Способ получения аллергена для диагностики бруцеллеза у сельскохозяйственных животных
Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ получения аллергена для диагностики бруцеллеза у сельскохозяйственных животных, включающий: накопление бактериальной массы культуры бруцелл, термическую инактивацию и отделение бакмассы от культуральной среды, проведение щелочного гидролиза бакмассы, отделение гидролизата от гидролизованной бакмассы, объединение фильтрата культуральной среды с гидролизатом, доведение концентрации белка в целевом продукте до рабочего значения. Изобретение позволяет получить аллерген для аллергической внутрикожной пробы у сельскохозяйственных животных, расширить арсенал способов получения аллергенов для диагностики бруцеллеза у сельскохозяйственных животных. 3 табл., 28 пр.
Изобретение относится к области диагностики инфекционных заболеваний, а именно к аллергической диагностике бруцеллеза сельскохозяйственных животных, и может быть использовано при проведении оздоровительных мероприятий в неблагополучных по бруцеллезу хозяйствах, а также при установлении диагноза в благополучных хозяйствах.
Проведение диагностических исследований имеет ведущее значение в борьбе с бруцеллезной инфекцией. Своевременное выявление инфицированных животных - залог успеха при сохранении благополучия и оздоровлении неблагополучных хозяйств. При заболевании животных бруцеллезом изменяется реактивность организма, что ведет к образованию антител и развитию аллергического состояния, т.е. в результате этого происходит специфический ответ иммунной системы (гуморальной, клеточной).
Наиболее удобным и доступным для массовой диагностики бруцеллеза у сельскохозяйственных животных является аллергический метод исследования, что особенно важно при исследовании поголовья животных в крупных животноводческих хозяйствах и на отгонных пастбищах, где серологические исследования затруднительны и нередко практически не выполнимы.
Кроме того, применение аллергопробы для прижизненной диагностики бруцеллеза животных выгодно отличается от применения серологических методов исследования, так как позволяет исключить такие процессы, как взятие крови, ее подготовку к исследованию, транспортировку в лабораторию. Аллергический метод исследования является более безопасным для исполнителей при работе в неблагополучных хозяйствах.
На результаты серологических исследований влияет стадийность инфекционного процесса.
Поэтому при диагностике бруцеллеза необходимо учитывать проявление иммунобиологических реакций на различных этапах инфекционного процесса, т.к. при этом происходит появление различных классов антител в крови, а также развитие аллергизации организма.
Серологические реакции на различных стадиях инфекционного процесса не полностью выявляют больных животных даже при комплексном исследовании. Аллергическая проба на бруцеллез является более стабильной и позволяет выявлять животных с латентными формами бруцеллеза.
Разработке диагностических реакций и методов их применения посвящено множество работ, но до сих пор не разработан совершенный метод диагностики и диагностикум.
Уровень техники.
Еще в 1918-1922 годах было установлено, что при внутрикожном введении зараженным морским свинкам убитых культур бруцелл возникает местная реакция в виде отека или инфильтрата. Аналогичную реакцию на введение убитой культуры бруцелл получили и у инфицированного крупного рогатого скота. В 1932 году Дюбуа и Соллье применили данную реакцию для аллергической диагностики бруцеллеза. В качестве аллергена они использовали культуры бруцелл убитых нагреванием при 70°С в течение одного часа. Аллерген вводили внутрикожно в подхвостовую складку. [Биологические химиотерапевтические ветеринарные препараты ред. Я.Р. Коваленко // ОГИЗ, Сельхозгиз, 1948, стр. 412-424].
Для диагностики бруцеллеза животных в 1932 году А.Н. Пашковский впервые предложил корпускулярный аллерген «абортин». Этот препарат представлял собой убитую нагреванием бульонную культуру В. abortus, выпаренную до 0,1 первоначального объема. Абортин Пашковского, по заключению автора и отзывам других исследователей, в опытах на крупном рогатом скоте давал удовлетворительные результаты, как при внутрикожной, так и при глазной пробе [Пашковский А.Н. Реакция аллергии как метод диагностики аборта Банги крупного рогатого скота // Радяньска ветеринария. - 1932, - С. 13-14].
