Способ получения биологически активной добавки на основе молочной сыворотки и растительного экстракта
Изобретение относится к пищевой промышленности. Способ получения биологически активной добавки на основе молочной сыворотки и растительного экстракта осуществляют следующим образом. Подготавливают и экстрагируют этиловым спиртом растительное сырье, в качестве которого используют клеточные культуры растений каллусную культуру тимьяна обыкновенного и/или корневую культуру женьшеня настоящего. Экстракцию биомассы каллусной культуры тимьяна обыкновенного проводят при температуре 70°C и концентрации этилового спирта 70 %, экстракцию биомассы корневой культуры женьшеня настоящего проводят при температуре 50°C и концентрации этилового спирта 30 % при соотношении растительное сырье:экстрагент 1:86 и продолжительности экстрагирования 4 ч. Фильтруют экстракт и выпаривают экстрагент. Высушивают экстракт на распылительной сушилке. Смешивают сухой экстракт со вспомогательными компонентами: микрокристаллической целлюлозой, аэросилом, стеаратом магния, сухой молочной сывороткой - творожной и/или подсырной. Инкапсулируют полученную смесь. Изобретение обеспечивает получение капсулированной формы биологически активной добавки, содержащей сухую молочную сыворотку и антиоксидантный комплекс биологически активных веществ (БАВ) растительного происхождения. 3 з.п. ф-лы, 7 табл., 3 пр.
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в пищевой и фармацевтической промышленности для получения биологически активной добавки с антиоксидантными свойствами на основе молочной сыворотки (творожной и подсырной) и экстрактов каллусной культуры тимьяна обыкновенного (Thymus vulgaris L.) и корневой культуры женьшеня настоящего (Panax ginseng С.А. Меу).
В настоящее время наиболее быстрым, экономически приемлемым и научно обоснованным способом решения проблемы рационализации питания человека является широкое применение биологически активных добавок (БАД) к пище в повседневной практике.
Молочная сыворотка (творожная и/или подсырная) является побочным продуктом производства творога или сыра. Молочная сыворотка зачастую не используется, а сливается в канализацию либо в водоемы, что ухудшает экологическую ситуацию, приводит к техногенной нагрузке на очистные сооружения и окружающую среду. В то же время молочная сыворотка содержит легкоусвояемые компоненты - белки, углеводы (лактоза), минеральные соли и др. [1].
По химическому составу подсырная и творожная сыворотка содержит в среднем (мас. %): сухих веществ 6,0-6,5, лактозы 4,2-4,5, белковых веществ 0,6-0,8, минеральных солей 0,5-0,6, а также витамины А, Е, группы В и другие [2].
Молочная сыворотка вследствие высокой массовой доли влаги и возможности порчи должна скармливаться скоту в течение 12 часов. В течение 2 суток без специальной обработки питательность сыворотки снижается: содержание лактозы уменьшается на 40%, белка на 14%, сухих веществ на 10%. Эффективны способы использования сыворотки в сухом и сгущенном виде [3].
Использование жидкой молочной сыворотки нецелесообразно, так как усвоение основных питательных веществ из сыворотки достигается только на 20% [4].
Имеется опыт применения сгущенной молочной сыворотки в виде белково-углеводного концентрата. Например, указанный концентрат рекомендуется для приготовления кормовой смеси для выращивания телят-молочников. Смесь включает в себя молочную сыворотку, муку гороховую и овсяную, дрожжи кормовые, рыбий жир, поваренную соль и другие компоненты. Концентрат достаточно сложен по составу и в приготовлении. Скармливание смеси молодняку крупного рогатого скота увеличивает ежесуточный прирост живой массы на 25-30% [5].
Антиоксиданты - это молекулы, борющиеся с окислительными процессами в организме, вызванными свободными радикалами. К главным факторам, увеличивающим выработку свободных радикалов, относят: внутренние воспаления, загрязненный воздух, чрезмерное воздействие ультрафиолета, сигаретный дым. Оксидативный стресс, возникающий из-за свободных радикалов, провоцирует различные заболевания, включая сердечнососудистые, диабет, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона и проблемы с глазами, такие как катаракта и возрастная дегенерация желтого пятна [6]. Антиоксиданты способны замедлить эти процессы, а в некоторых случаях и обратить их вспять, восстанавливая поврежденные клетки. Борьба с окислительными процессами - основная задача антиоксидантов. Как следствие, они могут: укреплять функцию тканей человека, омолаживать, повышать иммунитет человека, улучшать метаболическую функцию, снижать риск развития рака, укреплять функцию лимфатических тканей и противостоять перекисному окислению [7].
Антиоксиданты, производимые организмом самостоятельно, называются эндогенными, а поступающие извне - экзогенными. Наиболее активными в борьбе со свободными радикалами считаются вторичные метаболиты растений (флавоноиды, полифенолы, гликозиды, дубильные вещества, витамины) [8]. В качестве источников вторичных метаболитов, обладающих антиоксидантными свойствами, интерес представляет тимьян обыкновенный (Thymus vulgaris L.) и женьшень настоящий (Panax ginseng С.А. Меу).
