (98,0 мг, 0,99 ммоль, 3,0 экв.) в 1 мл ДМФА с последующим перемешиванием в течение 5 мин, и затем добавляют раствор Т3Р (154,0 мг, 0,48 ммоль, 1,5 экв.) в 1 мл ДМФА с последующим перемешиванием в течение 1,5 час. К реакционному раствору добавляют по каплям раствор соединения 63 (46,0 мг, 0,29 ммоль, 0,9 экв.) в 1 мл ДМФА с последующим перемешиванием в течение ночи. По завершении реакции добавляют 30 мл ЕА, доводят рН реакционного раствора до рН=3 30% лимонной кислотой, экстрагируют, промывают, сушат, концентрируют и очищают нормально-фазовой колоночной хроматографией, и получают 90 мг соединения 64 в виде белого твердого вещества с выходом 52%. ЖХ-МС (ESI+) 607,1 [M+H]+.

Соединение 64 (90 мг, 0,15 ммоль, 1,0 экв.) растворяют в 3 мл безводного DCM при перемешивании, и затем добавляют раствор (4 M, 1,0 мл, 4 ммоль, 26,7 экв.) HCl в 1,4-диоксане с последующим перемешиванием при комнатной температуре в течение 2 час. Реакционный раствор концентрируют при пониженном давлении. Остаток диспергируют с помощью ультразвука в 20 мл метил-трет-бутилового эфира, центрифугируют с удалением супернатанта и затем диспергируют в 20 мл петролейного эфира и центрифугируют с удалением супернатанта. Твердое вещество выдерживают при пониженном давлении для удаления растворителя, и получают 82 мг соединения 65 в виде белого твердого вещества с выходом 100%. ЖХ-МС (ESI+) 506,9 [M+H]+.

Соединение 62 (30,0 мг, 0,03 ммоль, 1,0 экв.) растворяют в 2 мл ДМФА, охлаждают до -15°С в атмосфере Ar, и к полученному раствору добавляют раствор ТЕА (11,0 мг, 0,095 ммоль, 4,0 экв.) в 500 мкл ДМФА с последующим перемешиванием в течение 5 мин, и затем добавляют раствор Т3Р (15,0 мг, 0,047 ммоль, 1,5 экв.) в 500 мкл ДМФА с последующим перемешиванием в течение 1,5 час. К реакционному раствору добавляют по каплям раствор соединения 65 (19,0 мг, 0,035 ммоль, 1,1 экв.) в 500 мкл ДМФА с последующим перемешиванием в течение ночи. По завершении реакции реакционный раствор разбавляют 2 мл ацетонитрила и очищают препаративной жидкостной хроматографией, и получают 9 мг продукта A'-8-DM1 с выходом 20%. ЖХ-МС (ESI+) 1437,3 [M+H]+.

(4) Синтез A'-7-DM4

Соединение 67 (737,5 мг, 4,03 ммоль), EDCI (846,13 мг, 4,43 ммоль), HOBt (108,9 мг, 0,806 ммоль) растворяют в 10 мл DCM с последующим перемешиванием при комнатной температуре в течение 2 час. Соединение 66 (1 г, 4,03 ммоль) растворяют в 5 мл дихлорметана и медленно, по каплям, добавляют к реакционному раствору в 3 приема с последующим перемешиванием при комнатной температуре в течение ночи. По завершении реакции реакционный раствор концентрируют при пониженном давлении для удаления растворителя. Остаток растворяют в 6 мл смеси ацетонитрил/вода (1:1), разделяют препаративной жидкостной хроматографией и лиофилизуют, и получают 1,11 г соединения 68 в виде бесцветного маслянистого вещества с выходом 67%. ЖХ-МС (ESI+) 414,2 [M+H]+.

Соединение 68 (1,11 г, 2,7 ммоль) растворяют в 1,1 мл DMA. Полученный раствор, 0,1 мл, растворяют в 1 мл DMA и добавляют DIPEA (41,3 мг, 0,32 ммоль) с последующим перемешиванием при комнатной температуре в течение 2 мин, и затем добавляют DM4 (69, 202,5 мг, 0,26 ммоль) с последующим перемешиванием при комнатной температуре в течение 6 час. Реакционный раствор непосредственно разделяют препаративной жидкостной хроматографией и лиофилизуют, и получают 260 мг соединения 70 в виде белого твердого вещества с выходом 84%. ЖХ-МС (ESI+) 1193,5 [M+H]+.

Способ синтеза соединения 71 такой же, как способ синтеза соединения 65. Добавляют 119,3 мг соединения 70, и получают 106 мг соединения 71 в виде белого твердого вещества с выходом 96%. ЖХ-МС (ESI+) 1093,5 [M+H]+.

Способ синтеза A'-7-DM4 такой же, как способ синтеза A'-8-DM1. Добавляют 52 мг A'-7 и 54,6 мг соединения 71, и получают 15 мг A'-8-DM1 в виде белого твердого вещества с выходом 19%. ЖХ-МС (ESI+) 1594,4 [M+H]+.

Пример 27. Синтез конъюгата антитело-лекарственное средство и анализ продукта на однородность

Общий способ синтеза конъюгата антитело-лекарственное средство

1) Получение маточных растворов восстановителя и защитного агента. Маточные растворы восстановителя и защитного агента - 1~20 мМ ТСЕР (трис-2-карбоксиэтилфосфин) (восстановитель) и 1~20 мМ DTPA (диэтилентриаминпентауксусная кислота) (защитный агент) - получают соответственно с очищенной водой.

