Патент ссср 421200

 

СОюз СОВетских

Республик ааоо

К ПАТЕНТУ (61) Зависимый от патента (22) Заявлено 04.05.72 (21) 1781030 31-16 (32) Приоритет 05.05.71 (31) P 2122294.6 (33) ФРГ

Опубликовано 25.03.74. Бюллетень № 11

Дата опубликования описания 14.08.74 (51) М. Кл. С 12d 13/10

Гасударственный комитет

Совета Министров СССР оо долам изобретений и открытий (53) УДК 577.155.38 (088.8) (72) Авторы изобретения

Иностранцы

Гюнтер Хольц, Иоганна Грамзалль (ФРГ), Михаель Нельбек-Хохштеттер (Австрия) и Ханс Ульрих Бергмайер (ФРГ) Иностранная фирма

«Берингер Маннхайм ГмбХ» (ФРГ) (71) Заявитель л -инозит гликоллят пеларгонат фенилацетат валин аргинин

6-аминовалерат триптофан бетаин гиппурат ацетамид бензиламин

WS 90001 — грибок вида пеницилла.

Чтобы соответственно увеличить количество требуемых ферментов в применяемых соглас25 но изобретеншо микроорганизмах, последние культивируются преимущественно с добавкой креати ина в среду для роста. Оба микроорганизма выращиваются преимущественно на одной питательной среде, которая содержит

30 глюкозу или глицерин как источник углерода, Для получения креатинина-амидогидролазы и креатина-амидиногидролазы применяются микроорганизмы Alcaligenes spec. WS. 51400 или Penicillium 90001.

Alcaligenes spec. WS. 51400 характеризуется определенно оксидированными грамотрицагельными короткими палочками со жгутиками. Зародыши имеют слабую положительную реакцию на оксидазу, подщелачивают лакму(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРМЕНТА, КАТАЛИЗИРУЮЩЕГО

ПРЕВРАЩЕНИЕ КРЕАТИНИНА И КРЕАТИНА

1 2

Изобретение относится к медицине и ка- совое молоко и способны к денитрификации. сается получения ферментных препаратов из Культура обладает следующими свойствами; микроорганизмов.

Известен способ получения фермента, ката- Рост при 4 С лизирующего превращение креатинипа в кре- 5 Рост при 41 С атин и креатинина в аммиак и мочевину lio- Разжижение желатисредством культивирования граммположи- ны тельных бактерий NS, выделенных из почвы, Расщепление трибути- адипат на среде, содержащей креатинин, агар, фос- рина фаты. 10 Реакция с яичным и-оксибензоат +

Целью изобретения является получение желтком фермента, катализирующего превращение кре- Образование пигмента атинина в креатин, и фермента, катализирую- Ферментация щего превращение креатина в саркозин и мо- Арабиноза + + чевину. 15 Глюкоза +

Поставленная цель достигается тем, что в Мальтоза + качестве продуцента используют культуру Целлобиоза + +

Alcaligenes spec. WS. 51400 или Penicillium Трегалоза +

WS. 90001 и вводят в состав среды глюкозу 2-кетоглюконат + или глицерин, а также витамины. 20 Манпит +

421200

Предмет изобретения

Составитель С. Шенева

Техред А. Камышникова

Корректор М. Лейзерман

Редактор Д. Пинчук

Заказ 1813/13 Изд. № 664 Тираж 456 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам. изобретений. и открытий

Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Сапунова, 2

Типография, пр. креатинин и соли и витамины .в известном в микробиологии количестве и составе. Особенно подходящая питательная среда имеет следующий состав:

0,5 вес. /о глюкозы или глицерина, 0,5 вес. /о креатинина, 0,08 вес. о/о сульфата аммония, 0,02 вес. /о магнийсульфатгидрата, ничтожные количества сульфата железа, хлорида кальция, сульфата марганца, 005 вес. /о дрожжевого экстракта, никотиновой кислоты, тиамин-и-аминобензойной кислоты, витамин Вв (по 1 мг), 0,1 мг биотина, который растворяют в 0,1 М буферном растворе с фосфатом калия рН 6 (грибок) или рН 7 (Alcali genes) .

Штамм микроорганизмов получают обычным образом в пробирке с косым агаром добавкой 2% агара в соответствующую .питательную среду, к которой еще добавляют 5 мл/л

0,05%-.ного раствора брома-тимола синего. В предпочитаемых условиях роста окраска этого индикатора у грибка через 4 — 6 дней, а у бактерий через 2 — 3 дня отчетливо переходит в щелочную область, что обусловлено расщеплением креатинина-креатина. Потребляющие креатинин микроорганизмы, которые не lnpoизводят расщепления по вышеназванной схеме обмена веществ с перечисленными ферментами, не имеют этого,подщелачивания.

П р им ер 1. 2 л питательной среды, содержащей 1 вес. /о глюкозы, 0,5 вес. /о креатинина, 0 08 вес. /о сульфата аммония, 0,02 вес. % гептагидрата сульфата магния, 0,05 вес. % дрожжевого экстракта, .по 1 мг никотиновой кислоты, тиамин-и-аминобензойной кислоты и витамина Рв, 0,1 мг биотина, сульфата железа, хлорида кальция и сульфата марганца в ничтожных количествах в О,! М буферного раствора фосфата калия с рН 6 засевают в качалочной колбе 200 мл предварительно выращенной (48 час) культуры

Penicillium 90001 и культивируют 4 дня в аппарате для встряхивания. Содержание креатинина снижается с 0,5 до,почти 0,1 а глюкоза к этому моменту уже .израсходована, величина рН,повышается с 7,5 до 8.

То

Зо

4 ,Получают 3 — 4 г WS 90001 сухого веса на

1 л .питательного раствора с 45 — 60 МЕ/г сухого веса креатинин-амидогидролазы.

Пример 2. В соответствующем сосуде для разведения культуры культивируют 15 л описанной в примере 1 среды с 1,5 л предварительно выращенной культуры Alcaligenes

spec. WS 51400 при интенсивной аэрации. При этом в течение всего периода культивирования поддерживают постоянную величину рН 7.

Непрерывно следят за содержанием креатинина и глюкозы. Расход креатинина происходит, главным образом, во второй трети рабочей фазы, в то время как глюкоза расщепляется сначала. Культуру выдерживают при

30 С. Через 35 час можно собрать 1,5 г/л сухого вещества бактерий.

П р и ме р 3. Культивируется как описано в примере 2 Alcaligenes spec, 51400 в рабочем объеме 60 л. Как только достигается требуемая стадия роста, начинают подавать в сосуд для культивирования свежую питательную среду и в одинаковой степени отбирать из сосуда для культивирования выращенный питательный раствор. При этом норма разбавления (скорость течения/рабочий объем) составляет 0,13 — 0,18, преимущественно 0,16. За

1 час пропускают 500 л воздуха. При непрерывном культивировании получают выход 3—

5 г/л сухого вещества бактерий со специфической активностью, которую определяют по описанному в примере 2 периодическому методу.

Alcaligenes spec. WS 51400 хорошо пригодна для непрерывного культивирования.

Способ получения фермента, катализирующего превращение креатинина и креатина, путем .выращивания культуры-,продуцента на среде, содержащей креатинин и минеральные соли, отличающий.ся тем, что, с целью получения фермента, катализирующего inpeвращение креатинина в креатин, и фермента, катализирующего превращение креатина в саркозин н мочевину, в качестве продуцента используют культуру. Alcaligenec spec. WS 51400 или Penicillium WS 90001 и вводят в состав среды глюкозу или глицерин, а также витамины.