Изоксазол в качестве агонистов fxr-рецептора

Изобретение относится к новым изоксазолам формулы (I) или его фармацевтически приемлемым солям, обладающим агонистической активностью в отношении фарнезоидного рецептора FXR. В указанной формуле R₁ и R₂ независимо выбраны из группы, включающей H, галоген и CF₃, при условии, что R₁ и R₂ не являются H одновременно; R₃ представляет собой C₁-C₃алкил; n представляет собой целое число, выбранное из 1, 2 и 3; R₄ выбран из группы, включающей фенил, незамещенный или замещенный одним R₅, и бифенил, незамещенный или замещенный одним R₅; R₅ выбран из группы, включающей COOR₆, CN, гидрокси-C₁-C₃алкил, C₁-C₃алкил-O-фенил, незамещенный или замещенный одним R₇, и C₁-C₃алкил-O-бифенил, незамещенный или замещенный одним R₇; R₆ выбран из группы, включающей H и C₁-C₃алкил, а R₇ выбран из группы, включающей COOR₆, CN и гидрокси-C₁-C₃алкил; при условии, что соединение не является 4-((3-(2,6-дихлорфенил)-5-изопропилизоксазол-4-ил)метокси)бензойной кислотой. Изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей изоксазол формулы (I), и его применению в качестве лекарственного средства для профилактики и/или лечения FXR-зависимых заболеваний. 3 н. и 6 з.п. ф-лы, 1 табл., 6 пр.

(I)

 

Перекрестная ссылка на родственные заявки

Настоящая патентная заявка претендует на приоритет на основании патентной заявки Италии №102018000007265, поданной 17 июля 2018 года, полное раскрытие которой включено в настоящий документ путем ссылки.

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к производным изоксазола и к их применению, в частности, в лечении и/или профилактике FXR-опосредованных заболеваний.

Предпосылки создания изобретения

Фарнезоидный Х-рецептор (FXR, также известный как BAR (рецептор желчных кислот), NR1H4) представляет собой лиганд-зависимый фактор транскрипции и относится к суперсемейству ядерных гормональных рецепторов.

Экспрессируемый на высоком уровне в кишечно-печеночных тканях (печень и кишечник) FXR регулирует гомеостаз желчных кислот, липопротеинов, метаболизм глюкозы, регенерацию печени и нарушения работы сердечно-сосудистой системы (Мангельсдорф, Д. Дж., и др. Cell 1995, 83; 835; Форман, Б. М., и др. Cell 1995, 81, 687; Макисима, М., и др. Science 1999, 284, 1362; Парке, Д. Дж., и др. Science 1999, 284, 1365; Ван, X., и др. Mol. Cell 1999, 3, 543; Койперс, Ф., и др. Rev. Endocr. Metab. Disord. 2004, 5,319; Чжан, и др. Proc. Natl. Acad. Sci. США 2006, 103, 1006; Мацубара, Т., и др. Mol. Cell. Endocrinol. 2013, 368, 17; Клодель, Т., и др. Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 2005, 25, 2020). Специфические желчные кислоты связывают и активируют FXR, причем наиболее высокоактивной из них является хенодезоксихолевая кислота (CDCA), которая представляет собой эндогенный лиганд FXR и первичную желчную кислоту, находящуюся в желчи человека.

В последние годы появились сообщения о различных высокоактивных и селективных агонистах FXR, относящихся к классам стероидных и нестероидных химических веществ, таких как 6-ECDCA, GW4064 и фексарамин. Однако в результате проведения расширенных клинических исследований выявлены некоторые побочные эффекты, выраженные в диерегуляции в липидах сыворотки крови, наблюдаемые у пациентов с диабетом и стеатозом печени (Фиоруччи С, и др. Expert Opin. Ther. Targets 2014, 18, 1449-59).

В контексте нестероидного лиганда, GW4064 представляет собой этап в области агонистов FXR изоксазольного типа.

Действительно, GW4064 показал ограниченное кишечное всасывание (<10%) у крыс после перорального введения, демонстрируя короткий период полувыведения в конечной фазе. Кроме того, π-электронная система, широко делокализованная во фрагменте молекулы стильбена, ответственна за его неустойчивость к УФ-излучению, поэтому GW4064 потенциально токсичен для клеток. Раскрытие изобретения

Целью настоящего изобретения является идентификация новых соединений, действующих как агонисты FXR, с улучшенными фармакокинетическими свойствами по сравнению с GW4064.

Указанная цель достигается посредством настоящего изобретения применительно к селективным агонистам FXR, содержащим химический каркас изоксазола по пункту 1, к фармацевтической композиции по пункту 5, к применению по пунктам 6 и 7 формулы изобретения. Предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения изложены в зависимых пунктах формулы изобретения.

Наилучший вариант осуществления изобретения

Нижеследующие абзацы содержат определения различных химических фрагментов соединений по настоящему изобретению и предназначены для единообразного применения во всем описании и в формуле изобретения, если иное недвусмысленным образом изложенное определение не содержит более широкое определение. Термин «алкил», в контексте настоящего документа, относится к насыщенным алифатическим углеводородным группам. Этот термин включает нормальные (неразветвленные) цепи или разветвленные цепи.

Неограничивающими примерами алкильных групп по настоящему изобретению являются, например, метил, этил, пропил, изопропил, н-бутил, изо-бутил, трет-бутил, н-пентил, изопентил, н-гексил и тому подобные.

Термин «алкил», в контексте настоящего документа, относится к алкильной группе, которая сцеплена с остальной частью соединения посредством атома кислорода.

Термин «галоген», в контексте настоящего документа, относится к фтору, хлору, брому и йоду.

Если не указано иное, термин «замещенный», в контексте настоящего документа, означает, что, по меньшей мере, один атом водорода вышеуказанных групп заменен другим неводородным атомом или функциональной группой, при условии, что нормальная валентность сохраняется, и что замещение приводит к стабильному соединению.

Термин «фармацевтически приемлемые соли» относится к солям указанных ниже соединений Формулы (I), которые сохраняют желаемую биологическую активность и признаны регуляторными органами.

В контексте настоящего документа, термин «соль» относится к любой соли соединения по настоящему изобретению, полученной из неорганического или органического основания. Обычно, такие соли имеют физиологически приемлемый катион.

Кроме того, соединения Формулы (I) могут образовывать соль с основанием, и эти соли включены в настоящее изобретение, поскольку они являются фармацевтически приемлемыми солями.

Соединения Формулы (I), содержащие протоны кислоты, могут быть превращены в их терапевтически активные, нетоксичные формы солей присоединения оснований, например, солей металлов или аминов, посредством обработки соответствующими органическими и неорганическими основаниями.

Физиологически или фармацевтически приемлемые соли особенно подходят для медицинского применения из-за их большей растворимости в воде по сравнению с исходным соединением.

Фармацевтически приемлемые соли также могут быть получены из других солей, включая другие фармацевтически приемлемые соли соединений Формулы (I), с использованием обычных способов.

Специалистам в области органической химии будет понятно, что многие органические соединения могут образовывать комплексы с растворителями, в которых они вступают в реакцию, или из которых они осаждаются, или кристаллизуются. Эти комплексы известны как «сольваты». Например, комплекс с водой известен как «гидрат». Сольваты соединений по настоящему изобретению входят в объем настоящего изобретения. Соединения Формулы (I) могут быть легко выделены в сочетании с молекулами растворителя посредством кристаллизации или выпаривания подходящего растворителя с получением соответствующих сольватов.

Соединения Формулы (I) могут быть в кристаллической форме. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения, кристаллические формы соединений Формулы (I) представляют собой полиморфы.

Объект настоящего изобретения также включает меченые изотопами соединения, которые идентичны соединениям, приведенным в Формуле (I) и далее, но отличаются тем, что, по меньшей мере, один атом заменен атомом, имеющим атомную массу или массовое число, отличное от атомной массы или массового числа, обычно встречающегося в природе. Примеры изотопов, которые могут быть включены в соединения по настоящему изобретению и их фармацевтически приемлемые соли, включают изотопы водорода, углерода, азота, кислорода, такие как ²Н, ³Н, ¹¹С, ¹³С, ¹⁴С, ¹⁵N, ¹⁷O, ¹⁸O.

Соединения по настоящему изобретению и фармацевтически приемлемые соли указанных соединений, содержащие вышеупомянутые изотопы и/или другие изотопы других атомов, входят в объем настоящего изобретения. Меченые изотопами соединения по настоящему изобретению, например, соединения, в которые включены радиоактивные изотопы, такие как ³Н, ¹⁴С, подходят для проведения анализов распределения в тканях лекарственного средства и/или субстрата. Изотопы, насыщенные тритием, то есть, ³Н, и углерод-14, то есть, ¹⁴С, особенно предпочтительны из-за простоты их получения и определения. Изотоп ¹¹С особенно подходит для ПЭТ (позитронно-эмиссионной томографии). Кроме того, замещение более тяжелыми изотопами, такими как дейтерий, то есть, ²Н, может дать определенные преимущества в плане терапии, обусловленные большей метаболической стабильностью, например, увеличенный период полувыведения в условиях in vivo или сниженные требования к дозировке, и, следовательно, может быть предпочтительным при некоторых обстоятельствах. Меченые изотопами соединения Формулы (I) по настоящему изобретению обычно можно получить, выполняя процедуры, раскрытые в Схемах и/или в Примерах ниже, посредством замены немеченого изотопами реагента на легкодоступный меченый изотопами реагент.

Некоторые группы/заместители, включенные в настоящее изобретение, могут присутствовать в виде изомеров. Соответственно, в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, соединения Формулы (I) могут иметь аксиальную асимметрию и, соответственно, они могут существовать в форме оптических изомеров, таких как (R)-форма, (S)-форма и тому подобные. В объем настоящего изобретения включены все такие изомеры, включая рацематы, энантиомеры и их смеси.

В частности, в объем настоящего изобретения включены все стереоизомерные формы, включая энантиомеры, диастереоизомеры и их смеси, включая рацематы, и общая ссылка на соединения Формулы (I) включает все стереоизомерные формы, если не указано иное.

В общем, соединения или соли по настоящему изобретению следует интерпретировать как исключающие те соединения (если таковые имеются), которые являются настолько химически нестабильными, как сами по себе, так и в воде, что они явно не подходят для фармацевтического применения при всех путях введения, будь то перорально, парентерально или иным путем. Такие соединения известны специалисту в области химии.

Согласно первому аспекту настоящего изобретения, предложены соединения Формулы (I):

или их фармацевтически приемлемые соли и сольваты.

В соединениях Формулы (I):

R₁ и R₂ независимо выбраны из группы, состоящей из Н, галогена и CF₃, при условии, что R₁ и R₂ не являются Н одновременно;

R₃ выбран из группы, состоящей из C₁-С₃алкила и галоген-C₁-С₃алкила; 11 представляет собой целое число, выбранное из 1, 2 и 3;

R₄ выбран из группы, состоящей из фенила, незамещенного или замещенного одним R₅, и бифенила, незамещенного или замещенного одним R₅;

R₅ выбран из группы, состоящей из COOR₆, CN, гидрокси-C₁-С₃алкила, SO₂CH₃, CF₃, C₁-С₃алкил-О-фенила, незамещенного или замещенного одним R₇, и C₁-С₃алкил-О-бифенила, незамещенного или замещенного одним R₇;

R₆ выбран из группы, состоящей из Н и C₁-С₃алкила, а

R₇ выбран из группы, состоящей из COOR₆, CN, гидрокси-C₁-С₃алкила, SO₂CH₃ и CF₃;

при условии, что соединение не является 4-((3-(2,6-дихлорфенил)-5-изопропилизоксазол-4-ил)метокси)бензойной кислотой.

Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения, R4 выбран из группы, состоящей из

при этом, R₅ является таким, как определено выше.

Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения, R₅ выбран из группы, состоящей из СООН, СООСН₃, CN, -СН₂ОН, SO₂CH₃,

при этом, R₇ является таким, как определено выше.

Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения, n представляет собой 1.

Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения, R₁ и R₂ независимо выбраны из группы, состоящей из Н, О и CF₃, а в предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, R₁ и R₂ представляют собой хлор.

Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения, R₃ выбран из группы, состоящей из метила, этила, пропила, изопропила и CF₃.

Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения, R₇ выбран из группы, состоящей из СООН, СООСН₃, CN, СН₂ОН, SO₂CH₃ и CF₃.

Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения, соединение Формулы (I) выбрано из группы, состоящей из:

Второй аспект настоящего изобретения относится к фармацевтической композиции, содержащей соединение Формулы (I), как раскрыто выше, включающее 4-((3-(2,6-дихлорфенил)-5-изопропилизоксазол-4-ил)метокси)бензойную кислоту, и, по меньшей мере, один фармацевтически приемлемый наполнитель.

Специалисту в данной области техники известен целый ряд таких соединений-наполнителей, подходящих для составления фармацевтической композиции.

Соединения по настоящему изобретению вместе с обычно используемым наполнителем могут быть помещены в форму фармацевтических композиций и их однократных дозировок, и в такой форме могут использоваться в виде твердых веществ, таких как таблетки или наполненные капсулы, или жидкостей, таких как растворы, суспензии, эмульсии, эликсиры или капсулы, наполненные ими, все предназначенные для перорального применения, или в форме стерильных растворов для инъекций для парентерального введения (включая подкожное и внутривенное применение).

Такие фармацевтические композиции и их единичные дозированные формы могут содержать ингредиенты в обычных пропорциях, с дополнительными активными соединениями или веществами, или без них, и такие единичные дозированные формы могут содержать любое подходящее эффективное количество активного ингредиента, соизмеримое с предполагаемым диапазоном суточной дозировки, которую надлежит использовать.

Фармацевтические композиции, содержащие соединение по настоящему изобретению, могут быть получены способом, хорошо известным в фармацевтической области, и содержат, по меньшей мере, одно активное соединение. Обычно, соединения по настоящему изобретению вводят в фармацевтически эффективном количестве. Количество фактически введенного соединения, как правило, будет определять лечащий врач с учетом соответствующих обстоятельств, включая заболевание, подлежащее лечению, выбранный путь введения, фактическое введенное соединение, возраст, вес и реакцию конкретного пациента, тяжесть симптомов пациента и тому подобное.

Фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут вводиться различными путями, включая пероральный, ректальный, подкожный, внутривенный, внутримышечный, интраназальный и ингаляционный пути. Композиции для перорального применения могут принимать форму нерасфасованных жидких растворов или суспензий, или нерасфасованных порошков. Однако чаще всего композиции представлены в единичных дозированных формах, что способствует обеспечению точного дозирования. Термин «единичные дозированные формы» относится к физически дискретным единицам, подходящим в качестве стандартных дозировок для людей и других млекопитающих, причем каждая единица содержит предопределенное количество активного вещества, рассчитанное на получение желаемого терапевтического эффекта, в сочетании с подходящим фармацевтическим наполнителем. Типичные единичные дозированные формы включают предварительно наполненные жидкими композициями, содержащие предварительно отмеренную дозу ампулы или шприцы, или пилюли, таблетки, капсулы, или тому подобное, если композиции представлены в твердой форме.

Жидкие формы, подходящие для перорального введения, могут включать подходящее водное или неводное вспомогательное транспортное вещество с буферами, суспендирующими и дозируемыми агентами, красителями, ароматизаторами и тому подобным. Твердые формы могут включать, например, любой из следующих ингредиентов или соединений аналогичной природы: связующее вещество, такое как микрокристаллическая целлюлоза, трагакантовая камедь или желатин; наполнитель, такой как крахмал или лактоза, распадающееся вещество, такое как альгиновая кислота, примогель или кукурузный крахмал; лубрикант, такой как стеарат магния; глидант, такой как коллоидный диоксид кремния; подсластитель, такой как сахароза или сахарин; или ароматизирующее вещество, такое как мята перечная, метилсалицилат или апельсиновый ароматизатор.

Композиции для инъекций обычно основаны на стерильном физиологическом растворе для инъекций или на фосфатно-солевом буфере, или на других носителях для инъекций, известных в данной области техники.

Фармацевтические композиции могут быть в форме таблеток, пилюль, капсул, растворов, суспензий, эмульсий, порошков, суппозиториев и в виде составов с замедленным высвобождением.

При желании, таблетки могут быть покрыты оболочкой, нанесенной с использованием стандартных водных или неводных методов. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, такие композиции и препараты могут содержать, по меньшей мере, 0,1 процента активного соединения. Конечно, процентное содержание активного соединения в этих композициях может варьироваться, и оно вполне может находиться в диапазоне от, примерно, 1 процента до, примерно, 60 процентов от массы единицы. Количество активного соединения в таких терапевтически подходящих композициях таково, что будет получена терапевтически активная дозировка. Активные соединения также могут вводиться интраназально в виде, например, жидких капель или спрея.

Таблетки, пилюли, капсулы и тому подобное могут также содержать связующее вещество, такое как трагакантовая камедь, аравийская камедь, кукурузный крахмал или желатин; наполнители, такие как фосфат кальция; распадающееся вещество, такое как кукурузный крахмал, картофельный крахмал, альгиновая кислота; лубрикант, такой как стеарат магния; и подсластитель, такой как сахароза, лактоза или сахарин. Когда единичная дозированная форма представляет собой капсулу, она может содержать, в дополнение к веществам вышеуказанного типа, жидкий носитель, такой как жирное масло. Различные другие вещества могут присутствовать в качестве оболочек или изменять физическую форму единицы дозирования. Например, таблетки могут быть покрыты оболочкой из шеллака, сахара или из того, и другого. Сироп или эликсир может содержать, помимо активного ингредиента, сахарозу в качестве подсластителя, метилпарабен и пропилпарабен в качестве консервантов, краситель и ароматизирующее вещество, такое как вишневый или апельсиновый ароматизатор. Чтобы предотвратить расщепление во время прохождения через верхнюю часть желудочно-кишечного тракта, композиция должна быть покрыта оболочкой из энтеросолюбильного состава.

Композиции для введения ингаляционным путем включают, но этим не ограничиваются, сухие порошковые композиции, состоящие из порошка соединения Формулы (I) или его соли и порошка подходящего носителя, и/или лубриканта. Композиции для введения ингаляционным путем можно вдыхать из любого подходящего устройства для ингаляции сухого порошка, известного специалисту в данной области техники.

Введение композиций осуществляется по протоколу и в дозировке, достаточной для уменьшения воспаления и боли у пациента. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, в фармацевтических композициях по настоящему изобретению активное вещество или активные вещества обычно включены в единицы дозирования. Единица дозирования может содержать от 0,1 до 1000 мг соединения Формулы (I) на единицу дозирования для ежедневного введения.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, количество, эффективное для конкретного состава, будет зависеть от тяжести заболевания или расстройства, от предшествующей терапии, состояния здоровья индивидуума и реакции на лекарственное средство. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, доза находится в диапазоне от 0,001% по массе до, примерно, 60% по массе состава.

При применении в комбинации с, по меньшей мере, одним другим активным ингредиентом, соединение по настоящему изобретению и другой активный ингредиент могут применяться в более низких дозах, чем при применении каждого из них по отдельности.

Что касается составов в плане разнообразия путей введения, то способы и составы для введения лекарственных средств раскрыты в источниках Remington's Pharmaceutical Science, 17-е издание, Дженнаро, и др., изд. Mack Publishing Co., 1985, и Remington's Pharmaceutical Sciences, Дженнаро АР, под ред., 20-е издание, 2000, Williams & Wilkins Пенсильвания, США, и Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21-е издание, изд. Lippincott Williams & Wilkins, 2005; и в источнике Лойд В. Аллен и Ховард С.Ансел, Фармацевтические дозированные формы и системы доставки лекарственных средств по методу Ансела, 10-е издание, изд. Lippincott Williams & Wilkins, 2014.

Вышеописанные компоненты для вводимых перорально или инъекционных композиций являются просто репрезентативными.

Соединения по настоящему изобретению также могут вводиться в формах с замедленным высвобождением или из систем доставки лекарственных средств с замедленным высвобождением.

Третий аспект настоящего изобретения относится к соединению Формулы (I), как раскрыто выше, включающему 4-((3-(2,6-дихлорфенил)-5-изопропилизоксазол-4-ил)метокси)бензойную кислоту, для применения в качестве медицинского препарата.

Соединение Формулы (I), как раскрыто выше, включающее 4-((3-(2,6-дихлорфенил)-5-изопропилизоксазол-4-ил)метокси)бензойную кислоту, может

применяться в профилактике и/или лечении заболевания, выбранного из группы, состоящей из нарушений со стороны желудочно-кишечного тракта, заболеваний печени, нарушений работы сердечно-сосудистой системы, сосудистых заболеваний, легочных заболеваний, патологий метаболических процессов, инфекционных заболеваний, рака, нарушений функции почек, воспалительных заболеваний, включая иммунно-опосредованные, и неврологических расстройств.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения, иммунно-опосредованные воспалительные заболевания включают аутоиммунные заболевания, такие как системная красная волчанка, ревматоидный артрит, синдром Шегрена, склеродермия, также известная как системный склероз, спондилоартрит, васкулит, саркоидоз, средиземноморская лихорадка и другие наследственные аутовоспалительные заболевания, полимиозит и дерматомиозит, синдром Бехчета.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения, инфекционные заболевания выбраны из группы синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИД) и связанных с ним расстройств, инфекций, вызванных вирусами В и С.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения, неврологические расстройства включают болезнь Альцгеймера и другие формы деменции, болезнь Паркинсона и другие двигательные расстройства, боковой амиотрофический склероз и другие нарушения двигательных нейронов, рассеянный склероз и другие демиелинизирующие заболевания, ишемический инсульт, миастению и мышечную дистрофию.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения, заболевания печени включают первичный билиарный цирроз (ПБЦ), церебротендинный ксантоматоз (ЦТК), первичный склерозирующий холангит (ПСХ), лекарственный холестаз, внутрипеченочный холестаз беременных, холестаз, связанный с парентеральным питанием, избыточный бактериальный рост или сепсис-ассоциированный холестаз, аутоиммунный гепатит, хронический вирусный гепатит, алкогольную болезнь печени, неалкогольную жировую болезнь печени (НАЖБП), неалкогольный стеатогепатит (НАСГ), трансплантацию печени, врожденный фиброз печени, гранулематозное поражение печени, внутри- или внепеченочные злокачественные новообразования, болезнь Вильсона, гемохроматоз и дефицит альфа-1-антитрипсина.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения, нарушения со стороны желудочно-кишечного тракта включают воспалительные заболевания кишечника (ВЗК) (включая болезнь Крона, язвенный колит и неопределенный колит), синдром раздраженного кишечника (СРК), избыточный бактериальный рост, острый и хронический панкреатит, мальабсорбцию, постлучевой колит и микроскопический колит.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения, нарушения функции почек включают диабетическую нефропатию, гипертензивную нефропатию, хронический гломерулонефрит, включая хронический гломерулонефрит после трансплантации, хронические интерстициальные заболевания канальцев и сосудистые заболевания почек.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения, сердечно-сосудистые заболевания включают атеросклероз, артериосклероз, дислипидемию, гиперхолестеринемию, гипертриглицеридемию, гипертензию, также известную как артериальная гипертензия, воспалительные заболевания сердца, включая миокардит и эндокардит, ишемическую болезнь сердца, стабильную стенокардию, нестабильную стенокардию, инфаркт миокарда, сердечно-сосудистые заболевания, включая ишемический инсульт.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения, сосудистые заболевания включают легочно-сердечную недостаточность, такую как легочная гипертензия, болезнь периферических артерий (БПА), также известную как периферическое сосудистое заболевание (ПСЗ), окклюзионную болезнь периферических артерий и периферическую облитерирующую артериопатию.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения, легочные заболевания включают астму, муковисцидоз, обструктивные легочные заболевания, интерстициальное легочное заболевание, включая, но этим не ограничиваясь, первичный или вторичный легочный фиброз.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения, метаболическое заболевание выбрано из группы заболеваний, содержащей инсулинорезистентность, метаболический синдром, диабет I типа и II типа, гипогликемию, заболевания коры надпочечников, включая недостаточность коры надпочечников. Метаболические заболевания также включают ожирение и заболевания, связанные с бариатрической хирургией.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения, рак выбран из группы, содержащей рак печени, разные виды рака желчных протоков, рак пищевода, рак поджелудочной железы, рак желудка, рак толстой и прямой кишки, рак груди, рак яичников и заболевание, связанное с резистентностью к химиотерапии.

Соединения Формулы (I), которые могут применяться в качестве медицинского препарата и для профилактики, и/или лечения вышеперечисленных заболеваний, выбраны из группы, состоящей из

Дальнейшие характеристики настоящего изобретения будут вытекать из следующего описания некоторых исключительно иллюстративных и не ограничивающих примеров.

В прилагаемых примерах используются следующие сокращения.

Метиленхлорид (CH₂Cl₂), гидроксиламин гидрохлорид (NH₂OH), метиловый спирт (МеОН), карбонат калия (K₂CO₃), сульфат натрия (Na₂SO₄), N,N-Диизопропилэтиламин (DIPEA), диметилформамид (DMF), (2-(1Н-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилурония гексафторфосфат (HBTU), бромид лития (LiBr), бикарбонат натрия (NaHCO₃), трифторуксусная кислота (TFA), тетрагидрофуран (THF), гидроксид лития (LiOH), соляная кислота (HCl), этилацетат (EtOAc), азот (N₂), вода (H₂O), час (h), комнатная температура (rt), время удерживания (t_R).

Если не указано иное, спектры ¹Н ЯМР записывали на приборе Varian Inova 400 МГц с использованием CDCl₃ в качестве растворителя, а спектры ¹³С ЯМР записывали на приборе Varian Inova 100 МГц с использованием CDCl₃ в качестве растворителя. Примеры

ПРИМЕР 1. ПОЛУЧЕНИЕ BAR2101-2105, BAR2110-2113, BAR2116, BAR2118-2120

Спирт 1 получали по многоэтапной процедуре, включающей образование оксима альдегида, хлорирование, образование изоксазола, опосредованного β-кетоэфиром, и восстановление эфира, опосредованного диизобутилалюминийгидридом, как описано ранее (Чиприани, С, и др. Sci. Rep.2017, 7, 41055). Затем ключевой промежуточный первичный спирт 1 использовали в многочисленных реакциях Мицунобу с различными фенолами (Схема 1) для получения BAR2101-BAR2103, BAR2110, BAR2113, BAR2116 и BAR2118 с высокорезультативными химическими выходами.

В результате восстановления LiBH₄ и щелочного гидролиза на метиловых эфирах BAR2102 и BAR2110 получали соответствующие спирты BAR2104 (95% выход) и BAR2112 (количественный выход), и карбоновые кислоты BAR2105 (количественный выход), и BAR2111 (89% выход), соответственно.

В результате реакции Мицунобу, проведенной на спирте 1 с метил-4'-гидрокси-[1,1'-бифенил]-3-карбоксилатом, образовался ограниченный метиловый эфир BAR2118 с выходом 68%. Восстановление и гидролиз в тех же экспериментальных условиях, что описаны выше, дали соответствующие спирт BAR2120 и карбоновую кислоту BAR2119 (83% и 64% химического выхода, соответственно).

Схема 1

a) PPh₃, DIAD, THF сухой, 0°С; b) LiBH₄, МеОН сухой, THF сухой, 0°С; с) NaOH, МеОН : H₂O 1:1 об/об. Общие процедуры

Этап а) Реакция Мицунобу. К раствору PPh₃ (3,5 экв.) в сухом THF при 0°С добавляли по каплям DIAD (3,5 экв). Суспензию перемешивали встряхиванием в течение 10 мин, затем добавляли раствор соединения 1 в сухом THF. Через 10 мин добавляли раствор соответствующего фенолав сухом THF. Через 3 часа, ночью, добавляли воду (10 мл), и реакционную смесь выпаривали. Затем остаток экстрагировали посредством EtOAc (3×50 мл). Комбинированные органические слои промывали раствором КОН 2,5 М и воды, сушили и выпаривали до получения желтого масла. Очистка методом флэш-хроматографии на силикагеле дала BAR2101-2103, BAR2110, BAR2113, BAR2116, BAR2118.