2) Реакция восстановления антитела. Маточные растворы DTPA и ТСЕР добавляют к раствору моноклонального антитела (например, 5-30 мг/мл), соответственно. Маточный раствор DTPA смешивают с раствором моноклонального антитела (например 5-30 мг/мл) согласно определенному объемному соотношению (1~5:10), и молярное отношение ТСЕР к моноклональному антителу составляет 0,5~6,0:1. После добавления восстановителя и защитного агента реакцию выполняют при 25°С при перемешивании в течение 1 часа.

3) Синтез A-L-D и получение раствора. Синтезируют конъюгат (A-L-D) первая линкерная составляющая-вторая линкерная составляющая-составляющая лекарственного средства, синтезированный A-L-D растворяют в 25% ДМСО (диметилсульфоксид), и получают раствор A-L-D концентрации 5 мМ.

4) Реакция сочетания лекарственного средства и антитела. Раствор A-L-D, полученный на стадии 3), медленно добавляют к раствору восстановленного антитела, полученному на стадии 1), и согласно фактической потребности, причем молярное отношение A-L-D к тиогруппе антитела регулируют в интервале 0,3~5:1, реакцию выполняют при 25°С при перемешивании в течение 4 час.

5) Стадии очистки и детекции. По завершении реакции на стадии 4) реакционный раствор центрифугируют и подвергают ультрафильтрации 3 раза с буфером PBS для очистки и удаления оставшихся непрореагировавших химикатов и небольших свободных молекул, таких как ДМСО, и результат сочетания определяют с помощью электрофореза в SDS-PAGE и гидрофобной высокоэффективной жидкостной хроматографии (HIC-HPLC).

Результат сочетания конъюгат антитело-лекарственное средство анализируют электрофорезом в SDS-PAGE и HIC-HPLC. Используют описанный далее способ.

1) Электрофорез в поликриламидном геле (SDS-PAGE)

Для детекции в SDS-PAGE используют гелевую пластинку NUPAGE 4-12%, 1,5 мкл образца помещают в 1,5-мл EP пробирку, добавляют 2,5 мкл буфера, затем добавляют 1,5 мкл восстановителя, и добавляют воду до получения объема 10 мкл с последующим перемешиванием смеси на осцилляторе и нагреванием в микроволновой печи в течение 1 мин. После загрузки образца выполняют гель-электрофорез. По завершении гель-электрофореза гель извлекают и помещают в пенал для хранения в свежем состоянии, в который добавляют 50 мл быстрого красителя, греют в микроволновой печи в течение 5 мин и затем сушат на вибростенде в течение 5 мин. Краситель сливают, и затем добавляют 100 мл очищенной воды, греют на индукционной плите в течение 5 мин и обесцвечивают на вибростенде в течение 1 часа. Эту операцию повторяют три раза.

2) Гидрофобная высокоэффективная жидкостная хроматография (HIC)

Условия испытания. HIC-HPLC: Tosoh TSK Gel Butyl, 4,6 мм × 3,5 см, 10 мм; буфер A: 20 мМ фосфат натрия, 1,5 M сульфат аммония, pH 7,0; буфер B: 20 мМ фосфат натрия, 25% (об./об.) изопропанол, pH 7,0; скорость потока 1 мл/мин; градиент: от 10% буфера B до 100% буфера B за 15 минут; 10 мкл образца.

С использованием описанного выше способа получают следующие 4 конъюгата антитело-лекарственное средство: Her2-A'-7-Val-Cit-PAB-MMAE, Her2-A'-11-Val-Cit-PAB-MMAE, Her2-A'-10-Val-Cit-PAB-MMAE, Her2-575DZ-Val-Cit-PAB-MMAE, причем антителом является моноклональное антитело Her2 (такое же, как и выше). Результаты сочетания - указанных выше 4 конъюгатов антитело-лекарственное средство, анализированных HIC-HPLC и электрофорезом в SDS-PAGE, показаны в таблице 1, на фигуре 1A, фигуре 1B, фигуре 1C, фигуре 1D и фигуре 2A, фигуре 2B.

В таблице 1 и на фигуре 1A, фигуре 1B, фигуре 1C, фигуре 1D D0% представляет пропорцию конъюгатов антитело-лекарственное средство с 0 лекарственного средства, соединенного с линкером, т.е., пропорцию голого антитела, D1% представляет пропорцию конъюгатов антитело-лекарственное средство с 1 лекарственным средством, соединенным с одним антителом через линкер, D2% представляет пропорцию конъюгатов антитело-лекарственное средство с 2 лекарственными средствами, соединенными с одним антителом через линкер, D3% представляет пропорцию конъюгатов антитело-лекарственное средство с 3 лекарственными средствами, соединенными с одним антителом через линкер, D4% представляет пропорцию конъюгатов антитело-лекарственное средство с 4 лекарственными средствами, соединенными с одним антителом через линкер, и D5% представляет пропорцию конъюгатов антитело-лекарственное средство с 5 лекарственными средствами, соединенными с одним антителом через линкер.

