Способ получения кормовой добавки для сельскохозяйственных животных

 

п11 563897

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ

Союз Советских

Социалистических

Республик (61) Дополнительный к патенту (51) М. Кл.з- А 23К 1/00 (22) Заявлено 13.04.73 (21) 1907400/15 (23) Приоритет — (32) (31) (33)

Опубликовано 30.06.77. Бюллетень № 24

Государственный комитет

Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий (53) УДК 636.085(088.8) Дата опубликot.atit описаш я 19.09.77 (72) Авторы изобретспия

Иностранцы

Реймонд Кенворти и Филип Портер (Великобритания) Иностранная фирма

«Юнилевер Н. Ф.» (Нидерланды) (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОРМОВОЙ ДОБАВКИ

ДЛЯ СЕЛЪСКОХОЗЯЙСТВЕННЪ|Х ЖИВОТНЫХ

Изобретение относится к области получения кормовых добавок для сельскохозяйственных животных, преимущественно для телят, на основе продуцентов микроорганизмов.

Известны способы получения кормовых добавок путем выращивания микроорганизмов, например, бактерий, продуцирующих молочную кислоту.

Однако получаемые таким способом добавки не оказыва;от какого-либо профилактического действия на организм животного, так как бактерии, используемые для их приготовления, не являются патогенными.

Наиболее близок к изобретению способ получения кормовой добавки на основе выращивания патогенного микроорганизма.

Недостаток такого способа состоит в том, что получаемый продукт пс содержит в достаточном количестве эидотокспнов, которые наиболсе важны для создания высокого иммунологичсского эффекта.

Телята, особенно первые дни жизни, склонны к расстройствам желудочно-кишечного тракта, преимущественно к сальмонеллезу и расстройству, вызываемому патогенными бактериями Escherichia coli. Наиболее часто это происходит при транспортировках, изменениях рациона и т. п.

Целью изобретения является повышение сопротивляемости организма телят к желудочно-кишечным заболеваниям.

Для этого по предлагаемому способу культивируют микроорганизмы Sàløottållà dublin и/или Ьа1шопе11а 1ур111п1пг1шп, и/или Eschcrichia coli серотипов 08 и/iiли 09, и/или 015, и/или 078, и/или 0114, и/или 0137, и/или 0139, затем бактерии отделяют от культуры, суспсн1о дируют, и полученную суспензию подвергают термообработке для выделения эндотоксинов, при этом термообработку ведут при температуре 68 — 125 С в течение 30 — 60 мин, а для болсс эффективного выделения эндо оксинов

15 суспензию после тсрмообработки обраоагывают этано Ioì или трипспном.

Технология способа состоит в следующем.

Получение и выделение эндотоксинов. Зидотоксины получают из штаммов Яа!шопс1,а и

20 семи ссротипов E. coli методом, который согласуется с методом Вестфаля, 1юдсрнца ll

Бистера.

Высушенную при замораживании культуру микроорганизмов восстанавливают в пептоно25 вой воде и выдерживают 6 ч в термостате прп

37 С. После выращивания культуру провсряют на чистоту на пластинкс агар-агара с промытой овечьей кровью, а затем используют

563897

4О

;-о

65 для инокулирования твердых косых питательных сред (питательный агар, оксоид) в колбах Ру. Культуру выращивают при 37"С в течение ночи, и бактерии собирают в стерильную дистиллированную воду. Полученную бактериальную суспензию переносят асептически в 30-миллиметровые универсальные склянки и центрифугируют 10 мин при 4000 об/мин. )Кидкость удаляют, остаточные гранулы бактерий повторно суспендируют в 4 мл стерильной дистиллированной воды, а затем высушивают вымораживанием.

Для выделения эндотоксинов 0,5 г высушенного замораживанием материала суспендируют в 5 мл 0,15 М NaCl и растворяют в

10 мл 90 / -ного водного фенола. Смесь нагревают 30 мин при 68"С, непрерывно перемешивая, после чего ее центрифугируют при

4000 об/мин для уплотнения остатков клеток.

