Способ получения антибиотика

 

и и 440847

О п И g" ф"Н:И Е

ИЗОБРЕТЕНИЯ

Союз Советских

Социалистических

Республик

К ПАТЕНТУ (61) Зависимый от патента (22) Заявлено 26.04.72 (21) 1778057/30-15 (51) M. Кл. С 126 9/00 (32) Приоритет 27.04.71 (31) 137894 (33) США

Опубликовано 25.08.74. Бюллетень № 31

Государственный комитет

Совета вбиннстров СССР (53) УДК 779 925(088.8) ло делам изобретений и открытий

Дата опубликования описания 22.05,75 (72) Авторы изобретения и (71) заявители

Иностранцы

Савао Мурао (Япония) Эдвард Мойерс и Вильям Лоурен Паркер (США) (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБИОТИКА

Изобретение относится к области микробиологии, а именно к микробиологическим способам получения антибиотиков.

Известен способ получения антибиотика путем культивирования Bacillus circulans в аэробных условиях в водной питательной среде, содержащей источник углеводорода, азота и минеральные соли, с последующим выделением целевого продукта из фильтрата культуральной жидкости и хроматографическим разделением его на активные компоненты.

Предлагаемым способом антибиотик получают путем культивирования штамма микроорганизма Bacillus circulans АТСС 21656 в аэробных условиях в водной питательной среде, содержащей источник усвояемого углерода, азота и минеральные соли, до накопления в культуральной жидкости значительной активности антибиотика.

Затем культуральную жидкость подкисляют, выпавший осадок отделяют фильтрованием и промывают водой. Фильтрат и промывные воды объединяют и экстрагируют спиртом, смешивающимся с водой, предпочтительно н-бутанолом. Спиртовой раствор концентрируют, и антибиотик осаждают этилацетатом ацетонитрилом, эфиром или ацетоном.

Продукт можно затем подвергать более тщательной очистке распределением в системе, содержащей воду, спирт и органическую кислоту, например, н-пропанол, н-бутанол, воду и уксусную кислоту, или образованием соли гелиантовой кислоты и регенерацией антибио5 тика из этой соли.

Этот процесс приводит к выделению антибиотика ЕМ-49 в виде соли с кислотой, соответствующей кислоте, применяемой для подкисления бульона. Соль превращают в сво10 бодное основание нейтрализацией, водным раствором аммиака, гидроокисью натрия, гидроокисью бария, и экстрагированием н-бутанолом.

Полученный таким образом антибиотик

15 ЕМ-49 представляет собой вещество с антимикробной активностью. При более тщательном разделении антибиотик можно разделить на четыре активные фракции, близкие по структуре друг другу, и пятую фракцию, со20 держащую активное вещество неопределенной структуры.

Все ИК-спектры сняты в КВ„а ЯМРспектры — в диметилсульфоксиде d6, 25 Иа фиг. 1 изображен ИК-спектр антибиотика ЕМ-49 в виде хлоргидрата; на фиг. 2—

ЯМР-спектр хлоргидрата антибиотика ЕМ-49 на фиг. 3 — ИК-спектр антибиотика ЕМ-49: на фиг. 4 — ЯМР-спектр антибиотика ЕМ-49:

30 на фиг. 5 — 9 ИК-спектры антибиотика EM-49

3 альфа, бета, гамма, дельта и МПФ соответственно.

Антибиотик ЕМ-49 и фракция, полученные при его разделении, активны по отношению к грибкам, а также к грам-положительным и грам-отрицательным бактериям, например, видов Staphylococcus aureus, Streptococcus

pyogenes, Pseudomonas aeruginosa, Esherichia

coli u Candida albicans.

Поэтому антибиотик или его физиологически приемлемую соль с кислотой можно применять в качестве противомикроб ного средства либо для дезинфекции окружающей среды, например, в формах для разбрызгивания или распыления, содержащих примерно по 1% вещества в обычно применяемом носителе, либо для борьбы с инфекциями, поражающими различные виды животных, вызванные вышеуказанными микроорганизмами, например при нанесении в виде мазей, содержащих до 1% вещества, или в виде инъекций в дозировке 50 — 125 мг/кг веса в день. Доза

ЕД1О для мышей для борьбы с инфекцией, вызванной Esherichia coli, составляет примерно 50 мг/кг веса. Штамм Bacillus circulans — продуцент антибиотика ЕМ-49, выделен из почвы и хранится в коллекции культур в США.

Морфолого-культуральные свойства. Спорообразующие бациллы грамм-отрицательные.

Споры расположены центрально или субцентрально, овальные; стенки опор толстые и легко окрашиваются; спорангии отчетливо набухают. Палочки не образуют цепочек. Мазки, окрашенные 0,5% основным раствором фуксина, показывают наличие тонкой оболочки.

Колонии на питательном orape, содержащем глюкозу, блестящие с гладкими или неровными краями, очень клейкие, слизистые, подвижные, легко размазываются на поверхности агара особенно при увлажнении чашек.

В питательном бульоне наблюдается мутность, тяжелый осадок, тонкая слизистая пленка.

Физиологические свойства. Испытания по

Боже — Проскауэру на образование ацетилметилкарбинола отрицательные, Культура индол не образует, крахмал (казеин) гидрализует газ из углеводов не образуется, Не растет при 60 — 65 С.