Результаты показывают, что средняя величина DAR Her2-A'-7-Val-Cit-PAB-MMAE составляет 4,10 (молярное отношение лекарственного средства к антителу во время сочетания составляет 5:1); средняя величина DAR Her2-A'-11-Val-Cit-PAB-MMAE составляет 2,12 (молярное отношение лекарственного средства к антителу во время сочетания составляет 5:1); средняя величина DAR Her2-A'-10-Val-Cit-PAB-MMAE составляет 2,26 (молярное отношение лекарственного средства к антителу во время сочетания составляет 5:1); средняя величина DAR Her2-575DZ-Val-Cit-PAB-MMAE составляет 4,10 (молярное отношение лекарственного средства к антителу во время сочетания составляет 5:1). Результаты показывают, что Her2-A'-7-Val-Cit-PAB-MMAE, Her2-A'-11-Val-Cit-PAB-MMAE, Her2-A'-10-Val-Cit-PAB-MMAE - все имеют хороший эффект сочетания (средняя величина DAR составляет величину 2-4 в идеальных условиях), причем отношения DAR2 Her2-A'-11-Val-Cit-PAB-MMAE и Her2-A'-10-Val-Cit-PAB-MMAE составляют 65,574% и 78,9% соответственно, отношение D4% Her2-A'-7-Val-Cit-PAB-MMAE составляет 59,45%, распределение величины DAR очень узкое, и однородность продукта очень хорошая (у всех лучше, чем у Her2-575DZ-Val-Cit-PAB-MMAE).

Таблица 1. Результаты анализа конъюгатов гидрофобной высокоэффективнойжидкостной хроматографией (HIC-HPLC)
ADC D0% D1% D2% D3% D4% D5% DAR
Her2-A'-7-Val-Cit-PAB-MMAE 0 0,07 1,93 12,16 59,45 26,40 4,10
Her2-A'-10-Val-Cit-PAB-MMAE 0 9,03 78,9 11,9 0 0 2,26
Her2-A'-11-Val-Cit-PAB-MMAE 0 11,41 65,57 23,02 0 0 2,12
Her2-575DZ-Val-Cit-PAB-MMAE 0 0 1,99 18,46 52,94 21,17 4,10

Фигура 2А, фигура 2В показывают картины электрофореза в SDS-PAGE вышеуказанных конъюгатов антитело-лекарственное средство, причем фигура 2A показывает картины электрофореза в SDS-PAGE Her2-A'-11-Val-Cit-PAB-MMAE (буферы для сочетания соответственно имеют pH 8,5, 9,0, 7,4), Her2-A'-7-Val-Cit-PAB-MMAE (буферы для сочетания соответственно имеют pH 8,5, 9,0, 7,4), Her2-A'-10-Val-Cit-PAB-MMAE (буферы для сочетания соответственно имеют pH 8,5, 9,0, 7,4), и фигура 2B показывает картины электрофореза в SDS-PAGE, слева направо, Her2-A'-7-Val-Cit-PAB-MMAE, Her2-575DZ-Val-Cit-PAB-MMAE, Her2-A'-10-Val-Cit-PAB-MMAE (буфер для сочетания соответственно имеет pH 9,0).

И-за применения восстановительного электрофореза выставлены все тиогруппы в антителах. Поэтому 25 кДа представляют молекулярную массу одной легкой цепи антитела, 50 кДа представляют молекулярную массу одной тяжелой цепи, и 75 кДа представляют молекулярную массу одной легкой цепи и одной тяжелой цепи (т.е., один линкер ковалентно связывается с тиогруппой между одной тяжелой цепью и одной легкой цепью), 100 кДа представляют молекулярную массу двух тяжелых цепей (т.е., один линкер ковалентно связывается с тиогруппой между двумя тяжелыми цепями), 125 кДа представляют молекулярную массу одной легкой цепи и двух тяжелых цепей (т.е., один линкер ковалентно связывается с тиогруппами между двумя тяжелыми цепями и одной легкой цепью), 150 кДа представляют молекулярную массу двух тяжелых цепей и двух легких цепей (т.е., один линкер ковалентно связывается с тиогруппами между двумя тяжелыми цепями и двумя легкими цепями).

Фигура 2А показывает, что конъюгаты антитело-лекарственное средство (Her2-A'-7-Val-Cit-PAB-MMAE, Her2-A'-10-Val-Cit-PAB-MMAE, Her2-A'-11-Val-Cit-PAB-MMAE), представленные в примерах в настоящем описании, имеют, каждый, линкеры, которые одновременно ковалентно связываются с тиогруппами соответственно между одной тяжелой цепью и одной легкой цепью (75 кДа), между двумя тяжелыми цепями (100 кДа), между двумя тяжелыми цепями и одной легкой цепью (125 кДа) или между двумя тяжелыми цепями и двумя легкими цепями (150 кДа), что доказывает, что 4 пары дисульфидных связей в антителе полностью или частично образуют мостики, и эффект мостикового соединения более сильный.

Фигура 2В показывает параллельные контрастные картины электрофореза в SDS-PAGE Her2-A'-7-Val-Cit-PAB-MMAE, Her2-575DZ-Val-Cit-PAB-MMAE, Her2-A'-10-Val-Cit-PAB-MMAE (буфер для сочетания имеет pH 9,0). Из этой фигуры можно видеть, что отношение полос 150 кДа и 125 кДа в конъюгатах Her2-A'-7-Val-Cit-PAB-MMAE и Her2-A'-10-Val-Cit-PAB-MMAE существенно выше, чем отношение соответствующих полос в конъюгате Her2-575DZ-Val-Cit-PAB-MMAE. В то же время, отношение полос 50 кДа и 25 кДа также существенно ниже, что доказывает, что первая линкерная составляющая по настоящему изобретению имеет большую эффективность сочетания и может привести к конъюгату антитело-лекарственное средство, который имеет более высокую степень образования мостиковой связи.