Этап b) Восстановление LiBH₄. К раствору эфиров BAR2102, или BAR2110, или BAR2118 в сухом THF (25 мл) при 0°С добавляли сухой метиловый спирт (3,0 экв.) и LiBH₄ (3,0 экв.). Полученную смесь перемешивали встряхиванием в течение 4-8 часов при 0°С, затем гасили добавлением 1М NaOH (2,0 экв.) и этилацетата. Органическую фазу промывали водой, сушили (Na₂SO₄) и концентрировали с получением неочищенного остатка, который очищали методом ВЭЖХ или колоночной хроматографии на силикагеле.

Этап с) Щелочной гидролиз. Другую часть BAR2102, или BAR2110, или BAR2118 подвергали гидролизу посредством NaOH (5,0 экв.) в растворе МеОН : H₂O 1:1 об/об (30 мл). Смесь перемешивали в течение 8 часов с обратным холодильником. Полученный раствор затем подкисляли HCl 6М и экстрагировали этилацетатом (3×50 мл). Собранные органические фазы промывали рассолом, сушили над безводным Na₂SO₄ и выпаривали при пониженном давлении с получением сложного неочищенного остатка, который подвергали очистке методом ВЭЖХ или флэш-хроматографии.

Пример 1А. Получение 3-(2,6-дихлорфенил)-5-изопропил-4-(феноксиметил)изоксазола (BAR2101)

Очистка силикагелем (гексан и 0,5% TEA) после этапа а дала BAR2101 (40%). Аналитический образец был получен методом ВЭЖХ с фазой Nucleodur 100-5 С18 (5 мкм; 4,6 мм внутр. диам. × 250 мм), используя MeOH/H₂O (82:18) в качестве элюента (скорость потока 1 мл/мин) (t_R = 10 мин). BAR2101 C₁₉H₁₇Cl₂NO₂

¹Н ЯМР (CDCl₃, 400 МГц): δ 7,39 (2Н, d, J=7,7 Гц), 7,31 (1H, t, J=7,7 Гц), 7,22 (2Н, t, J=7.8 Гц), 6,93 (1H, t, J=7,8 Гц), 6,78 (2Н, d, J=7,8 Гц), 4,72 (2Н, s), 3,33 (1H, септет, J=6.9 Гц), 1.41 (6Н, d, J=6,9 Гц);

¹³С ЯМР (CDCl₃, 100 МГц) δ 176,3, 159,1, 158,9, 135,8 (2С), 131,2, 129,4 (2С), 128,0 (ЗС), 121,2, 114,7 (2С), 109,4, 59,2, 27,0, 20,8 (2С).

Пример 2А. Получение метил 4-((3-(2,6-дихлорфенил)-5-изопропилизоксазол-4-ил)метокси)бензоата (BAR2102)

Очистка силикагелем (9:1 гексан/AcOEt и 0,5% TEA) после этапа а дала BAR2102 (82%). Аналитический образец был получен методом ВЭЖХ с фазой Nucleodur 100-5 С18 (5 мкм; 4,6 мм внутр. диам. × 250 мм), используя MeOH/H₂O (82:18) в качестве элюента (скорость потока 1 мл/мин) (t_R = 12 мин). BAR2102 C₂₁H₁₉Cl₂NO₄

¹Н ЯМР (CDCl₃, 400 МГц): δ 7,91 (2H, d, J=8,2 Гц), 7,39 (2H, d, J=7,6 Гц), 7,31 (1H, t, J=7,6 Гц), 6,78 (2H, d, J=8,2 Гц), 4,77 (2H, s), 3,86 (3H, s), 3,32 (1H, септет, J=6,7 Гц), 1,42 (6H, d, J=6,7 Гц);

¹³C ЯМР (CDCl₃, 100 МГц): δ 176,5, 166,7, 161,8, 159,0, 135,7 (2C), 131,5, 131,3 (2C), 128,1 (2C), 127,7, 123,0, 114,1 (2C), 108,8, 59,5, 51,9, 27,1, 20,8 (2C).

Пример 3А. Получение 4-((3-(2,6-дихлорфенил)-5-изопропилизоксазол-4-ил)метокси)бензонитрила (BAR2103)

Очистка силикагелем (9:1 гексан/AcOEt и 0,5% TEA) после этапа а дала BAR2103 (89%). Аналитический образец был получен методом ВЭЖХ с фазой Nucleodur 100-5 С18 (5 мкм; 4,6 мм внутр. диам. × 250 мм), используя МеОН/H₂O (82:18) в качестве элюента (скорость потока 1 мл/мин) (t_R = 7,4 мин). BAR2103 C20H16Cl2N2O2

¹Н ЯМР (CDCl₃, 400 МГц): δ 7,52 (2Н, d, J=8,5 Гц), 7,40 (2Н, d, J=7,0 Гц), 7,33 (1H, t, J=7,0 Гц), 6,81 (2Н, d, J=8,5 Гц), 4,77 (2Н, s), 3,31 (1H, септет, J=6,8 Гц), 1,42 (6Н, d, J=6,8 Гц);

¹³С ЯМР (CDCl₃, 100 МГц): δ 176,61, 161,3, 158,9, 135,7 (2С), 133,9 (2С), 131,4, 128,1 (2С), 127,5, 118,9, 115,2 (2С), 108,5, 104,5, 59,5, 27,1, 20,8 (2С).

Пример 4А. Получение 4-((3-(2,6-дихлорфенил)-5-изопропилизоксазол-4-ил)метокси)фенил)метанола (BAR2104)

Очистка силикагелем (100% CH₂Cl₂) после этапа b дала BAR2104 (95%). Аналитический образец был получен методом ВЭЖХ с фазой Nucleodur 100-5 С18 (5 мкм; 4,6 мм внутр. диам. × 250 мм), используя МеОН/H₂O (70:30) в качестве элюента (скорость потока 1 мл/мин) (t_R = 13 мин). BAR2104 C₂₀H₁₉Cl₂NO₃

1H ЯМР (CDCl₃, 400 МГц): δ 7,39 (2Н, d, J=7,2 Гц), 7,32 (1H, t, J=7,2 Гц), 7,22 (2Н, d, J=7,3 Гц), 6,76 (2Н, d, J=7,3 Гц), 4,71 (2Н, s), 4,58 (2Н, s), 3,32 (1H, септет, J=6,6 Гц), 1,41 (6Н, d, J=6,6 Гц);

¹³С ЯМР (CDCl₃, 100 МГц): δ 176,3, 159,1, 157,8, 135,8 (2С), 133,7, 131,2, 128,5 (2С), 128,1 (2С), 127,8, 114,8 (2С), 109,4, 64,9, 59,4, 27,1, 20,7 (2С).

Пример 5А

Получение 4-((3-(2,6-дихлорфенил)-5-изопропилизоксазол-4-ил)метокси)бензойной кислоты (BAR2105). Очистка силикагелем (100% CH₂Cl₂) после этапа с дала BAR2105 (количественный выход). Аналитический образец был получен методом ВЭЖХ с фазой Nucleodur 100-5 С18 (5 мкм; 4,6 мм внутр. диам. × 250 мм), используя МеОН/Н₂О (75:25) в качестве элюента (скорость потока 1 мл/мин) (t_R = 9,2 мин).

BAR2105 C20H17CI2NO4

1H ЯМР (CDCl₃, 400 МГц): δ 7,94 (2H, d, J=6,5 Гц), 7,37 (2H, d, J=7,0 Гц), 7,29 (1H, t, J=7,0 Гц), 6,77 (2H, d, J=6,5 Гц), 4,77 (2H, s), 3,31 (1H, септет, J=6,4 Гц), 1,41 (6H, d, J=6,4 Гц);

¹³C ЯМР (CDCl₃, 100 МГц): δ 177,4, 162,4, 162,3, 158,9, 135,7 (2C), 132,2 (2C), 131,3, 128,0 (2C), 127,7, 123,0, 114,2 (2C), 108,8, 59,4, 27,1, 20,8 (2C).

Пример 6A. Получение 3-(2,6-дихлорфенил)-5-изопропил-4-((4-(метилсульфонил)фенокси)метил)изоксазола (BAR2116)

Очистка силикагелем (100% CH₂Cl₂) после этапа а дала BAR2116 (67%). Аналитический образец был получен методом ВЭЖХ с фазой Nucleodur 100-5 С18 (5 мкм; 4,6 мм внутр. диам. × 250 мм), используя МеОН/H₂O (75:25) в качестве элюента (скорость потока 1 мл/мин) (t_R = 13,5 мин).

BAR2116 C₂₀H₁₉Cl₂NO₄S

¹Н ЯМР (CDCl₃, 400 МГц): δ 7,79 (2Н, d, J=8,5 Гц), 7,40 (2Н, d, J=7,8 Гц), 7,32 (1H, t, J=7,8 Гц), 6,88 (2Н, d, J=8,5 Гц), 4,80 (2Н, s), 3,32 (1Н, септет, J=6,9 Гц), 3,0 (3Н, s), 1,43 (6Н, d, J=6,9 Гц);

¹³С ЯМР (CDCl₃, 100 МГц): δ 176,6, 162,1, 158,9, 135,7 (2С), 132,8, 131,48, 129,5 (2С), 128,1 (2С), 127,5, 114,9 (2С), 108,5, 59,7, 44,2, 27,1, 20,8 (2С).

Пример 7А. Получение метил 3-((3-(2,6-дихлорфенил)-5-изопропилизоксазол-4-ил)метокси)бензоата (BAR2110)

Очистка силикагелем (8:2 гексан/AcOEt и 0,5% TEA) после этапа а дала BAR2110 (57%). Аналитический образец был получен методом ВЭЖХ с фазой Nucleodur 100-5 С18 (5 мкм; 4,6 мм внутр. диам. × 250 мм), используя МеОН/H₂O (82:18) в качестве элюента (скорость потока 1 мл/мин) (t_R = 16,5 мин).

BAR2110 C₂₁H₁₉Cl₂NO₄

¹Н ЯМР (CDCl₃, 400 МГц): δ 7,60 (1H, d, J=7,8 Гц), 7,43 (1H, s), 7,38 (2Н, d, J=7,7 Гц), 7,32-7,25 (2Н, m, ovl), 6,94 (1H, d, J=8,3 Гц), 4,77 (2Н, s), 3,89 (3Н, s), 3,33 (1Н, септет, J=6,9 Гц), 1,42 (6Н, d, J=6,9 Гц);

¹³С ЯМР (CDCl₃, 100 МГц): δ 176,4, 166,7, 159,1, 158,1, 135,7 (2С), 131,4, 131,2, 129,4, 128,1 (2С), 127,8, 122,5, 120,3, 114,6, 109,1, 59,5, 52,1, 27,1, 20,8 (2С).

Пример 8А. Получение 3-((3-(2,6-дихлорфенил)-5-изопропилизоксазол-4-ил)метокси)бензонитрила (BAR2113)

Очистка силикагелем (9:1 гексан/AcOEt и 0,5% TEA) после этапа а дала BAR2113 (73%). Аналитический образец был получен методом ВЭЖХ с фазой Nucleodur 100-5 С18 (5 мкм; 4,6 мм внутр. диам. × 250 мм), используя МеОН/H₂O (82:18) в качестве элюента (скорость потока 1 мл/мин) (t_R = 11,4 мин).

BAR2113 C₂₀H₁₆Cl₂N₂O₂

¹H ЯМР (CDCl₃, 400 МГц): δ 7,40 (1H, s), 7,39 (2Н, d, J=7,8 Гц), 7,33 (1H, dd, ovl), 7,31 (1H, t, ovl), 7,21 (1H, d, J=7,7 Гц), 6,99 (1H, d, J=8,0 Гц), 4,75 (2H, s), 3,31 (1H, септет, J=6,8 Гц), 1,41 (6H, d, J=6,8 Гц);

¹³C ЯМР (CDCl₃, 100 МГц): δ 176,6, 158,9, 158,1, 135,7 (2C), 131,4, 130,4, 128,1 (2C), 127,6, 125,0, 120,0, 118,4, 117,5, 113,2, 108,6, 59,6, 27,1, 20,8 (2C).

Пример 9A. Получение 3-((3-(2,6-дихлорфенил)-5-изопропилизоксазол-4-ил)метокси)фенил)метанола (BAR2112)

Очистка после этапа b методом ВЭЖХ с фазой Nucleodur 100-5 С18 (5 мкм; 4,6 мм внутр. диам. × 250 мм), используя МеОН/H₂O (75:25) в качестве элюента (скорость потока 1 мл/мин) (t_R = 18 мин), дала BAR2112 (количественный выход).

BAR2112 C₂₀H₁₉Cl₂NO₃

¹H ЯМР (CDCl₃, 400 МГц): δ 7,39 (2Н, d, J=7,5 Гц), 7,30 (1H, t, J=7,5 Гц), 7,19 (1H, t, J=7,8 Гц), 6,90 (1H, d, J=7,8 Гц), 6,80 (1H, s), 6,70 (1H, d, J=7,8 Гц), 4,73 (2Н, s), 4,61 (2Н, d, J=4,1 Гц), 3,33 (1H, септет, J=6,9 Гц), 1,41 (6Н, d, J=6,9 Гц);

¹³С ЯМР (CDCl₃, 100 МГц): δ 176,5, 159,0, 158,5, 142,5, 135,8 (2С), 131,2, 129,5, 128,1 (2С), 127,8, 119,6, 114,1, 112,8, 109,4, 65,0, 59,2, 27,1, 20,8 (2С).

Пример 10А. Получение 3-((3-(2,6-дихлорфенил)-5-изопропилизоксазол-4-ил)метокси)бензойной кислоты (BAR2111)

Очистка после этапа с методом ВЭЖХ с фазой Nucleodur 100-5 С18 (5 мкм; 4,6 мм внутр. диам. × 250 мм), используя МеОН/Н₂О (75:25) в качестве элюента (скорость потока 1 мл/мин) (t_R = 22,5 мин), дала BAR2111 (89%).