Тимьян обыкновенный (Thymus vulgaris L.) широко используют в пищевой, косметической и фармацевтической промышленности [9]. Трава тимьяна обыкновенного (Thymus vulgaris L.) содержит [10]:
- эфирное масло (примерно 0,6%), в состав которого входят тимол (до 42%), карвакрол, n-цимол, α-терпинеол, борнеол, гераниол;
- дубильные вещества;
- горечи;
- камедь;
- тритерпеновые соединения - урсоловая и олеаноловая кислоты;
- флавоноиды - апигенин, нарингенин, цинарозид, космоссиин, скутеллярин;
- минеральные соли;
- пигменты - зеаксантин, лютеин, лутеолин;
- сахара - глюкозу, галактозу, арабинозу, рамнозу, ксилозу, глюкуроновую кислоту, галактуроновую кислоту;
- аминокислоты - цистин, аланин, лейцин;
- жирные кислоты - пальмитиновая, линолевая, линоленовая кислоты;
- органические кислоты - лимонная, яблочная, малоновая, щавелевая кислоты. Также в метанольном и этанольном экстракте тимьяна обыкновенного (Thymus vulgaris L.) были обнаружены галловая, гидроксибензойная, хлорогеновая, сиринговая, кумаровая, бензойная, коричная и розмариновая кислоты [11]. Биологически активными свойствами растение обладает благодаря содержанию фенольных веществ, среди которых особое внимание уделяется тимолу, карвакролу и дубильным веществам. Благодаря наличию данных веществ тимьян обыкновенный (Thymus vulgaris L.) обладает противовоспалительной, антимикробной, болеутоляющей активностью [11].
Женьшень настоящий (Panax ginseng С.А. Меу), или женьшень обыкновенный - медленно растущее многолетнее растение рода Panax, которое часто используется в качестве компонента для функциональных продуктов и в качестве фитотерапевтического средства для предотвращения, лечения заболеваний (рака, аллергий, воспалительных заболеваний, сахарного диабета) [12]. По данным ученых женьшень настоящий (Panax ginseng С.А. Меу) используется в качестве адаптогенного агента, для повышения физической работоспособности, жизнеспособности, иммунитета, устойчивости к стрессу и старению [13].
К основным биологически активным компонентам женьшеня настоящего (Panax ginseng С.А. Меу) относят:
1. полисахариды (гликаны - гинсенан РА и гинсенан РВ, состоящие из L-арабинозы, D-галактозы, L-рамнозы, D-галактуроновой кислоты и D-глюкуроновой кислоты);
2. сапонины, в особенности гинзенозиды, которые можно классифицировать как олигогликозиды даммаранового, окотиллольного и олеананового типа, и разделить на протопанаксадиол и протопанаксатриол;
3. флавоноиды (кемпферол, трифолин и панасенозид);
4. полиацетилены (панаксинол и панаксидол).
Гинзенозиды (Re, Rg1, Rd, S-Rg2, Rb2, F1, Rc, S-Rh1, Rb3, R-Rg2, LC1) являются основными активными ингредиентами женьшеня настоящего (Panax ginseng С.А. Меу), они относятся к классу природных продуктов стероидных гликозидов и тритерпеновых сапонинов и накапливаются в корнях, ягодах и листьях растения [14].
Исследования показали, что гинзенозиды проявляют ярко выраженные фармакологические эффекты, такие как снятие усталости, улучшение иммунитета, замедление старения, ингибирование метастазирования раковых клеток, регулирование уровня глюкозы в крови и защита функций печени и почек [15]. Гинзенозиды обладают противоаллергической активностью в моделях бронхиальной астмы и атопических заболеваний у мышей. К тому же они подавляют развитие воспалительного процесса путем ингибирования активации NF-κВ, и повышают иммунитет.
Полифенолы являются естественными, безопасными антиоксидантами, способными предотвращать ряд заболеваний (сердечно-сосудистые, рак, гипертония, диабет, атеросклероз). Многие природные полисахариды являются высоко ценными биоматериалами, которые характеризуются биосовместимостью, низкой токсичностью и биоразлагаемыми свойствами [16]. Полисахариды растительного происхождения обладают различными фармакологическими свойствами, в том числе антиоксидантными, противоопухолевыми и иммуномодулирующими. Экстракт женьшеня настоящего (Panax ginseng С.А. Меу) индуцирует улучшение липидного профиля крови, главным образом, за счет снижения уровня общего и ЛПНП-холестерина [17].
С развитием науки и техники в области человеческого потенциала и высокой конкуренции на молочном рынке стоит ожидать появления молочных продуктов с добавлением антиоксидантов для усиления иммунного эффекта.
Из существующего уровня техники известен способ получения БАД к пище (патенте РФ №2370151, опубл. 20.10.2009). БАД к пище получают на основе растительного сырья. Готовят медовые экстракты календулы, одуванчика, мяты перечной, солодки, взятые в виде настоев (отваров), пророщенных в сыворотке семян тыквы, нута и расторопши. К основному недостатку данного способа получения БАД к пище относится применение в качестве экстрагента меда. Во-первых, у некоторых потребителей БАД наблюдается индивидуальная непереносимость меда. Во-вторых, мед является достаточно дорогим экстрагентом. Также данная БАД характеризуется низкой антиоксидантной активностью из-за отсутствия фенольных кислот и стероидоподобных соединений.