Получение антибиотика

Штамм Bacillus circulans АТСС 21656 продуцирует антибиотика, обладающий активностью против грам-положительных и грамотрицательных бактерий, а также грибков типа Candida albicans. Для получения антибиотика штамм Bacillus circulans АТСС 21656 выращивают в аэробных условиях в водной питатель среде, содержащей усвояемый углевод и источник азота. Ферментацию проводят в течение 60 †1 час, предпочтительно

144 час, затем образуется антибиотик.

После завершения ферментации культуральную жидкость подкисляют до рН 2 кон5

Зо

4 центрированной соляной кислотой, добавляют осадитель, и всю суспензию фильтруют. Осадок промывают большим количеством воды, и промывные воды соединяют с фильтратом.

Промытый осадок отбрасывают. Фильтрат вместе с промывными водами экстрагируют н-бутанолом, насыщенным водой, Бутанольный экстракт концентрируют под вакуумом при температуре ниже 45 С до небольшого объема. Концентрат затем разбавляют

15 об. ч. ацетона. Полученный осадок промывают ацетоном, этилацетатом и эфиром и получают после высушивания светло-бурый порошок. Антибиотик, содержащийся в этом неочищенном препарате, подвергают последующей очистке противоточным распределением с применением системы, содержащей н-пропанол, н-бутанол, воду и уксусную кислоту в соотношении по объему 50: 75: 100: 2.

Материал, полученный после 29 операций противоточного распределения, применяют для характеристики антибиотика.

Антибиотик ЕМ-49 представляет собой пептид основного характера, образующий соли с неорганическими и органическими кислотами.

При подкислении культуральной жидкости соляной кислотой получают хлоргидрат. При использовании других кислот, например неорганических, типа бромистоводородной кислоты, серной кислоты можно получать соответствующие соли этих кислот. Образующуюся соль, в виде которой сначала получают антибиотик, можно нейтрализовать основанием, например гидроокисью натрия, с получением свободного основания. Соли, не растворимые в воде, например арилсульфокислоты, типа нафталин-2-сульфокислоты, метилоранжа, н-фенизазобензосульфокислоты, могут быть образованы реакцией кислой соли антибиотика ЕМ-49, например его хлоргидрата, с солью щелочного металла арилсульфокислоты.

Особенно рекомендуемым способом выделения антибиотика ЕМ-49 является способ с применением соли гелиантовой кислоты. Светло-бурый порошок, полученный осаждением ацетоном из концентрата, обрабатывают водным раствором метилоранжа, полученным осаждением соли гелиантовой кислоты антибиотика ЕМ-49, Гелиантат, представляющий собой аморфный порошок, в этом состоянии, подвергают очистке повторным осаждением из диметилформамида, смеси метанола и ацетонитрила и из подобных растворителей. Обработка соляной кислотой способствует повторному превращению гелиантата в хлоргидрат.

Светло-бурый порошок, не растворимый в ацетоне, содержит антибиотик ЕМ-49. Порошок подвергают очистке. Очищенный порошок содержит близкие по строению антибиотики со структурой пептидов и характеризующиеся наличием четырех свободных аминогрупп, которые можно разделить с применением ионообменной хроматографии.

440847

10

50 давлением перед приприменяют роста. Со.

15,0

15,0

В том случае, когда водный раствор хлоргидрата антиоиотика ЕМ-49, полученный через соль гелиантовой кислоты подвергают хроматографии на колонне, заполненной карбоксиметилцеллюлозой в виде натриевой формы (например, «Ватман целлюлоза СМ-52») и элюируют разбавленным раствором хлористого натрия, антибиотик разделяют на четыре фракции в зависимости от поверхностного натяжения вытекающего потока. Эти фракции обозначаются соответственно ЕМ-49 альфа, бета гамма и дельта в порядке проведения их элюирования. Некоторые фракции различаются по их аминокислотному составу и по различиям в структуре остатка жирной кислоты. Анализ аминокислот показал, что фракции ЕМ-49 альфа и бета не содержат фенилалапина, содержат пять остатков 2,4 —диаминомасляной кислоты и три остатка лейцина, Фракции ЕМ-49 гамма и дельта содержат один остаток фенилаланина, два остатка лейцина и пять остатков 2,4-диаминомасляной кислоты. Фракции ЕМ-49 альфа и бета отличаются друг от друга по структуре жирных кислот, выделяющихся после гидролиза в кислой среде. Аналогично отличаются друг от друга фракции ЕМ-49 гамма и дельта.

Хроматография не растворимого в ацетоне порошка в некоторых системах показала малоподвижную фракцию (МПФ), обладающую также широким спектром анти микробного действия. Эту фракцию выделяют и подвергают очистке экстрагированием н-бутанолом с последующей хроматографией на диэтиламиноэтилцеллюлозе и повторной распределительной хроматографией на колонне, заполненной кремниевой кислотой и целлюлозой, элюированием смесью, содержащей н-бутанол, изомасляную кислоту, пиридин и воду (40: 9:

: 4: 10). Фракцию антибиотика ЕМ-49 МПФ можно также выделить и очистить путем хроматографии порошка, не растворимого в ацетоне, на «Сефадекс LH20» (алкилированный сшитый декстран) с элюированием метанолом. Фракцию МГ можно легко выделять посредством образования кристаллической соли Рейнеке, получаемую в виде ярко-красных кристаллов, Пример 1, Дрожжевомясной косой агар засевают микроорганизмом штамма Bacillus

circulans АТСС 21656, Культуру выдерживают в термостате в течение ночи при 37 С, а затем смывают 50 мл водной среды из соевой муки в колбы Эрленмейера емкостью

250 мл. Состав ростовой среды, r:

Соевая мука 15,0

Обезвоженный измельченный картофель 15,0

Глюкоза 50,0

СоСl 2Н О 0,005

СаСОЗ 10,0

Дистиллированная вода до 1000 мл.