BAR2111 C₂₀H₁₇Cl₂NO₄

¹H ЯМР (CDCl₃, 400 МГц): δ 7,65 (1H, d, J=7,0 Гц), 7,47 (1H, s), 7,37 (2Н, d, J=7,5 Гц), 7,31-7,25 (2Н, m, ovl), 6,97 (1H, d, J=7,8 Гц), 4,77 (2Н, s), 3,32 (1Н, септет, J=7,1 Гц), 1,41 (6Н, d, J=7,1 Гц);

¹³С ЯМР (CDCl₃, 100 МГц): δ 176,41, 159,7, 159,1, 158,2, 135,7 (2С), 131,3, 129,5 (2С), 128,0 (2С), 127,6, 123,2, 121,0, 115,2, 109,1, 59,5, 27,1, 20,8 (2С).

Пример 11А. Получение метил 4'-((3-(2,6-дихлорфенил)-5-изопропилизоксазол-4-ил)метокси)-[1,1'-бифенил]-3-карбоксилата (BAR2118)

Очистка силикагелем (100% CH2CI2) после этапа а дала BAR2118 (68%). Аналитический образец был получен методом ВЭЖХ с фазой Nucleodur 100-5 С18 (5 мкм; 4,6 мм внутр. диам. × 250 мм), используя МеОН/Н₂О (90:10) в качестве элюента (скорость потока 1 мл/мин) (t_R = 9,9 мин).

BAR2118 C₂₇H₂₃Cl₂NO₄

¹H ЯМР (CDCl₃, 400 МГц): δ 8,20 (1H, s), 7,98 (1H, d, J=7,7 Гц), 7,71 (1H, d, J=7,7 Гц), 7,49 (2Н, d, J=8,5 Гц), 7,48 (1H, t, J=7,7 Гц), 7,42 (2H, d, J=8,0 Гц), 7,33 (1H, dd, J=7,1, 8,0 Гц), 6,87 (2H, d, J=8,5 Гц), 4,78 (2H, s), 3,95 (3H, s), 3,36 (1H, септет, J=7,1 Гц), 1,44 (6H, d, J=7,1 Гц);

¹³C ЯМР (CDCl₃, 100 МГц): δ 176,4, 167,1, 159,1, 158,1, 140,8, 135,8 (2C), 133,2, 131,2, 131,0, 130,6, 128,8, 127,8, 127,7, 128,1 (4C), 126,8, 115,1 (2C), 109,3, 59,4, 52,1, 27,1, 20,8 (2C).

Пример 12A. Получение (4'-((3-(2,6-дихлорфенил)-5-изопропилизоксазол-4-ил)метокси)-[1,1'-бифенил]-3-ил)метанола (BAR2120)

Очистка силикагелем (9:1 гексан/AcOEt и 0,5% TEA) после этапа b дала BAR2120 (83%). Аналитический образец был получен методом ВЭЖХ с фазой Nucleodur 100-5 С18 (5 мкм; 4,6 мм внутр. диам. × 250 мм), используя МеОН/H₂O (83:17) в качестве элюента (скорость потока 1 мл/мин) (t_R = 8,5 мин).

BAR2120 C₂₆H₂₃Cl₂NO₃

¹H ЯМР (CD3OD, 400 МГц): δ 7,53 (1H, s), 7,52 (2Н, d, J=7,5 Гц), 7,47 (1H, t ovl), 7,46 (2Н, d, J=8,8 Гц), 7,43 (1H, d, J=7,8 Гц), 7,36 (1H, t, J=7,8 Гц), 7,27 (1H, d, J=7,8 Гц), 6,84 (2Н, d, J=8,8 Гц), 4,84 (2Н, s), 4,64 (2Н, s), 3,43 (1H, септет, J=6,7 Гц), 1,42 (6Н, d, J=6,7 Гц);

¹³С ЯМР (CDCl₃, 100 МГц): δ 176,4, 157,8, 154,1, 141,4, 137,4, 135,8 (2С), 134,0, 131,2, 129,0, 128,1 (4С), 126,0, 125,4, 125,3, 122,8, 115,1 (2С), 109,3, 65,4, 59,4, 27,0, 20,8 (2С).

Пример 13А. Получение 4'-((3-(2,6-дихлорфенил)-5-изопропилизоксазол-4-ил)метокси)-[1,1'-бифенил]-3-карбоновой кислоты (BAR2119)

Очистка силикагелем (99:1 CH₂Cl₂/МеОН) после этапа с дала BAR2119 (64%). Аналитический образец был получен методом ВЭЖХ с фазой Nucleodur 100-5 С18 (5 мкм; 4,6 мм внутр. диам. × 250 мм), используя МеОН/H₂O (83:17) в качестве элюента (скорость потока 1 мл/мин) (t_R = 12,5 мин).

BAR2119 C₂₆H₂₁Cl₂NO₄

¹H ЯМР (CDCl₃, 400 МГц): δ 8,27 (1H, s), 8,04 (1H, d, J=8,0 Гц), 7,76 (1H, d, J=7,7 Гц), 7,51 (2Н, d, J=8,2 Гц), 7,50 (1H, t, J=8,0 Гц), 7,42 (2Н, d, J=7,6 Гц), 7,33 (1H, t, J=7,6 Гц), 6,87 (2Н, d, J=8,2 Гц), 4,78 (2Н, s), 3,36 (1H, септет, J=7,1 Гц), 1,44 (6Н, d, J=7,1 Гц);

¹³С ЯМР (CDCl₃, 100 МГц): δ 176,4, 164,9, 160,6, 158,1, 140,8, 135,8 (2С), 133,1, 132,1, 131,5, 131,2, 128,8, 128,3, 128,1 (4С), 127,8, 127,7, 115,1 (2С), 109,3, 59,4, 27,1, 20,8 (2С).

ПРИМЕР 2. ПОЛУЧЕНИЕ BAR2106-2109, BAR2121-2124, BAR2139, BAR2140 И BAR2147

BAR2104, полученный по Схеме 1, алкилировали шестью различными фенолами посредством реакции Мицунобу с получением BAR2106, BAR2107, BAR2121, BAR2122, BAR2138 и BAR2144. В результате восстановления LiBH₄ и щелочного гидролиза на метиловых эфирах BAR2106, BAR2122, BAR2138 и BAR2144, образовались соответствующие спирты BAR2108, BAR2124, BAR2140, BAR2146 и кислоты BAR2109, BAR2123, BAR2139 и BAR2147, соответственно (Схема 2).

Схема 2

а) PPh₃, DIAD, THF сухой, 0°С; b) LiBH₄, МеОН сухой, THF сухой, 0°С; с) NaOH, МеОН : H₂O 1:1 об/об.

ПРИМЕР 2А. Получение метил 4-((4-((3-(2,6-дихлорфенил)-5-изопропилизоксазол-4-ил)метокси)бензил)окси)бензоата (BAR2106)

Очистка силикагелем (100% CH₂Cl₂) после этапа а дала BAR2106 (63%). Аналитический образец BAR2106 был получен методом ВЭЖХ с фазой Phenomenex С18 (5 мкм; 4,6 мм внутр. диам. × 250 мм), используя МеОН/H₂O (85:15) в качестве элюента (скорость потока 1 мл/мин) (t_R = 10,4 мин). BAR2106 C28H25CI2NO5

¹H ЯМР (CDCl₃, 400 МГц): δ 7,98 (2Н, d, J=8,0 Гц), 7,40 (2Н, d, J=7,7 Гц), 7,33-7,26 (3Н, m, ovl), 6,96 (2Н, d, J=8,0 Гц), 6,79 (2Н, d, J=7,7 Гц), 5,00 (2Н, s), 4,72 (2Н, s), 3,88 (3Н, s), 3,32 (1H, септет, J=6,9 Гц), 1,41 (6Н, d, J=6,9 Гц);

¹³С ЯМР (CDCl₃, 100 МГц): δ 176,4, 166,8, 162,4, 159,1, 158,2, 135,7 (2С), 131,5, 131,2 (2С), 129,2 (2С), 128,8, 128,1 (2С), 127,3, 122,7, 114,9 (2С), 114,4 (2С), 109,3, 69,7, 59,4, 51,8, 27,1, 20,7 (2С).

ПРИМЕР 2В. Получение 4-((4-((3-(2,6-дихлорфенил)-5-изопропилизоксазол-4-ил)метокси)бензил)окси)бензонитрила (BAR2107)

Очистка силикагелем (7:3 гексан/AcOEt и 0,5% TEA) после этапа а дала BAR2107 (количественный выход). Аналитический образец был получен методом ВЭЖХ с фазой Phenomenex С18 5 мкм (4,6 мм внутр. диам. × 250 мм), используя МеОН/H₂O (87:13) в качестве элюента (скорость потока 1 мл/мин) (t_R = 8 мин).

BAR2107 C₂₇H₂₂Cl₂N₂O₃

¹H ЯМР (CDCl₃, 400 МГц): δ 7,58 (2Н, d, J=8,5 Гц), 7,40 (2Н, d, J=8,0 Гц), 7,32 (1H, t, J=8,4 Гц), 7,27 (2Н, d, J=8,4 Гц), 6,98 (2Н, d, J=8,5 Гц), 6,80 (2Н, d, J=8,0 Гц), 5,00 (2Н, s), 4,73 (2Н, s), 3,32 (1H, септет, J=6,9 Гц), 1,42 (6Н, d, J=6,9 Гц);

¹³С ЯМР (CDCl₃, 100 МГц): δ 176,1, 161,7, 158,8, 158,1, 135,5 (2С), 133,7 (2С), 131,1, 129,0 (2С), 128,1, 127,8 (2С), 127,5, 118,9, 115,3 (2С), 114,7 (2С), 109,1, 103,8, 69,7, 59,2, 26,8, 20,5 (2С),

ПРИМЕР 2С. Получение (4-((4-((3-(2,6-дихлорфенил)-5-изопропилизоксазол-4-ил)метокси)бензил)окси)фенил)метанола (BAR2108)

Очистка после этапа b методом ВЭЖХ с фазой Phenomenex С18 (5 мкм, 4,6 мм внутр. диам. × 250 мм), используя МеОН/H₂O (75:25) в качестве элюента (скорость потока 1 мл/мин) (t_R = 24 мин), дала BAR2108 (количественный выход). BAR2108 C27H25CI2NO4

¹H ЯМР (CDCl₃, 400 МГц): δ 7,39 (2Н, d, J=7,9 Гц), 7,31 (1H, ovl), 7,28 (4Н, d, ovl), 6,94 (2Н, d, J=8,3 Гц), 6,80 (2Н, d, J=8,3 Гц), 4,96 (2Н, s), 4,72 (2Н, s), 4,62 (2Н, d, J=5,1 Гц), 3,33 (1H, септет, J=6,9 Гц), 1,41 (6Н, d, J=6,9 Гц);

¹³С ЯМР (CDCl₃, 100 МГц): δ 176,5, 159,3, 158,4, 158,2, 135,7 (2С), 133,7, 131,4, 129,8 (2С), 129,2 (2С), 128,8, 128,2 (2С), 128,0, 115,0 (4С), 109,5, 69,8, 64,9, 59,6, 27,3, 20,9 (2С).

ПРИМЕР 2D. Получение 4-((4-((3-(2,6-дихлорфенил)-5-изопропилизоксазол-4-ил)метокси)бензил)окси)бензойной кислоты (BAR2109)

Очистка силикагелем (7:3 гексан: AcOEt) после этапа с дала BAR2109 (93%). Аналитический образец был получен методом ВЭЖХ с фазой Nucleodur VP 100-5 Silica (5 мкм; 10 мм внутр. диам. × 250 мм), используя н-гексан/AcOEt (50:50) в качестве элюента (скорость потока 3 мл/мин) (t_R = 15 мин).

BAR2109 C₂₇H₂₃Cl₂NO₅

¹H ЯМР (CDCl₃, 400 МГц): δ 8,05 (2Н, d, J=8,6 Гц), 7,40 (2Н, d, J=7,89 Гц), 7,33-7,29 (3Н, m, ovl), 6,99 (2Н, d, J=8,6 Гц), 6,81 (2Н, d, J=8,4 Гц), 5,03 (2Н, s), 4,73 (2Н, s), 3,32 (1H, септет, J=6,9 Гц), 1,42 (6Н, d, J=6,9 Гц);

¹³С ЯМР (CDCl₃, 100 МГц): δ 176,4, 163,2, 162,4, 158,9, 158,3, 135,8 (2С), 132,3, 131,2 (2С), 129,2 (2С), 128,7, 128,1 (2С), 127,8, 121,7, 114,9 (2С), 114,5 (2С), 109,3, 69,8, 59,4, 27,1, 20,8 (2С),

ПРИМЕР 2Е. Получение метил 3-((4-((3-(2,6-дихлорфенил)-5-изопропилизоксазол-4-ил)метокси)бензил)окси)бензоата (BAR2122)

Очистка силикагелем (100% CH₂Cl₂) после этапа а дала BAR2122 (61%). Аналитический образец был получен методом ВЭЖХ с фазой Nucleodur 100-5 С18 (5 мкм; 4,6 мм внутр. диам. × 250 мм), используя MeOH/H₂O (85:15) в качестве элюента (скорость потока 1 мл/мин) (t_R = 18 мин).

BAR2122 C₂₈H₂₅Cl₂NO₅

¹H ЯМР (CDCl₃, 400 МГц): δ 7,63 (2H, d, J=7,6 Гц), 7,40 (2H, d, J=8,1 Гц), 7,33 (1H, t, J=8,1 Гц), 7,30-7,29 (3Н, m, ovl), 7,13 (1H, d, J=7,9 Гц), 6,79 (2H, d, J=8,3 Гц), 5,00 (2H, s), 4,72 (2H, s), 3,91 (3H, s), 3,32 (1H, септет, J=6,9 Гц), 1,41 (6H, d, J=6,9 Гц);

¹³C ЯМР (CDCl₃, 100 МГц): δ 176,4, 171,1, 169,3, 157,0, 152,9, 135,8 (2C), 131,2, 129,4, 129,2 (4C), 128,1 (2C), 122,2, 120,8, 120,2, 115,0, 114,8 (2C), 109,3, 69,8, 59,4, 52,2, 27,1, 20,7 (2C).

