Способ моделирования синтеза ревматоидного фактора

 

Союз Советских

Социалистических

Республик

ОП ИСАН И Е

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

III45490l (6!) Зависимое от авт. свпдстсльства— (22) Заявлено 27.09.71 (21) 1701938/31-16 (51) М.Кл, А 61Ь 10/00

G 01п 33/!6 с присоединением заявки №вЂ”

1асударственный комитет

Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий (32) ПриоритетовЂ

Опубликовано 30.12.74. Бюллетень № 48 (53) УДК 616.12-002.72 (088.8) Дата опубликования описания 12.04.75 (72) Автор ы изобретения

Е. В. Бененсон и Л. К. Буренкова (7!) Заявитель

Пермский государственный медицинский инстит (54) СПОСОБ МОДЕЛИРОВАНИЯ СИНТЕЗА

РЕВМАТОИДНОГО ФАКТОРА

Изобретение относится к области медицины.

Известна модель индукции ревматоидного фактора .при трансплантации органов путем стимуляции клеток иммунной системы аллогенной тканью.

Однако известная модель затрудняет изучение механизмов образования ревматоидного фактора.

С целью упрощения и стандартизации методики его получения по предлагаемому способу производят in vitro взаимодействие культуры лимфоидных клеток периферической крови человека с первичной культурой аллогeHHbIx фибробластов с последующим определением ревматоидного фактора в надосадочной жидкости.

Способ моделирования синтеза ревматоидного фактор ln vItlo включает следующие этапы: получение лимфоцитов периферической крови здоровых лиц; приготовление первичной культуры фибробластов эмбриона человека; методику внесения и культивирования лимфоцитов в культуре аллогенных фибробластов, в числе и в присутствии винбластина; методику обнаружения ревматоидного фактора.

Получение лимфоцитов периферической крови здоровых лиц. Культуру лейкоцитов получают методом осаждения венозной гепаринизированной крови. Лейкоконцентрат дважды отмывают от плазмы средой 199 центрифугированпем при 1000 oo/.чин в течение 5 лгин и заливают 10 л .г этой среды íà 20%-ной телячьей сыворотке. На следующий день надосадок сливают, и лейкоцитарную массу, состоящую из лимфоцитов, ресуспендируют в этой питательной среде из ра чета 2 лиг на

2 10 клето.к.

Приготовление триисинизированных культур тканей эмбриона человека. Шести-двенадцати

t0 недельные человеческие эмбрионы сразу после доставки трижды отмывают раствором гидролизат-лактальбумина с высокой когщентрацпей антибиотиков (1000 ед пенициллина и

1000 ед стрептомицина на 1 лиг среды), затем

15 отбирают кожномышечную ткань, отмывают этим раствором, измельчают стерильными ножницами до кашеобразного состояния и помещают в колбу для трипсинизацпп. В эту колбу добавляют подогретый до 37 C

20 0,25%-HI,III раствор трипс|ша «Дифко» в таком количестве, чтобы осевшая ткань была покрыта слоем жидкости 1,5 — 2 с.ч. Во время инкубации ткань постоянно в течение 5 лгин встряхивают, затем трипсинизировапную взвесь кле2б ток удаляют и в ткань вносят свежую порцию трипсина. Взвесь клеток в обеих порциях трипсина центрифугируют при 1000 об/лгик в течение 5 лгин, ресуспендпруют и разводят питательной средой (гидролизат-лактальбумина, 10 — 1 5О/о-ная телячья сыворотка с добавче45490!

Составитель С. Малютина

Техред Г. Дворина

Реда.ктор Н. Суханова

Корректор Л. Котова.

Заказ 135 Изд. ¹ 1957 Тираж 482 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делаи изобретений и открызий

Москва, Ж-35, Раушская наб., л. 4/5

Обл. тип. Костромского управления издательств, полиграфии и книжной торгова 1 нием 100 ед пенициллгина и 100 ед стсптом1щпна с таким расчетом, чтобы в 1 мл содерж.тлось 500 000 клеток). Полученную взвесь в количестве 2 мл разливают в стерильные пенициллиновые флаконы, которые помещают в термостат при 37 С.

Методика внесения и кулыивирования мелифоцитов в культуре аллогенных фибробластов, в том числе и в присутствии винбластина.

Лимфоциты периферической крови в количестве 2)(10 клеток в 2 мл среды 199 па 20%-ной телячьей сыворотке, вносят в одноа точную первичную культуру аллогенных фибробластов после удаления из пее питательной среды.

В ряде опытов взвесь лимфоцитов, вносимая в монослой фибробластов, -одержала мг х1пЬ)аЖпе s1!lf!trici. 1хулыивировапие производят в термостате при 37 С. Одновременно с основным опытом, включающим пробы с винбласт:1ном, ставят контроли на отсутствие спонта1гной продукции ревматоидного фактора: взвесь лимфоцитов периферическои крови здоровых лиц; первичная культура аллогс IHbtx фибробластов.

Через 24 — 96 час культивирования в надосадочных жидкостях опытных и контрольных проб производят обнаружение ревматогидного фактора.

Методика обнаружения ревматопдпого фактора. Дерматоловую пробу используют как дающую наиболее специфические результаты.

Суспензию дерматолога (! г дерматолога в

25 мл натрий-боратного буфера рН 8,2) тщателы1о размегпива1от и оставля1от 11а 1 час при комнатной температуре. После оседания крупных частиц верхп1ою прозрачную жидкость отсасывают пипеткой, а средний слой сливают и центрифугируют при 5000 об/мин в течение ! 0 мин. Надосадочную жидкость сливают и взвесь дерматола ресуспендируют в 1 мл натрий-боратного буфера. 1х суспензии частиц осторожно по стенке добавляют 0,2 мл

0,5 (0-íîãî ампульного раствора человеческого у-глобулина и оставляют на 30 11ин при комнатнои температуре. Реакцию ставят на стекле. 1х Ilo ледоватсльным двойным разведениям (1:2, 1:4, 1:8 ... 1:128) 11сследуемого образца трех-, чет»! percy оч пой н адосадоч ной жидкости добавляют дермаголовые частицы, нагруженные у-глобулипом, Результат уч:1тывают визуально !I под микроскопом через 2 — 4 11ин.

Оценивают рсакцгио по разведениям падосадоч1ий ж11дкости, вызывающей аггл1отпнацию половины и более дерматоловых частиц.

Предмет изобретения

Спо;об моделирования синтеза ревматоидного фактора путем стиму IHt! IIII клеток иммунной системы аллогенной тканью, отлича1о1циися тем, что, с целью упрощения и стандартизации методики его получения, производят 111 х.11го вза11модействие культуры лимфоидных клеток

Зр периферической крови человека с первичной культурой аллогенных фибробластов . последующим определением ревматоидного фактора в надосадочной жидкости.