Среду стерилизуют в течение 30 мин при

121 С и паром под давлением 1,55 кг/см пеЬ ред ее использованием. Посеянную культуру выращивают при 25 С в течение 72 час при постоянном перемешивании на ротационной мешалке (280 об/мин) и при перемещении склянки на два дюйма (5,08 см).

Из каждой колбы отбирают пипеткой по

2,5 об. % культуральной жидкости в колбу

Эрленмеиера, содержащую 100 мл жидкой питательной среды (рН 7,0) следующего состава, г: жидкий кукурузный экстракт 6,0 (NH4) Н РО4 3,0

Дрожжевой экстракт 2,5

Декстроза 10,0

СаСОЗ 2,5

Дистиллированная вода до 1000 мл.

Колбы выдерживают в тех же условиях.

Образцы отбирают через 3 и 6 дней и изучают с применением бумажной хроматографии и биоанализа. Для бумажной хроматографии подходящее количество бутанольного экстракта подкисленной ферментативной жидкости наносят на листы бумаги «Ватман» Г», и хроматограмму проявляют растворителем следующего состава: н-бутанол, уксусная кислота, вода 4: 1: 5 (по объему). Верхнюю фазу этой системы используют в качестве растворителя.

Антибиотик ЕМ-29 (в виде хлоргидрата) имеет величину К1 0,71. Антибиотик определяют биологически по отношению к штаммам микроорганизмов Staphylococcus aureus ГДА

209Р и Esherichia coli ATCC 10536. Для биоанализа эти штаммы микроорганизмов применяют обычным образом с использова нием пробирок с различной степенью разбавления.

Пример 2. 250 литров культуры микроорганизма штамма Bacillus circutans АТСС

21656 подвергают ферментации в аппарате из нержавеющей стали емкостью в 100 галлонов (378,5 л) средой в условиях, описанных ниже.

Стадия l.

Инокулюм. Культуру микроорганизма штамма Bacillus circulans АТСС 21656 сохраняют в жидком азоте, выращивают на дрожжевомясном косом arape следующего состава, r;

Мясной экстракт 1,5

Дрожжевой экстракт 3,0

Пептон 6,0

Декстроза 1,0

Агар 15,0

Дистиллированная вода до 1000 мл.

Среду стерилизуют под

l,55 кг/см при 121 С за 15 мин менением.

Ростовую среду из косого arapa для инокуляции первых колб для став среды, r:

Соевая мука

Обезвоженный измельченный картофель

50,0

0,005

10,0

1000 мл.

45

Глюкоза

СоС1 . 2Н О

СаСОз

Дистиллированная вода до

Стерилизацию проводят при 121 С в течение 30 мин.

100 мл этой среды, помещенной в колбу

Эрлейнмейера, выдерживают в течение 72 час на роторной мешалке при 25 С. Мешалка работает со скоростью 280 об/мин, давая перемещение склянки 5,08 см.

Стадия 2.

Инокулюм: 100 мл материала из первой стадии.

Среда такая же, как ростовая среда на стадии I. Инокулируемый материал и 1000 мл среды в колбе Эрленмейера емкостью 4000 мл прививают в течение 72 час при 25 С на роторной мешалке (280 об/мин), перемещая склянку на 5,08 см, Стадия 3.

Инокулюм: 3000 мл материала из второй стадии.

Применяют среду (рН 7,0) следующего состава, r:

Кукурузный экстракт (жидкий) 6,0 (NH4) Н РО4 3,0

Дрожжевой экстракт 2,5

Декстроза 10,0

СаСО3 2,5

Дистиллированная вода до 100 мл.

Инокулированный материал добавляют к

250 л среды и выдерживают при постоянных условиях в течение 144 час при аэрации со скоростью 0,61 мл/мин под давлением

0,7 кг/см и перемешивании со скоростью

155 об/мин (0,4 вт/л).

Пример 3. Культуральную жидкость, полученную по методике, описанной в примере 2 (209 л), подкисляют до рН 2,0 1,5 л концентрированной соляной кислоты и добавляют фильтрующее средство («Гифло», 15 кг) .

Смесь фильтруют с образованием 41 кг нерастворимого материала. Нерастворимый осадок на фильтре промывают 10 л воды, и промывные воды соединяют с фильтратом с образованием 190 л жидкости. Промытый мокрый осадок на фильтре (41 кг) отбрасывают, Пример 4. Фильтрат (190 л), полученный цо методике, описанной в примере 3, экстрагируют трижды 56 л н-бутанола, насыщенного водой. Бутанольные слои (194 л) собирают и концентрируют под вакуумом при 45 С до небольшого объема (2,3 л).