Известен способ получения БАД к пище «ЭРАМИН» (патент РФ №2435455, опубл. 10.12.2011). Способ получения БАД включает подготовку растительного сырья, взвешивание компонентов рецептуры, приготовление раствора из сухой смеси сена люцерны, микроэлементов и дистиллированной воды, экстрагирование при температуре 180-190°С 5-6 ч при давлении 6⋅105 Па, сушку экстракта в сушильном шкафу при температуре 55-60°С продолжительностью 4 ч. К недостаткам данного способа относят высокую температуру и продолжительность экстрагирования растительного сырья, а также низкую антиоксидантную активность.
Описан метод получения биологически активной пищевой добавки (патент РФ №2449600, опубл. 10.05.2012). БАД представляет собой комплекс из растительного сырья, инозина, янтарной кислоты и вспомогательного компонента - стеарата магния. В качестве компонентов растительного происхождения используют сухие экстракты из элеутерококка колючего, плодов расторопши пятнистой, якорцев стелющихся и зеленого чая. К недостатку данного метода относят недостаточно сбалансированные по своему составу БАВ, невысокую антиоксидантную активность из-за отсутствия фенольных кислот и стероидоподобных соединений.
Существует способ получения сухой смеси для приготовления спортивного напитка (патент РФ №2579211, опубл. 10.04.2016). Способ предусматривает получение сухой биологически активной добавки, которая содержит, масс. %: сыворотку подсырную сухую 25,0-27,0, сухой экстракт ягод годжи 22,2-24,2, сухой экстракт ананаса 20,1-20,4, пыльцу цветочную 11,1-12,2, молочко пчелиное маточное 4,3-4,5, фруктозу - остальное. Недостатком этой композиции является непереносимость у некоторых пациентов отдельных компонентов, например, пчелиного маточного молочка и цветочной пыльцы.
Также у данной БАД имеется низкая антиоксидантная активность из-за отсутствия фенольных кислот и стероидоподобных соединений.
Патент РФ №2672914, опубл. 21.11.2018 описывает получение молочной сыворотки с антиоксидантными свойствами. Изобретение описывает получение антиоксидантного комплекса, который содержит: антиоксидант растительного происхождения и молочный гидролизат, обогащенный лактатами в процессе гидролиза, из молочной сыворотки и/или пахты, и/или обезжиренного молока. Недостатком способа является несбалансированный состав витаминно-минерального комплекса, который не обладает антиоксидантными свойствами.
Известен метод получения БАД к пище капсулированной формы (патент РФ №2756855, опубл. 06.10.2021). Способ включает получение БАД капсулированной формы, содержащей комплекс БАВ в форме сухого экстракта в качестве активного компонента, включающего в себя корни заманихи высокой, траву хвоща полевого, плоды кизила, плоды череды трехраздельной, корни и корневища девясила, побеги черники обыкновенной, траву гелеги, листья шелковицы и листья земляники. Способ получения БАД капсулированной формы включает получение жидкого экстракта с последующим выпариванием, очистку экстракта с последующим получением сухого экстракта, перемешивание с вспомогательными веществами и инкапсулирование. В числе недостатков способа получения такой БАД следует назвать ультразвуковую экстракцию растительного сырья, так как при таком методе экстракции используется дорогое оборудование, высокая агрессивность ультразвука в отношении антиоксидантных веществ. В качестве экстрагента используется вода, такой экстрагент не способен выделять достаточно высокое количество антиоксидантного комплекса БАВ.
Описан способ получения БАД на основе растительного источника для комплексного эффективного питания собак (патент CN №104026419А, опубл. 10.09.2014). Способ приготовления комплексной БАД растительного происхождения для собак, предназначенной для самостоятельного питания, включает этапы: добавление сухого обезжиренного молока, сухой молочной сыворотки, сахарозы и галактоолигосахарида в контейнер, равномерное перемешивание и добавление микрокристаллической целлюлозы, смешивание питательного вещества с растительным источником (экстракт грецкого ореха, экстракт ореха пекан и экстракт банана), повторное перемешивание, затем вся смесь таблетируется. Недостатками являются длительность процесса выпаривания экстрактов грецкого ореха, ореха пекан и банана, а также низкая антиоксидантная активность из-за отсутствия фенольных кислот и стероидоподобных соединений.
В патенте (патент RO №134736А2, опубл. 26.02.2021) описан способ получения микрокапсулированной БАД различной функциональности на основе экстрактов антоцианов из кожуры баклажанов и молочнокислых бактерий, и ее применение. Согласно изобретению, способ заключается в сублимационной сушке этанолового экстракта из кожуры баклажанов, имеющего высокое содержание антоциановых соединений, и выбранных молочнокислых бактерий в комбинации матриц на основе сывороточных белков и гидролизатов, карбоксиметилцеллюлозы и пектина, с получением натуральных ингредиентов с биосовместимостью in vitro, с высокой антиоксидантной и метаболической активностью. Недостатком данного способа является лиофилизационное высушивание экстракта кожуры баклажанов, так как для лиофилизации необходима тщательная подготовка высушиваемого сырья к сушке, создание вакуума для полноты высыхания, длительность сушки и достаточно высокие энергозатраты. Также для данной БАД отмечена низкая антиоксидантная активность из-за отсутствия фенольных кислот и стероидоподобных соединений.