Пример 28. Анализ гидролиза конъюгата антитело-лекарственное средство

Результат гидролиза конъюгата антитело-лекарственное средство (клаудин 18.2-A'-7-VC-PAB-MMAE) описывают анализом молекулярной массы и анализом изоэлектрической точки белка.

1) Анализ молекулярной массы (ЖХ-МС)

Условия испытания: прибор модель Thermo Q Exactive Plus; подвижная фаза 25 мМ раствор ацетата аммония; скорость потока 0,3 мл/мин; объем впрыска 1 мг/мл, 20 мкл, т.e., 20 мкг; интервал детекции 5000-8000 Да; интервал производительности прибора 140000-160000 Да.

2) Анализ изоэлектрической точки белка

Сведения о приборе: прибор визуализации капиллярного электрофореза с изоэлектрическим фокусированием, модель iCE 3.

Настройка прибора: время фокусировки 1: 1500 В в течение 1,00 мин; время фокусировки 2: 3000 В в течение 8,00 мин.

Голое антитело (антитело к клаудину 18.2): носитель амфотерный электролит: 1% Pharmalyte 5-8, 3% Pharmalyte 8-10,5; маркер для нижней изоэлектрической точки 8,18; маркер для верхней электрической точки 9,77; концентрация белка 0,25 мг/мл; температура лотка 15°С.

Клаудин 18.2-A'-7-VC-PAB-MMAE: носитель амфотерный электролит: 3% Servalyt 5-9, 1% Servalyt 9-11; маркер для нижней изоэлектрической точки 5,85; маркер для верхней электрической точки 9,46; концентрация белка 0,50 мг/мл; температура лотка 15°С.

Фигура 6А показывает результат измерения молекулярной массы голого антитела, и фигура 6В показывает результат измерения молекулярной массы клаудин 18.2-A'-7-VC-PAB-MMAE. Из фигур можно видеть, что молекулярная масса голого антитела составляет 145144 Да и молекулярные массы клаудин 18.2-A'-7-VC-PAB-MMAE (когда отношение A'-7-VC-PAB-MMAE к антителу составляет 4:1) составляют 152078 Да, 152119 Да, 152147 Да. Когда одно антитело сочетается с 4 A'-7-VC-PAB-MMAE без гидролиза, его теоретическая молекулярная масса составляет 151999 Да. Фактическая определенная молекулярная масса составляет 152078 Да, 152119 Да, 152147 Да, которая имеет значительное отклонение от теоретической молекулярной массы, превышающее интервал отклонений (20 Да) прибора. Когда конъюгат клаудин18.2-A'-7-VC-PAB-MMAE претерпевает гидролиз, в котором гидролизуются 4, 7, 8 малеимидов, его теоретическая молекулярная масса составляет 152071 Да, 152125 Да, 152143 Да. При сравнении с этими теоретическими величинами относительное отклонение фактически определенных величин находится в интервале отклонений прибора. Это предполагает, что антитело-A'-7-VC-PAB-MMAE является частично гидролизованным.

Далее, исследуется гидролизованная составляющая. Фигура 7А показывает результат размещения изоэлектрической точки голого антитела, и фигура 7В показывает результат размещения изоэлектрической точки клаудин18.2-A'-7-VC-PAB-MMAE. Из фигуры 7А можно видеть, что главный пик изоэлектрической точки голого антитела находится при 8,91, и отношение кислотного пика (изоэлектрическая точка <8,91) и щелочного пика (изоэлектрическая точка >8,91) относительно небольшое. Из фигуры 7В можно видеть, что изоэлектрическая точка антитело-A'-7-VC-PAB-MMAE размещается между 7,86 и 8,70. По сравнению с голым антителом изоэлектрическая точка антитело-A'-7-VC-PAB-MMAE существенно снижается, показывая, что на его поверхности имеется больше кислотных групп, таких как карбоксильные группы. Путем комбинирования со структурным анализом можно видеть, что позиция гидролиза находится в малеимидной составляющей антитело-A'-7-VC-PAB-MMAE, и путем регулирования среды для синтеза и гидролиза конъюгата антитело-лекарственное средство возможно регулировать степень гидролиза малеимида в линкере конъюгата антитело-лекарственное средство, например, для достижения полного гидролиза или отсутствия гидролиза. Кроме того, также можно использовать способы очистки для отделения продуктов, которые гидролизуются в той же степени, от синтезированных продуктов.

Пример 29. Определение аффинности конъюгатов антитело-лекарственное средство к антигену (метод ELISA)

