Селективная питательная среда с маннитом, желчью и полимиксином для выявления бактерий родов proteus, morganella, providencia сухая


C12N1/00 - Микроорганизмы, например простейшие; их композиции (лекарственные препараты, содержащие материал из микроорганизмов A61K 35/66; приготовление лекарственных составов, содержащих бактериальные антигены или антитела, например бактериальных вакцин A61K 39/00); способы размножения, содержания или консервирования микроорганизмов или их композиций; способы приготовления или выделения композиций, содержащих микроорганизмы; питательные среды

Владельцы патента RU 2792438:

Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ПМБ) (RU)

Изобретение относится к области биотехнологии. Сущность изобретения заключается в том, что в качестве белковой основы используют панкреатический гидролизат рыбной муки (ПГРМ K2HPO4) деминерализованный от катионов кальция и магния с дополнительным осаждением высокомолекулярных белков и пептидов, желчь очищенную (ЖОГ) при следующем количественном соотношении компонентов, г/л: панкреатический гидролизат рыбной муки сухой (ПГРМ K2HPO4 сухой) 8,8-12,8, желчь очищенная сухая 3,0-7,0, маннит D(-) 0,5-1,5, натрий хлористый 4,0-6,0, бромтимоловый синий 0,03-0,05, кристаллический фиолетовый 0,0015-0,0025. Состав СД, г/л: полимиксина В сульфат 0,01-0,014. Готовая среда после стерилизации, внесения мочевины и селективной добавки (полимиксина В) – прозрачная, зеленого цвета, что улучшает визуальную интерпретацию результатов исследований. 1 табл., 5 пр.

 

Изобретение относится к санитарной и клинической микробиологии и может быть использовано для селективного выявления бактерий родов Proteus, Morganella, Providencia и их дифференциации по способности расщеплять мочевину при санитарно-бактериологических исследованиях.

В соответствии с ГОСТ 28560-90 «Продукты пищевые. Метод выявления бактерий родов Proteus, Morganella, Providencia рекомендована Среда жидкая селективная. Основа среды: к 1 дм3 мясо-пептонного бульона добавляют 1,0 г маннита, 50,0 см3 натуральной бычьей желчи или эквивалентное количество сухой желчи, 0,8 г калия фосфорнокислого двузамещенного, 2,0 см3 раствора кристаллического фиолетового, 2,0 см3 спиртового раствора бромтимолового синего. Устанавливают pH таким образом, чтобы после стерилизации он составлял (6,9±0,1) при 25°С. Стерилизуют текучим паром при 100°С в течение 15 мин. Для приготовления среды к основе добавляют асептически 10,0 см3 раствора мочевины и 100 000 ЕД полимиксина В сульфата или 120 000 ЕД полимиксина М сульфата. Готовая среда прозрачная, желто-бурого цвета.

Селективное накопление бактерий родов Proteus, Morganella, Providencia обеспечивается наличием желчи, кристаллического фиолетового и полимиксина, в значительной степени подавляющих рост грамположительной и грамотрицательной сопутствующей микрофлоры, а маннит и мочевина придают дифференцирующие свойства среды в присутствии индикатора бромтимолового синего.

Недостатком Среды жидкой селективной лабораторного изготовления являются:

- сложность приготовления (предварительное изготовление мясо-пептонного бульона, приготовление маточных растворов кристаллического фиолетового и бромтимолового синего, что значительно увеличивает время и трудозатраты);

- использование в качестве элективного фактора неочищенной желчи крупного рогатого скота;

- отсутствие отечественных сухих препаратов - пептона и желчи, обладающих высокой степенью прозрачности в растворах;

- сложность соблюдения условий стерилизации текучим паром: - отсутствие химических (термовременных) индикаторов паровой стерилизации, с помощью которых при соблюдении заданной длительности стерилизационной выдержки и температуры необратимо изменяется цвет, и индикаторная метка достигает конечного цвета, соответствующего цвету эталона.