По предложению С.Н. Вышелевского Абортин стали готовить в виде суспензии бруцелл убитых нагреванием в физиологическом растворе в концентрации 2x109 микробных клеток. По мнению многих исследователей [Вышелесский С.Н. Аллергическая реакция в диагностике бруцеллеза домашних животных // Советская ветеринария. - 1934, - №4, - стр. 37-41; Касьянов А.Н. Аллергическая и серологическая диагностика и профилактика бруцеллеза животных: дис… докт. вет. наук. М., 1987], этот препарат при внутрикожной пробе давал хорошие результаты, как на крупном, так и на мелком рогатом скоте. Однако он обладал сенсибилизирующими свойствами. Кроме того, после внутрикожной инъекции абортина Вышелесского, как, впрочем, и после других подобных аллергенов, у животных наблюдалось появление агглютининов, которые могли сохраняться до 3 месяцев.
В 1934 г. для аллергической диагностики П.Ф. Здрадовский с сотрудниками предложил метод аллергической диагностики бруцеллеза у мелкого рогатого скота при помощи лизированного препарата под названием бруцеллизат ВИЭМ. Бруцеллизат ВИЭМ получали путем механического разрушения микробных клеток с последующей экстракцией физиологическим раствором при рН 8. В качестве аллергена использовали надосадочную жидкость, стандартизованную по белку. Бруцеллизат ВИЭМ был принят для применения в широкой практике. После внутрикожной инъекции этого препарата также наблюдалось кратковременное появление у некоторых животных специфических агглютининов.
Ввиду большой важности проблемы поиски более совершенного аллергена для аллергической диагностики бруцеллеза у животных не прекращались. В 1939 году Д.А. Цуверкалов и В.М. Красов предложили аллерген в виде продукта кислотного гидролиза микробной массы бруцелл и дали ему название «бруцеллогидролизат ВИЭВ». Этот препарат также был принят для диагностики бруцеллеза у мелкого рогатого скота и свиней. Он выгодно отличался от других аллергенов тем, что не обуславливал появления серопозитивности [Биологические химиотерапевтические ветеринарные препараты ред. Я.Р. Коваленко // ОГИЗ, Сельхозгиз, 1948, - С. 412-424].
Ряд аллергенов для диагностики бруцеллеза были получены при помощи ультразвукового дезинтегрирования, но их исследования не вышли за пределы лабораторий и не нашли широкого применения [Иванов Н.П., Чубуков А.А. Изыскание и испытание аллергенов для диагностики заболевания вызываемого В. ovis // Труды КазНИВИ. - Алма - Ата, - 1983, - стр. 80-83; Тен В.Б. Методологические основы изготовления и совершенствования профилактических противобруцеллезных препаратов и диагностических средств: Автореф…. докт. вет. наук. - Алматы, 1996, стр. 45].
В 1964 году Е.С. Орловым, А.Н. Касьяновым и А.А. Клочковым предложен способ получения нового аллергена для диагностики бруцеллеза - бруцеллина [Авторское свидетельство СССР №251141 1965 г.; Ветеринарные препараты. Справочник, под ред. Д.Ф. Осидзе // изд. Колос, 1981, стр. 189-190], однако применение данного аллергена вызывало появление серопозитивности. Дальнейшее усовершенствование способа получения бруцеллина привело к созданию препарата под коммерческим названием Бруцеллин ВИЭВ [Авторское свидетельство №641692 1976 г.]. При производстве Бруцеллина ВИЭВ использовался неагглютиногенный штамм, который не вызывал синтеза специфических бруцеллезных антител и не затруднял проведение серологических исследований. Бруцеллин ВИЭВ показал высокую специфичность и активность при диагностике бруцеллеза у овец и коз при пальпебральном введении и у свиней при внутрикожном. Бруцеллин ВИЭВ нашел широкое применение для аллергической диагностики бруцеллеза у сельскохозяйственных животных [Усманова Ф.И., Сафронов Н.В., Бельченко В.Б., Гаврилова А.Н. Результаты производственного испытания бруцеллина ВИЭВ. // Сельское хозяйство Казахстана, 1967, стр. 12]. Применяемые ранее для диагностики бруцеллеза аллергены бруцеллогиролизат и бруцеллизат были сняты с производства.
Наиболее близким аналогом, для заявляемого способа является способ изготовления бруцеллина, известного под коммерческим названием «Бруцеллин ВИЭВ» (Прототип) [Авторское свидетельство №641692 1976 г.; Ветеринарные препараты ред. Д.Ф. Осидзе // Москва, «Колос» 1981 г, стр. 189-192].
