Способ получения алкилированных нуклеиновых кислот

 

О П И С А Н И Е о>) 836184

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

Союз Советских

Социалистических

Республик

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт, свид-ву— (22)Ъаявлено ТФ.05,74 (21) 2022812 04 (51) М. Кл.е

С 07 В 27/00 !

IC 07 H 21/OG с-присоединением заявки №

Гасударстеениы>й комитет

Совета Министров СССР ао делам иеооретений н аткры!тий (23) Приоритет (43) Опубликовано 25.11.76. Б(оллетень ¹ 43 (53) УДК 547.963.3(088.8) (45) Дата опубликования описания l5,06.77 (72) Авторы изобретения Н. И. Грииева, Г. Г. Карпова, С. д. Мызина и T. А. Фаткулнна (71) Заявитель Новосибирский государственный университет (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АЛКИЛИРОВАННЫХ

НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ

Изобретение относи гся к способу получения алкилиронанных нуклеиновых кислот, что дает возможность исследон;пь псрничную структуру и биологические функции нуклеиновых кислот.

Исследование нуклешювых кислот имеет большое практическое значение для изучения про>тессон наследлие»носги, а также дчя изучения проблемы рака.

Известно доста >очно много ал кили рую»>их реагентов, взаимодейстнующих с гетероциклическими основаниями нуклеинов ых кислот, в том числе и производные хлорз1илариламинон.

Однако к недостаткам известных способов алкилиронония I етсроникли >вских оснований в составе нуклеиновых кислот следует о1нести отсутствие избирательности действия таких реагентов: больнгинстно алкилирующих реагентов реагируют в соизмеримой степени с адениновыми, гуаниновыми и цитозиновыми щх>изводив>ми в составе нуклеиновых кислог. В то же время для структурных исследований нуклеиновых кислот большое значение имеет специфическое взаимодействие реагента только с одним типом гетероциклических оснований, входящих в состав нуклеиновых кислот, например только с производными гуанина.

С целью избирательного алкилиронания только гуаниновых оснований в составе нуклеиновых кислот описывается способ получения алкилированных нуклеиновых кислот, заклк>чанициися н б том, что в известный процесс алкили1к>нация нуклеиновых кислот производными хлорзпглариламинон добавляют карбонилсодержашие ароматические ал ьде гиды.

Процесс осуществляется при температуре

10 0 — 70 СирН6 — 7.

Наиболее целесообразно осущестнлят> алкили ронание нуклеиновых кислот в присутствии

2 — 4-кратного избытка карбонильного соединения по отношению к суммарному содержанию аленина и цитозина в составе нуклеиновой кис>н>гы и рН раствора поддерживать постоянным добавлением

0,1 н. раствора щелочи.

Описываемый способ специфического алкили20 рования гуанииовых оенований в нуклеиновых кислотах основан на том, что карбонильные соединения образуют с производными аденина и цитозина лабильные алкилольные производные и препятствуют алкилированию этих гетероциклических осно25 ваний, но не гуанина.

536154 (оставитсль (.. Чернова е"ред О. Пи оная редактор Н. Джа рагс.пи

Корректор В. Салка

Тираж 575 Подписное

ЦИИИПИ Государственного комитета (овета Минно)ров С((.Р ио делам изобретений и откргитий

1! ЗВ15, Москва. Ж-35. Раугиская наб., д. 4/5

Зака s 5750/271

Филиал ППП "Патент", <. Ужгород, ун. Проектная, 4,!1ан1н и! способ может представлять особый интерес дпя алкипи!х1вания (уаниновых оснований в виславе деэоксприбонукпсиновых кислот (ДНК) в свя гп с проблемой специфического расщепления этэ х биопопил1еров.

II ð и ме р !. Ллкнлирование Д11К 4- (;.. й—

-хиорэтиз1- N- метила мино) бензиламином (NH CH

RCI) в врзисутствии и-диметипамшгобепзальдегида (ДМЦ.

В колбу помещают 25 мг ДНК (денатурированной нагреванием или нативной) в 25 мл Н,О и

23,4мг ДМБ в 5 мл диоксана (до конечной концентрации диоксана в растворе равной l77o) . После этого вносят в реакционную среду 38,5 мг NHp CH>

RCI (или л1обого другого алкилирующего are na).

Смесь выдерживают при 50 С в течение 8 час, поддерживая постоянным значение рН б,2 добавлением

О,1 и. КОН. После окончания реакции ДМБ экстрагируют эфиром до отсутствия оптического поглощения при 330 ммк м. После удаления ДМБ осаждав,т алкилированную ДНК и выделяют целевой продукт известными методами. Контроль 33 ходом реакции осуществляют, определяя количество не модифицироватп(ых оснований в нуклеиновой кислоте и накопление алкипированных оснований после кислотного гидролиза алкилированныхДНК

В описанных условиях алкилировапию подверга ется только гуанин. Выход алкилированных про изводных гуанина в составе ДНК составляет 95% о: исходного.

Пример 2. Ллкипирование риоонуклеиповой кислоты (PHK) 2-„3 -0- (4- (N-2-хлорэтип-N-метипамино) бензилиден) -уридином (URCI) в присутствии 4- (N-2-хлорзтил- N- метилачино) бен зальдсгида (RCI).

В копоу помеп1аит(50 мг URCI и 50 л1г RCI, растворенных в 30 мл диоксана, и добавпяизт 20 мг

Р!1К я 70 мл воды. СMecb вьц(сржп1ают при 50 С в о течение 8 час, поддерживая р!1 6,2 добавлением 0,1 н. КСН. По окончании реакции к РНК добавляют

100 мл 0,05 М ацстагного буфера (рН 4,0), содер. жащего 2М NaCI и 400 мл зтанопа. Смесь вьц1ержпвают на холоду l час, и осадок алкилированной

PHK выделяют центрифугированием. Контроль за

111 ходом реакции осуществляют, анализируя смесь методом бумажной и колоночной хроматографии.

Полученные результаты показывают, что количество алкилированного гуанина составляет

90 — 95% от исходного.

Формула изобретения

1. Способ получения алкилированных нуклеиновыЯ кислот путем вэаимодсйствиянуклеиповых кислот с производными хлорэтилариламинов, о т -, л и ч а ю щ и и ся тем, что, с целью избирательного алкилнрования гуанина в нуклеиновых кислотах, процесс проводят с добавлением карбонилсоои держащего ароматическогО альдегида при температуре 0-70оС и рН 6 — 7.

2. Способ по и. l,, отличающийся тем, что количество вводимого карбонилсодержащего ароматического альдегида составляет 2--4-кратный избыток по отношению к исходному содержашпо нуклеиновых кислот.

3. Способ по и. 1, отличающийся тем, что рН поддерживают постоянным добавлением 0,1 и. раствора щелочи.