Пример 5. 50 мл концентрата, полученного по методике, описанной в примере 4, разбавляют 750 мл ацетона и центрифугируют.

Осадок промывают ацетоном (60 мл) суспендированием его в растворителе, а затем центрифугируют. Операцию повторяют с применением этилацетата (трижды по 60 мл) и эфира (трижды по 60 мл). Осадок высушивают на воздухе, измельчают и высушивают под

Зо

8 вакуумом. Получают 1,4 r светло-бурого порошка.

Пример 6. 1,4 г образца, не растворимого в ацетоне, полученного по методике, описанной в примере 5, подвергают последующей очистке противоточным распределением с использованием системы, содержащей н-пропанол, н-бутанол, воду и уксусную кислоту (50: 75: 100: 2 по объему). Проводят 29 переносов по 40 мл каждой фазы на пробирку.

Максимальная активность, определяемая диффузией с применением бумажных дисков, наблюдается в пробирке 11. Содержимое пробирок 8 — 14 соединяют, и растворители удаляют под вакуумом. Остаток растворяют в небольшом количестве метанола и осаждают антибиотик путем добавления ацетона и эфира. Осадок тщательно промывают эфиром, высушивают на воздухе, а затем под вакуумом и получают 0,466 r светло-бурого порошка. Этот порошок представляет собой преимущественно основной антибиотик ЕМ-49 пептидного характера в виде хлористоводородной соли.

Найдено, %: С 45,58; Н 7,31; N 14,62;

С1 11,86 (ионный); (а) р (с= 1,0, вода); — 42<-3 (589 ммк); — 44 (578 ммк); — 50 (546 ммк); — 91 (436 ммк).

ИК-спектр поглощения для хлоргидрата изображен на фиг. 1; ЯМР-спектр для хлоргидрата в диметилсульфоксиде d — на фиг. 2, Для определения антибиотика применяют бумажную хроматографию (фильтровальная бумага марки «Ватман 1»), а также биологический анализ с применением Е. coliATCC

10536.

Система растворителей н-бутанол: уксусная кислота: вода (4: 1: 5) 0,71 н-пропанол: н-бутанол: вода (2: 3: 4) 057

Хлороформ: метанол: вода (5: 4: 2) 0,38

Хлороформ: метанол: 1%-ная уксусная кислота (5: 4: 2) 0,35

Хлороформ: метанол: 0,5 н.

ыН4ОН (5 0,91

Хлоргидрат антибиотика ЕМ-49 имеет температуру плавления 180 †2 С (с разложением), растворим в воде, метаноле, этаноле, диметилсульфоксиде и уксусной кислоте, не растворим в ацетоне, этилацетате, эфире и ацетонитриле.

Продукт гидролиза образца (2,30 мг) хлоргидрата антибиотика ЕМ-49, продуцируемого по описанной методике, получают нагреванием этого антибиотика в 6 н. растворе соляной кислоты при 110 С в течение 16 час.

Анализ по известному способу Штейна—

Мура показал присутствие лейцина (3,95 моль) и 2,4-диаминомасляной кислоты (7,35 мкмоль). В продукте гидролиза обнаружен также фенилаланин (0,86 мкмоль), а также следы других аминокислот. Продукт

440847

9 содержит идентифицируемое количество треонина, что служит для отличия антибиотика

ЕМ-49 от других антибиотиков пептидного характера, например, циркулина, полимиксинов и полипептина. Из продукта гидролиза можно выделить неидентифицированную жирную кислоту, что показывает присутствие примерно 10 вес. /о этой кислоты в антибиотике.

Спектр ультрафиолетового поглощения хлоргидрата в 0,05 н. растворе соляной кислоты показывает наличие небольшого пика при

248 ммк (Е =25) и конечную адсорбцию.

Интенсивность адсорбции при 248 ммк усиливается окрашенными примесями, что дает повышение пика поглощения также и в видимой области спектра. Этот пик и конечная адсорбция являются (по крайней мере частично) следствием наличия фенилаланина.

Пример 7. Хлоргидрат антибиотика

ЕМ-49 превращают в свободное основание противоточным распределением с применением системы, содержащей н-бутанол и

0,5 мл раствор Н40Н 1,01 г хлоргидрата антибиотика ЕМ-49, полученного по методике, описанной в примере 6, подвергают 29-кратному переносу с применением 40 мл верхней и нижней фазы в пробирку. Содержимое пробирок

25 — 29 соединяют, верхнюю фазу отделяют и упаривают досуха под вакуумом. Остаток затем растворяют в теплом метаноле (примерно 50 мл). Добавляют этилацетат (50 мл), бензол (50 мл) и циклогексан (50 мл). Удаляют эту смесь растворителей под вакуумом и получают 0,75 г беловатого порошка, представляющего собой свободное основание антибиотика ЕМ-49. Температура плавления полученного антибиотика 245 — 248 С. Найдено, о/О С 56,64; Н 8,65; N 16,50; Сl 0,0

Молекулярный вес свободного основания определяют в этаноле посредством ультрацентрифугирования. Он составляет примерно

1080. Эквивалентный вес, определяемый титрованием хлорной кислотой, составляет 272.

Эмпирическая формула антибиотика ЕМ-49 в виде свободного основания соответствует примерно С Н9эМдОд.