Известна коммерческая Селективная среда для определения родов Proteus, Morganella, Providencia

В настоящее время в России ООО «НПЦ «Биокомпас-С» выпускает Селективную среду для определения родов Proteus, Morganella, Providencia, предназначенную для приготовления жидкой селективной среды по ГОСТ 28560-90, представляющую собой набор из сухой среды с прилагаемыми флаконами растворов: индикатора бромтимолового синего и кристаллического фиолетового.

Недостатком коммерческих сред является:

- ограниченная доступность;

- сложность соблюдения условий стерилизации текучим паром: - отсутствие химических (термовременных) индикаторов паровой стерилизации, с помощью которых при соблюдении заданной длительности стерилизационной выдержки и температуры необратимо изменяется цвет, и индикаторная метка достигает конечного цвета, соответствующего цвету эталона.

- нестабильность ингибирующей способности бычьей желчи.

Наиболее близкой к предлагаемой среде является Среда жидкая селективная по ГОСТ 28560-90 лабораторного приготовления, на основе пептона мясного ферментативного,

Техническим результатом является создание отечественной сухой Селективной питательной среды с маннитом, желчью и полимиксином для выявления бактерий родов Proteus, Morganella, Providencia, прозрачной в готовом к применению состоянии, обладающей высокой специфической активностью и селективностью, обеспечивающей доступность и получение объективных результатов бактериологического контроля.

Технический результат достигается тем что предлагается Селективная питательная среда с маннитом, желчью и полимиксином для выявления бактерий родов Proteus, Morganella, Providencia сухая содержащая белковую основу, маннит, бычью желчь, кристаллический фиолетовый, бромтимоловый синий, полимиксина В сульфат и мочевину, а в качестве белковой основы содержит панкреатический гидролизат рыбной муки (ПГРМ K2HPO4) деминерализованный от катионов кальция и магния с дополнительным осаждением высокомолекулярных белков и пептидов, желчь очищенную (ЖОГ), при следующем количественном соотношении компонентов, г/л:

Панкреатический гидролизат рыбной муки сухой (ПГРМ K2HPO4 сухой) 8,8-12,8
Желчь очищенная сухая 3,0-7,0
Маннит D(-) 0,5-1,5
Натрий хлористый 4,0-6,0
Бромтимоловый синий 0,03-0,05
Кристаллический фиолетовый 0,0015-0,0025

Состав СД, г/л:

Полимиксина В сульфат 0,01-0,014

Внесение калия фосфорнокислого в жидкий ПГРМ позволяет исключить дополнительное внесение его в состав среды, обеспечивает прозрачность и высокую буферную емкость готовой среды. Сбалансированность компонентного состава среды обеспечивает хорошие ростовые и селективные свойства Селективной питательной среды с маннитом, желчью и полимиксином для выявления бактерий родов Proteus, Morganella, Providencia.

Способ получения Селективной питательной среды с маннитом, желчью и полимиксином для выявления бактерий родов Proteus, Morganella, Providencia предусматривает смешивание сухих компонентов, г/л:

Панкреатический гидролизат рыбной муки сухой
(ПГРМ K2HPO4 сухой)
8,8-12,8
Желчь очищенная сухая по 3,0-7,0
Маннит D(-) 0,5-1,5
Натрий хлористый 4,0-6,0
Бромтимоловый синий 0,03-0,05
Кристаллический фиолетовый 0,0015-0,0025

Состав СД, г/л:

Полимиксина В сульфат 0,01-0,014

Добавка – мочевина (карбамид по ГОСТ 6691-77 или импортная аналогичного качества) из расчета 5,0 г/л. Мочевина в состав сухой среды не входит.

Отличием предлагаемой среды от прототипа является использование в качестве питательной основы специально изготовленного панкреатического гидролизата рыбной муки с фосфатом калия двузамещенным. Расчетное количество, в пересчете на сухое вещество двузамещенного фосфата калия вносят в жидкий ПГРМ, реакционную смесь нагревают до температуры 100°С, выдерживают в течение 15-20 мин, фильтруют и высушивают на сушильной установке в виброкипящем слое.