Известен способ получения БАД к пище с антиоксидантными свойствами (патент MD №1480Y, опубл. 31.01.2021). Изобретение относится к пищевой промышленности и санокреатологии, а именно к биологически активной добавке к пище, обладающей антиоксидантной активностью. Пищевая добавка, согласно изобретению, содержит, в мас. %: сухой экстракт семян амаранта 25, сухой экстракт листьев полыни горькой 35, сухой экстракт дигидрокверцетина 10, сухой экстракт скорлупы грецкого ореха 10, сухой экстракт корней одуванчика 10 и активированный уголь 10. К недостаткам данного способа относят высокую температуру и продолжительность экстрагирования растительного сырья, что приводит к разрушению антиоксидантных БАВ.
Наиболее близким к заявляемому способу (ближайшим аналогом) является способ производства биологически активной добавки к пище капсулированной формы (патент РФ №2759731, опубл. 17.11.2021). Данный способ подразумевает получение БАД капсулированной формы, содержащей комплекс БАВ в форме сухого экстракта в качестве активного компонента, включающей в себя траву тысячелистника, цветки ноготков, листья березы, траву хвоща полевого, корни солодки голой, листья крапивы, плоды фенхеля в соотношении 2:2:1,5:1,5:1:1:1, и комплекс вспомогательных веществ, включающий в себя наполнитель, связующее, дезинтегрант, противоприлипающее, скользящее. Способ получения БАД капсулированной формы включает получение жидкого экстракта с последующим выпариванием, очистку экстракта с последующим получением сухого экстракта, перемешивание с вспомогательными веществами и инкапсулирование. БАД применяют в качестве источника флавоноидов и глицизирриновой кислоты. Недостатком данной БАД является многокомпонентность состава, которая ведет к низкой стабильности из-за химического взаимодействия ингредиентов. Также данная БАД характеризуется низкой антиоксидантной активностью из-за отсутствия фенольных кислот и стероидоподобных соединений, также не содержит дополнительный источник лактозы, белка, витаминов, макро- и микроэлементов.
Техническая задача, решаемая использованием разработанного изобретения, состоит в разработке нового способа получения биологически активной добавки к пище с антиоксидантными свойствами на основе молочной сыворотки и экстрактов клеточных культур тимьяна обыкновенного (Thymus vulgaris L.) и женьшеня настоящего (Panax ginseng С.А. Меу).
Техническим результатом, полученным при реализации заявленного способа, является получение капсулированной формы биологически активной добавки, содержащей сухую молочную сыворотку и антиоксидантный комплекс биологически активных веществ (БАВ) растительного происхождения.
Для достижения указанного технического результата предложено использовать способ получения капсулированной БАД на основе сухой молочной сыворотки и экстрактов клеточных культур тимьяна обыкновенного (Thymus vulgaris L.) и женьшеня настоящего (Panax ginseng С.А. Меу), включающий последовательные этапы: выращивание клеточных культур растений, водно-спиртовая экстракция высушенной биомассы клеточных культур растений, фильтрование экстракта, выпаривание этилового спирта, распылительное высушивание молочной сыворотки и экстрактов клеточных культур растений in vitro, смешивание и капсулирование компонентов БАД: сухой молочной сыворотки, сухих растительных экстрактов и вспомогательных веществ.
В настоящее время особенное внимание привлекает метод получения изолированных клеток и тканей растений с последующим выделением из них БАВ. Клеточные культуры растений в сравнении с традиционным растительным сырьем имеют ряд преимуществ: возможность круглогодичного получения сырья независимо от природных условий региона и климатических параметров года; возможность оптимизации и стандартизации условий выращивания; способность клеточных культур растений синтезировать высокий уровень вторичных метаболитов, превосходящий уровень традиционных растений.
Разработанный способ реализуют следующим образом.
Предварительно выращивают каллусную культуру тимьяна обыкновенного (Thymus vulgaris L.) и корневую культуру женьшеня настоящего (Panax ginseng С.А. Меу).
Для определения и разработки качественного и количественного состава капсул БАД использованы результаты количественного определения фенольных кислот в биомассе каллусной культуры тимьяна обыкновенного (Thymus vulgaris L.) и гинзенозидов в биомассе корневой культуры женьшеня настоящего (Panax ginseng С.А. Меу), которые приведены в таблице 1.
На втором этапе осуществляется процесс водно-спиртовой экстракции высушенной биомассы каллусной культуры тимьяна обыкновенного (Thymus vulgaris L.) и корневой культуры женьшеня настоящего (Panax ginseng С.А. Меу). Температура для экстракции биомассы каллусной культуры тимьяна обыкновенного (Thymus vulgaris) составляет 70°С, для биомассы корневой культуры женьшеня настоящего (Panax ginseng С.А. Меу) - 50°С; концентрация этилового спирта для экстракции каллусной культуры тимьяна обыкновенного (Thymus vulgaris) равна 70%, а для корневой культуры женьшеня настоящего (Panax ginseng С.А. Меу) - 30% при соотношении растительное сырье/экстрагент 1:86, продолжительность экстрагирования для обеих клеточный культур составляет 4 ч.
