Способ получения глюканорасщепляющихферментов

 

ОП И САН И Е

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

К П АТЕ НТУ

3I4357

Союз Саеетских

Социалистических

Республик

Зависимый от патента №

МГ1К С 12d 13/10

Заявлено 13.111.1968 (№ 1224831/28-13)

Приоритет ЗОЛ 1.1967, ¹ ВП 6а/125697, ГДР

Комитет оо делам изобретений и открытий ори Совете Мииистаое

СССР

Опубликовано 07.IX.1971. Бюллетень № 27

Дата опубликования описания 14.III.1972

УДК 577.15.07(088.8) Авторы изобретения

Иностранцы

Иоханн Хубер, Хельга Мюллер, Барбара Херфорт, Рудольф Дикшайт, Барбара Хефнер и Клаус Ридель (Германская Демократическая Республика) Иностранное предприятие

«Форшунгсинститут фюр ди Герунгсиндустри, Энзимологи унд технише

Микробиологи» (Германская Демократическая Республика) Заявитель

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГЛЮКАНОРАСЩЕПЛЯЮЩИХ

ФЕРМЕНТОВ

Изобретение относится к области биотехнического получения глюканорасщепляющих ферментов (энзимов) .

Известен способ получения глюканорасщепляющих ферментов, например глюконазы, путем выращивания их продуцентов на питательной среде, содержащей источники углерода и азота, в присутствии минеральных солей, с последующим выделением фермента из культуральной жидкости.

Предлагаемый способ позволяет получать глюконазу, расщепляющую полисахариды с р-1,3 и Р-1,4 глюкозидными связями.

Для этого в качестве продуцента используют Bacillus subtillis СОН № 1872, Сущность способа заключается в следующем.

Выращивают продуцент глюканорасщепляющих ферментов, например глюконазы, амилазы Bacillus subtillis СОН ¹ 1872 на водйой минеральной среде, содержащей источники азота, углерода в течение 24 — 72 час при аэрации и перемешивании среды с последующим выделением ферментов одним из известных способов.

Вышеуказанный штамп выделен из естественных материалов и адаптирован в процессе длительного культивирования и гидролпзу злаков.

Штамм Bacillus subtillis имеет следующую характеристику.

Морфология. Вегетативные клетки имеют форму подвижных продольных палочек с закругленнымп концами, в виде одиночных или сдвоенных палочек или же коротких цепочек.

Величина клеток 2,5 — 6,0+0,6 — 0,8 лтк. Споры

10 овальные, без определенной локализации в спорангпях. Спорангпи не вздутые. Повсдение по Граму положительное, в старости грамлабильное.

Органические среды. На агаре мясного

15 бульона интенсивное развитие, колонии с матовым блеском. Грязновато-белого цвета, края дольчатые, частично мицелеобразные, бахромчатые. Прокол агара богатые колонии на поверхности, а вдоль прокола — слабое раз20 вити е.

На мясном бульоне интенсивное развитие в виде белых Шмер и нежной, легко рвущейся поверхностной пленки, легкое помутнение.

На мясном бульоне и глюкозе интенсивное развитие как на чистом мясном бульоне, толстая прочная поверхностная пленка. На мясном бульоне с NaCI — 5% ХаС1 — интенсив314357

Корректоры: С. Сатагулова и и . Шевченко

Заказ 247/17

Тираж 473

Изд. Ка 96

Подписное

Типография, пр. Сапунов1, 2 ное развитие. 7% NaCI — очень слабое развитие.

На ломтиках или кусках картофеля — интенсивное развитие, слизистые колонии с мокрым блеском, грязновато-белого цвета до 5 желтовато-коричневого, после 3 — 4 дней при

37 С образуются пузырьки (заполненные слизью), старые колонии темно-коричневого цвета, без складчатости. желатина. 5Келатину разжижает. Молоко 10 коагулирует. Казеин гидролизует. Сероводород и индол не образует. Отношение к углеводам. Усваивает глюкозу, сахарозу, маннозу, галактозу, арабинозу, мальтозу, декстрин, маннитол, крахмал. 15