Также отличием является наличие желчи очищенной сухой, обеспечивающей прозрачность готовой среды и ингибирующие свойства среды.

Панкреатический гидролизат рыбной муки (ПГРМ K2HPO4) является источником питательных веществ, необходимых для роста микроорганизмов: азота, витаминов, минеральных солей и аминокислот. Маннит является ферментируемым и дифференцирующим субстратом, а также источником углерода. Среда обеспечивает элективность в отношении грамположительной и грамотрицательной сопутствующей микрофлоры за счет присутствия в среде желчи очищенной крупного рогатого скота, кристаллического фиолетового и полимиксина.

Пример 1. Для приготовления среды берут навески следующих ингредиентов, г/л:

Панкреатический гидролизат рыбной муки сухой
(ПГРМ K2HPO4 сухой)
8,8
Желчь очищенная сухая по 3,0
Маннит D(-) 0,5
Натрий хлористый 4,0
Бромтимоловый синий 0,03
Кристаллический фиолетовый 0,0015
рН готовый среды 6,9-7,1

СД, г/л:

Полимиксина В сульфат 0,01

Навески размешивают в 1 л дистиллированной воды, кипятят в течение 2 мин, стерилизуют автоклавированием при температуре 121°С в течение 15 мин. После охлаждения питательной среды до температуры 40-45°С в асептических условиях вносят стерильный 50 % раствор мочевины из расчета 10 мл/л и содержимое флакона с СД из расчета 5 мл на 1 л питательной среды, разливают по 5 мл в стерильные стеклянные пробирки по ГОСТ 25336-82.

Для приготовления 50 % раствора мочевины 50,0 г мочевины помещают в колбу на 100 мл, растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды, затем объем раствора доводят до метки. Раствор мочевины стерилизуют выдержкой при комнатной температуре в течение 2-3 суток. Раствор мочевины хранят в течение месяца при температуре 2-8°С.

Для контроля полученной среды используют тест-штаммы микроорганизмов из Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-Оболенск».

Готовят стандартную взвесь культуры каждого тест-штамма, соответствующую 10 единицам по стандартному образцу мутности ОСО 42-28-85 П, с использованием стерильного 0,9% раствора натрия хлористого. Полученные взвеси культур десятикратными разведениями (4,5 мл 0,9 % раствора натрия хлорида с 0,5 мл микробной взвеси) доводили до разведения 10-6 (для Escherichia coli АТСС 25922 и Staphylococcus aureus Wood-46 АТСС 10832 - до разведения 10-4)

Для определения ростовых свойств засев производили по 0,5 мл микробной взвеси каждого из тест-штаммов из разведения в 5,0 мл среды.

Посевы инкубировали при температуре (37±1)°С в течение 20-24 ч. Готовая питательная среда прозрачная зеленого цвета, обеспечивает рост и накопление следующих тест-штаммов: Proteus vulgaris HX 19 222, Proteus mirabilis 3177, Morganella morganii АТСС 25830 DSM 30164.

Питательная среда в значительной степени ингибирует рост тест-штаммов Escherichia coli АТСС 25922, Staphylococcus aureus Wood-46 АТСС 10832.

Результаты биологического контроля лабораторных образцов Селективной среды для определения родов Proteus, Morganella, Providencia на наборе тест-штаммов представлены в таблице 2.

Пример 2. Среду готовят в соответствии с примером 1.

Панкреатический гидролизат рыбной муки сухой
(ПГРМ K2HPO4 сухой)
10,8
Желчь очищенная сухая по 5,0
Маннит D(-) 1,0
Натрий хлористый 5,0
Бромтимоловый синий 0,04
Кристаллический фиолетовый 0,002
рН готовый среды 6,9-7,1

СД, г/л:

Полимиксина В сульфат 0,012

Результаты биологического контроля представлены в таблице 2 и аналогичны результатам проверки по примеру 1.