На третьем этапе полученные экстракты подвергают очистке с помощью фильтрационной установки - друк-фильтра, работающего под давлением углекислого газа, азота и флегматизированного воздуха.
Четвертый этап подразумевает выпаривание полученных экстрактов каллусной культуры тимьяна обыкновенного (Thymus vulgaris L.) и корневой культуры женьшеня настоящего (Panax ginseng С.А. Меу) на роторной вакуум-выпарной установке. В испарителе происходит концентрирование экстракта до 20% сухих веществ от общего объема.
Пятый этап заключается в высушивании экстрактов каллусной культуры тимьяна обыкновенного (Thymus vulgaris L.) и корневой культуры женьшеня настоящего (Panax ginseng С.А. Меу) и молочной сыворотки. Высушивание осуществляется распылительным способом.
Шестой стадией в рамках описанного способа является смешивание и капсулирование компонентов БАД: сухой молочной сыворотки, сухих растительных экстрактов и вспомогательных веществ.
Экспериментальным путем установлен оптимальный состав БАД капсулированной формы на основе сухой молочной сыворотки и сухих экстрактов каллусной культуры тимьяна обыкновенного (Thymus vulgaris L.) и корневой культуры женьшеня настоящего (Panax ginseng С.А. Меу), обладающих антиоксидантными свойствами. Для капсулирования компонентов БАД используют желатиновые капсулы, вмещающие 700 мг биодобавки. Помимо сухих растительных экстрактов и сухой молочной сыворотки в состав БАД входят вспомогательные вещества: микрокристаллическая целлюлоза (МКЦ), диоксид кремния коллодный (аэросил) и стеарат магния.
Необходимое количество фенольных кислот в высушенной биомассе каллусной культуры тимьяна обыкновенного (Thymus vulgaris L.) и гинзенозидов в высушенной биомассе корневой культуры женьшеня настоящего (Panax ginseng С.А. Меу) на основании рекомендованных доз, указанных в методических рекомендациях MP 2.3.1.1915-04 «Рекомендуемый уровень потребления пищевых и биологически активных веществ», представлено в таблице 2 [18]. В составе суточной порции БАД содержание фармакологически активных соединений лекарственного растения должно быть не более 50-60% от разовой терапевтической дозы (РТД) при использовании данного растения в качестве лекарственного средства. При этом нижняя граница содержания этих соединений в БАД не должна быть менее 10% от разовой терапевтической дозы.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами:
Пример 1. Подготавливают каллусную культуру тимьяна обыкновенного (Thymus vulgaris L.). На первом этапе получения каллусной культуры тимьяна обыкновенного используют стерильные семена. Стерилизация семян тимьяна обыкновенного осуществляется следующим образом: семена промывают детергентом, затем помещают в 70%-ный этиловый спирт на 1 мин, после чего в 5%-ный раствор гипохлорита натрия на 50 мин. После стерилизации материал трехкратно отмывают в течение 20 мин в дистиллированной стерильной воде. После стерилизации для получения стерильных проростков семена высаживают на питательную среду, следующего состава: макросоли по Гамборгу (В5)×20 - 50 мл; микросоли В5×20 - 10 мл; Fe-ЭДТА - 5 мл; сахароза - 30 мг; никотиновая кислота - 1 мг; пиридоксин - 1 мг; тиамин - 10 мг; инозит - 100 мг; агар - 20; дистиллированная вода - 1000 мл. Первые проростки тимьяна обыкновенного наблюдаются спустя 4-5 недель. Для индукции каллусных культур клеток используют 2-8 недельные стерильные проростки с 2-4 настоящими листьями. Для этого листья и стебли проростков разрезают на части и высаживают на агаризованные среды в чашки Петри диаметром 60 и 90 мм, а также в баночки с вентилируемыми крышками. Образование первичных каллусов наблюдают на 7-14 сутки культивирования. Питательной средой для дальнейшего выращивания каллусной культуры тимьяна обыкновенного служит питательная среда, следующего минерального и гормонального состава: макросоли В5х20 - 50,00 мл; микросоли В5 - 10,00 мл; Fe-ЭДТА - 5,00 мл; тиамин - 10,00 мг; пиридоксин - 1,00 мг; никотиновая кислота - 1,00 мг; сахароза - 30,00 г; инозит - 100,00 мг; кинетин - 2,00 мг; 6-бензиламинопурин (6-БАП) - 0,10 мг; р-индолилуксусная кислота (ПУК) - 2,00 мг; 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота (2,4-Д) - 2,00 мг; агар - 20,00 г; дистиллированная вода - 1000 мл. Из образовавшихся проростков в качестве эксплантов используют стебли и листья (через 8 суток после появления первого листа). Все экспланты помещают на питательную среду аналогичного минерального и гормонального состава и инкубируют около 25 суток. Первичный каллус отделяют от остатков растительных эксплантов и переносят на свежую питательную среду. Дальнейший цикл выращивания культуры составляет 4-5 недель.