«Бруцеллин ВИЭВ» готовят из штамма В. abortus В-1 который выращивают в ферментативно расщепленной безбелковой жидкой питательной среде при рН 7,2-7,4 в течение 4-5 суток. Выращенную культуру инактивируют нагреванием при температуре 105-110°С в течение 30 минут. Охлаждают и центрифугируют, полученный супернатант №1 дополнительно пропускают через стерилизующие фильтры, собирая в стерильную емкость.
Бактерийную массу суспензируют в физиологическом растворе в соотношении 1 к 50 и гомогенизируют. Доводят рН до 8,0-9,0 40% раствором едкого натрия и прогревают при 105°-110°С в течение 1 часа выдерживают 15-20 часов, центрифугируют, отделяют бакмассу, доводят рН супернатанта №2 до 7,2-7,4, фильтруют через бактериальный фильтр в стерильную емкость. Оба фильтрата объединяют разводят физраствором до концентрации белка 250-300 мкг/мл.
Технической проблемой является необходимость создания способа получения аллергена для эффективной прижизненной аллергической диагностики бруцеллеза животных.
Раскрытие сущности изобретения Техническим результатом изобретения является получение аллергена для аллергической внутрикожной пробы у сельскохозяйственных животных, расширение арсенала способов получения аллергенов для диагностики бруцеллеза у сельскохозяйственных животных.
Способ получения аллергена для диагностики бруцеллеза у сельскохозяйственных животных осуществляется на основе многостадийного процесса, состоящего из ряда этапов:
1. Накопление бактериальной массы бруцелл на жидкой питательной среде содержащей: калий фосфорнокислый одназамещенный 2,5-3,0%; натрий пировиноградокислый 1%; глюкоза 1%; натрий хлористый 0,4%; аммоний сернокислый 0,1%; глицин 0,02%; натрий лимоннокислый 0,09%; натрий сернокислый 0,01%; сернокислый магний 0,001%; азотнокислое железо 0,0001%; вода дистиллированная до 100%
2. Выращивание бакмассы бруцелл проводят при температуре 37°С в течение 4-5 суток до достижения концентрации 30-40 млрд микробных клеток в мл, при достижении нужной концентрации температуру поднимают до 50°С и продолжают культивировать в течение суток, по окончании культивирования для инактивации микробных клеток температуру поднимают до 90°С в течение 10 минут.
3. Проверяют полноту инактивации культуры бруцелл.
4. После проверки полноты инактивации проводят отделение бакмассы от культуральной среды путем центрифугирования или методом фильтрации
5. Бакмассу разделяют на две равные части,
6. Одну часть разводят 0,1% раствором соляной кислоты до концентрации 400-500 млрд микробных клеток в мл и нагревают в течение 2 часов при температуре 80°С
7. Другую часть разводят 0,1% раствором гидроокиси натрия до концентрации 400-500 млрд микробных клеток в мл и нагревают в течение 2 часов при температуре 80°С
8. Обе гидролизованные части смешивают, добавляют диметилсульфоксид (ДМСО) из расчета 5 мл на 100 мл гидролизата, выдерживают в течение 4 часов при помешивании.
9. В течение 12 часов при температуре +4-6°С проводят солевую экстракцию из расчета 3 г Хлористого натрия на 100 мл гидролизата.
10. Проводят отделение бакмассы от гидролизата, фильтрацией или центрифугированием.
11. Смешивают культуральную жидкость с гидролизатом
12. Устанавливают рН в пределах 7,2-7,4
13. Методом ультрафильтрации из полученной смеси удаляют низкомолекулярные примеси с молекулярной массой менее 10 кДа и высокомолекулярные выше 100 кДа
14. Определяют содержание белка в полученном фильтрате. Количество белка доводят физраствором до конечной концентрации 200-300 мкг/мл.
Осуществление изобретения.