ПРИМЕР 2F. Получение 3-((4-((3-(2,6-дихлорфенил)-5-изопропилизоксазол-4-ил)метокси)бензил)окси)бензонитрила (BAR2121)

Очистка силикагелем (100% CH₂Cl₂) после этапа а дала BAR2121 (93%). Аналитический образец был получен методом ВЭЖХ с фазой Nucleodur 100-5 С18 (5 мкм; 4,6 мм внутр. диам. × 250 мм), используя МеОН/Н₂О (82:18) в качестве элюента (скорость потока 1 мл/мин) (t_R = 16 мин).

BAR2121 C₂₇H₂₂Cl₂N₂O₃

¹H ЯМР (CDCl₃, 400 МГц): δ 7,40 (2Н, d, J=7,8 Гц), 7,33 (1Н, t, J=7,8 Гц), 7,29-7,23 (4Н, m, ovl), 7,16 (2Н, ovl), 6,79 (2Н, d, J=8,5 Гц), 4,97 (2Н, s), 4,72 (2Н, s), 3,32 (1H, септет, J=7,0 Гц), 1,41 (6Н, d, J=7,0 Гц);

¹³С ЯМР (CDCl₃, 100 МГц): δ 176,4, 163,2, 159,1, 158,3, 135,7 (2С), 131,2, 130,4, 129,7, 129,1 (2С), 128,1 (2С), 124,7, 123,9, 120,5, 118,9, 118,7, 114,9, 114,8, 114,6, 109,3, 69,9, 59,4, 27,1, 20,8 (2С).

ПРИМЕР 2G. Получение (3-((4-((3-(2,6-дихлорфенил)-5-изопропилизоксазол-4-ил)метокси)бензил)окси)фенил)метанола (BAR2124)

Очистка после этапа b методом ВЭЖХ с фазой Phenomenex С18 5 мкм (4,6 мм внутр. диам. × 250 мм), используя МеОН/Н₂О (80:20) в качестве элюента (скорость потока 1 мл/мин) (t_R = 10 мин), дала BAR2124 (84%).

BAR2124 C₂₇H₂₅Cl₂NO₄

¹H ЯМР (CDCl₃, 400 МГц): δ 7,40 (2Н, d, J=7,70 Гц), 7,33 (1H, t, J=7,70 Гц), 7,28 (2Н, d, J=8,4 Гц), 7,27 (1H, dd, ovl), 6,98 (1H, s), 6,94 (1H, d, J=7,5 Гц), 6,87 (1H, d, J=8,0 Гц), 6,78 (2H, d, J=8,4 Гц), 4,96 (2H, s), 4,72 (2H, s), 4,66 (2H, br s), 3,32 (1H, септет, J=6,9 Гц), 1,41 (6H, d, J=6,9 Гц);

¹³C ЯМР (CDCl₃, 100 МГц): δ 176,3, 159,1, 158,9, 158,1, 142,5, 135,7 (2C), 131,2, 129,6, 129,0 (3C), 128,0 (2C), 123,2, 119,3, 114,8 (2C), 114,1, 113,2, 109,3, 69,6, 65,2, 59,3, 27,1,

20,8 (2C).

ПРИМЕР 2H. Получение 3-((4-((3-(2,6-дихлорфенил)-5-изопропилизоксазол-4-ил)метокси)бензил)окси)бензойной кислоты (BAR2123)

Очистка силикагелем (8:2 гексан/AcOEt) после этапа с дала BAR2123 (72%). Аналитический образец был получен методом ВЭЖХ с фазой Phenomenex С18 5 мкм (4,6 мм внутр. диам. × 250 мм), используя МеОН/H₂O (80:20) в качестве элюента (скорость потока 1 мл/мин) (t_R = 12 мин).

BAR2123 C₂₇H₂₃Cl₂NO₅

¹H ЯМР (CD3OD, 400 МГц): δ 7,58 (1H, s), 7,57 (1H, d, J=8,0 Гц), 7,49 (2Н, d, J=7,7 Гц), 7,43 (1H, dd, J=8,0, 8,4 Гц), 7,30 (1H, t, J=7,7 Гц), 7,28 (2Н, d, J=8,6 Гц), 7,10 (1H, d, J=8,4 Гц), 6,77 (2Н, d, J=8,6 Гц), 5,00 (2Н, s), 4,81 (2Н, s), 3,41 (1H, септет, J=7,1 Гц), 1,40 (6Н, d, J=7,1 Гц);

¹³С ЯМР (CDCl₃, 100 МГц): δ 176,3, 169,7, 159,1, 158,6, 158,1, 135,7 (2С), 132,0 (2С), 131,2, 129,5, 129,2, 128,4, 128,0 (2С), 122,7, 120,8, 116,1, 115,3, 114,8 (2С), 109,3, 69,7, 59,3, 27,1, 20,7 (2С).

ПРИМЕР 2I. Получение 4'-((4-((3-(2,6-дихлорфенил)-5-изопропилизоксазол-4-ил)метокси)бензил)окси)-[1,1'-бифенил]-3-карбоновой кислоты (BAR2139)

Очистка методом ВЭЖХ с фазой Nucleodur Sphinx C18 5 мкм (4,6 мм внутр. диам. × 250 мм), используя МеОН/H₂O (95:5) и 0,1% TFA в качестве элюента (скорость потока 1 мл/мин), дала BAR2139 (t_R = 5 мин).

BAR2139 C₃₃H₂₇Cl₂NO₅

¹H ЯМР (CDCl₃, 400 МГц): δ 8,27 (1Н, br s), 8,02 (1Н, d, J=7,7 Гц), 7,78 (1H, d, J=7,7 Гц), 7,56 (2H, d, J=8,2 Гц), 7,52 (1H, t, J=7,7 Гц), 7,40 (2H, d, J=7,9 Гц), 7,32 (2H, d, J=8,2 Гц), 7,30 (1H, t, J=7,9 Гц), 6,81 (2H, d, J=8,2 Гц), 5,01 (2H, s), 4,73 (2H, s), 3,33 (1H, септет, J=7,0 Гц), 1,42 (6H, d, J=7,0 Гц);

¹³C ЯМР (CDCl₃, 100 МГц): δ 176,3, 165,3, 159,1, 158,7, 158,2, 141,1, 135,8 (2C), 132,6, 131,8, 131,3, 129,5 (2C), 129,2 (2C), 128,9, 128,4 (2C), 128,2 (2C), 128,1, 127,8, 115,3 (2C), 114,9 (2C), 109,3, 69,6, 59,6, 27,0, 20,7 (2C).

ПРИМЕР 2J. Получение (4'-((4-((3-(2,6-дихлорфенил)-5-изопропилизоксазол-4-ил)метокси)бензил)окси)-[1,1'-бифенил]-3-ил)метанола (BAR2140)

Очистка методом ВЭЖХ с фазой Nucleodur Sphinx C18 5 мкм (4,6 мм внутр. диам. × 250 мм), используя МеОН/H₂O (85:15) в качестве элюента (скорость потока 1 мл/мин), дала BAR2140 (t_R = 12 мин).

BAR2140 C₃₃H₂₉Cl₂NO₄

¹H ЯМР (CDCl₃, 400 МГц): δ 7,54-7,39 (9Н, ovl), 7,27 (2Н, d, J=7,8 Гц), 7,01, (2Н, d, J=7,9 Гц), 6,76 (2Н, d, J=8,0 Гц), 4,98 (2Н, s), 4,79 (2Н, s), 4,64 (2Н, s), 3,39 (1Н, септет, J=7,0 Гц), 1,38 (6Н, d, J=7,0 Гц);

¹³С ЯМР (CDCl₃, 100 МГц): δ 176,4, 159,1, 158,4, 158,2, 141,3, 141,2, 135,8 (2С), 133,7, 131,2, 129,6, 129,2, 129,0, 128,2 (2С), 128,1 (2С), 127,8 (2С), 126,1, 125,4, 125,3, 115,1 (2С), 114,8 (2С), 109,4, 69,6, 65,3, 59,3, 27,0, 20,8 (2С),

ПРИМЕР 2K. Получение 4'-((4-((3-(2,6-дихлорфенил)-5-изопропилизоксазол-4-ил)метокси)бензил)окси)-[1,1' -бифенил] -4-карбоновой кислоты (BAR2147)

Очистка методом ВЭЖХ с фазой Nucleodur Sphinx С18 5 мкм (4,6 мм внутр. диам. × 250 мм), используя МеОН/H₂O (90:10) в качестве элюента (скорость потока 1 мл/мин) (t_R = 8 мин).

BAR2147 C₃₃H₂₇Cl₂NO₅

¹H ЯМР (CDCl₃, 400 МГц): δ 7,8 (2Н, d, J=8,6 Гц), 7,6 (2Н, d, J=8,6 Гц), 7,53 (2Н, d, J=8,5 Гц), 7,40 (2Н, d, J=7,9 Гц), 7,32 (3Н, ovl), 7,05 (2Н, d, J=8,5 Гц), 6,81 (2Н, d, J=8,2 Гц), 5,01 (2Н, s), 4,73 (2Н, s), 3,33 (1H, септет, J=7,0 Гц), 1,42 (6Н, d, J=7,0 Гц);

¹³С ЯМР (CDCl₃, 100 МГц): δ 176,3, 169,3, 159,4, 159,1, 158,2, 145,1, 135,8 (2С), 132,6 (2С), 131,7, 131,3, 129,3, 129,1 (2С), 128,4 (2С), 128,2 (2С), 127,8, 127,1 (2С), 115,4 (2С), 114,8 (2С), 109,3, 69,8, 59,4, 27,1, 20,8 (2С),

ПРИМЕР 3. ПОЛУЧЕНИЕ BAR2151, BAR2159, BAR2175, BAR2183

Начав со спирта BAR2112 и выполняя далее процедуру, описанную выше в примере 2 (схема 2), в результате алкилирования четырьмя различными фенолами посредством реакции Мицунобу и гидролиза получили карбоновые кислоты BAR2151, BAR2159, BAR2175, BAR2183.

Схема 3

a) PPh₃, DIAD, Фенолы-СООСН₃, THF сухой, 0°С; с) NaOH, МеОН : Н₂О 1:1 об/об.

ПРИМЕР 3А. Получение 4'-((3-((3-(2,6-дихлорфенил)-5-изопропилизоксазол-4-ил)метокси)бензил)окси)-[1,1' -бифенил]-3-карбоновой кислоты (BAR2151)

Очистка методом ВЭЖХ с фазой Phenomenex С18 5 мкм (4,6 мм внутр. диам. × 250 мм), используя МеОН/H₂O (80:20) в качестве элюента (скорость потока 1 мл/мин), дала BAR2151 (t_R = 11 минимум).

BAR2151 C₃₃H₂₇Cl₂NO₅

¹H ЯМР (CD3OD, 400 МГц): δ 8,27 (1H, br s), 8,02 (1H, d, J=7,8 Гц), 7,75 (1H, d, J=7,8 Гц), 7,56 (2H, d, J=8,2 Гц), 7,52 (1H, t, J=7,8 Гц), 7,40 (2H, d, J=8,0 Гц), 7,32 (1H, t, J=8,0 Гц), 7,30 (1H, t, J=7,5 Гц), 7,04 (2H, d, J=8,2 Гц), 7,00 (1H, d, J=7,5 Гц), 6,85 (1H, s), 6,80 (1Н, d, J=7,5 Гц), 5,06 (2H, s), 4,78 (2H, s), 3,33 (1H, септет, J=7,3 Гц), 1,42 (6H, d, J=7,3 Гц);

¹³C ЯМР (CDCl₃, 100 МГц): δ 176,4, 165,5, 159,1, 158,7, 158,5, 141,0, 137,7, 135,6 (2C), 132,3, 131,8, 131,6, 131,4, 129,8, 129,5, 129,1, 128,9, 128,4 (2C), 128,2 (2C), 127,6, 120,4, 115,1 (2C), 114,5, 113,7, 109,3, 69,8, 59,3, 27,0, 20,7 (2C).

ПРИМЕР 3В. Получение 4'-((3-((3-(2,6-дихлорфенил)-5-изопропилизоксазол-4-ил)метокси)бензил)окси)-[1,1' -бифенил] -4-карбоновой кислоты (BAR2159)

Очистка методом ВЭЖХ с фазой Nucleodur Sphinx С18 5 мкм (4,6 мм внутр. диам. × 250 мм), используя MeOH/H₂O (90:10) в качестве элюента (скорость потока 1 мл/мин), дала BAR2159 (t_R = 8 мин).

BAR2159 C₃₃H₂₇Cl₂NO₅

¹H ЯМР (CDCl₃, 400 МГц): δ 7,90 (2Н, d, J=7,7 Гц), 7,70 (2Н, d, J=7,7 Гц), 7,56 (2Н, d, J=8,2 Гц), 7,53 (1H, t, J=8,0 Гц), 7,40 (2Н, d, J=7,9 Гц), 7,30 (1H, t, J=7,9 Гц), 7,05 (2Н, d, J=8,2 Гц), 7,02 (1H, d, J=8,0 Гц), 6,88 (1H, s), 6,76 (1H, d, J=8,0 Гц), 5,03 (2Н, s), 4,73 (2Н, s), 3,33 (1H, септет, J=7,0 Гц), 1,42 (6Н, d, J=7,0 Гц);

¹³С ЯМР (CDCl₃, 100 МГц): δ 176,3, 165,3, 159,3, 159,1, 158,2, 141,1, 137,7, 135,8 (2С), 132,6, 131,5, 131,2, 129,5, 129,2 (2С), 129,1, 128,1 (2С), 128,0 (2С), 123,8 (2С), 115,4 (2С), 120,0, 114,5, 113,7, 109,3, 69,8, 59,4, 27,0, 20,7 (2С).

ПРИМЕР 3С. Получение 4-((3-((3-(2,6-дихлорфенил)-5-изопропилизоксазол-4-ил)метокси)бензил)окси)бензойной кислоты (BAR2175)

Очистка методом ВЭЖХ с фазой Nucleodur Sphinx C18 5 мкм (4,6 мм внутр. диам. × 250 мм), используя МеОН/H₂O (80:20) в качестве элюента (скорость потока 1 мл/мин), дала BAR2175 (t_R = 13 мин).

