Способ получения меченных тритием нуклеозидтрифосфатов

 

Союз Советских

Социалистимеских

Республик

ОП ИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

К АВТОРСКОМУ СВКДЕТИЗЬСТВУ (11) 412764 (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено12.01.72 (21) 1737609/23-4 с присоединением заявки № (23) Приоритет (43) Опубликовано 25.10.78.Бюллетень № 39 (45) Дата опубликования описания,14.02.77 (51) М. Кл.

С 07 Н 19/00

С 07 В 23/00 (53) УДК 547.857. .7. 07 (088. 8) Гасударственный комитет

Совета Министров СССР пс делам изввретений и вткрытий (72) Авторы изобретения

О.В. Лавров, Н.С. Марченков, К.С. Михайлов, H.Ô. Мясоедов и Г.В. Сидоров (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МЕЧЕННЫХ ТРИТИЕМ

НУКЛЕОЗИДТРИФОСФАТОВ

1 2

Изобретение относится к способу получения, меченных тритием биологических соединений„которые могут найти применение в биологических и биохимических исследованиях.

14 5

Известен способ получения меченных С нуклеозидтрифосфатов, заключающийся в том, что выращивают культуру микроорганизмов на среде, содержащей С 0 выделяют из

+ биомассы меченую РНК, гидролизуют ее до нуклеотидов, разделяют их с последующим биохимическим фосфорилированием отдельных нуклеотидов до нуклеозидтрифосфатов -С 4.

Однако известный способ получения меченых нуклеозидтрифосфатов позволяет нов лучать целевой продукт только низкой удельной активности с неравномерно распределеНной меткой.

Предлагаемый способ получения меченных тритием нуклеозидтрифосфатов отличается от известного тем, что соответствующий галоидзамещенный нуклеозидмонофосфат, абсорбированный на палладиевом катализаторе, подвергают обработке газообразным тритием в условиях высокочастотного электрического разряда с промежуточным выделением меченного тритием нуклеозидмонофосфата и последующим биохимическим фосфорилированием выделенного нуклеозидмонофосфата до нуклеозидтрифосфата и радиохимической очисткой последнего, совмещенной с процессом фосфорилирования и выделением целевого продукта известным способом, Обычно меченные тритием нуклеозидмо— нофосфаты отделяют от соответствующих галоидзамещенных и продуктов радиолиза на смоле Дауэкс 1х8 в формиатной форме.

При этом для элюции аденозинмонофосфата, цитидинмонофосфата и уридинмонофосфата используют соответственно 0,1; 0,2 и 2,0н. муравьиную кислоту.

После этого выделенные нуклеотиды концентрируют, например, с помощью активиро— ванного угля и затем фосфорилируют до три фосфатов ферментной системой, выделенной из бактерий Бвс1е мсЪ а со6 . Продукты фосфорилирования обычно разделяют на ионообменной ДЭАЭ-целлюлозе A-25 в бикарбонатной форме с помощью линейного

412764

Составитель В. Жестков

Редактор О. С генина Техред Г Родак Корректор Н. Бабурка

Заказ 5442/171 Тираж 575 П одписное

ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб„д,4/5

Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4

3 градиента триэтиламмоний-бикарбонатного буфера. Выход по активности грифосфатов

50-70%. Поврежденные нуклеотиды и другие продукты радиолиза не подвергаются фосфорилированию, в связи с чем остальная радиоактивность сбрасывается при разделении продуктов фосфорилирования.

Радиохимическая чистота полученных нуклеозидтрифосфатов не ниже 99%. Высокая радиохимическая чистота препаратов достигается на последней стадии, в процессах биологического фосфорилирования и выделения препарата за счет высокой специфичности ферментов к .субстрату. Таким образом, стадии фосфорнлирования и выделения конечного препарата совмещены с его радиохимической очисткой.

Предлагаемый способ иллюстрируется с

"ледующим примером.

100 мг 5-B r -цитидинмонофосфата (5-Bt -ЦМФ) наносят на 1000 мг катализатора (10% РД на угле "ХО 14"). Тритирование проводят в стеклянной ампуле со впаянным электродом, вокруг которого помещают нанесенный на стекловату катали- фф затор с 5-В -UMC. Время тритирования в условиях разряда 30 мин, температура в ампуле 120-150оС. После окончания тригпрования продукты с катализатора смывают 60 см спиртоаммиачной смеси (1 н. 30 раствор аммиака в 50О/о-ном спирте). Сухой остаток растворяют в 20 см воды и .вносят на колонну, заполненную смолой Да уэкс 1х8 в формиатной форме. Колонну праN

4 5 мывают 300 см дистиллированной воды, а затем меченный тритием ЦМФ элюируют

170 см 0,2 н. муравьиной кислоты. По лученный препарат ЦМФ- (5Т) концентрируют на активированном угле и фосфорилиру3 ют 10 см ферментного раствора до цитидинтрифосфата (ЦТФ) . Продукты фосфорилирования разделяют на колонке, заполненной

ДЭАЭ-целлюлозной A-25 в бикарбонагной форме. В качестве элюэнта используют линейный градиент концентрации триэтиламмоний-бикарбонатного буфера (0,01-0,21 моль/л).

Концентрирование ЦТФ проводят с помощью КМ-целлюлозы.

Формула изобретения

Способ получения меченных тритием нук леозидгрифосфатов биохимическим фосфорилированием соответствующих меченых нуклеозидмонофосфатов с последующим выделением целевого продукта известным способом, отличающийся тем, что, с целью повышения удельной активности и радиохимической чистоты, соответствующий галоидзамещенный нуклеозидмонофосфат, абсорбированный на палладиевом катализаторе, подвергают обработке газообразным тритием в условиях высокочастотного электрического разряда с промежуточным выделением меченного тритием нуклеозидмонофосфата и последующей радиохимической очисткой последнего, совмещенной с процессом фосфорилирования.