П р» м е р 1. Для предлагаемого способа получения глюконазы с помощью варианта

Ba=illus subtillis СОН № 1872 употребляется следующая среда в %. дробленого ячменя 9 20 дробленых соевых бобов 3

КН Р04 0,25

ИазНРО4 1,2. Н20 12, водопроводная вода, рН до стерилизации 7,2 рН после стерилизации 6,5 — 6,9. 25

Производственную среду разливают по

50 лл в устойчивую круглодонную колбу емкостью 500 лил, стерилизуют, засевают и устанавливают на качалку для встряхивания. Необходимое посевное количество составляет 30

1 — 2%. Целесообразно, чтобы плотность посевного материала составляла около 6. 10в клеток/мл. Продолжительность встряхивания составляет 3 дня, инкубационная температура 30 С. 35

Во время инкубационного периода в 3 дня в производственной среде наряду со значительным количеством глюконазы, а именно

80 — 150 яеж/ед/мл. образуется еще амилаза и протеаза, Количество полученной амилазы 40 составляет от 2000 до 5000 яеж/ед/л л, ооразовавшееся количество амилазы пе зависит от количества образовавшейся глюконазы.

П р им ер 2. Производство глюконазы осуществляют в ферментациопном баке емко- 45 стью 500 л из стали V 2A. С принудительной аэрацией.

Состав питательной среды следующий в : дробленый ячмень 2 картофельный крахмал 2 50 соевая мука 0,95

МН,НГО 1,5 цитрат натрия и различные микроэлементы 0,08 водопроводная вода. 55

После стерилизации в течение 30 мин при

120 С концентрацию Н-ионов устанавливают на рН 7,0 — 7,2.

После охлаждения осуществляют посев при стерильных условиях 2% посевного мате- 60 риала.

Лэрация во время логарифмической фазы роста составляет 0,7 л воздуха на 1 л жидкости в illllH.

Скорость движения мешалки составляет в зависимости от ее свойств 160 — 420 об/мин.

Через 36 час ферментацию прерывают, так как питательная среда истощается углеводами и наступает изменение показателя рН. По прошествии 36 час выдерживания культуры образуются 100 — 150 меж. ед. глюконазы, 2000 — меж. ед. амилазы и около 1 единицы протеазы (по казеину) .

П ример 3. 1000 мл. фильтрата культуры с активностью Р-глюконазы в 150,0 м. е./,нл и активностью альфа-амилазы в 500 лг. е./мл осветляют добавлением геля кальция. Осаждение желательного фермента производится при помешивании с твердым (NH4)>SO4. Может быть использован чистый для анализа или технически чистый осадитель. Осаждение происходит при температуре от 10 С до комнатной. Осадок высушивают в вакууме при 40 С и вслед за тем гомогенизируют. Посредством кратковременной обработки влажного препарата ацетоном при 0 С период сушки препарата значительно сокращается, и достигается его осветление. Конечный продукт порошкообразен, не гигроскопичен и хорошо растворим в воде.

Выход. Из 1000 мл, фильтрата культуры вышеуказанной активности получаются 10 г твердого продукта с активностью 9,0 м. е./мг р-глюконазы и 160 м. е. L-амилазы. Это соответствует выходу, приблизительно 90% р-глюконазы и 35% L-амилазы.

Пример 4. Осаждение ферментов из

1000 мл. фильтрата культуры вышеуказанной активности осуществляют добавлением ацетона при перемешивании и температуре 0 С до степени насыщения 0,65. Показатель рН раствора культуры устанавливают фосфатным буфером по Соренсену на рН 7,0.

Продукт осаждения обрабатывают согласно вышеупомянутому описанию.

Выход. Получают 11,5 г твердого продукта со следующей активностью; Р--глюконазы

8,0 л . е./мг=82, L-амилазы 300 м. е./мг)

>77 /о.

Предмет изобретения

Способ получения глюканорасщепляющих ферментов, например глюконазы, путем выращивания их продуцентов на питательной среде, содержащей источники углерода и азота в присутствии минеральных солей, с последующим выделением фермента из культуральной жидкости, отличающийся тем, что, с целью получения глюконазы, расщепляющей полисахариды с р-1,3 и р-1,4 глюкозидными связями, в качестве продуцента используют Bacillus

subtil lis СОН № 1872.