Спектр ультрафиолетового поглощения, определяемый в метаноле, имеет дополнительно к сильному концевому поглощению следующие пики. макс (Е- ") ммк;

247,5 (плато, 5,8), 252 (плато, 4,5), 258 (4,1), 265 (3,4), 268 (3,2).

ИК-спектр в КВг изображен на фиг. 3.

ЯМР-спектр в диметилсульфоксиде d6 — на фиг. 4.

Раствор хлоргидрата антибиотика ЕМ-49 в воде (0,1 — 10 мг/мл) обрабатывают растворами солей натрия и калия (0,5 мл). Соли следующих анионов не обр азуют осадка:

ОАс Н РО4 J-, С10 С 04 Вг

В407 —, J03 —. Следующие анионы образуют осадки в возрастающей степени растворимости: $04 - Мо04 — НРО4 — Сг04 — Fe (CN)6 Fe (СИ)6 -, Сг 07 - WO4

I0

25 зо

Пример 8. Антибиотик ЕМ-49 можно также осаждать из водного раствора в виде соли с различными арилсульфокислотами путем обработки кислотой или соль кислоты.

1,00 г хлоргидрата антибиотика ЕМ-49 растворяют в 50 мл воды и добавляют раствор 1,25 r п-фенилазобензолсульфокислоты в

20 мл воды. Смесь перемешивают в течение

30 мин и выдерживают для отстаивания.

Верхний слой декантируют и осадок промы= вают дважды по 30 мл воды, а затем фильтруют. Осадок высушивают под вакуумом и получают 1,43 г аморфного твердого вещества. Полученную твердую соль п-фенилбензолсульфокислоты кристаллизуют из метанола.

Образец перекристаллизовывают 4 раза из смеси метанола с ацетонитрилом (2: 1) и получают продукт, разлагающийся при температуре примерно 267 С при быстром нагревании под вакуумом. Полученный продукт высушивают в течение нескольких часов под давлением 0,02 мм рт. ст. и 100 С и получают повышение веса на 4,17 /о за счет атмосферной влаги.

Найдено, %: С 53,29; Н 6,42; N 13,10;

О 21,33 (по разнице); $5,86.

Для молекулярного веса 2103 (определенного исходя из наличия четырех атомов серы) анализ соответствует формуле С97Н)3дИ (О аЯ4.

Пример 9. Смесь 30,8 мг хлоргидрата антибиотика ЕМ-49, 1 мл н-бутанола, 1 мл метилэтилкетона, 0,2 мл 1 М раствора 2,4 динитрофторбензола в толуоле и 2 мл 10% раствора бикарбоната натрия перемешивают при комнатной температуре в течение 1,7 час.

Верхнюю фазу отделяют, а нижнюю фазу промывают несколько раз этилацетатом. Соединяют верхние фазы, а промывные жидкости и растворители удаляют под вакуумом. Остаток растворяют в минимальном количестве метилкетона, осадок удаляют центрифугированием и отбрасывают. Верхний слой обрабатывают досуха в потоке азота. Остаток растворяют в небольшом количестве ацетона, и продукт осаждают добавлением бензола.

Твердое 2,4-динитрофенилпроизводное промывают несколько раз бензолом и высушивают под вакуумом. Получают 36,1 мг желтого порошка. Анализ с использованием тонкопленочной хроматографии на силикагеле после элюирования смесью метанола с хлороформом (1: 9) дает одно чистое пятно (Rf 0,51).

Материал подвергают очистке с применением тонкослойной хроматографии и такой же системы растворителей. Собирают желтую ленту с величиной Rf 0,52 — 0,68. Продукт вымывают из силикагеля смесью ацетона и метанола (1: 1) и превращают в порошкообразное состояние (30,4 мг) осаждением из ацетонового раствора бензолом. УФ-спектр поглощения в метилэтилкетоне дает Х„а,„. 352 ммк, E =398. Образец высушивают при 100 С и давлении 0,02 мм рт. ст. и доводят до постоянного веса атмосферной влагой.

440847

11

Найдено, /о. Н О 1,04; С 52,02; Н 6,13;

N 16,61; О 25,24 /о (по разнице). Для молекулярного веса 1744 это соответствует эмпирической формуле С Н ;Ь4 0р .

Пример 10. 1,00 r порошка, не растворимого в ацетоне, полученного по методике, описанной в примере 5, растворяют в 10 мл воды. Нерастворимую часть удаляют центрифугированием, промывают 10 мл воды и промывные жидкости соединяют.

1,00 r метилоранжа суспендируют в 15 мл воды. Добавляют 5 мл диметилформамида, и смесь нагревают до растворения метилоранжа. Этот теплый раствор добавляют к раствору антибиотика ЕМ-49. Смесь охлаждают до комнатной температуры, и осадок выделяют центрифугированием, промывают трижды по 35 мл воды и высушивают под вакуумом.

Неочищенный гелиантат растворяют в 3 мл диметилформамида и нерастворившуюся часть удаляют центпифугированием, промывая ее дважды по 3 мл диметилформамида.

Соединенные растворы диметилформамида соединяют с 90 мл воды, осадок выделяют центрифугированием и промывают трижды по 30 мл воды.