BAR2175 C₂₇H₂₃Cl₂NO₅

¹H ЯМР (CDCl₃, 400 МГц): δ 8,05 (2Н, d, J=8,7 Гц), 7,40 (2Н, d, J=7,9 Гц), 7,32 (1Н, t, J=7,9 Гц), 7,29 (1H, d, J=8,0 Гц), 7,25 (1H, t ovl), 7,0 (2Н, d, J=8,7 Гц), 6,85 (1H, s), 6,76 (1H, d, J=8,0 Гц), 5,07 (2Н, s), 4,74 (2Н, s), 3,33 (1H, септет, J=7,0 Гц), 1,44 (6Н, d, J=7,0 Гц);

¹³С ЯМР (CDCl₃, 100 МГц): δ 176,4, 163,9, 159,3, 159,0, 158,5, 137,8, 135,8 (2С), 132,3 (2С), 131,5, 131,3, 129,7, 129,5, 128,0 (2С), 120,2, 114,6, 114,4 (2С), 113,6, 109,2, 69,9, 59,3, 27,0, 20,7 (2С).

ПРИМЕР 3D. Получение 3-((3-((3-(2,6-дихлорфенил)-5-изопропилизоксазол-4-ил)метокси)бензил)окси)бензойной кислоты (BAR2183)

Очистка методом ВЭЖХ с фазой Nucleodur Sphinx C18 5 мкм (4,6 мм внутр. диам. × 250 мм), используя МеОН/H₂O (80:20) в качестве элюента (скорость потока 1 мл/мин), дала BAR2183 (t_R = 15 мин).

BAR2183 C₂₇H₂₃Cl₂NO₅

¹H ЯМР (CDCl₃, 400 МГц): δ 7,72 (1H, d, J=7,5 Гц), 7,67 (1H, br s), 7,41 (1H, ovl), 7,40 (2H, d, ovl), 7,31 (1H, t, ovl), 7,30 (1H, tovl), 7,24 (1H, d, J=8,0 Гц), 7,20 (1H, d, J=8,2 Гц), 6,87 (1H, br s), 6,76 (1H, d, J=8,3 Гц), 5,04 (2H, s), 4,75 (2H, s), 3,34 (1H, септет, J=6,9 Гц), 1,42 (6H, d, J=6,9 Гц);

¹³C ЯМР (CDCl₃, 100 МГц): δ 176,7, 165,3, 159,0, 158,9, 158,5, 137,7, 135,7 (2C), 131,3, 129,6, 129,3, 128,9, 128,4, 128,2 (2C), 120,9, 120,5, 116,1, 115,3, 114,7, 113,8, 110,1, 69,6, 59,3, 27,0, 20,5 (2C).

ПРИМЕР 4. ПОЛУЧЕНИЕ BAR2163, BAR2171, BAR2199, BAR2207

Начав со спирта BAR2120 и выполняя далее процедуру, описанную выше в примерах 2 и 3 (схема 2 или схема 3), в результате алкилирования двумя различными фенолами и щелочного гидролиза получили карбоновые кислоты BAR2163, BAR2171, BAR2199 и BAR2207 (схема 4).

Схема 4

a) PPh₃, DIAD, Фенолы-СООСН₃, THF сухой, 0°С; с) NaOH, МеОН : H₂O 1:1 об/об.

ПРИМЕР 4А. Получение 4-((4'-((3-(2,6-дихлорфенил)-5-изопропилизоксазол-4-ил)метокси)-[1,1'-бифенил]-3-ил)метокси)бензойной кислоты (BAR2163)

Очистка методом ВЭЖХ с фазой Luna Polar С18 5 мкм (4,6 мм внутр. диам. × 250 мм), используя МеОН/H₂O (85:15) в качестве элюента (скорость потока 1 мл/мин), дала BAR2163 (t_R = 13 минимум).

BAR2163 C₃₃H₂₇Cl₂NO₅

¹H ЯМР (CDCl₃, 400 МГц): δ 7,60 (2Н, d, J=8,8 Гц), 7,55, (1H, br s), 7,51 (1Н, d, J=7,9 Гц), 7,46 (2H, d, J=8,5 Гц), 7,42 (2H, d, J=7,9 Гц), 7,40 (1H, t, ovl), 7,35 (1H, d, J=7,5 Гц), 7,33 (1H, t, J=7,9 Гц), 7,04 (2H, d, J=8,8 Гц), 6,87 (2H, d, J=8,5 Гц), 5,16 (2H, s), 4,77 (2H, s), 3,36 (1H, септет, J=7,0 Гц), 1,44 (6H, d, J=7,2 Гц);

¹³C NMR (CDCl₃, 100 МГц): δ 176,4, 165,3, 160,0, 159,1, 157,9, 141,3, 136,2, 135,8 (2C), 134,0, 133,7, 131,1 (3C), 129,2, 128,2 (2C), 128,1 (2C), 127,8, 126,7, 125,8 (2C), 115,6 (2C), 115,0 (2C), 109,3, 70,3, 59,3, 27,1, 20,7 (2C).

ПРИМЕР 4B. Получение 3-((4'-((3-(2,6-дихлорфенил)-5-изопропилизоксазол-4-ил)метокси)-[1,1'-бифенил]-3-ил)метокси)бензойной кислоты (BAR2171)

Очистка методом ВЭЖХ с фазой Luna Polar С18 5 мкм (4,6 мм внутр. диам. × 250 мм), используя МеОН/H₂O (85:15) в качестве элюента (скорость потока 1 мл/мин), дала BAR2171 (t_R = 20 минимум).

BAR2171 C₃₃H₂₇Cl₂NO₅

¹H ЯМР (CDCl₃, 400 МГц): δ 7,51 (1H, br s), 7,51-7,22 (12Н, ovl) 6,87 (2Н, d, J=8,4 Гц), 5,10 (2H, s), 4,78 (2Н, s), 3,36 (1H, септет, J=7,3 Гц), 1,44 (6H, d, J=7,3 Гц);

¹³C ЯМР (CDCl₃, 100 МГц): δ 176,5, 165,3, 159,1, 158,7, 157,9, 141,2, 136,3, 135,8 (2C), 133,8, 131,2, 130,4, 129,2, 128,2 (2C), 128,1 (2C), 126,7, 125,8 (2C), 124,8, 120,5, 118,7, 117,8, 115,1 (2C), 113,3, 109,4, 70,4, 59,5,27,0, 20,7 (2C).

ПРИМЕР 4C. Получение 3-((4'-((3-(2,6-дихлорфенил)-5-изопропилизоксазол-4-ил)метокси)-[1,1'-бифенил]-4-ил)метокси)бензойной кислоты (BAR2199)

Очистка методом ВЭЖХ с фазой Luna Polar С18 5 мкм (4,6 мм внутр. диам. × 250 мм), используя МеОН/H₂O (85:15) в качестве элюента (скорость потока 1 мл/мин), дала BAR2199 (t_R = 23 минимум).

BAR2199 C₃₃H₂₇Cl₂NO₅

¹H ЯМР (CDCl₃, 400 МГц): δ 7,57 (1H, br s), 7,22-7,51 (12Н, ovl) 6,87 (2Н, d, J=8,1 Гц), 5,16 (2H, s), 5,00 (2Н, s), 3,33 (1H, септет, J=7,0 Гц), 1,44 (6H, d, J=7,0 Гц); ¹³C ЯМР (CDCl₃, 100 МГц): δ 176,5, 169,3, 160,1, 159,3, 158,1, 141,0, 135,8 (2C), 135,6, 133,0, 131,2 (2C), 130,5 (2C), 130,1 (2C), 129,6, 128,7, 128,2 (2C), 128,1 (2C), 122,6, 119,5, 114,9 (2C), 114,4, 109,3, 70,6, 59,8, 27,0, 20,7 (2C).

ПРИМЕР 4D. Получение 4-((4'-((3-(2,6-дихлорфенил)-5-изопропилизоксазол-4-ил)метокси)-[1,1'-бифенил]-4-ил)метокси)бензойной кислоты (BAR2207)

Очистка методом ВЭЖХ с фазой Luna Polar С18 5 мкм (4,6 мм внутр. диам. × 250 мм), используя МеОН/H₂O (85:15) в качестве элюента (скорость потока 1 мл/мин), дала BAR2207 (t_R = 15 минимум).

BAR2207 C₃₃H₂₇Cl₂NO₅

¹H ЯМР (CDCl₃, 400 МГц): δ 8,02 (2Н, d, J=8,2 Гц), 7,61 (2Н, d, J=8,0 Гц), 7,47 (2Н, d, J=7,7 Гц), 7,40 (2Н, d, J=7,9 Гц), 7,39 (2Н, d, J=7,7 Гц), 7,32 (1H, t, J=7,9 Гц), 7,03 (2Н, d, J=8,0 Гц), 6,90 (2Н, d, J=8,2 Гц), 5,20 (2Н, s), 5,05 (2Н, s), 3,33 (1H, септет, J=7,0 Гц), 1,45 (6Н, d, J=7,0 Гц);

¹³С ЯМР (CDCl₃, 100 МГц): δ 176,3, 165,5, 159,1, 158,7, 158,5, 141,1, 135,8 (2С), 133,0, 132,6, 131,7, 131,3 (2С), 131,2, 129,2 (2С), 129,1 (2С), 128,9, 128,2 (2С), 128,0 (2С), 115,4 (2С), 114,9 (2С), 109,3, 70,5, 59,3, 27,0, 20,7 (2С).

ПРИМЕР 5. ПОЛУЧЕНИЕ BAR2222-BAR2226, BAR2227 и BAR2228

Следуя той же процедуре, которая описана выше для синтеза карбоновой кислоты BAR2119 (схема 1 и пример 12А), и поочередно изменяя исходный материал (различные альдегиды) или различные β-кетоэфиры для образования изоксазола, были синтезированы BAR2222-BAR2226, BAR2227 и BAR2228, соответственно.

Пример 5А. Получение 4'-((3-(2-хлорфенил)-5-изопропилизоксазол-4-ил)метокси)-[1,1'-бифенил]-3-карбоновой кислоты (BAR2222)

В результате очистки методом ВЭЖХ на колонке с фазой Nucleodur Sphinx RP C18 (5 мкм; 4,6 мм внутр. диам. × 250 мм), используя МеОН/H₂O (80:20) в качестве элюента (скорость потока 1 мл/мин), образовался чистый BAR2222 (t_R = 13,1 мин).

BAR2222 C₂₆H₂₂ClNO₄

¹H ЯМР (CDCl₃, 400 МГц): δ 8,27 (1H, br s) 8,04 (1H, d, J=7,32 Гц), 7,75 (1H, d, J=7,32 Гц), 7,48-7,51 (5Н, m, ovl), 7,42 (1H, t, J=7,41 Гц), 7,35 (1H, t, J=7,41 Гц), 6,86 (2H, d, J=8,05 Гц), 4,84 (2H, s), 3,35 (1H, септет, J=6,93 Гц), 1,44 (6Н, d, J=6,93 Гц).

¹³С ЯМР (CDCl₃, 100 МГц): δ 176,5 (2С), 161,1, 157,6, 140,0, 133,3, 133,1, 131,7, 131,6, 130,9, 130,8, 129,7, 129,6, 128,2, 128,1(2С), 127,9, 127,8, 126,8, 114,8 (2С), 109,2, 59,4, 26,9, 20,6 (2С).

Пример 5В. Получение 4'-((3-(2-бромфенил)-5-изопропилизоксазол-4-ил)метокси)-[1,1'-бифенил]-3-карбоновой кислоты (BAR2223)

В результате очистки методом ВЭЖХ на колонке с фазой Nucleodur Sphinx RP C18 (5 мкм; 4,6 мм внутр. диам. × 250 мм), используя МеОН/H₂O (80:20) в качестве элюента (скорость потока 1 мл/мин), образовался чистый BAR2223 (t_R = 12,6 мин).

BAR2223 C₂₆H₂₂BrNO₄

¹H ЯМР (CDCl₃, 400 МГц): δ 8,26 (1H, br s) 8,04 (1H, d, J=7,85 Гц), 7,77 (1H, d, J=7,85 Гц), 7,64 (1H, d, J=8,20 Гц), 7,53 (1Н, t, J=7,85 Гц), 7,51 (1H, t, ovl), 7,51 (2H, d, J=8,61 Гц), 7,18 (1H, t, J=8,20 Гц), 6,88 (2H, d, J=8,61 Гц), 4,79 (2H, s), 3,37 (1H, септет, J=7,07 Гц), 1,45 (6H, d, J=7,07 Гц).

¹³C ЯМР (CDCl₃, 100 МГц): δ 176,6, 171,4, 162,6, 157,8,140,4, 133,6, 132,9, 131,8, 131,1, 130,4, 130,3, 128,5, 128,2, 128,13(2C), 128,1, 127,4, 126,2, 123,0, 115,1 (2C), 109,2, 59,6, 27,0, 20.7 (2C).

Пример 5C. Получение 4'-((5-изопропил-3-(2-трифторметил)фенил)изоксазол-4-ил)метокси)-[1,1'-бифенил]-3-карбоновой кислоты (BAR2224)

В результате очистки методом ВЭЖХ на колонке с фазой Nucleodur Sphinx RP C18 (5 мкм; 4,6 мм внутр. диам. × 250 мм), используя МеОН/H₂O (80:20) в качестве элюента (скорость потока 1 мл/мин), образовался чистый BAR2224 (t_R = 10,8 мин).

BAR2224 C₂₇H₂₂F₃NO₄

¹H ЯМР (CDCl₃, 400 МГц): δ 8,25 (1H, br s) 8,03 (1H, d, J=7,90 Гц), 7,81 (1H, d, J=7,66 Гц), 7,76 (1H, d, J=7,66 Гц), 7,61 (1Н, m, ovl), 7,60 (1H, m, ovl), 7,52-7,51 (4H, ovl), 6,88 (2H, d, J=8,72 Гц), 4,72 (2H, s), 3,33 (1H, септет, J=7,03 Гц), 1,44 (6H, d, J=7,03 Гц).