Общая процедура: антиген разбавляют буфером для покрытия до требуемой концентрации (такой как 500 нг/мл, 250 нг/мл, 100 мг/мл, или приспосабливают как есть согласно потребностям эксперимента) при 100 мкл/лунку и оставляют при 4°С на ночь; промывка планшета: планшет промывают 3 раза раствором для промывки PBST по 350 мкл/лунка и соответствующим образом сушат; блокировка: планшет блокируют 3% раствором BSA для блокировки по 200 мкл/лунка и оставляют при 4°С на ночь; промывка планшета: планшет промывают дважды PBST по 300 мкл/лунка, и раствор в лунке анализируют блоттингом; загрузка образца: образец разбавляют разбавителем 1% раствором BSA-PBST, затем добавляют разбавленный образец в блокированный планшет для культивирования клеток по 100 мкл/лунка с тремя повторами, и разбавитель как контроль, и инкубируют в инкубаторе при 37°С в течение 2 час (схему разбавления можно изменять согласно фактической ситуации); промывка планшета: планшет промывают дважды PBST по 200 мкл/лунка, и раствор в лунке анализируют блоттингом; загрузка испытываемого антитела: HRP, конъюгированную с козьим antA-Human IgG-Fc, разводят 1:5000 1% BSA-PBST при 100 мкл/лунка и инкубируют при 37°C в течение 1 часа (разбавитель может быть заменен согласно фактической ситуации); промывка планшета: планшет промывают 4 раза PBST по 200 мкл/лунка, и раствор в лунке анализируют блоттингом; выявление окраски: добавляют субстрат TMB по 100 мкл/лунка для эффекта появления окраски в течение 2 мин; завершение: добавляют 2 M H2SO4 по 50 мкл/лунка для завершения реакции; считывание: измеряют поглощение или оптическую плотность при 450/655 нм с помощью аппарата для прочтения микропланшетов, и экспериментальные результаты анализируют с помощью программы prism analysis, причем по оси абсциссе показывают концентрацию, а оптическую плотность - поглощение по оси ординат, величины EC50 и подобные вычисляются программой автоматически. Результаты приводятся в таблице 2 и на фигуре 3.

Таблица 2 показывает величины EC50 конъюгатов антитело-лекарственное средство (Her2-A'-7-Val-Cit-PAB-MMAE, Her2-A'-10-Val-Cit-PAB-MMAE) против антигена Her2, причем Her2 представляет собой голое антитело, с Her2-Mc-vc-PAB-MMAE как контролем ADC. Результаты показывают, что Her2-A'-10-Val-Cit-PAB-MMAE и Her2-A'-7-Val-Cit-PAB-MMAE, оба, имеют хорошую аффинность к антигену, и полученные результаты показывают, что используемый способ связывания не изменяет исходную аффинность антитела.

Таблица 2. Аффинность конъюгатов антитело-лекарственноесредство к антигену (величина EC50)
ADC EC50 (нг/мл) R2
Her2 1,073 0,999
Her2-Mc-vc-PAB-MMAE 2,132 0,994
Her2-A'-10-Val-Cit-PAB-MMAE 1,725 0,999
Her2-A'-7-Val-Cit-PAB-MMAE 2,692 1,000

Пример 30. Испытание на эффективность in vitro

Чашку для культивирования, содержащую клетки рака молочной железы человека SK-BR-3, помещают в инкубатор, 37°C, 5% CO2, для инкубации. Клетки в состоянии хорошего роста отбирают, а исходную среду для культивирования отбрасывают, затем полученные клетки суспендируют со средой для культивирования и подсчитывают отдельно. Клеточную суспензию добавляют в 96-луночный планшет (5000 клеток на лунку) и инкубируют инкубаторе, 37°C, 5% CO2, в течение ночи. Затем в клеточную суспензию для инкубации добавляют лекарственное средство, которое разбавлено. После инкубации в течение 72 час используют набор Cell Counting Kit-8 (сокращенно набор CCK-8) для активного выявления окраски, и после появления окраски 96-луночный планшет детектируют с помощью аппарата для прочтения микропланшетов, и получают величину OD при 450 нм. Величину IC50 вычисляют из величины OD с помощью программы Prism. Подбирают четыре параметрические кривые, используя программу, со степенью ингибирования как величиной y и концентрацией лекарственного средства как величиной x, и регистрируют величину концентрации лекарственного средства (которую по программе задают по умолчанию как величину IC50), соответствующую величине степени ингибирования между максимальной степенью ингибирования и минимальной степенью ингибирования. Когда построенная кривая является «S-образной кривой» и R2 ≥ 0,95, величина IC50 применима. Величины IC50 конъюгатов антитело-лекарственное средство Her2-A'-8-Val-Cit-PAB-MMAE, Her2-A'-7-Val-Cit-PAB-MMAE, Her2-A'-11-Val-Cit-PAB-MMAE, Her2-A'-10-Val-Cit-PAB-MMAE против клеток рака молочной железы человека SK-BR-3 показаны в таблице 3, и кривые степени ингибирования показаны на фигуре 4A и фигуре 4B.

Таблица 3 показывает IC50 степени ингибирования конъюгатов антитело-лекарственное средство (Her2-A'-8-Val-Cit-PAB-MMAE, Her2-A'-7-Val-Cit-PAB-MMAE, Her2-A'-11-Val-Cit-PAB-MMAE, Her2-A'-10-Val-Cit-PAB-MMAE) против клеток рака молочной железы человека SK-BR-3.

Таблица 3. Эффективность in vitro конъюгатов антитело-лекарственное средство против клеток рака молочной железы человека SK-BR-3
ADC IC50 (нг/мл)
Her2-A'-8-Val-Cit-PAB-MMAE 5,13
Her2-A'-7-Val-Cit-PAB-MMAE 1,57
Her2-A'-11-Val-Cit-PAB-MMAE 2,53
Her2-A'-10-Val-Cit-PAB-MMAE 2,11

Настоящее изобретение поясняется примерами различных конкретных воплощений. Однако специалист в данной области техники может понять, что настоящее изобретение не ограничивается каким-либо конкретным воплощением, и специалисты в данной области техники могут осуществить различные изменения или модификации в пределах объема настоящего изобретения, и различные технические особенности, указанные в настоящем описании, могут комбинироваться друг с другом без отхода от сущности и объема настоящего изобретения. Такие изменения и модификации все находятся в пределах объема настоящего изобретения.