Каллусные культуры тимьяна обыкновенного (Thymus vulgaris L.) подвергают высушиванию при температуре 25°С в защищенном от действия света месте и измельчению. Высушенный растительный материал измельчают в мельнице марки ЛЗМ-1М (Россия, Олис) и просеивают через сито с размером отверстия 1 мм. Процесс экстракции каллусной культуры тимьяна обыкновенного (Thymus vulgaris) осуществляют при температуре 70°С, концентрации этилового спирта 70% при соотношении растительное сырье/экстрагент 1:86 в течение 4 ч.
Полученные экстракты подвергают очистке с помощью фильтрационной установки - друк-фильтра, работающего под давлением углекислого газа, азота и флегматизированного воздуха.
После очистки экстракт подвергается выпариванию на роторной вакуум-выпарной установке. В испарителе происходит концентрирование экстракта до 20% сухих веществ от общего объема.
Дальнейшее высушивание экстракта осуществляют на распылительной сушилке при температурном режиме 90°С, скорости потока воздуха (аспирации) 100 м /ч и скорости подачи раствора в распылительную установку 7 мл/мин.
Высушенный экстракт каллусной культуры тимьяна обыкновенного является одним из компонентов БАД. Второй биоактивный компонент - сухая молочная сыворотка (творожная и/или подсырная).
Высушивание молочной сыворотки (творожная и/или подсырная) осуществляется на распылительной установке при заданных параметрах: температура высушивания составляет 100°С, скорость потока воздуха (аспирация) - 100 м /ч и скорость подачи раствора в распылительную установку 10 мл/мин.
Следующая стадия - смешивание компонентов БАД. Процесс смешивания подразумевает соединение в V-образном смесителе для сыпучих сред следующих компонентов: сухой экстракт каллусной культуры тимьяна обыкновенного (Thymus vulgaris L.), сухая молочная сыворотка (творожная и/или подсырная) и вспомогательные вещества в соответствии с рецептурой БАД (таблица 3). После смешивания компонентов БАД происходит капсулирование в желатиновые капсулы. Полученные капсулы упаковываются в цельные блистеры по 10 ячеек.
Для готовой БАД проводят контроль показателей качества, в том числе устанавливают антиоксидантную активность (таблица 6, 7).
Пример 2. Аналогичен примеру 1, но способ предусматривает использование корневой культуры женьшеня настоящего.
Подготавливают корневую культуру женьшеня настоящего (Panax ginseng С.А. Меу). На первом этапе получения корневой культуры женьшеня настоящего используют стерильные корневища. Корневища промывают детергентом и помещают в 0,1%-ный раствор сулемы (HgCl2) на 1 мин. После стерилизации материал трехкратно отмывают в течение 20 мин в дистиллированной стерильной воде. Части корневища разрезают скальпелем на сегменты размером 5×5 мм и используют в качестве эксплантов. Для трансформации экспланты протыкают стерильной иглой и помещают на питательную среду В5, содержащую суспензию (OD600=0.4) агробактерии Agrobacterium rhizogenes. Перед трансформацией суспензионную культуру агробактерии наращивают на среде YEB в течение 24 ч в темноте, при +23°С на качалке с круговым вращением (амплитуда 5-10 см, скорость вращения 90 об/мин). В качестве контроля используют проткнутые иглой экспланты, помещенные на твердую среду В5 без нанесения суспензии микроорганизма.
После 12-48 ч выдерживания в бактериальной суспензии экспланты промывают стерильной водой, удаляют с них влагу (насухо) стерильной фильтровальной бумагой, и помещают на твердую среду В5, содержащую 500 мг/л цефотаксима («Клафоран», Великобритания). Антибиотик добавляют для удаления остатков агробактерий. Через 30 суток культивирования оценивается частота трансформации (количество трансформированных эксплантов к их общему количеству).
Отбирают трансформированные экспланты, опираясь на фенотипические признаки (латеральное ветвление, отсутствие геотропизма, способность расти в среде без гормонов). В дальнейшем два пассажа полученных корней осуществляют на твердой среде В5, не содержащей гормоны, но содержащей уменьшенную дозу цефотаксима (250 мг/л). Культивирование происходит в отсутствии света при температуре +23°С на качалке с частотой 100 об/мин, продолжительность 5 недель. Последующую пересадку на свежую среду проводят по мере появления контаминации агробактерией.
Через 14 суток наблюдают ризогенез на отдельных эксплантах. Проростки женьшеня настоящего разрезают на сегменты по 0,5 см (0,5-1,0 г) и погружают штамм Agrobacterium rhizogenes на 15 мин. После инфицирования эксплантаты сушат на стерилизованной фильтровальной бумаге и культивируют при 23°С в темноте на среде 1/2 Мурасиге-Скуга (MS), содержащей 500 мг/л цефотаксима. Через 2 суток совместного культивирования эксплантаты переносят в среду 1/2 MS, содержащую 500 мг/л цефотаксима для уничтожения Agrobacterium. Цикл культивирования корневых культур женьшеня настоящего составляет 5 недель.
Корневые культуры женьшеня настоящего (Panax ginseng С.А. Меу) подвергают высушиванию при 25°С в защищенном от действия света месте и измельчению. Высушенный растительный материал измельчают в мельнице марки ЛЗМ-1М (Россия, Олис) и просеивают через сито с размером отверстия 1 мм. Процесс водно-спиртовой экстракции корневой культуры женьшеня настоящего (Panax ginseng С.А. Меу) осуществляется при температурном режиме 50°С и концентрации этилового спирта 30% при соотношении растительное сырье/экстрагент 1:86 продолжительностью 4 ч.