¹³C ЯМР (CDCl₃, 100 МГц): δ 176,4, 171,0, 161,3, 158,1, 140,9, 133,1, 132,0, 131,8, 131,5, 129,9, 129,8, 129,7, 128,9, 128,4, 128,3, 128,2 (2C), 126,5, 126,4, 122,2, 115,1 (2C), 109,4, 59,1, 27,0, 20,8 (2C).

Пример 5D. Получение 4'-((3-(2-бром-6-хлорфенил)-5-изопропилизоксазол-4-ил)метокси)-[1,1'-бифенил]-3-карбоновой кислоты (BAR2225)

В результате очистки методом ВЭЖХ на колонке с фазой Nucleodur Sphinx RP C18 (5 мкм; 4,6 мм внутр. диам. × 250 мм), используя МеОН/H₂O (80:20) в качестве элюента (скорость потока 1 мл/мин), образовался чистый BAR2225 (t_R = 36,7 мин).

BAR2225 C₂₆H₂₁BrClNO₄

¹H ЯМР (CDCl₃, 400 МГц): δ 8,23 (1H, br s) 8,00 (1H, d, J=7,77 Гц), 7,71 (1H, d, J=7,77 Гц), 7,58 (1H, d, J=7,77 Гц), 7,44-7,46 (4H, m, ovl), 7,23 (1H, t, J=8,55 Гц), 6,85 (2H, d, J=8,73 Гц), 4,76 (2H, br s), 3,35 (1H, септет, J=7,03 Гц), 1,43 (6H, d, J=7,03 Гц).

¹³C ЯМР (CDCl₃, 100 МГц): δ 176,4, 171,7, 160,6, 158,2, 140,9, 135,7, 133,0, 131,8, 131,6, 131,2, 129,7, 128,9, 128,6, 128,4, 128,3 (2C), 128,1 (2C), 125,0, 115,2 (2C), 109,1, 59,4, 27,0, 20,7 (2C).

Пример 5E. Получение 4'-((3-(2,6-дибромфенил)-5-изопропилизоксазол-4-ил)метокси)-[1,1'-бифенил]-3-карбоновой кислоты (BAR2226)

В результате очистки методом ВЭЖХ на колонке с фазой Nucleodur Sphinx RP C18 (5 мкм; 4,6 мм внутр. диам. × 250 мм), используя МеОН/H₂O (80:20) в качестве элюента (скорость потока 1 мл/мин), образовался чистый BAR2226 (t_R = 13,3 мин).

¹H ЯМР (CDCl₃, 400 МГц): δ 8,26 (1H, br s) 8,04 (1H, d, J=7,77 Гц), 7,77 (1H, d, J=7,77 Гц), 7,64 (2Н, d, J=8,08 Гц), 7,53 (1Н, t, J=7,77 Гц), 7,51 (2H, d, J=8,78 Гц), 7,18 (1H, t, J=8,08 Гц), 6,90 (2H, d, J=8,78 Гц), 4,79 (2H, s), 3,37 (1H, септет, J=7,03 Гц), 1,45 (6Н, d, J=7,03 Гц).

¹³С ЯМР (CDCl₃, 100 МГц): δ 176,5, 171,4, 161,9, 158,1, 140,7, 132,8, 131,9, 131,8, 130,8, 129,7, 128,7, 128,3, 128,2, 128,2 (2С), 124,9, 124,1, 123,9, 115,0 (2С), 108,9, 59,4, 27,1, 20,8 (2С).

Пример 5F. Получение 4'-((3-(2,6-дихлорфенил)-5-метилизоксазол-4-ил)метокси)-[1,1'-бифенил]-3-карбоновой кислоты (BAR2227)

Очистка силикагелем после этапа с дала BAR2227 (98%). Аналитический образец был получен методом ВЭЖХ с фазой Luna С18 (5 мкм; 4,6 мм внутр. диам. × 250 мм), с градиентным режимом буфера В от 40% до 95% за 13 мин (буфер А = 95 H₂O : 5 CH₃CN : 0,1 TFA; буфер В = 95 CH₃CN : 5 H₂O : 0,1 TFA) в качестве элюента (скорость потока 1,5 мл/мин) (t_R = 13,3 мин).

BAR2227 C₂₄H₁₇Cl₂NO₄

¹H ЯМР (CDCl₃, 400 МГц): δ 8,27 (1H, s), 8,04 (1H, d, J=7,7 Гц), 7,77 (1H, d, J=7,7 Гц), 7,51 (2H, d, J=8,2 Гц), 7,53 (1H, t, J=7,7 Гц), 7,43 (2H, d, J=8,0 Гц), 7,34 (1H, t, J=8,0 Гц), 6,89 (2H, d, J=8,2 Гц), 4,80 (2H, s), 2,59 (3H, s);

¹³C ЯМР (CDCl₃, 100 МГц): δ 168,6, 165,4, 159,0, 158,1, 141,0, 135,8 (2C), 133,1, 131,8 (2C), 131,3, 129,0, 128,5, 128,4, 128,2 (2C), 128,1 (2C), 127,8, 115,1 (2C), 111,2, 59,7, 11,6.

Пример 5G. Получение 4'-((3-(2,6-дихлорфенил)-5-пропиллизоксазол-4-ил)метокси)-[1,1'-бифенил]-3-карбоновой кислоты (BAR2228)

Очистка силикагелем после этапа с дала BAR2228 (количественный выход). Аналитический образец был получен методом ВЭЖХ с фазой Luna С18 (5 мкм; 4,6 мм внутр. диам. × 250 мм), с градиентным режимом буфера В от 40% до 95% за 13 мин (буфер А = 95 H₂O : 5 CH₃CN : 0,1 TFA; буфер В = 95 CH₃CN : 5 H₂O : 0,1 TFA) в качестве элюента (скорость потока 1,5 мл/мин) (t_R = 14,7 мин).

BAR2228 C₂₆H₂₁Cl₂NO₄

¹H ЯМР (CDCl₃, 400 МГц): δ 8,26 (1H, s), 8,04 (1Н, d, J=7,8 Гц), 7,76 (1H, d, J=7,8 Гц), 7,50 (2Н, d, J=8,5 Гц), 7,52 (1H, t, J=7,8 Гц), 7,42 (2Н, d, J=8,0 Гц), 7,34 (1H, t, J=8,0 Гц), 6,88 (2Н, d, J=8,5 Гц), 4,78 (2Н, s), 2,91 (2Н, t, J=7,3 Гц), 1,86 (2Н, секстет, J=7,3 Гц), 1,04 (3Н, t, J=7,3 Гц);

¹³С ЯМР (CDCl₃, 100 МГц): δ 172,2, 165,2, 159,0, 158,1, 141,0, 135,8 (2С), 133,0, 131,9, 131,3 (2С), 129,0, 128,5, 128,4, 128,2 (2С), 128,1 (2С), 127,9, 115,1 (2С), 111,0, 59,5, 27,9, 21,1, 13,6.

ПРИМЕР 6. БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ

Биологическую активность выбранных соединений (Таблица 1) испытывали в условиях in vitro с использованием клеточной модели, трансфицированной репортерными генами, на рецепторе FXR и сравнивали с контрольным агонистом, хенодезоксихолевой кислотой (CDCA), первичной желчной кислотой, которая функционирует как эндогенный лиганд рецептора.

Клетки HepG2 культивировали при 37°С в среде Е-МЕМ (минимальная питательная среда с солями Эрла) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 1% L-глютамина и 1% пенициллина/стрептомицина. Эксперименты по трансфекции проводили с использованием реагента Fugene HD (Promega) в соответствии с инструкциями производителя. Клетки высевали в 24-луночные планшеты при плотности 5×10⁴ клеток/лунка.

Клетки HepG2 трансфицировали 100 нг вектора pSG5-FXR, 100 нг вектора pSG5-RXR, 100 нг вектора pGL4.70 Renilla, плазмиды, кодирующей ген Renilla человека, и 200 нг репортерного вектора p(hsp27)-TK-LUC, содержащего чувствительный к FXR элемент IR1, клонированный из промотора белка теплового шока 27 (hsp27).

Через 24 часа после трансфекции, клетки стимулировали соединениями и CDCA в качестве положительного контроля. Для оценки ЕС₅₀, были составлены кривые доза-эффект в клетках HepG2, трансфицированных, как описано выше, и обработанных увеличивающимися концентрациями соединений (0,1, 0,5, 1, 2,5, 5, 7,5, 10, 12,5, 25 и 50 мкМ) (Таблица 1). После обработки, клетки лизировали в 100 мкл лизисного буфера (25 мМ Трис-фосфата, рН 7,8; 2 мМ DTT; 10% глицерина; 1% Тритона Х-100); анализировали 10 мкл клеточного лизата каждого образца на активность люциферазы с использованием Двойной люциферазной репортерной системы анализа (Promega Italia S.r.l., Милан, Италия) в соответствии с инструкциями производителя. Люминесценцию измеряли посредством люминометра Glomax 20/20 (Promega Italia S.r.l., Милан, Италия). Активность люциферазы (Блок регистрации люциферазы, БРЛ) нормализовали с помощью активности Renilla (Блок регистрации Renilla, БРР).

Активацию FXR также измеряли в бесклеточном анализе посредством технологии альфа скрининга с помощью Анализа рекрутинга коактиваторов. Акцепторные гранулы, покрытые анти-GST, использовали для захвата FXR-LBD GST-слияния, в то время как биотинилированный SRC-1 пептид был захвачен донорными гранулами стрептавидина. При освещении с длиной волн 680 нм, химическая энергия передается от донора к акцепторным гранулам через комплекс стрептавидин-донор/SRC-l-биотин/GSTFXR-LBD/анти-GST-акцептор, и вырабатывается сигнал. Анализ проводили в белых, малообъемных, 384-луночных планшетах Optiplates (PerkinElmer) с использованием конечного объема 25 мкл, содержащего конечные концентрации 10 нМ очищенного GST-меченого белка FXR-LBD, 30 нМ биотинилированного SRC-1 пептида, 20 мг/мл акцепторных гранул, покрытых анти-GST, и 10 мг/мл донорной гранулы стрептавидина (PerkinElmer). Аналитический буфер содержал 50 мМ Трис (рН 7,4), 50 мМ хлористого калия (KCl) и 1 мМ DTT. Время стимуляции 1 мкл испытуемого соединения (каждое в конечной концентрации 5 мкМ) было зафиксировано, как 30 мин при комнатной температуре. Концентрация DMSO в каждой лунке поддерживалась на уровне конечной концентрации 2%. После добавления детектирующей смеси (акцепторные и донорные гранулы), планшеты инкубировали в темноте в течение 3 часов при комнатной температуре, а затем считывали в микропланшетном анализаторе Envision (PerkinElmer).

В Таблице 1 представлена эффективность выбранных соединений, включенных в Формулу (I), при рекрутировании коактиватора SRC-1 в процентах от максимальной эффективности соединения относительно CDCA, установленной как 100%. Результаты выражены в виде среднего значения трех независимых измерений±стандартная ошибка. Каждый лиганд испытывали в концентрации 5 мкМ.

В Таблице 1 представлена эффективность выбранных соединений, включенных в Формулу (I), в виде значений ЕС₅₀ (мкМ), рассчитанных в ходе анализа трансактивации на основании, по меньшей мере, трех экспериментов. Результаты выражены в виде среднего значения ± стандартная ошибка.

Для исследования специфичности соединений в сравнении с PPARy, клетки HepG2 транзиентно транс фицировали посредством 200 нг репортерного вектора p(UAS)5XTKLuc, 100 нг pGL4.70 и вектора, содержащего домен связывания лиганда ядерного рецептора PPARy, клонированного выше ДНК-связывающего домена GAL4 (pSG5-PPARγLBD-GAL4DBD).

Для исследования специфичности соединений в сравнении с GPBAR1, клетки HEK-293Т транзиентно транс фицировали посредством реагента Fugene HD (Promega) с использованием следующих векторов: pCMVSPORT6-GPBAR1 человека, pGL4.29 (Promega), репортерный вектор, содержащий сАМР-ответный элемент (CRE), клонированный выше люциферазного репортерного гена luc2P и pGL4.70.

Для исследования специфичности соединений в сравнении с трансактивацией, опосредованной LXRα и LXRβ, клетки HepG2 трансфицировали посредством 200 нг репортерного вектора p(UAS)5XTKLuc, 100 нг вектора, содержащего домен связывания лиганда LXRα или LXRβ, клонированного выше ДНК-связывающего домена GAL4 (то есть, pSG5-LXRαLBD-GAL4DBD или pSG5-LXRβLBD-GAL4DBD), и 100 нг pGL4.70 (Promega), вектора, кодирующего ген Renilla человека.

Через 24 часа после трансфекции, клетки стимулировали агонистами специфических рецепторов GW3965 (10 мкМ), Росиглитазоном (500 нМ) и TLCA (10 мкМ), соответственно, или соединениями (10 мкМ).

Через 18 часа после стимуляции, клеточный лизат анализировали на активность люциферазы и Renilla с использованием Двойной люциферазной репортерной системы анализа (Е1980, Promega). Люминесценцию измеряли посредством люминометра Glomax 20/20 (Promega). Активность люциферазы нормализовывали с помощью активности Renilla.

Ни одно из соединений, относящихся к Формуле (I), не проявило агонистической/антагонистической активности в отношении LXRs, PPARγ и GPBAR1.

Выделение РНК и ОТ-ПЦР. Клетки HepG2 высевали при плотности 1×10⁶ клеток/колба в колбе Т25. После инкубации в течение ночи, клеткам не давали питание, и затем их стимулировали в течение 18 часов 10 мкМ GW3965 или соединениями (0,1, 1 и 5 мкМ).