Пример 3. Среду готовят в соответствии с примером 1.

Панкреатический гидролизат рыбной муки сухой
(ПГРМ K2HPO4 сухой)
12,8
Желчь очищенная сухая по 7,0
Маннит D(-) 1,5
Натрий хлористый 6,0
Бромтимоловый синий 0,05
Кристаллический фиолетовый 0,0025
рН готовый среды 6,9-7,1

СД, г/л:

Полимиксина В сульфат 0,014

Результаты биологического контроля представлены в таблице 2 и аналогичны результатам проверки по примеру 1.

Пример 4. Среду готовят в соответствии с примером 1.

Панкреатический гидролизат рыбной муки сухой
(ПГРМ K2HPO4 сухой)
6,8
Желчь очищенная сухая по 2,0
Маннит D(-) 0,25
Натрий хлористый 3,0
Бромтимоловый синий 0,02
Кристаллический фиолетовый 0,001
рН готовый среды 6,9-7,1

СД, г/л:

Полимиксина В сульфат 0,008

Нарушение количественного соотношения ингредиентов среды в примере 4 ведет к ухудшению ростовых и ингибирующих свойств.

Результаты биологического контроля представлены в таблице 2.

Пример 5. Среду готовят в соответствии с примером 1.

Панкреатический гидролизат рыбной муки сухой
(ПГРМ K2HPO4 сухой)
14,8
Желчь очищенная сухая по 7,0
Маннит D(-) 1,75
Натрий хлористый 7,0
Бромтимоловый синий 0,06
Кристаллический фиолетовый 0,003
рН готовый среды 6,9-7,1

СД, г/л:

Полимиксина В сульфат 0,016

Результаты биологического контроля представлены в таблице 2.

Нарушение количественного соотношения ингредиентов среды в большую сторону на примере 5 ведет к значительному повышению ингибирующих свойств, что негативно сказывается на специфической активности среды.

Из таблицы видно, что предлагаемая питательная среда в соответствии с примерами 1, 2, 3 обладает хорошими ростовыми свойствами, эффективна в накоплении представителей рода Proteus и подавляет рост ряда грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов.

Визуальный учет результатов выявления бактерий рода Proteus и их дифференциации по способности расщеплять мочевину по окончании срока инкубации посевов показал идентичные результаты в испытуемых и контрольной (лабораторного приготовления) средах.

Изменение количественного соотношения компонентов среды ведет к нарушению биологических показателей качества предложенной среды.

Так, в случае приготовления среды в соответствии с примерами 4,5 наблюдается снижение специфической активности и изменение ингибирующей способности среды:

- при концентрации компонентов ниже минимальных пределов наблюдался рост Staphylococcus aureus Wood-46 АТСС 10832.

- слабое изменение цвета и диффузное помутнение при росте Proteus vulgaris HX 19 222, Proteus mirabilis 3177, Morganella morganii АТСС 25830 DSM 30164

- при концентрации компонентов выше максимальных пределов

- подавляется рост Proteus vulgaris HX 19 222, Proteus mirabilis 3177, Morganella morganii АТСС 25830 DSM 30164 (слабое изменение цвета и диффузное помутнение, при визуальном просмотре посевов после культивирования):

ингибирующий эффект среды ярко выражен.

Таким образом, разработана отечественная конкурентоспособная Селективная питательная среда с маннитом, желчью и полимиксином для выявления бактерий родов Proteus, Morganella, Providencia сухая;

разработана технология получения сухой питательной основы из жидкого панкреатического гидролизата рыбной муки (ПГРМ K2HPO4) с калием фосфорнокислым двузамещенным, деминерализованного от катионов кальция и магния с дополнительным осаждением высокомолекулярных белков и пептидов обеспечивает прозрачность и высокую буферную емкость готовой среды.