Стадии очистки и высушивания экстракта, получения сухой молочной сыворотки, смешивания компонентов БАД и капсулирования аналогичны примеру 1. Рецептура БАД на основе экстракта корневой культуры женьшеня настоящего приведена в таблице 4.
Результаты определения химического состава и антиоксидантной активности БАД представлены в таблицах 6,7.
Пример 3. Аналогичен примеру 1 и 2, но отличается рецептурой БАД. В данную БАД входит смесь сухих растительных экстрактов каллусной культуры тимьяна обыкновенного (Thymus vulgaris L.) и корневой культуру женьшеня настоящего (Panax ginseng С.А. Меу), сухая молочная сыворотка и вспомогательные вещества, в соответствии с рецептурой (таблица 5).
Готовую БАД подвергают контролю показателей качества, в том числе проводят анализ антиоксидантной активности (таблица 6, 7).
В основе количественного определения комплекса БАВ антиоксидантной направленности лежит метод ВЭЖХ. Результаты проведенного анализа представлены в таблице 6.
Антиоксидантную способность очистки от радикалов 2,2'-азино-бис-(3-этил-бенотиазолина-6-сульфоновой кислоты) диаммониевой соли (ABTS+) («Angene», Великобритания) определяли в соответствии с методикой [19]. Результаты определения антиоксидантной активности БАД представлены в таблице 7.
Определяющими существенными отличительными признаками заявляемого способа получения БАД капсулированной формы на основе молочной сыворотки и экстрактов Thymus vulgaris L. и Panax ginseng С.А. Меу по сравнению с ближайшим аналогом (патент РФ №2759731), являются:
- Использование каллусных и корневых культур in vitro Thymus vulgaris L. и Panax ginseng С.А. Меу позволяет получить высокий выход антиоксидантных БАВ в сравнении с традиционным растительным сырьем;
- Распылительное высушивание экстрактов каллусных и корневых культур in vitro Thymus vulgaris L. и Panax ginseng С.А. Меу, позволяет сократить продолжительность высушивания, что в свою очередь способствует сохранению БАВ и сокращению энергозатрат.
- Способ подразумевает использование молочной сыворотки как дополнительного источника легкоусвояемого белка, лактозы, витаминов, микро- и макроэлементов.
Список литературы:
1. Мякиньков, А.Г. Вторичные сырьевые ресурсы молочной промышленности и пути их рационального использования в условиях рыночной экономики / А. Г. Мякиньков // Пищевая и перерабатывающая промышленность. Реферативный журнал. - 2001. - №1. - С. 357.
2. Шувалова, Е.Г. Пищевая и биологическая ценность молочной сыворотки и ее рациональное использование / Е.Г. Шувалова, А.С. Арнатович, Е.Ю. Седых // Актуальные вопросы совершенствования технологии производства и переработки продукции сельского хозяйства. - 2018. - №20. - С. 271-273.
3. Витушкина, М. А. Использование молочной сыворотки в пищевой промышленности / М. А. Витушкина // Вестник науки. - 2021. - Т. 5. - №1(34). -С.127-132.
4. Волкова, Т. А. К вопросу об эффективном использовании молочной сыворотки / Т. А. Волкова // Сборник научных трудов к 75-летию со дня основания ВНИИМС "Научные подходы к решению актуальных вопросов в области переработки молока", Углич, 05-06 сентября 2019 года. - Углич: Всероссийский научно исследовательский институт маслоделия и сыроделия, 2019. - С.120-124.
5. Патент №2363238 С1 Российская Федерация, МПК А23К 1/08. Способ получения молочно-растительной кормовой добавки: №2008114792/13: заявл. 15.04.2008: опубл. 10.08.2009 / И. М. Осадченко, И. Ф. Горлов, С.Е. Божкова [и др.]; заявитель Государственное учреждение Волгоградский научно-исследовательский технологический институт мясо-молочного скотоводства и переработки продукции животноводства Россельхозакадемии (ГУ ВНИТИ ММС и ППЖ Россельхозакадемии).
6. Berger RG, Lunkenbein S, Strohle A, Hahn A. Antioxidants in food: mere myth or magic medicine? Crit Rev Food Sci Nutr. 2012;52(2):162-71. doi: 10.1080/10408398.2010.499481.
7. Hagymasi K, Egresi A, Eengyel G. Antioxidansok-antioxidanssokk: tenyek es kerdesek, 2015 [Antioxidants-antioxidative stress: facts and questions, 2015]. Orv Hetil. 2015 Nov 22;156(47):1884-7. Hungarian. doi: 10.1556/650.2015.30302.
8. Naito Y, Yoshikawa T. [Antioxidants as anti-ageing medicine]. Nihon Rinsho. 2009 Jul;67(7): 1377-83.
9. Mahdavi, A. Variation in Terpene Profiles of Thymus vulgaris in Water Deficit Stress Response / A. Mahdavi, P. Moradi, A. Mastinu // Molecules. - 2020. -№25(5). - P. 1091. doi: 10.3390/molecules25051091.