1. Линкер, имеющий структуру, представленную формулой I

(I) ,

в которой

каждый из M1’, M2’ выбирают независимо из , M1’, M2’ являются одинаковыми или различными;

L1, L2 выбирают, каждый независимо, из C1-C9-алкила;

Q выбирают из , N;

L3’ выбирают из C (=O) R8C (=O), NH2, OH, и их любой комбинации;

X выбирают из Br;

Y представляет собой , ;

Z выбирают из C;

R1 выбирают из H, C1-C6-алкила, R2, R8, R10 выбирают, каждый независимо, из H, C1-C6-алкила.

2. Линкер по п. 1, где

каждый из M1’, M2’ выбирают независимо из ;

L1, L2 выбирают, каждый независимо, из C1-C4-алкила;

Q выбирают из N;

L3’ выбирают из C (=O) R8C (=O), OH, и их любой комбинации;

X представляет собой Br;

Y представляет собой или ;

R1, R8 выбирают, каждый независимо, из H, C1-C4-алкила.

3. Линкер по п. 1 или 2, который имеет структуру

(A’-1’) .

4. Линкер, который имеет структуру

A'-1 A'-2 A'-4
A'-7 A'-8 A'-9
A'-10 A'-11 A'-12
A'-13 A'-14 A'-15
A'-16 A'-19 A'-20
A'-26 A'-27 A'-28
A'-29 A'-31 A'-33
A'-34 .

5. Применение линкера по любому из пп. 1-4 при получении конъюгатов антитело-лекарственное средство.

6. Конъюгат антитело-лекарственное средство, который имеет структуру, представленную формулой II

Ab-(A-L-D) n (II),

в которой

Ab представляет собой антитело или функциональный фрагмент антитела;

линкерная составляющая включает первую линкерную составляющую А и вторую линкерную составляющую L;

D представляет собой составляющую лекарственного средства;

n равен 1, 2, 3 или 4;

где

первая линкерная составляющая А включает группу, ковалентно связанную с тиольной группой в Ab, которая имеет структуру, представленную формулой III:

(III) ,

в которой M1, M2 выбирают, каждый независимо, из , , , , M1 и M2 являются одинаковыми или различными;

L1, L2 выбирают, каждый независимо, из C1-C9-алкила;

Q выбирают из , N;

L3 ковалентно связан со второй линкерной составляющей L, и L3 выбирают из R2 (C=O) , C (=O) R2C (=O) ;

R1 выбирают из H, C1-C6-алкила, R2, R10выбирают, каждый независимо, из H, C1-C6-алкила;

вторая линкерная составляющая L отсутствует или выбрана из:

или

e равен 0 или 1.

7. Конъюгат антитело-лекарственное средство по п. 6, характеризующийся тем, что

L1, L2 выбирают, каждый независимо, из C1-C4-алкила;

Q выбирают из , N;

L3 выбирают из R2 (C=O), C(=O)R2C(=O);

R1 выбирают из H, C1-C6-алкила, R2, R10 выбирают, каждый независимо, из H, C1-C6-алкила.

8. Конъюгат антитело-лекарственное средство по любому из пп. 6, 7, характеризующийся тем, что первая линкерная составляющая имеет структуру

(A-1’) (A-1’’)
(A-1’’’)

(A-2’)		 (A-2’’) (A-2’’’)
(A-2’’’’)
(A-4’)

(A-4’’)
(A-4’’’)

(A-6’’)
(A-6’’’).

9. Конъюгат антитело-лекарственное средство по любому из пп. 6-8, характеризующийся тем, что антитело или функциональный фрагмент антитела специфически связывается с рецепторами клеточной поверхности или связанными с опухолями антигенами.

10. Конъюгат антитело-лекарственное средство по любому из пп. 6-9, характеризующийся тем, что первая линкерная составляющая А включает группу, ковалентно связанную с тиольной группой в Ab.

11. Конъюгат антитело-лекарственное средство, который имеет структуру, представленную формулой II:

Ab-(A-L-D) n (II),

в которой

Ab представляет собой антитело или функциональный фрагмент антитела;

линкерная составляющая включает первую линкерную составляющую А и вторую линкерную составляющую L;

D представляет собой составляющую лекарственного средства;

n равен 1, 2, 3 или 4;

где

первая линкерная составляющая А включает группу, ковалентно связанную с тиольной группой в Ab, которая имеет структуру, представленную как:

A-4 A-5 A-16
A-17 A-18 A-19
A-29

вторая линкерная составляющая L отсутствует или выбрана из:

L-4 L-6
или,
L-7

e равен 0 или 1.

12. Конъюгат антитело-лекарственное средство по любому из пп. 6-11, характеризующийся тем, что составляющая лекарственного средства D представляет собой цитотоксические лекарственные средства, факторы клеточной дифференцировки, питательные факторы стволовых клеток, стероидные лекарственные средства, лекарственные средства для лечения аутоиммунных заболеваний, противовоспалительные лекарственные средства или лекарственные средства для лечения инфекционных заболеваний; составляющая лекарственного средства D предпочтительно представляет собой ингибиторы тубулина или повреждающие ДНК агенты; составляющая лекарственного средства D также предпочтительно представляет собой доластатины, ауристатины, майтансины, калихеамицины, дуокамицины, производное антрамицина PBD, производное камптотецина SN-38, ингибиторы топоизомеразы I, аманитины, антрациклины, баккатины, камптотецины, цемадотины, колхицины, колцимиды, комбрестатины, криптофицины, дискодермолиды, доцетаксел, доксорубицин, эхиномицины, элеутеробины, эпотилоны, эстрамустины, лекситропсины, майтансины, метотрексат, нетропсины, пуромицины, ризоксины, таксаны, тубулизины, винка-алкалоиды, предшественника витамина А, фолиевую кислоту.