упрощена процедура и снижены трудозатраты приготовления среды;

готовая среда после стерилизации, внесения мочевины и селективной добавки (полимиксина В) - прозрачная, зеленого цвета, что улучшает визуальную интерпретацию результатов исследований;

изменен режим стерилизации среды, позволяющий проводить контроль за процессом с использованием индикаторов химических.

Таблица 2. Биологические показатели Селективной питательной среды с маннитом, желчью и полимиксином для выявления бактерий родов Proteus, Morganella, Providencia.

№ п/п Наименование тест-штамма Селективная питательная среда с маннитом, желчью и полимиксином для выявления бактерий родов Proteus, Morganella, Providencia. Контроль
Среда лабораторного приготовления
Пример 1 Пример 2 Пример 3 Пример 4 Пример 5
1 Proteus vulgaris HX 19 222
разведение 10-6
диффузное помутнение
изменение цвета среды из зеленого в синий
диффузное помутнение
изменение цвета среды из зеленого в синий
диффузное помутнение
изменение цвета среды из зеленого в синий
слабое диффузное помутнение
изменение цвета среды из зеленого в синий
слабое диффузное помутнение
изменение цвета среды из зеленого в синий
диффузное помутнение
изменение цвета среды из зеленого в синий
2 Proteus mirabilis 3177
разведение 10-6
диффузное помутнение
изменение цвета среды из зеленого в синий
диффузное помутнение
изменение цвета среды из зеленого в синий
диффузное помутнение
изменение цвета среды из зеленого в синий
слабое диффузное помутнение
изменение цвета среды из зеленого в синий
слабое диффузное помутнение
изменение цвета среды из зеленого в синий
диффузное помутнение
изменение цвета среды из зеленого в синий
3 Providencia alcalifaciens1068-50 NCTC
разведение 10-6
диффузное помутнение
Без изменения цвета среды
диффузное помутнение
Без изменения цвета среды
диффузное помутнение
Без изменения цвета среды
слабое диффузное помутнение
Без изменения цвета среды
слабое диффузное помутнение
Без изменения цвета среды
диффузное помутнение
Без изменения цвета среды
4 Morganella morganii АТСС 25830 DSM 30164
разведение 10-6
диффузное помутнение
изменение цвета среды из зеленого в синий
диффузное помутнение
изменение цвета среды из зеленого в синий
диффузное помутнение
изменение цвета среды из зеленого в синий
слабое диффузное помутнение
изменение цвета среды из зеленого в синий
слабое диффузное помутнение
изменение цвета среды из зеленого в синий
диффузное помутнение
изменение цвета среды из зеленого в синий
5 Staphylococcus aureus Wood-46 АТСС 10832
разведение 10-4
Нет роста Нет роста Нет роста слабое диффузное помутнение
Без изменения цвета среды
Нет роста Нет роста
6 Escherichia coli АТСС 25922
разведение 10-4
Нет роста Нет роста Нет роста Нет роста Нет роста Нет роста

Селективная питательная среда для выявления бактерий родов Proteus, Morganella, Providencia сухая, содержащая следующие исходные компоненты, г/л:

Панкреатический гидролизат рыбной муки
деминерализованный от катионов кальция и
магния с дополнительным осаждением
высокомолекулярных белков и пептидов
сухой (ПГРМ K2HPO4 сухой) 8,8-12,8
Желчь очищенная сухая 3,0-7,0
Маннит D(-) 0,5-1,5
Натрий хлористый 4,0-6,0
Бромтимоловый синий 0,03-0,05
Кристаллический фиолетовый 0,0015-0,0025,

селективная добавка (СД), г/л:

Полимиксина В сульфат 0,01-0,014



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ очистки сточных вод с получением биомассы, включающий прокачку углекислого газа, выработанного при окислении биологических загрязнений сточных вод в отдельной емкости, через взвесь фотосинтезирующих организмов в жидкой среде, находящуюся в отдельном резервуаре под лучами света с выработкой отводящегося кислорода и получением биомассы, причем предварительно эмпирическим путем определяют необходимый объем сточных вод и количество фотосинтезирующих организмов.
Изобретение относится к области ветеринарии и предназначено для лечения инфекционного перитонита кошек (FIP), вызываемого кошачьим коронавирусом (FCoV). Предложена лиофилизированная форма композиции для приготовления раствора для подкожного введения на основе аналога нуклеозида VS-121354 и аминокислоты Таурин в качестве активных ингредиентов с применением солюбилизаторабетадексасульфобутилата натрия и агента, регулирующего pH, при следующем соотношении компонентов % мас.: аналог нуклеозида VS-121354 или его аналог 2,8-3,8, таурин 6,9-8,5, бетадексасульфобутилат натрия 84,55-93,45.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в лабораторной диагностике лекарственной устойчивости цитомегаловируса (ЦМВ) к ганцикловиру (ГЦВ) и валганцикловиру (ВГЦВ) у пациентов с подтвержденной ЦМВ инфекцией. У пациентов с подтвержденной ЦМВ инфекцией стандартным способом производят забор образца крови и осуществляют: выделение ДНК ЦМВ; определение вирусной нагрузки ЦМВ; амплификацию фрагмента гена UL97, включающего кодоны 460, 520 и 590-607, с использованием следующих праймеров: acaacgtcacggtacatcga, gtcgtagtccaaactcgaga, cgacacgaggacatcttgg и различных температурных режимов; детекцию и визуализацию продуктов амплификации фрагмента гена UL97 ЦМВ методом оценочного электрофореза; очистку продуктов амплификации; секвенирование фрагмента UL97 ЦМВ; анализ полученных результатов с определением генотипа фрагмента гена UL97 ЦМВ.

Изобретение относится к биохимии. Описан способ определения референтных значений показателей микроорганизмов в предстательной железе, который позволяет провести высокоточную диагностику хронического простатита, путем сопоставления с разработанными нормами содержания микробиоты в секрете простаты.

Группа изобретений относится к области микробиологии и биотехнологии и касается киллерного штамма Saccharomyces cerevisiae VKPM Y-5058, применения штамма для получения дсРНК, а также способа получения дсРНК. Изобретение позволяет повысить продуктивность нового штамма Saccharomyces cerevisiae.
Изобретение относится к области медицины, а именно к молекулярно-генетическим методам диагностики наследственных заболеваний, конкретно к способам проведения диагностики ряда наследственных заболеваний, в основе которых лежит патология скелета. В изобретении используется библиотека из 166 генов панели «Скелетные дисплазии».

Изобретение относится к области микробиологии. Предложен штамм гриба Hericium erinaceus с депозитарным номером CCTCC No.

Настоящее изобретение относится к микробиологии. Описан штамм бактерии Escherichia coli ВКПМ В-14269 с инактивированным геном yqeG, обладающий способностью продуцировать L-треонин.
Изобретение относится к биотехнологии и агроэкологии и предназначено для реабилитации почвогрунтов после аварийных разливов в районах добычи, транспортировки и переработки нефти, для рекультивации свалок ТБО и сельскохозяйственных земель, для утилизации отходов сельского хозяйства и отраслей промышленности по переработке растительного сырья, для очистки жидких отходов и сточных вод производств путем сорбции, фильтрации загрязненных вод и предотвращения миграции тяжелых металлов и нефтеуглеводородов с одновременным структурированием почвы и очисткой от загрязнений нефтью и нефтепродуктами.

Изобретение относится к области молекулярной биологии и может быть использовано для дифференциальной диагностики глиальных опухолей мозга высоких степеней злокачественности. Описан способ дифференциальной диагностики глиом высоких грейдов, в котором из образца ткани глиомы выделяют общую РНК, осуществляют синтез 1-й цепи кДНК с помощью реакции обратной транскрипции, проводят ПЦР в реальном времени с праймерами, подобранными к мРНК генов ТЕK, С3, MKI67, HIF1A, OLIG2, TNFRSF1A.
Наверх