10. Винокурова, О.А. Сравнительная характеристика различных видов тимьяна: состав, свойства, применение (обзор) / О.А. Винокурова, О.В. Тринеева, А.И. Сливкин // Разработка и регистрация лекарственных средств. - 2016. - №4(17). - С134-150.
11. Винокурова, О.А. Сравнительная характеристика различных видов тимьяна: состав, свойства, применение (обзор) / О.А. Винокурова, О.В. Тринеева, А.И. Сливкин // Разработка и регистрация лекарственных средств. -2016. -№4(17).-С134-150.
12. Kang, O-J. Comparison of Ginsenoside Contents in Different Parts of Korean Ginseng (Panax ginseng C.A. Meyer) / O-J. Kang, J-S. Kim // Nutr. Food Sci. - 2016. - №21 (4). - P. 389-392. https://doi.Org/10.3746/rJnf.2016.21.4.389.
13. Kim, D. H. Chemical Diversity of Panax ginseng, Panax quinquifolium, and Panax notoginseng / D. H. Kim // Journal of ginseng research. - 2012. - №36 (1). - P. 1-15. https://doi.Org/10.5142/jgr.2012.36.l.l.
14. Kim, J-S. Investigation of phenolic, flavonoid, and vitamin contents in different parts of Korean Ginseng (Panax ginseng CA Meyer) / J-S. Kim // Preventive Nutrition and Food Science. - 2016. - №3 (21). - C. 263. DOI: 10.3746/pnf.2016.21.3.263.
15. Mancuso, C. Panax ginseng and Panax quinquefolius: from pharmacology to toxicology / C. Mancuso, R. Santangelo // Food and Chemical Toxicology. -2017. -№107. -P. 362-372. doi: 10.1016/j.fct.2017.07.019.
16. Oshima, Y. Isolation and hypoglycemic activity of panaxans I, J, К and L, glycans of Panax ginseng roots / Y. Oshima, C. Konno, H. Hikino // J Ethnopharmacol. - 1985. - №14 (2-3). - P. 255-9. DOI: 10.1016/0378-8741(85)90091-1.
17. Zhao, J.L. Microwave-Assisted Extraction, Purification, Partial Characterization, and Bioactivity of Polysaccharides from Panax ginseng / J. L. Zhao, M. Zhang, H. L. Zhou // Molecules (Basel, Switzerland). - 2019. - №24 (8). -P. 1605. https://doi.org/!0.3390/molecules24081605.
18. Рекомендуемые уровни потребления пищевых и биологически активных веществ: Методические рекомендации. - М.: Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России, 2004.
19. Study of antioxidant activity and phenolic compounds of extracts obtained from different craft beer by-products / M.J. Petron, A.I. Andres, G. Esteban, MX. Timon // Journal of Cereal Science. - 2021. №98. - c.103162. https://doi.org/10.1016/i.ics.2021.103162.
1. Способ получения биологически активной добавки на основе молочной сыворотки и растительного экстракта, включающий последовательные стадии подготовки и экстракции растительного сырья, фильтрования экстракта, выпаривания экстрагента, высушивания экстракта, смешивания сухого экстракта со вспомогательными компонентами: микрокристаллической целлюлозой, аэросилом, стеаратом магния и инкапсулирования полученной смеси, отличающийся тем, что в качестве растительного сырья используют клеточные культуры растений: каллусную культуру тимьяна обыкновенного и/или корневую культуру женьшеня настоящего, экстрагирование осуществляют этиловым спиртом, при этом экстракцию биомассы каллусной культуры тимьяна обыкновенного проводят при температуре 70°C и концентрации этилового спирта 70 %, экстракцию биомассы корневой культуры женьшеня настоящего проводят при температуре 50°C и концентрации этилового спирта 30 % при соотношении растительное сырье:экстрагент 1:86 и продолжительности экстрагирования 4 ч, высушивание экстракта осуществляют на распылительной сушилке, в состав биологически активной добавки дополнительно вносят сухую молочную сыворотку - творожную и/или подсырную вместе со вспомогательными компонентами.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что биологически активная добавка содержит следующие исходные компоненты, мас. %:
| сухая молочная сыворотка | 36,0 |
| сухой экстракт биомассы каллусной культуры тимьяна обыкновенного (Thymus vulgaris L.) | 25,0 |
| МКЦ | 35,0 |
| аэросил | 1,2 |
| стеарат магния | 2,8 |
3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что биологически активная добавка содержит следующие исходные компоненты, мас. %:
| сухая молочная сыворотка | 36,0 |
| сухой экстракт биомассы корневой культуры женьшеня настоящего (Panax ginseng C. A. Mey) | 27,4 |
| МКЦ | 33,5 |
| аэросил | 1,2 |
| стеарат магния | 1,9 |
4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что биологически активная добавка содержит следующие исходные компоненты, мас. %:
| сухая молочная сыворотка | 32,3 |
| сухой экстракт биомассы каллусной культуры тимьяна обыкновенного (Thymus vulgaris L.) | 12,0 |
| сухой экстракт биомассы корневой культуры женьшеня настоящего (Panax ginseng C. A. Mey) | 18,0 |
| МКЦ | 35,0 |
| аэросил | 1,2 |
| стеарат магния | 1,5 |