13. Конъюгат антитело-лекарственное средство по любому из пп. 6-12, характеризующийся тем, что составляющая лекарственного средства представляет собой

MMAD
MMAE
MMAF
DM1
DM4
PBD
CBI
Dxd
SN-38

14. Конъюгат антитело-лекарственное средство по любому из пп. 6-13, характеризующийся тем, что имеет структуру

ADC1

ADC2
ADC10
ADC11,

в которой

Ab является антителом против рецепторов клеточной поверхности и связанных с опухолями антигенов;

n1, n2, n3 выбирают, каждый независимо, из 0, 1, 2, 3, 4; n1, n2, n3 не равны 0 в одно и то же время, и n1+n2+n3≤4;

m1, m2, m3 выбирают, каждый независимо, из 0, 1, 2; по меньшей мере один из m1, m2, m3 равен 0, но m1, m2, m3 не равны 0 в одно и то же время, и m1+m2+m3≤2.

15. Конъюгат антитело-лекарственное средство по п. 14, характеризующийся тем, что имеет структуру

ADC17
ADC18
ADC26
ADC27,

в которой

Ab является антителом против рецепторов клеточной поверхности и связанных с опухолями антигенов;

n10 равен 0, 1, 2, 3 или 4;

m6 равен 0, 1 или 2.

16. Конъюгат антитело-лекарственное средство по п. 14, характеризующийся тем, что имеет структуру

ADC33
ADC34
ADC42
ADC43,

в которой

Ab является антителом против рецепторов клеточной поверхности и связанных с опухолями антигенов;

n11 равен 0, 1, 2, 3 или 4;

m7 равен 0, 1 или 2.

17. Конъюгат антитело-лекарственное средство по любому из пп. 6-16, характеризующийся тем, что антитело выбирают из мышиных антител, антител млекопитающих, химерных антител, гуманизированных антител, человеческих антител, мультиспецифических антител.

18. Фармацевтическая композиция для лечения рака, связанного с антигеном HER2, которая включает эффективное количество конъюгата антитело-лекарственное средство по любому из пп. 6-17 и фармацевтически приемлемый носитель.

19. Применение конъюгата антитело-лекарственное средство по любому из пп. 6-17 или фармацевтической композиции по п. 18 при получении препарата для лечения рака, связанного с антигеном HER2.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к медицине. Предложено применение соединения N,N'-бис[2-(1H-имидазол-4-ил)этил]изофталамида или его фармацевтически приемлемой соли, гидрата или сольвата для лечения расстройства, выбранного болезни Крона, язвенного колита, перитонита, нефропатии или заболевания почек, которое является побочным эффектом применения лекарственных средств.

Изобретение относится к хиноксалиновым производным, а именно к группе индивидуальных соединений, таких как указаны в формуле изобретения. Также предложены фармацевтический препарат и способ его приготовления, лекарственное средство.

Изобретение относится к соединению формулы (I), его таутомеру или фармацевтически приемлемой соли, которые обладают ингибирующей активностью к аутотаксину (АТХ). В формуле (I) Q представляет инданил, необязательно замещенный m группами R1, m представляет собой целое число, выбранное из 0-8, каждая из m групп R1 независимо выбрана из водорода или галогена; X выбран из -N=; Y выбран из -C(R2)=; Z выбран из -N(R3)-; L1 выбран из L2 выбран из L3 выбран из одинарной связи или Ra1 и Ra2 каждый выбран из водорода или С1-С3 алкила; Rb1 и Rb2 независимо выбраны из водорода; выбран из одинарной связи, С4-С8 гетероциклоалкила или семи-восьмичленной N-спироциклической группы, где С4-8 гетероциклоалкил и семи-восьмичленная N-спироциклическая группа необязательно замещены одним Rc, выбранным из галогена или C1-С3 алкила, и 1 атом кольца С4-С8 гетероциклоалкила выбран из N; n представляет собой целое число, выбранное из 0-3; М1, М2 и М3 независимо выбраны из -N= или -N(R4)-; М4 выбран из С; М5 выбран из -C(R5)=; R2 и R5 каждый выбран из водорода; R3 и R4 каждый выбран из водорода.

Изобретение относится к области органической химии, а именно к гетероциклическому соединению формулы (I) или его фармацевтически приемлемой соли, где Y представляет собой ; A представляет собой фенил; n представляет собой 1; R1 выбран из водорода, галогена, C1-6алкила, C1-6 галогеналкила, C1-6алкокси и циано; каждый из R2 и R3 независимо выбран из водорода, галогена, C1-6алкила, C1-6 галогеналкила, C1-6алкокси, или R2 и R3 вместе образуют фенил или диоксолан.