РНК целиком выделяли из клеток HepG2 или ткани печени с использованием реагента TPIzol в соответствии со спецификациями производителя (Invitrogen). Один микрограмм очищенной РНК обрабатывали ДНКазой-I и обратно транскрибировали с помощью Набора обратной транскрипции QuantiTect (Qiagen). Для ПЦР в реальном времени, 10 нг матрицы растворяли в 25 мкл, содержащих 200 нмоль/л каждого праймера, и 12,5 мкл 2 × Универсальной готовой смеси SYBR FAST (Invitrogen). Все реакции проводили в трех повторностях, и условия термоциклирования были следующими: 2 мин при 95°С, затем проводили 40 циклов при 95°С в течение 20 сек и 60°С в течение 30 сек на амплификаторе StepOnePlus (Applied Biosystems). Относительную экспрессию мРНК рассчитывали в соответствии с пороговым методом Ct. Последовательности прямого и обратного праймеров были следующими: GAPDH человека: gaaggtgaaggtcggagt (SEQ ID: 1) и catgggtggaatcatattggaa (SEQ ID: 2); SHP человека: gctgtctggagtccttctgg (SEQ ID: 3) и ccaatgatagggcgaaagaag (SEQ ID: 4); GAPDH мыши, ctgagtatgtcgtggagtctac (SEQ ID: 5) и gttggtggtgcaggatgcattg (SEQ ID: 6); SHP мыши acgatcctcttcaacccaga (SEQ ID: 7) и agggctccaagacttcacac (SEQ ID: 8); FXR мыши: agcttccagggtttcagaca (SEQ ID: 9) и cttccaacaggtctgcatga (SEQ ID: 10); BSEP мыши: gatgcttcccaagttcaagg (SEQ ID: 11) и taaagaggaaggcgatgagc (SEQ ID: 12).

Животные и протоколы. Самцы мышей C57BL/6N были предоставлены Jackson's Laboratory. Мышей содержали при регулируемой температуре (22°С) и световом дне (12:12-часовой цикл свет/темнота), у мышей был неограниченный доступ к стандартному корму для мышей и питьевой воде, и мышам предоставили возможность акклиматизироваться к этим условиям в течение, по меньшей мере, 5 дней перед включением в эксперимент. Протокол эксперимента был одобрен Комитетом по содержанию и использованию животных Университета Перуджи, а также министром здравоохранения Италии и Национальным институтом здравоохранения (Италия), и он соответствовал Европейскому руководству по использованию экспериментальных животных (разрешение №214/2017-PR). Общее состояние животных ежедневно контролировалось ветеринаром в виварии. Для оценки кишечного всасывания в условиях in vivo и успешной транспортировки в печень, мышам вводили 10 мг/кг BAR2109, растворенного в метилцеллюлозе, ежедневно через желудочный зонд (OS) или интраперитонеально в течение 3 дней. По окончании лечения животных умерщвляли и осуществляли сбор крови и печени для дальнейшего анализа.

Микросомальная стабильность. Использовали микросомы печени самцов мышей (CD-1) (Sigma-Aldrich). Все инкубации проводили в двух повторностях на встряхивающей водяной бане при температуре 37°С.Инкубационные смеси содержали 1 мкМ соединения с 1% DMSO, используемого в качестве вспомогательного транспортного вещества, микросомы печени мыши (0,3 мг микросомального белка на мл), 5 мМ MgCl₂, 1 мМ NADP, 5 мМ глюкозо-6 фосфата, 0,4 ед/мл^-1 глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы и 50 мМ калий-фосфатного буфера (рН 7,4) в конечном объеме 0,5 мл. Аликвоты удаляли через 0, 5, 10, 20, 30 и 40 мин после добавления микросомы, и реакцию останавливали добавлением 200 мкл ацетонитрила, охлажденного до температуры льда. Через 2 часа образцы центрифугировали в течение 10 мин при 10000 об/мин, а супернатанты переносили в стандартных калибровочных кюветах для анализа LC-MS/MS. Пропранолол, известный как лекарственное средство с высоким печеночным клиренсом у грызунов, использовали в качестве соединения, контролирующего качество, для микросомальных инкубаций. Угловой коэффициент линейной регрессии полученной кривой, показывающей натуральный логарифм площади соединения в зависимости от времени инкубации (-k), использовали при преобразовании в значения t_1/2 в условиях in vitro посредством t_1/2=-ln(2)/k. Собственный клиренс в условиях in vitro (CL_int, выраженный в мкл/мин/мг) рассчитывали по следующей формуле: Cl_int = объем реакции (мкл)/ t_1/2(мин)/белок микросом печени (мг). Процентное содержание немодифицированного соединения рассчитывали, исходя из того, что площадь пика соединения в момент времени 0 мин составляет 100%.

Предпочтительными примерами, включенными в общую формулу, являются BAR2119 (Cl_int 53 мкл/мин/мг, (мин) 44), BAR2109 (Cl_int 32 мкл/мин/мг, (мин) 72) и BAR2123 (Cl_int 35 мкл/мин/мг, (мин) 66), демонстрирующие повышенную метаболическую стабильность в условиях in vitro по отношению к эталонному соединению GW4064 (Clint 56 мкл/мин/мг, (мин) 41).

Предпочтительными примерами, включенными в общую формулу, являются BAR2109 и BAR2123, индуцирующие экспрессию SHP мРНК в концентрации 5 мкМ в 6, 8 раз и 6,2 раза, соответственно (эталонное соединение GW4064 испытывали в концентрации 10 мкМ; индукция экспрессии SHP мРНК = 4,2 раза).

Предпочтительным примером, включенным в общую формулу, является BAR2109, индуцирующий экспрессию SHP мРНК и BSEP мРНК в печени при введении перорально.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> БАР ФАРМАЦЕВТИКАЛС СОЩИЕТА А РЕСПОНСАБИЛИТА ЛИМИТАТА

<120> ИЗОКСАЗОЛ В КАЧЕСТВЕ АГОНИСТОВ FXR-РЕЦЕПТОРА

<130> 557-18

<160> 12

<170>BiSSAP 1.3.6

<210> 1

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная Последовательность

<220>

<223> прямой праймер

<400> 1

gaaggtgaaggtcggagt 18

<210> 2

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная Последовательность

<220>

<223> обратный праймер

<400> 2

catgggtggaatcatattggaa 22

<210> 3

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная Последовательность

<220>

<223> Прямой праймер

<400> 3

gctgtctggagtccttctgg 20

<210> 4

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная Последовательность

<220>

<223> обратный праймер

<400> 4

ccaatgatagggcgaaagaa g 21

<210> 5

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная Последовательность

<220>

<223> Прямой праймер

<400> 5

ctgagtatgtcgtggagtctac 22

<210> 6

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная Последовательность

<220>

<223> обратный праймер

<400> 6

gttggtggtgcaggatgcattg 22

<210> 7

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная Последовательность

<220>

<223> Прямой праймер

<400> 7

acgatcctcttcaacccaga 20

<210> 8

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная Последовательность

<220>

<223> обратный праймер

<400> 8

agggctccaagacttcacac 20

<210> 9

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная Последовательность

<220>

<223> прямой праймер

<400> 9

agcttccagggtttcagaca 20

<210> 10

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная Последовательность

<220>

<223> обратный праймер

<400> 10

cttccaacaggtctgcatga 20

<210> 11

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная Последовательность

<220>

<223> прямой праймер

<400> 11

gatgcttcccaagttcaagg 20

<210> 12

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная Последовательность

<220>

<223> обратный праймер

<400> 12

taaagaggaaggcgatgagc 20

<---

1. Соединение формулы (I):

или фармацевтически приемлемые соли, отличающееся тем, что

R₁ и R₂ независимо выбраны из группы, включающей H, галоген и CF₃, при условии, что R₁ и R₂ не являются H одновременно;

R₃ представляет собой C₁-С₃алкил;

n представляет собой целое число, выбранное из 1, 2 и 3;

R₄ выбран из группы, включающей фенил, незамещенный или замещенный одним R₅, и бифенил, незамещенный или замещенный одним R₅;

R₅ выбран из группы, включающей COOR₆, CN, гидрокси-C₁-С₃алкил, C₁-С₃алкил-O-фенил, незамещенный или замещенный одним R₇, и C₁-С₃алкил-O-бифенил, незамещенный или замещенный одним R₇;

R₆ выбран из группы, включающей H и C₁-С₃алкил, а

R₇ выбран из группы, включающей COOR₆, CN и гидрокси-C₁-С₃алкил;

при условии, что соединение не является 4-((3-(2,6-дихлорфенил)-5-изопропилизоксазол-4-ил)метокси)бензойной кислотой.

2. Соединение по п. 1, отличающееся тем, что R₄ выбран из группы, включающей

.

3. Соединение по любому из пп. 1 или 2, отличающееся тем, что R₅ выбран из группы, включающей COOH, COOCH₃, CN, -CH₂OH,

.

4. Соединение по любому из предыдущих пунктов, отличающееся тем, что оно выбрано из группы, включающей:

5. Фармацевтическая композиция для профилактики и/или лечения FXR-зависимых заболеваний, содержащая соединение формулы (I):

,

отличающаяся тем, что R₁ и R₂ независимо выбраны из группы, включающей H, галоген и CF₃, при условии, что R₁ и R₂ не являются H одновременно;

R₃ представляет собой C₁-С₃алкил;

n представляет собой целое число, выбранное из 1, 2 и 3;

R₄ выбран из группы, включающей фенил, незамещенный или замещенный одним R₅, и бифенил, незамещенный или замещенный одним R₅;

R₅ выбран из группы, включающей COOR₆, CN, гидрокси-C₁-С₃алкил, C₁-С₃алкил-O-фенил, незамещенный или замещенный одним R₇, и C₁-С₃алкил-O-бифенил, незамещенный или замещенный одним R₇;

R₆ выбран из группы, включающей H и C₁-С₃алкил, а

R₇ выбран из группы, включающей COOR₆, CN и гидрокси-C₁-С₃алкил;

или фармацевтически приемлемые соли и, по меньшей мере, один фармацевтически приемлемый наполнитель.

6. Применение соединения формулы (I) в качестве лекарственного средства для профилактики и/или лечения FXR-зависимых заболеваний, при этом соединение формулы (I) представляет собой:

,

отличающееся тем, что R₁ и R₂ независимо выбраны из группы, включающей H, галоген и CF₃, при условии, что R₁ и R₂ не являются H одновременно;

R₃ представляет собой C₁-С₃алкил;

n представляет собой целое число, выбранное из 1, 2 и 3;

R₄ выбран из группы, включающей фенил, незамещенный или замещенный одним R₅, и бифенил, незамещенный или замещенный одним R₅;

R₅ выбран из группы, включающей COOR₆, CN, гидрокси-C₁-С₃алкил, C₁-С₃алкил-O-фенил, незамещенный или замещенный одним R₇, и C₁-С₃алкил-O-бифенил, незамещенный или замещенный одним R₇;

R₆ выбран из группы, включающей H и C₁-С₃алкил, а

R₇ выбран из группы, включающей COOR₆, CN и гидрокси-C₁-С₃алкил;

или их фармацевтически приемлемые соли.

7. Применение по п. 6, отличающееся тем, что FXR-зависимое заболевание выбрано из группы, включающей нарушения со стороны желудочно-кишечного тракта, заболевания печени, нарушения работы сердечно-сосудистой системы, сосудистые заболевания, легочные заболевания, патологии метаболических процессов, инфекционные заболевания, рак, нарушения функции почек, воспалительные заболевания, включая иммунно-опосредованные, и неврологические расстройства.

8. Применение по п. 7, отличающееся тем, что указанное заболевание выбрано из группы, включающей системную красную волчанку, ревматоидный артрит, синдром Шегрена, склеродермию, спондилоартрит, васкулит, саркоидоз, средиземноморскую лихорадку, полимиозит и дерматомиозит, синдром Бехчета, приобретенный иммунодефицит и связанные с ним расстройства, инфекции, вызванные вирусами B и C, болезнь Альцгеймера и другие формы деменции, болезнь Паркинсона и другие двигательные расстройства, боковой амиотрофический склероз и другие нарушения двигательных нейронов, рассеянный склероз и другие демиелинизирующие заболевания, миастению и мышечную дистрофию, первичный билиарный цирроз, церебротендинный ксантоматоз, первичный склерозирующий холангит, лекарственный холестаз, внутрипеченочный холестаз беременных, холестаз, связанный с парентеральным питанием, холестаз, связанный с пролиферацией бактерий или сепсисом, аутоиммунный гепатит, хронический вирусный гепатит, алкогольную болезнь печени, неалкогольную жировую болезнь печени, неалкогольный стеатогепатит, трансплантацию печени, врожденный фиброз печени, гранулематозное поражение печени, внутри- или внепеченочное злокачественное новообразование, болезнь Вильсона, гемохроматоз, дефицит альфа-1-антитрипсина, воспалительное заболевание кишечника, болезнь Крона, язвенный ректоколит, неопределенный колит, синдром раздраженного кишечника, пролиферацию бактерий, острый и хронический панкреатит, мальабсорбцию, постлучевой колит, микроскопический колит, диабетическую нефропатию, гипертензивную нефропатию, хронический гломерулонефрит, хронический гломерулонефрит после трансплантации, хронические тубулоинтерстициальные заболевания, сосудистые заболевания почек, атеросклероз, артериосклероз, дислипидемию, гиперхолестеринемию, гипертриглицеридемию, артериальную гипертензию, воспалительные заболевания сердца, миокардит, эндокардит, ишемическую болезнь сердца, стабильную стенокардию, нестабильную стенокардию, инфаркт миокарда, сердечно-сосудистые заболевания, ишемический инсульт, легочную гипертензию, болезнь периферических артерий, окклюзионную болезнь периферических артерий, периферическую облитерирующую артериопатию, астму, муковисцидоз, обструктивные легочные заболевания, интерстициальные легочные заболевания, первичный или вторичный легочный фиброз, инсулинорезистентность, метаболический синдром, диабет I типа и II типа, гипогкликемию, заболевания коры надпочечников, недостаточность коры надпочечников, ожирение, заболевания, связанные с бариатрической хирургией, рак печени, разные виды рака желчных протоков, рак пищевода, рак поджелудочной железы, рак желудка, рак толстой и прямой кишки, рак груди, рак яичников и заболевание, связанное с резистентностью к химиотерапии.

9. Применение по любому из пп. 6-8, отличающееся тем, что соединение формулы (I) выбрано из группы, включающей: