Полипептиды для лечения заболеваний
Владельцы патента RU 2792848:
НЕОПЕП ФАРМА ГМБХ ЭНД КО. КГ (DE)
Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, в частности к новым пептидам для лечения рака. Изобретение раскрывает пептид, эффективный в блокировании CXC-хемокинового рецептора 4 (CXCR4). Изобретение может быть использовано в медицинской практике для контроля пролиферации раковых клеток при лечении злокачественных новообразований и ассоциированных с ними заболеваний. 3 н. и 6 з.п. ф-лы, 2 табл., 1 пр.
Настоящее изобретение относится к полипептидам, в частности, к их терапевтическому применению, а также к способу получения пептидов согласно настоящему изобретению.
Уровень техники
Когда клетки движутся, растут и дифференцируются в организме, в процесс вовлекаются так называемые хемокины (аттрактанты). Они воздействуют на клетки через хемокиновые рецепторы на их поверхности. Один из этих рецепторов, CXC хемокиновый рецептор 4 (CXCR4), активирует быстрый рост раковых клеток и миграцию, образуя метастазы по всему организму, преимущественно в легких, костях и печени. Большинство видов рака становятся более агрессивными посредством рецептора хемокина, если рецептор активирован.
Данный CXCR4 - это G-белково-связанный рецептор (GPCR) с фактором-1, полученным из стромальных клеток (SDF-1 или CXCL12), в качестве единственного опубликованного лиганда. CXCR4 участвует в многочисленных процессах развития и физиологии, включая хоуминг стволовых клеток (Mohle and Drost, 2012) и миграцию иммунных клеток (Campbell et al., 2003). Ось CXCR4-CXCL12 также играет роль во врожденной и адаптивной иммунологии, а также в различных болезненных процессах, таких как метастазирование раковых клеток, миграция лейкозных клеток, ревматоидный артрит и фиброз легких. (Nagasawa et al., 1996; Zou et al., 1998; Tachibana et al. 1998; Furze et al., 2008). Антропогенные антагонисты CXCR4 способны мобилизовать гематопоэтические стволовые клетки (HSCs), которые используются для восстановления иммунной системы после трансплантации или химиотерапии (Ratajczak and Kim, 2012; Schroeder and DiPersio, 2012). Кроме того, CXCR4 также является основным ко-рецептором для проникновения ВИЧ 1 типа в клетки-мишени (Feng et al., 1996; Bleul et al., 1996). Ко-рецепторное применение CXCR4 является высокоэффективным, и высокая доля CD4+ Т-клеток экспрессируют этот GPCR в лимфатических тканях in vivo (внутри организма). Тем не менее, почти все варианты ВИЧ 1 типа, использующие С-С хемокиновый рецептор 5 типа (CCR5), передаются и обнаруживаются при хронической инфекции ВИЧ 1 типа (Alkhatib et al., 1996; Deng et al., 1996; Dragic et al., 1996). Было высказано предположение, что множество факторов способствуют неэффективной передаче CXCR4-тропных (X4) штаммов ВИЧ 1 типа (Margolis and Shattock, 2006). Однако механизм(ы), лежащий(ие) в основе эффективного контроля Х4 ВИЧ 1 типа у иммунокомпетентных людей, остаются недостаточно изученными.
Исследования CXCR4-антагонистов в последнее время представляет огромную область для разработок из-за многообразия показателей. В частности, попытки найти стратегию вмешательства в пролиферацию, дифференцировку и метастазирование раковых клеток еще не были столь успешными в клинических исследованиях, как ожидалось. Разработка одной из групп соединений, а именно, AMD3100 A CXCR4-антагонистов (соединение бициклама: Hendrix and Flexner 2000), вынуждены были прекратить для длительных видов лечения вследствие токсичных побочных эффектов. Хотя AMD3100 зарегистрирован для однократного короткого применения при мобилизации стволовых клеток, тем не менее рудность заключается в поиске соответствующих антагонистов для направленного действия на CXCR4.
Terjee, S. et al. недавно был сделан обзор в Adv Cancer Res.2014; 124: 31-82 о роли CXCR4 в развитии рака.
WO 2009/004054 A2 раскрывает пептид, имеющий аминокислотную последовательность Z1-LVRYTKKVPQVSTPTL-Z2 (ALB-408) и его биологически активные агенты и/или варианты и/или производные, особенно амидированные, ацетилированные, сульфатированные, фосфорилированные и/или гликозилированные производные, и пептиды, полученные путем многократного синтеза, которые обладают биологической активностью ALB408-423; где Z представляет число от 0 до 10 аминокислотных остатков.
WO 2014/198834 A1 раскрывает пептиды, в частности димеры, эффективные в блокировании CXC-хемокинового рецептора 4 (CXCR4), опосредованного ВИЧ тип 1 NL4-3 (X4-tropic) инфекцией со значением IC50 менее 50 мкм.
Целью данного изобретения является получение пептидов, которые ингибируют пролиферацию раковых клеток, метастазирование и проявляют типы рака, на которые направлены различные аналоги, а также реакцию противовоспалительных аллергических реакций.
Другой целью данного изобретения является получение соединения, которое способно влиять на пролиферацию раковых клеток.
Следующей целью настоящего изобретения является получение соединения, которое способно влиять на миграцию или хоуминг раковых клеток.
Еще одной целью данного изобретения является получение соединения, которое способно влиять на образование метастазов.
Другой целью настоящего изобретения является получение соединения, способного лечить высоко агрессивные опухоли таким образом, что рак ингибируется в значительной степени или переходит в хроническую стадию заболевания.
Еще одной целью данного изобретения является получение соединения, способного регулировать и лечить различные заболевания, такие как иммунные и аллергические заболевания, рост тканей и регуляцию нервной системы.
Краткое описание изобретения
Задачи изобретения решаются с помощью любого из полипептидов согласно настоящему изобретению. Полипептиды согласно изобретению обладают большим терапевтическим эффектом.
Полипептид согласно изобретению содержит общую аминокислотную последовательность (записанную в виде однобуквенного кода):
Z1 I X2 R W X5 X6 K X8 P X10 X11 S Z3,
где
X2 = V, M или L, в частности, L,
X5 = S или T,
X6 = K или R, в частности, R,
X8 = V, M, L или F, в частности, M,
X10 = Q или C, в частности, C и
X11 = V, M или F, в частности, V;
Z1 = 0, Z2, или <E, где Z2 = 0 или представляет собой модификацию N-концевого атома азота пептидной цепи, причем указанная модификация образует вместе с аминогруппой N-концевой аминокислоты пептида фрагмент, имеющий структуру -NR2R3, где R2 и/или R3 являются независимо друг от друга Н или замещенной или незамещенной ацильной, алкильной, арильной, аралкильной, циклоалкильной и гетероциклоалкильной группами;
Z3 = 0, or Z4, где
Z4 = 0 или является модификацией C-концевой карбоксильной группы пептидной цепи, которая вместе с карбоксильной группой C-концевой аминокислоты пептида образует фрагмент, имеющий структуру-C (O) - O-R1 или C (O)-NR2R3, где R1 представляет собой замещенную или незамещенную алкильную, арильную, аралкильную, циклоалкильную и гетероциклоалкильную группы; и
при этом употребляемые в дальнейшем сокращения имеют следующее значение:
Cap = капроновая кислота (C6 карбоновая кислота), Aca = аминокапроновая кислота, <E = пироглютамат, Val = валерная кислота (C5 карбоновая кислота) и Sul = сульфоновые аминокислоты.
В одном из вариантов осуществления изобретения пептид согласно изобретению включает по меньшей мере одну из следующих аминокислотных последовательностей:
IVRWSKKVPQVS, IMRWSRKMPCVS, ILRWSRKLPCVS, ILRWSRKMPCVS, ILRWTRKMPCVS, ILRWSRKMPCMS, ILRWSRKFPCVS, ILRWSRKMPCFS, ILRWSRKMPQFS, и IVRWSKKMPQVS.
Согласно изобретению один или несколько аминокислотных остатков в последовательности могут быть заменены, удалены или добавлены, или могут быть введены химические модификации на отдельных аминокислотах указанного полипептида, которые приводят к улучшенной биологической или фармакологической активности немодифицированного полипептида по изобретению. Специалистам в данной области техники известны соответствующие способы модификации.
Кроме того, по меньшей мере одна боковая цепь аминокислоты указанного полипептида может быть химически модифицирована, в частности фосфорилирована, амидирована, ацетилирована, гликозилирована, пегилирована, гезилирована или модифицирована комбинацией указанных способов.
Выбор подходящей функциональной группы для производного ПЭГ основан на типе доступных реакционноспособных групп на молекуле, которая будет присоединена к ПЭГ. Для белков типичные реакционноспособные аминокислоты включают лизин, цистеин, гистидин, аргинин, аспарагиновую кислоту, глутаминовую кислоту, серин, треонин, тирозин. N-концевая аминогруппа и С-концевая карбоновая кислота также могут быть использованы в качестве специфического соединения путем конъюгации с альдегидными функциональными полимерами.
Полипептид согласно изобретению может содержать по меньшей мере одну D-аминокислоту. В частности, полипептид изобретения может состоять из цепи D-аминокислот в ретроинверсной конфигурации цепи полипептида согласно изобретению.
Другим объектом настоящего изобретения является лекарственное средство, содержащее по меньшей мере один полипептид согласно изобретению и фармацевтически приемлемый носитель. В одном из простейших вариантов полипептид согласно изобретению можно вводить в воде для инфузии, физиологическом растворе или буферных водных растворах. Также возможны другие составы, например, инкапсулирование в липосомы, образующие наночастицы различных размеров, например, от 20 до 2000 нм.
Обычно пептид согласно изобретению вводят в количествах от 10 до 1000 мг/кг массы тела в течение периода времени, достаточного для остановки роста опухоли. Время введения составляет от двух до десяти недель. Лекарственное средство согласно изобретению предпочтительно подходит для перорального, внутривенного, внутримышечного, внутрикожного, подкожного, интратекального введения или представлено в виде аэрозоля, пригодного для транспульмонального и интраназального введения, в частности инкапсулированного в липосомы; или для применения в водной или липосомальной упаковке.
Объектом настоящего изобретения является также полинуклеотид, кодирующий полипептид согласно изобретению и/или его фрагменты, варианты, производные и аналоги. Полинуклеотид согласно изобретению может состоять из ДНК, РНК, геномной ДНК или ПНК. Кроме того, полинуклеотид, гибридизующийся с полинуклеотидом согласно изобретению, который кодирует полипептид согласно изобретения, также является объектом данного изобретения.
Другим объектом настоящего изобретения является также вектор, содержащий полинуклеотид согласно изобретению, а также генетически сконструированная клетка-хозяин, содержащая вектор согласно изобретению.
Еще одним объектом изобретения является антитело, направленное по меньшей мере против одного полипептида согласно изобретению.
Еще одним объектом настоящего изобретения является соединение антагониста/ингибитора, направленное против полипептида согласно изобретению.
Объектом изобретения является также пептид по изобретению для применения в лечении неврологических заболеваний, в частности инсульта, болезни Паркинсона, болезни Альцгеймера, рассеянного склероза; в области иммунологии, в частности для лечения WHIm-синдрома, волчанки и ревматоидного артрита; в области онкологии, в частности, для лечения рака, именно рака, демонстрирующего CRCX-рецептор, такого как рак печени, поджелудочной железы, простаты или молочной железы; для лечения отсутствия мобилизации, пролиферации и миграции стволовых клеток, активации Т-клеток, а также поддержания иммунобластов, таких как CTL/PD-1; при лечении ран, вызванных ожогом; для лечения антифиброза; лечение или профилактика рубцов; для лечения кардиологических нарушений, в частности, сердечной недостаточности; для лечения нарушений обмена веществ, в частности, диабета; для лечения вирусных заболеваний, в частности инфекций ВИЧ 1 типа, ВИЧ 2 типа, цитомегаловируса, вируса простого герпеса (типа 1 и 2), вируса ветряной оспы, вируса гепатита A и вируса гепатита B, вируса гриппа, вируса полиомиелита, вируса Рино, вируса краснухи, вируса кори, вируса бешенства, вируса саркомы Роуз, вируса Эпштейна-Барра; а также для лечения инфекций, вызванных бактериями и грибками, в частности Pseudomonas, Candida, S. aureus; для лечения инфекционных процессов, аномальных инфекционных процессов; лечение нарушений роста, нейрональных заболеваний, нарушений каскада свертывания крови и кроветворения, сосудистых заболеваний, заболеваний иммунной системы, а также для улучшения заживления ран и костей, легочных заболеваний и аллергии.
Другим способом получения полипептида согласно изобретению является твердофазный синтез в соответствии с синтезом Меррифилда или жидкофазный синтез методами, известными специалисту с использованием защищенных аминокислот, и его очистка.
Еще один способ получения полипептида в соответствии с изобретением может включать методы гетерологичной экспрессии, известные специалисту, с использованием общепринятых биотехнологических векторов, и при необходимости последующую посттрансляционную или химическую модификацию.
Объектом настоящего изобретения является диагностический агент, содержащий поли - или моноклональные антитела согласно изобретению или содержащий нуклеиновую кислоту или мРНК, кодирующую полипептид согласно изобретению.
Еще одним объектом изобретения является диагностическое средство, содержащее полипептид согласно изобретению или полинуклеотид согласно изобретению для тест-систем с целью определения уровней этого вещества в ткани, плазме, моче и спинномозговой жидкости, диагностические средства и тест-системы, обнаруживающие полипептид согласно изобретению для определения уровней этого вещества в плазме, моче и спинномозговой жидкости масс-спектрометрическими методами, такими как MALDI-MS или ESI-MS, в сочетании с пробоподготовкой методом RP-HPLC, осаждения белка и/или твердофазной экстракции. Предпочтительно методы масс-спектрометрии используются для обнаружения мельчайшего количества молекул в диапазоне Фемто-или Атто-молярных величин.
Также предметом изобретения является диагностическое средство, содержащее полипептид согласно изобретению в качестве маркеров вирусных заболеваний, бактериальных и грибковых инфекций, воспалительных и неопластических процессов,а также в качестве маркеров воспалительных процессов, нарушенных воспалительных реакций, опухолевых заболеваний, нарушений роста, заболеваний иммунной системы, WHIm-синдрома, красной волчанки и в качестве маркеров заболеваний костей и др.
Изобретение далее описано более подробно с использованием пептида IVRWSKKVPQVS (Seq. ID No 1) и ILRWSRKMPQFS (Seq. ID No 9) в качестве типичного представителя пептида согласно изобретению.
ПРИМЕРЫ
Пептиды
Пептиды Seq ID No 1 и Seq ID No 9 и их различные производные синтезировали обычным твердофазным синтезом на пептидном синтезаторе 9050 (прикладные биосистемы) с использованием химического соединения Fmoc. Пептид очищали путем RP хроматографии, и его идентичность и чистоту определяли с помощью аналитической RP-HPLC и MALDI-MS и LC-ESI-MS.