Изобретение относится к области органической химии, а именно к производному фенилимидазола формулы (1) или его фармацевтически приемлемой соли, где R1 представляет собой (1-1) водород, (1-4) пиридил, имеющий один или два заместителя, каждый из которых независимо выбирают из группы, состоящей из галогена, циано и галогензамещенного C1-C6 алкила, (1-5) оксазолил, имеющий одну C1-C6 алкильную группу, R2 представляет водород или C1-C6 алкокси; R3 представляет собой (3-1) водород, или (3-2) C1-C6 алкокси; R4 представляет собой (4-2) C3-C10 циклоалкил, необязательно имеющий один или два заместителя, каждый из которых независимо выбирают из группы, состоящей из галогена и C1-C6 алкила; R5 представляет собой (5-1) водород или (5-3) C1-C6 алкокси; R6 представляет собой (6-1) водород или (6-3) C1-C6 алкил, необязательно замещенный одной или более C3-C10 циклоалкильными группами, при этом R6 прикреплен к только одному из N в 1-позиции и N в 3-позиции имидазольного скелета, R6 прикреплен к N в 1-позиции, когда связь между N в 3-позиции и C в 2-позиции имидазольного скелета представляет собой двойную связь, и R6 прикреплен к N в 3-позиции, когда связь между N в 3-позиции и C в 2-позиции имидазольного скелета представляет собой одинарную связь; R7 представляет собой (7-1) водород, (7-2) галоген или (7-3) C1-C6 алкил, A представляет собой одинарную связь, когда R1 представляет собой водород, и A представляет собой C1-C6 алкилен, когда R1 представляет собой группу, не являющуюся водородом; в имидазольном скелете связь между C в 2-позиции и N в 1-позиции представляет собой одинарную связь, когда связь между N в 3-позиции и C в 2-позиции представляет собой двойную связь, и связь между C в 2-позиции и N в 1-позиции представляет собой двойную связь, когда связь между N в 3-позиции и C в 2-позиции представляет собой одинарную связь.

Группа изобретений относится к фармацевтической химии, а именно к соединению формулы 1 или к соединению, выбранному из группы, состоящей из 1-(4-(2-цианопиримидин-4-ил)тетрагидро-2Н-пиран-4-ил)-3-(4-фтор-3-(трифторметил)фенил)мочевины и 1-(1-(2-цианопиримидин-4-ил)циклогексил)-3-(4'-этинил-[1,1'-дифенил]-4-ил)мочевины, их фармацевтически приемлемым солям, фармацевтической композиции и реагенту на их основе.

Изобретение относится к (1R,2S,5S)-N-{(1S)-1-циано-2-[(3S)-2-оксопирролидин-3-ил]этил}-6,6-диметил-3-[3-метил-N-(трифторацетил)-L-валил]-3-азабицикло[3.1.0]гексан-2-карбоксамиду, его сольвату или гидрату, содержащим его фармацевтическим композициям и способу лечения коронавирусной инфекции, такой как COVID-19.

Настоящее изобретение относится к соединению, представленному формулой (I), или его фармацевтически приемлемой соли. В формуле (I) выбирают из и , X1 выбирают из N и C(R5); каждый X2 или X3 независимо выбирают из N и СН; R4 представляет собой водород; R3 выбирают из группы, состоящей из: 1) водорода, 2) -С1-С8 алкила и 3) -С3-С8 циклоалкила, необязательно замещенного алкилом; R5 выбирают из группы, состоящей из: 1) галогена и 2) -С1-C8 алкокси; R представляет собой , где R1 выбирают из группы, состоящей из: 1) -С1-С8 алкила, необязательно замещенного галогеном, -ОС(О) C1-C8-алкилом, ОН, -С(O)ОН, -NHC(O)CH3 или -ОС(O)фенилом, 2) -С3-С8 циклоалкила, необязательно замещенного галогеном, гидроксилом или алкилом, 3) 5-членного гетероциклоалкила, где гетероатом представляет собой О; R2 выбирают из группы, состоящей из: 1) -С1-С8 алкила, необязательно замещенного галогеном или ОН, 2) галогена и 3) 5- или 6-членного гетероциклоалкила, включающего 1 или 2 гетероатома, выбранные из N и О, необязательно замещенного алкилом.

Настоящее изобретение относится к соединению, имеющему структуру Формулы (1), или к его фармацевтически приемлемой соли, обладающим иммуномодулирующими свойствами, которые действуют через TLR7 и которые полезны при лечении вирусных инфекций и раковых заболеваний. (1),где R1a выбирают из группы, состоящей из H, C1–C4 алкила и A, где алкил необязательно замещен –COOH, –SO2CH3, –SCH3, –OCH3, или A; R1b представляет собой C2–C5 алкил; X представляет собой C1–C4 алкил, где алкил необязательно замещен A или –OH; L1 выбирают из группы, состоящей из связи, –CH2–, -О- и –CH2CH2–; Y выбирают из группы, состоящей из C1–C3 алкила и С6 арила, где С6 арил необязательно замещен 1–5 заместителями, которые независимо выбирают из A, C1–C3 алкила, и C1–C3 алкокси; A выбирают из группы, состоящей из , , , , и ; L2 выбирают из группы, состоящей из связи, –(CH2)n–, –C(O)NH(CH2)n–, , и ; m представляет собой целое число от нуля до четырех; n представляет собой целое число от одного до четырех; где соединение замещено по меньшей мере одним А.

Изобретение относится к бензимидазольным производным, фармацевтическому препарату, содержащему указанные производные, который предназначен для лечения и/или профилактики физиологических и/или патофизиологических состояний, опосредованных активностью аденозинового рецептора A2A или аденозиновых рецепторов A2A и A2B, например, таких как гиперпролиферативные или инфекционные заболевания и нарушения.

Изобретение описывает новые способы получения димерных соединений индолинбенздиазепина и их синтетических прекурсоров. Способы являются более универсальными и пригодными для крупномасштабного производства.
© Патентный поиск, поиск патентов на изобретения - FindPatent.RU 2012-2024
Политика конфиденциальности 2018-12-17 2023-03-20T10:20:30
Наверх