Пример 1. Культуру В. abortus 19, выращивали на матрацах с твердой питательной среде в течении 2 суток с последующим их смывом 0,9%-ным физиологическим раствором. Полученную бактериальную массу использовали в качестве расплодки для засева в жидкую питательную среду, содержащую: калий фосфорнокислый одназамещенный 2,5%; натрий пировиноградокислый 1%; глюкоза 1%; натрий хлористый 0,4%; аммоний сернокислый 0,1%; глицин 0,02%; натрий лимоннокислый 0,09%; натрий сернокислый 0,01%; сернокислый магний 0,001%; азотнокислое железо 0,0001%; вода дистиллированная до 100%. В пять литров жидкую питательную внесли расплодку штамма В. abortus 19 в количестве 500 мл. Культивирование бруцелл в жидкой питательной среде вели при 37°С в течение 4 суток. Причем культуру продолжали культивировать и при окончании экспоненциальной фазы роста и выхода на стационарную фазу в течение 1 суток. Каждые 12 часов контролировали рН среды корректируя 0,1% раствором соляной кислоты до рН 7,2-7,6. Концентрацию клеток бруцелл определяли по оптическому отраслевому стандарту мутности ГНИИСК им. Л.А. Тарасевича, при достижении концентрации 40 млрд микробных клеток в мл, повышали температуру до 50°С и продолжали культивировать еще в течение суток. По окончанию культивирования накопившуюся бакмассу бруцелл термически инактивировали путем повышения температуры до 90°С в течение 10 минут. Полноту инактивации культуры бруцелл и ее чистоту проверяли путем высева на чашки с твердой питательной средой. Рост бруцелл и посторонней микрофлоры через 5 суток отсутствовал. После проверки полноты инактивации проводили отделение бакмассы от культуральной среды путем центрифугирования. Бакмассу разделяли на две равные части. Одну часть бакмассы суспензировали в 300 мл 0,1% растворе соляной кислоты до концентрации 400-500 млрд микробных клеток в мл. Полученную суспензию выдерживали на водяной бане в течение 2 часов при температуре 80°С.Другую часть бакмассы суспензировали в 300 мл 0,1% растворе гидроокиси натрия до концентрации 400-500 млрд микробных клеток в мл. Полученную суспензию выдерживали на водяной бане в течение 2 часов при температуре 80°С. Обе гидролизованные части смешивали и добавляли диметилсульфоксид из расчета 5 мл на 100 мл гидролизата, инкубировали при помешивании, при комнатной температуре в течение 4 часов. После обработке диметилсульфоксидом проводили солевую экстракцию аллергена из гидролизованных остатков бруцелл. Для этого в суспензию бруцелл добавляли хлористый натрий из расчета 3 г на 100 мл. Экстракцию проводили в течение 24 часов при температуре +4-+6°С. После проведения солевой экстракции центрифугированием отделяли бакмассу от жидкой части и смешивали супернатант с полученной ранее культуральной средой. Устанавливали рН в пределах 7,2-7,4.
Для отделения от целевого продукта низкомолекулярных и высокомолекулярных примесей проводили проточную ультрафильтрацию через фильтрующие мембраны с задерживающей способностью 100 кДа, и 10 кДа.
Сначала пропускали через фильтр с размером пор 100 кДа, оставляли фильтрат, не профильтрованную высокомолекулярную часть - ретентат удалили. Фильтрат содержащий низкомолекулярные примеси разбавляли дистиллированной водой в 5 раза и концентрировали фильтрованием до первоначального объема через фильтр с задерживающей способностью 10 кДа. В оставшейся не профильтрованный концентрат повторно заливали 5 объемов дистиллированной воды и концентрировали до первоначального объема, удаляя таким образом оставшиеся низкомолекулярные примеси. Низкомолекулярный фильтрат - пермеат, полученный после первой и второй фильтрации отбрасывали.
В полученном концентрате или ретентате нефелометрическим методом определяли содержание белка [Бруцеллин ВИЭВ, ГОСТ 25134-82]. Количество белка в 1 мл составило 1800 мкг, фильтрат разбавляли физраствором до конечной концентрации 300 мкг/мл.
Пример 2. Аналогичен примеру №1 только использовали питательную среду на основе перевара Хоттингера. Количество белка в 1 мл составило 2500 мкг, за счет белков присутствующих в питательной среде.
Пример 3. Аналогичен примеру №1 только использовали Бульон для бруцелл (Brucella Broth) производитель Condalab, Испания. Количество белка в 1 мл составило 1100 мкг.
Пример 4. Аналогичен примеру №1 только в составе питательной среды отсутствовал сернокислый аммоний. Количество белка в 1 мл составило 900 мкг.
Пример 5. Аналогичен примеру №1 только в составе питательной среды отсутствовал глицин. Количество белка в 1 мл составило 700 мкг.
Пример 6. Аналогичен примеру №1 только в составе питательной среды отсутствовало азотнокислое железо. Количество белка в 1 мл составило 1200 мкг.
Пример 7. Аналогичен примеру №1 только питательной среда имела следующее соотношение компонентов калий фосфорнокислый одназамещенный 3,0%; натрий пировиноградокислый 1,5%; глюкоза 2%; натрий хлористый 0,4%; аммоний сернокислый 0,15%; глицин 0,01%; натрий лимоннокислый 0,1%; натрий сернокислый 0,02%; сернокислый магний 0,2; азотнокислое железо 0,0002%; вода дистиллированная до 100%. При культивировании концентрация бакмассы составила 30 млрд в мл. Количество белка в 1 мл составило 1300 мкг.
Пример 8. Аналогичен примеру №1 только при достижении концентрации 30 млрд микробных клеток в мл, температуру до 50°С не повышали и продолжали культивировать еще в течение суток. Количество белка в 1 мл составило 1300 мкг.
Пример 9 Аналогичен примеру №1 только одну часть бакмассы суспензировали в 300 мл 0,2% растворе соляной кислоты до концентрации 400-500 млрд микробных клеток в мл и гидролизовали при 80°С в течение 2 часов. Другую часть бакмассы суспензировали в 300 мл 0,2% растворе гидроокиси натрия и гидролизовали при 80°С в течение 2 часов. Количество белка в 1 мл составило 10000 мкг.
Пример 10. Аналогичен примеру №1 только одну часть бакмассы суспензировали в 300 мл 0,1% растворе соляной кислоты до концентрации 400-500 млрд микробных клеток в мл и гидролизовали при 100°С в течение 2 часов. Другую часть бакмассы суспензировали в 300 мл 0,1% растворе и гидролизовали при 100°С в течение 2 часов. Количество белка в 1 мл составило 600 мкг.
Пример 11. Аналогичен примеру №1 только время кислотного и щелочного гидролиза бакмассы сократили до 1 часа. Количество белка в 1 мл составило 500 мкг.
Пример 12. Аналогичен примеру №1 только время кислотного и щелочного гидролиза бакмассы увеличили до 3 часов. Количество белка в 1 мл составило 16000 мкг.
Пример 13. Аналогичен примеру №1 только бакмассу не разделяли на две части, а всю бакмассу суспензировали в 600 мл 0,1% раствора соляной кислоты и гидролизовали в течение 2 часов при температуре 80°С. Количество белка в 1 мл составило 10000 мкг.
Пример 14. Аналогичен примеру №1 только бакмассу не разделяли на две части, а всю бакмассу суспензировали в 600 мл 0,1% раствора гидроокиси натрия и гидролизовали в течение 2 часов при температуре 80°С. Количество белка в 1 мл составило 12000 мкг.
Пример 15. Аналогичен примеру №1 только после смешивания двух гидролизованных частей не добавляли диметилсульфоксид, а сразу проводили солевую экстракцию. Количество белка в 1 мл составило 14000 мкг.
Пример 16 Аналогичен примеру №1 только диметилсульфоксид добавили из расчета 10 мл на 100 мл гидролизата. Количество белка в 1 мл составило 17000 мкг.
Пример 17. Аналогичен примеру №1 только диметилсульфоксид добавили из расчета 2 мл на 100 мл гидролизата, инкубировали при помешивании, при комнатной температуре в течение 8 часов. Количество белка в 1 мл составило 15000 мкг.
Пример 18. Аналогичен примеру №1 только при проведении солевой экстракции в суспензию бруцелл добавили хлористый натрий из расчета 1 г на 100 мл. Экстракцию проводили в течение 24 часов при температуре +4-6°С. Количество белка в 1 мл составило 7000 мкг.
Пример 19. Аналогичен примеру №1 только при проведении солевой экстракции в суспензию бруцелл добавили хлористый натрий из расчета 5 г на 100 мл. Экстракцию проводили в течение 24 часов при температуре +4-6°С. Количество белка в 1 мл составило 17000 мкг.
Пример 20. Аналогичен примеру №1 только солевую экстракцию не проводили, а отделяли бакмассу от жидкой части и смешали супернатант с полученной ранее культуральной средой. Количество белка в 1 мл составило 5000 мкг.
Пример 21. Аналогичен примеру №1 только не проводили ультрафильтрацию для удаления низкомолекулярных и высокомолекулярных примесей через фильтрующие мембраны 100 кДа, и 10 кДа. Количество белка в 1 мл составило 29000 мкг за счет балластных примесей.
Пример 22. Аналогичен примеру №1 только вместо культуры В. abortus 19 использовали штамм B. melitensis Revl, находящейся в S-форме. Количество белка в 1 мл составило 1700 мкг.
Пример 23. Аналогичен примеру №1 только вместо культуры В. abortus 19 использовали штамм B. suis 61, находящейся в S-форме. Количество белка в 1 мл составило 15000 мкг.
Пример 24. Аналогичен примеру №1 только вместо культуры В. abortus 19 находящейся в стабильной S-форме использовали штамм В. abortus 82 находящейся в R- S-форме. Количество белка в 1 мл составило 19000 мкг.
Пример 25. Аналогичен примеру №1 только вместо культуры В. abortus 19 находящейся в стабильной S-форме использовали штамм B. ovis 63/290 находящейся в R- форме. Количество белка в 1 мл составило 20000 мкг.
Пример 26. Аналогичен примеру №1 только конечный фильтрат разводили физраствором до конечной концентрации 100 мкг/мл.
Пример 27. Аналогичен примеру №1 только конечный фильтрат разводили физраствором до конечной концентрации 400 мкг/мл.
Пример 28. Специфическую активности полученного аллергена определяли на морских свинках. Морских свинок альбиносов предварительно сенсибилизировали путем подкожного введения двухсуточной агаровой культура штамма В. abortus 19 в дозе 1,75 млрд микробных клеток по оптическому отраслевому стандарту мутности ГНИИСК им. Л.А. Тарасевича. Через 35 дней после проведения сенсибилизации, на морских свинках проводили определение активности бруцеллезных аллергенов, полученных в примерах 1-25 в сравнении с коммерческим бруцеллином ВИЭВ.
Аллерген в дозе 0,1 мл вводили в боковую поверхность брюшка с правой и левой стороны внутрикожно, в центр депиллированных участков кожи размером 4 на 4 см. Каждый аллерген вводили отдельным шприцем. На месте введения аллергенов у морских свинок появлялась воспалительная реакция в виде различной отечной припухлости и гиперемии кожи. Учет интенсивности реакций проводили через 24 ч после введения аллергена, Положительной реакцией считали гиперемию и инфильтрат диаметром не менее 8 мм. Диаметр инфильтрата измеряли кутиметром в двух взаимно перпендикулярных направлениях и вычисляли среднее значение, которое и являлось показателем интенсивности аллергической реакции. Отрицательной реакцией считали отсутствие кожных проявлений или наличие гиперемии и инфильтрата менее 8 мм. Наиболее сильная аллергическая реакция 26 мм наблюдалась у морских свинок в ответ на введение аллергена из состава которого не были удалены низкомолекулярные и высокомолекулярные примеси, пример 21. Наибольший выход белка с единицы среды был при культивировании культуры бруцелл на среде Хоттингера пример №2 за счет содержания пептидов и аминокислот, представляющих собой продукты ферментативного переваривания мяса, а также дрожжевого аутолизата.
Использование культур бруцелл разных видов особо не влияло на качество и выход аллергена с единицы объема, однако получение аллергена из культур бруцелл находящиеся в R-miH-SR форме позволяли несколько увеличить выход аллергена.
У несенсибилизированных морских свинок внутрикожное введение аллергенов, полученных в примерах 1-25 вызывало местную реакцию в виде отечности диаметром не более 3 мм. Результаты представлены в таблице 1.
Пример 29. На крупном рогатом скоте определяли специфичность и чувствительность аллергенов, полученных предлагаемым способом. В опыте использовали 6 коров сенсибилизированных культурой из штамма В. abortus 19 в дозе 80 млрд микробных клеток и 2 несенсибилизированных (коровы 7 и 8).
Крупному рогатому скоту бруцеллезные аллергены, полученные по примерам 1, 2, 15, 21, 25 и бруцеллин ВИЭВ вводили внутрикожно в среднюю треть шеи безыгольным инъектором БИ-7М в дозе 0,2 мл. Каждому животному в разные точки шейной поверхности вводили по 3 аллергена.
Учет и оценку реакции у животных на внутрикожное введение аллергена проводили через 48 часов путем осмотра и измерения толщины кожной складки на месте введения препарата в сравнении со складкой кожи с противоположной стороны шеи.
У сенсибилизированных к бруцеллезу животных на месте введения аллергена появлялась воспалительная реакция в виде плотного отека с ярко выраженным контуром и достаточной плотной консистенцией, хорошо видимая при визуальном осмотре. У здоровых животных местная аллергическая реакция визуально и при измерении кутиметром не проявлялась.
Оценку реакции проводили по схеме:
Положительная реакция - утолщение кожной складки против физиологической нормы на 10 мм и более;
Сомнительная реакция - утолщение кожной складки против физиологической нормы от 4 мм и более;
Отрицательная реакция - отсутствие каких-либо признаков на введение аллергена. Полученные данные отражены в таблице 2.
Таким образом, положительная аллергическая реакция у сенсибилизированных животных была более выражена при введении аллергенов, полученных по примерам 1 и 2 в отличие от животных контрольной группы, которым вводили Бруцеллин ВИЭВ. Сильная реакция также наблюдалась на введение аллергена, полученного по примеру 21, что свидетельствует о присутствии балластных компонентов, которые вызывали также реактогенные проявления и у не сенсибилизированных животных.
Пример 30. На овцах определяли специфичность и чувствительность аллергенов, полученных предлагаемым способом. В опыте использовали 20 овец сенсибилизированных культурой из штамма B. melitensis Rev-1 в дозе 2 млрд микробных клеток (номера с 1 по 20) и 12 не сенсибилизированных (номера 21-32).
Овцам бруцеллезные аллергены, полученные по примерам 1, 2, 15, 21, 25 и бруцеллин ВИЭВ вводили внутрикожно в подхвостовую складку безыгольным инъектором БИ - 7М в дозе 0,2 мл.
Учет и оценку реакции у животных на внутрикожное введение аллергена проводили через 48 часов путем осмотра и пальпации складки кожи на месте введения препарата.
У сенсибилизированных к бруцеллезу животных на месте введения аллергена развивалась воспалительная реакция в виде плотного тестообразного отека с ярко выраженным контуром, хорошо видимая при визуальном осмотре. У здоровых животных местная аллергическая реакция визуально и инструментально не проявлялась. Полученные данные представлены в таблице 3.
Таким образом, предлагаемый способ получения аллергена для постановки аллергической пробы позволяет получать из бруцелл разной степени диссоциации высокий выход целевого продукта, очищенного от посторонних примесей, который не вызывает синтеза специфических бруцеллезных антител, улавливаемых коммерческими диагностикумами и обладает высокой диагностической эффективностью.
Способ получения аллергена для диагностики бруцеллеза у сельскохозяйственных животных, включающий: накопление бактериальной массы культуры бруцелл, термическую инактивацию и отделение бакмассы от культуральной среды, проведение щелочного гидролиза бакмассы, отделение гидролизата от гидролизованной бакмассы, объединение фильтрата культуральной среды с гидролизатом, доведение концентрации белка в целевом продукте до рабочего значения, отличающийся тем, что накопление бактериальной массы бруцелл проводят на питательной среде, содержащей: калий фосфорнокислый однозамещенный 2,5-3,0%; натрий пировиноградокислый 1%; глюкоза 1%; натрий хлористый 0,4%; аммоний сернокислый 0,1%; глицин 0,02%; натрий лимоннокислый 0,09%; натрий сернокислый 0,01%; сернокислый магний 0,001%; азотнокислое железо 0,0001%; вода дистиллированная до 100%, до концентрации 30-40 млрд микробных клеток в мл, культивирование бруцелл проводят при 37°С в течение 4-5 суток с последующим повышением температуры до 50°С в течение суток, инактивацией микробных клеток при температуре 90°С в течение 10 минут, бакмассу после отделения от культуральной среды разделяют на две равные части, одну часть гидролизуют в 0,1% растворе соляной кислоты при концентрации 400-500 млрд микробных клеток в мл в течение 2 часов при температуре 80°С, другую в 0,1% растворе гидроокиси натрия при концентрации 400-500 млрд микробных клеток в мл в течение 2 часов при температуре 80°С, обе гидролизованные части смешивают и выдерживают в течение 4 часов после добавления диметилсульфоксида из расчета 5 мл на 100 мл гидролизата, вносят 3% хлористого натрия и в течение 12 часов при температуре +4-6°С проводят дополнительную солевую экстракцию, отделяют бакмассу от гидролизата, смешивают культуральную жидкость с гидролизатом, устанавливают рН в пределах 7,2-7,4, методом ультрафильтрации удаляют низкомолекулярные примеси с молекулярной массой менее 10 кДа и высокомолекулярные выше 100 кДа доводят содержание белков в целевом продукте до конечной концентрации 200-300 мкг/мл.