Анализ инвазии раковых клеток
Анализ инвазии раковых клеток проводили на гуманизированных крысах (Eyol, E. et al., Oncology Reports, 28:2177-2187, 2012). Имплантировали клетки карциномы поджелудочной железы. Успешный имплантат наблюдался при люминесцентном старении, а также при увеличении экспрессии CXCR4.
После успешной имплантации клеток карциномы крыс обрабатывали пептидом в соответствии с Seq ID No. 1 и Seq. ID No. 9 соответственно. Результаты через 1 неделю терапии (1 Вт терапии), через 2 недели терапии (2 Вт терапии) и через 2 недели после окончания терапии представлены в нижеприведенных таблицах.
Результаты для пептида Seq ID No. 1
| Количество пептида | 1 вт терапии | 2 вт терапии | 2 вт после окончания терапии |
| 0 мг (контроль) | Рост опухоли | Рост опухоли | Рост опухоли |
| 10 мг | Отсутствие роста опухоли | Рост опухоли | Рост опухоли |
| 20 мг | Отсутствие роста опухоли | Полная ремиссия | Полная ремиссия |
| 70 мг | Отсутствие роста опухоли | Ремиссия | Полная ремиссия |
| 7 мг | Рост опухоли (мало) | Отсутствие роста опухоли | Рост опухоли (мало) |
| 70 мг | Рост опухоли (мало) | Рост опухоли (мало) | Рост опухоли (мало) |
| 70 мг | Частичная ремиссия | ||
| 70 мг | Частичная ремиссия | ||
| 35 мг | Частичная ремиссия | ||
| 35 мг | Полная ремиссия |
Результаты для пептида Seq ID No. 9
| Количество пептида | 1 вт терапии | 2 вт терапии | 2 вт после окончания терапии |
| 0 мг (контроль) | Рост опухоли | Рост опухоли | Рост опухоли |
| 35 мг | Рост опухоли (мало) | Ремиссия (мало) | Рост опухоли |
| 70 мг | Рост опухоли | Частичная ремиссия | Рост опухоли |
| 35 мг | Полная ремиссия | ||
| 35 мг | Полная ремиссия | ||
| 70 мг | Частичная ремиссия | ||
| 70 мг | Частичная ремиссия |
Крысы без терапии умерли после имплантации опухоли в течение нескольких дней.
Крысы, получавшие терапию с использованием пептидов согласно настоящему изобретению, выживали не менее двух недель. Рост опухоли был остановлен, и в зависимости от концентрации наблюдалась частичная или даже полная ремиссия опухоли. Токсического действия пептидов не наблюдалось.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> Neopep Pharma GmbH & Co. KG
<120> Полипептиды для Лечения Заболеваний
<130> 182081WO
<150> EP17190152.3
<151> 2017-09-08
<150> EP17205238.3
<151> 2017-12-04
<160> 10
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 12
<212> Белок
<213> Человек
<400> 1
Ile Val Arg Trp Ser Lys Lys Val Pro Gln Val Ser
1 5 10
<210> 2
<211> 12
<212> Белок
<213> Человек
<400> 2
Ile Met Arg Trp Ser Arg Lys Met Pro Cys Val Ser
1 5 10
<210> 3
<211> 12
<212> Белок
<213> Человек
<400> 3
Ile Leu Arg Trp Ser Arg Lys Leu Pro Cys Val Ser
1 5 10
<210> 4
<211> 12
<212> Белок
<213> Человек
<400> 4
Ile Leu Arg Trp Ser Arg Lys Met Pro Cys Val Ser
1 5 10
<210> 5
<211> 12
<212> Белок
<213> Человек
<400> 5
Ile Leu Arg Trp Thr Arg Lys Met Pro Cys Val Ser
1 5 10
<210> 6
<211> 12
<212> Белок
<213> Человек
<400> 6
Ile Leu Arg Trp Ser Arg Lys Met Pro Cys Met Ser
1 5 10
<210> 7
<211> 12
<212> Белок
<213> Человек
<400> 7
Ile Leu Arg Trp Ser Arg Lys Phe Pro Cys Val Ser
1 5 10
<210> 8
<211> 12
<212> Белок
<213> Человек
<400> 8
Ile Leu Arg Trp Ser Arg Lys Met Pro Cys Phe Ser