Гелиантат антибиотика ЕМ-49 представляет собой аморфное вещество, которое можно очистить перекристаллизацией из смеси метанола с ацетонитрилом (2: 1). Полученный продукт высушивают под давлением

0,02 мм рт. ст. и 100 С в течение 18 час, а затем доводят до постоянного веса атмосферной влагой. Температура плавления в горячем состоянии по Кофлеру: 242 — 244 С (с разложением).

Найдено, /о. С 53,01; Н 6,74; N 14,19;

S 5,44 (вода 5,05 /о). Для молекулярного веса 2238 элементарный анализ соответствует эмпирической формуле C„4H 44Nz40 4S4.

Гелиантат антибиотика ЕМ-49 превращают в хлоргидрат перемешиванием с 10 мл

0,36 н. раствора соляной кислоты в течение

20 мин. Нерастворимый материал удаляют центрифугированием и промывают дважды по

5 мл 0,36 н. раствора соляной кислоты. Соединенные верхние слои жидкости затем перемешивают с 320 мг активированного угля марки «Дарго С вЂ” 60» и фильтруют через диатомовую землю с образованием почти бесцветного р а створ а.

Фильтрат экстрагируют дважды по 10 мл н-бутанола. После удаления бутанола под вакуумом получают аморфное твердое вещество. Это вещество превращают в тонкоизмельченный порошок растворением в небольшом количестве метанола, добавлением этилацетата до осаждения антибиотика с последующим удалением смеси растворителей под вакуумом. Порошок затем высушивают при

50 С и 0,02 мм рт. ст. в течение нескольких, например пяти, часов, а затем подвергают воздействию атмосферной влаги в течение ночи.

12

Прим ер 11. Раствор 500 мг хлоргидрата антибиотика ЕМ-49, полученный по методике примера 10, растворяют в 5 мл воды и хроматографируют на колонне размером

2,5 60 см, заполненной целлюлозой марки

«Ватман СМ-52» (натриевая форма карбоксиметилцеллюлозы), выдерживаемой при 50 С, со скоростью потока 75 мл в час. Колонну элюируют 0,15 н. раствором хлористого натрия, собирая 600 небольших фракций (примерно по 24 мл). Размер вытекающих фракций определяют по поверхностному натяжению, так как антибиотики снижают поверхностное натяжение так, чтобы стекающие с постоянной скоростью фракций, содержащие антибиотики, имели уменьшенный объем. 3ависимость объема фракции от всего объема алюированного антибиотика — обратная.

Элюирование продолжают (примерно 161) до элюирования трех веществ, названных ЕМ-49 альфа, ЕМ-49 бета и ЕМ-49 гамма. Колонну затем элюируют 0,2 н. раствором хлористого натрия для элюирования четвертой фракции, показанной на графике поверхностного натяжения, обозначаемой ЕМ-49 дельта.

Фракции, содержащие, соответственно, ЕМ-49 альфа, бета, гамма и дельта соединяют. Каждую фракцию экстр агируют 50 о/О (от ее объема) н-бутанола. Бутанольные экстракты промывают дважды равными объемами

0,36 н. раствора соляной кислоты, а затем упаривают досуха.

Каждый из перечисленных остатков растворяют в метаноле, осаждают этилацетатом, промывают этилацетатом и эфиром, высушивают при 75 С и 0,02 мм рт. ст. в течение

1,5 час, а затем подвергают воздействию атмосферной влаги для равновесия, оставляя на ночь.

Анализ каждой фракции, полученной в виде хлоргидратов, показал следующие результаты (табл. 1).

Ооразцы фракций ЕМ-49 альфа, бета, гамма и дельта подвергают гидролизу в 6 н. растворе соляной кислоты при 110 С в течение ночи. Каждый гидролизат экстрагируют эфиром с целью удаления жирных кислот. Остаток применяют для анализа аминокислот.

Аминокислотный анализ фракций показал, что фракции ЕМ-49 альфа и бета отличаются от фракций ЕМ-49 гамма и дельта по остаткам аминокислот следующим образом (табл. 2).

ИК-спектры каждой из перечисленных фракций изображены соответственно на фиг. 5 — 8. Каждая такая фракция, так же как и хлоргидрат антибиотика ЕМ-49, растворима в воде, метаноле, этаноле, диметилсульфоксиде и уксусной кислоте и не растворима в ацетоне, этилацетате, эфире и ацетонитриле.

Каждая из этих фракций образует соли такого же тина, как антибиотик ЕМ-49.

440847

Таблица 1

Найдено, %

Брутто-формула*

С1 (ионный) Мол. вес з

Фракция

Н20

1203

1267

5,84

8,91

8,86

7,09

С„Нщ,И,зС1зОдз

С,;Нзз!ч,зС!„О,з

СззНз1И) зС!401з

Сз НзР4зС1яОи

11,85

11,06

I0,64

10,58

ЕМ-49 альфа

ЕМ-49 бета

8,16

7,85

6,96

7,17

42,96

43,49

43,42

44,75

13,41

13,68

12,92

13,13

EM-49 гамма

ЕМ-49 дельта Мол. вес и брутто-формулы приведены в расчете на безводные вещества.

Таблица 2

Остаток на молекулу

Фракция

Фенилала2,4-ДАБ

Лейцин нин

EM-49 альфа

ЕМ-49 бета

EM-49 гамма

ЕМ-49 дельта

* 2,4-Диаминомасляная кислота.

Эфирные экстракты гидролизатов содержат жирные кислоты, отщепляемые из антибиотика. Их обрабатывают диазометаном с образованием сложных метиловых эфиров. Полученные метиловые эфиры оценивают методом газовой хроматографии. 5Кирные кислоты, выделенные из фракции ЕМ-49 альфа, отличаются от жирных кислот, выделенных из фракции ЕМ-49 бета, а жирные кислоты, выделенные из фракции ЕМ-49 гамма, отличаются аналогичным образом от фракции EM-49 дельта.

Две фракции ЕМ-49 альфа и бета можно отличать от фракций гамма и дельта по небольшому пику при 696 cM в ИК-спектре последней пары фракций, что характеризует присутствие остатка фенилаланина. Аналогично УФ-спектр для пары фракций гамма и дельта имеет характерный пик поглощения, свойственный остатку фенилаланина, между

245 и 270 ммк и такой характерный рисунок спектра отсутствует в спектре поглощения ультрафиолетовых лучей для пары фракций альфа и бета.

Пример 12. 70 г порошка, не растворимого в ацетоне, полученного по методике, описанной в примере 5, экстрагируют дважды по 200 мл воды (рН 7,5) и бутанолом. Водные слои, не обладающие антибиотическими свойствами, отбрасывают. Бутанольные слои соединяют и экстрагируют 4 раза по 200 мл воды, насыщенной бутанолом при рН 1,0.

Соединенные водные экстракты содержат

45 наибольшее количество активного материала состоящего из антибиотика EM-49 и малоподвижной фракции (МПФ). Водный экстракт концентрируют под вакуумом до состояния сиропа и осаждают ацетоном. Вес полученного порошка, не растворимого в ацетоне, составляет примерно 15 г.

Антибиотик ЕМ-49 и малоподвижную фракцию сначала грубо разделяют растворением

15 г твердого вещества в 30 мл метанола и пропусканием этого раствора через колонну, заполненную дпэтиламиноэтилцеллюлозой (4,5)(60 см) в метаноле. После окончания выхода из колонны окрашенного раствора элюируют МПФ 2%-ным раствором уксусной кислоты в метаноле. Собирают фракции объемом примерно 50 мл до прекращения вытекания из колонны активных веществ, что определяют испытанием с применением дисков в отношении Е. со11 (S С2927) на агаровых пластинах. Фракции затем подвергают анализу посредством тонкопленочной хроматографии на листах из кремневой кислоты по Гельману с применением системы растворителей: бутанол: изомасляная кислота: пиридин: вода (40: 9: 4: 10), а также биологически на агаровых пластинах, засеянных Е. colL Фракции, содержащие МПФ (Rf=0,15), соединяют и концентрируют досуха с получением примерно 5 r. Это твердое вещество затем подвергают распределительной хроматографии на смеси кремневой кислоты с целлюлозой (2: 1 по весу, размер колонны 3 60 см) с применением того же растворителя, что при тонкослойной хроматографии. На этой колонне происходит разделение фракций ЕМ-49 и

МПФ, их подвергают анализу путем тонкослойной хроматографии. Снова соединяют нужные фракции и упаривают их досуха, получая примерно 800 .лг остатка. Для дальнейшей очистки соединен я операцию распределительной хроматографии повторяют. Образец растворяют в смеси ацетона и метанола (1: 1) и пропускают через колонну с «Сефадексом 1 И 20», которую пропитывают и заполняют тем же растворителем. При проявлении тем же растворителем можно заметить отдельные полосы. МПФ не вытекает с первыми порциями растворителя. Фракции снова

440847

Таблица 3

Активность, мг/мл

Микроорганизм

4,7

0,6

0,8

0,6

2,4

12,5

6,3

2,4

50,0

25,0

6,3

37,5

15 подвергают анализу путем тонкослойной хроматографии и фракции, расположение пятен у которых соответствует МПФ, соединяют и упаривают досуха. Общий выход составляет примерно 150 мл. Продукт имеет желтый цвет, не плавится до 310 С, от 270 С изменяет цвет до коричневого, Кристаллическую соль Рейнеке этого образца получают растворением 100 мг готового продукта в 5 мл воды, после чего доводят соляную кислоту до рН 2 — 3. Затем добавляют по каплям насыщенный водный раствор рейнеката аммония nо прекращения выделения осадка. Жидкость центрифугируют, и осадок промывают однократно 5 мл воды. Затем осадок высушивают и перекристаллизовывают из 50 мг смеси ацетона с гексаном.

Кристаллический рейнекат МПФ представляет собой порошок красного цвета, не растворимый в воде, но хорошо растворимый в ацетоне и метаноле. Он не дает четкой температуры плавления, но разлагается при

198 — 200 С. Испытания на цветные реакции показали следующие результаты: нингидрин (— ), антрон (— ), гидролизат на нингидрин (+) .

Антибиотик ЕМ-49 МПФ показывает конечную абсорбцию в УФ-спектре (см. фиг. 9).

Найдено, /о. С 50,46; Н 6,47; N 11,69, нейтральный эквивалент=584.

Для молекулярного веса 12000 элементарный анализ соответствует формуле

С5оНи%1о -424 °

Гидролизат получают гидролизом 2,012 мг антибиотика в 6 мн. растворе соляной кислоты при 110 С в течение 17 час и подвергают анализу на содержание аминокислот, которые присутствуют в следующих количествах, моль:

2,4-Диаминомасляная кислота 1,74

NH4OH 1,01

Треонин следы

Серии 0,84

Глутаминовая кислота следы

Алании 0,51

Валин 0,82

Лейцин 0,45

Фенилаланин 0,47

Тирозин следы

Кристаллический рейнекат антибиотика

ЕМ-49 МПФ имеет температуру плавления

198 — 200 С (с разложением), а УФ-спектр имеет максимум поглощения при 240 ммк (E :" = 450) и 315 м мк (F " = 350) .

16

Полученный рейнекат не растворим в воде и растворим в ацетоне и метаноле.

Пример 13. Двухкратные испытания на разбавление в пробирках для некоторых ми5 кроорганизмов дали следующие результаты.

Антибиотик ЕМ-49 применяют в данных опытах в виде хлоргидрата, и его чистота соответствует светло-бурому порошку, описанному в примере 6 (табл. 3).

Staphylococcus aureus ГДА 209Р

Streptococcus pyogenes С 203

Esherlchia соИ АТСС 10536

Esherlchla соИ SC 8294

Pseudomonas aeruginosa $С 8329*

CandIda alblcans SC 5314

Candida krusel $С 2616

Saccharomyces cerevlstae SC 1600

pspergillus niger SC 2828

Рцзат1ит bulbigenum SC 5273

Trtchophyton mentagrophytes SC 2637*

TrIchomonas vagtnalts $С 8660»

Организмы из коллекции культур Сквибба.

Пример 14. Для испытаний in vivo мы35 шам вводят внутрибрюшинно 100 доз LDsa

Streptococcus pyogenes С203. Испытания показали, что выжило только 50о/о мышей при введении всего 120 мг/кг антибиотика ЕМ-49 в виде хлоргидрата подкожно в два приема:

40 через 1 час и через 5 час после заражения.

В контрольной группе мышей, не получавших антибиотика, выживших мышей нет.

Пример 15. Аналогично, при введении мышам внутрибрюшинно 500 до LDsa штам45 ма микроорганизма Esherichia coli SC 8294, суспендированного в 5 муцина, выделенного из свиного желудка, 50 мышей выжило при подкожном введении антибиотика ЕМ-49 в виде хлоргидрата в количестве 50 мг/кг

50 через 1 час после заражения. Все мыши, не получившие антибиотика, погибли.

Пример 16. Испытания на двукратное разбавление в пробирках с указанными микроорганизмами дали следующие резуль55 таты (табл. 4).

440847

18

Таблица 4

Активность, мг/мл

ЕМ-49

Микроорганизм бета альфа гамма дельта МПФ

Предмет изобретения нием целевого продукта из фильтрата культуральной жидкости и хроматографическим разделением его на активные компоненты, о тл и ч а ю шийся тем, что в качестве продуцен5 та целевого продукта используют штамм

Bacillus circulans АТСС 21656.

4000 ЛОО О000 2500 2000 1800 7бОО 7400 7_#_0 1000 ЮО бЛ

Риг. 1

Staphylococcus aureus 209P

Streptococcus pyogenes C203

Esherichia соН SC2927

Esherichia соИ SC8294

Pseudomonas aeruginosa SC8329

Candida aIblcans SC53I4

Trichomonas vagInalts SC8560

Способ получения антибиотика путем культивирования культуры Bacillus circularts в аэробных условиях, в водной питательной среде, содержащей источник углерода, азота и минеральные соли, с последующим выделе12,5

1,6

0,6

0,4

0,8

9,4

=- 50,0

6,3

0,8

0,6

0,3

0,8

9,4

25,0

3,1

0,4

0,6

0,3

0,4

6,3

37,5

2,4

0,4

0,4

0,3

1,2

4,7

25,0

3,1

1,6

12,5

> 100,0

>25,0

440847

7 Д 3 70 72 75 ZG = 0 4-. 50

3 4 аг

0,9,. аб о,в !!

5 бОО ЕОО МО

00 1д 0 7бО

О0 г О 7400

i 00 7!700 d00

000 Л 00 а 00

7 8 9 70 !2 75 20 Л 40Я7

4 5

02

10

1 ! +Оп !яаа !ООО фаО g o аа да

ВОО О

ОООО.са, ы, аа >Оа !60 (Pgz б

Об

70

4 000 ЛОО .3 00 1500 M00 00 7б00!

400 00 OD 000 б О

400 г00

@us 7

С!

Об ю

70 !

5 а о в

8 9 10 1 1 _#_ 30 4050

440847

7 д 9 70 72 15 20 Я +050

02

10

4000 3 00 Л000 2 Оо 2 00 О 0 1б 0 1400 1200 1 00

00 000 400 200 б

7 8 9 10 72 15 20 Я 4050

00

oz о.г

0.2

О.б

Од

15

75

Составитель О. Сливкина

Техред В. Рыбакова

Корректоры; Л. Котова и И. Позняковская

Редактор Д. Пинчук

Заказ 784/4 Изд. № 381 Тираж 456 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

Москва, 3(-35, Раушская наб., д. 4/5

Типография, пр, Сапунова, 2

4 00 1 00 Ä 00 2 00 2 00 10 0 1000 Ясо 1200 100 Ю0 Ы0 Ф 0 200