1 5 10
<210> 9
<211> 12
<212> Белок
<213> Человек
<400> 9
Ile Leu Arg Trp Ser Arg Lys Met Pro Gln Phe Ser
1 5 10
<210> 10
<211> 12
<212> Белок
<213> Человек
<400> 10
Ile Val Arg Trp Ser Lys Lys Met Pro Gln Val Ser
1 5 10
<---
1. Полипептид для лечения рака, имеющий общую аминокислотную последовательность, написанную однобуквенным кодом
Z1 I X2 R W X5 X6 K X8 P Q X11 S Z3,
где:
X2 = V, M или L, в частности L,
X5 = S или T,
X6 = K или R, в частности R,
X8 = V, M, L или F, в частности M,
X11 = V, M или F, в частности V;
Z1 выбран из 0 (отсутствует), Z2 или пироглутамата, где Z2 представляет собой модификацию N-концевого атома азота пептидной цепи, причем указанная модификация образует вместе с аминогруппой N-концевой аминокислоты пептида фрагмент, имеющий структуру -NR2R3, где R2 и/или R3 являются независимо друг от друга Н или замещенной или незамещенной ацильной, алкильной, арильной, аралкильной, циклоалкильной или гетероциклоалкильной группой;
Z3 выбран из 0 (отсутствует) или Z4, где
Z4 представляет собой модификацию C-концевой карбоксильной группы пептидной цепи, которая образует вместе с карбоксильной группой C-концевой аминокислоты пептида фрагмент, имеющий структуру -C(O)-O-R1 или -C(O)-NR2R3, где R1 представляет собой замещенную или незамещенную алкильную, арильную, аралкильную, циклоалкильную или гетероциклоалкильную группу; и R2, и R3 определены, как указано выше.
2. Полипептид по п. 1, выбранный из группы, состоящей из полипептидов, имеющих или состоящих из аминокислотной последовательности IVRWSKKVPQVS,
ILRWSRKMPQFS и IVRWSKKMPQVS, в частности IVRWSKKVPQVS.
3. Полипептид по п. 1 или 2, в котором один или несколько аминокислотных остатков в последовательности были заменены, удалены или добавлены, или были введены химические модификации на одиночных аминокислотах указанного полипептида, которые приводят к улучшению биологической или фармакологической активности немодифицированного полипептида по п. 1 или 2.
4. Полипептид по любому из пп. 1-3, где по меньшей мере одна боковая цепь аминокислоты указанного полипептида химически модифицирована, в частности фосфорилирована, амидирована, ацетилирована, гликозилирована, пегилирована, гезилирована или модифицирована путем их комбинации.
5. Полипептид по любому из пп. 1-4, где полипептид содержит по меньшей мере одну D-аминокислоту.
6. Полипептид по п. 5, где цепь аминокислот указанного полипептида представляет собой ретроинверсную цепь полипептида по любому из пп. 1-4.
7. Лекарственное средство для лечения рака, содержащее эффективное количество по меньшей мере одного полипептида по любому из пп. 1-6 и фармацевтически приемлемый носитель.
8. Лекарственное средство по п. 7, подходящее для перорального, внутривенного, внутримышечного, внутрикожного, подкожного, интратекального введения или в форме аэрозоля, подходящего для транспульмонального введения, в частности инкапсулированное в липосомы; или для использования в водной или липосомной упаковке.
9. Способ получения полипептида по любому из пп. 1-6 методами гетерологичной экспрессии с использованием биотехнологических векторов и при необходимости последующей посттрансляционной или химической модификации.