Водную фазу удаляют, охлаждают до 4" С и медленно добавляют к ней 10 объемов охлажденного льдом этанола. Образующийся осадок вновь растворяют в воде, и из раствора добавлением двух объемов этанола осаждают нуклеиновые кислоты, которые удаляют. Из остаточного раствора осаждают эндотоксины, вводя 8 об.ьемов этанола. Их отделяют центрифугированием, промывают охлажденным на льду этанолом и повторно растворяют в

О, 15 М N a C l. Получают раствор э ндото ксинов — реагент № 1.

Получение иммунной сыворотки. Для получения специфической гипериммунной сыворотки используют промытые инактивированные нагреванием (100 С, 2,5 ч) организм E. coli u

Salmonella. Из них на основе раствора 0,1 М

NaCl готовят суспензию, содержащую 3Х

)(10 организмов на 1 мл, которую вводят внутривенно новозеланским белым кроликам.

Иммунизацию начинают с дозы 0,1 мл и каждый четвертый день дозу удваивают. Через

10 дней по завершении программы иммунизации у кроликов берут кровь, центрифугируют ее и собирают верхний слой — гипериммунную сыворотку (реагент № 2) .

Для определения активности антител (антиэндотоксинов) в иммунной сыворотке 5 /ц -ную суспензию промытых клеток эритроцитов овцы сенсибилизируют одинаковым объемом раствора эндотоксинов (реагент ¹ 1) при 37 С в течение 30 мин. Сенсибилизированные клетки разделяют центрифугированием, отмывают от избытка эндотоксинов и повторно суспендируют в 0,15 М NaC1 для получения 2,5 / -ной суспензии из эндотоксина и сенсибилизированных эритроцитов овцы (реагент № 3).

Иммунную сыворотку разбавляют последовательно 0,15 М раствором NaCI и получают растворы равного объема (1 объем) с концентрацией антител 1/5, 1/10, 1/20, 1/40 1/(5)(X2" — ). Затем к каждому из этих растворов добавляют 1/5 объема реагента ¹ 3. Гемагглютинация происходит в более крепких растворах иммунных сывороток, а не в более слабых, и за конец титрования (при 4 С) принимается раствор, в котором гемагглютинация происходит сразу. В типичном процессе это может быть двенадцатый раствор реагента № 22, т. е. раствор с концентрацией антител (5X2") и с титром 5)(2"=10240.

Прп измерении концентрации эндотоксинов испытуемый раствор (Y) последовательно разбавляют 0,15 М раствором NaC1 и получают растворы равного объема (3 объемa) с концентрацией эндотоксинов 1/3, 1/6, 1/12, 1/24 и т.д.

К каждому из этих растворов добавляют

1 объем реагента № 2 с титром 20 и через несколько минут 1 объем реагента № 3 и получают новые растворы с конечными концентрациями эндотоксинов 1/5, 1/10, 1/20, 1/(5X

X2" — ) . В типичном процессе гемагглютинация заканчивается сразу в шестом растворе с концентрацией эндотоксинов 1/(5X2" ) и титром 5 2 = 160, что эквивалентно 160 единицам эндотоксина на 1 мл.

Для получения сырого эндотоксинного материала бактерии основного штамма микроба высевают штрихом на промытые пластинки

arapa и крови (для Escherichia coli) или на пластинки питательного arapa (для Salmonella) и выдерживают 24 ч в термостате при

37 С. Затем пластинки проверяют на чистоту штаммов.

Колонии бактерий переносят с пластинок в

50 мл оксоидного питательного бульона № 2 (каталог М СМ 67) и выдерживают 24 ч в термостате со встряхиванием при 37 С. Полученной культурой инокулируют 15 л питательного оксоидного бульона № 2, который нагревают, перемешивая, при 37 С в течение 24 ч.

Каждая полученная таким образом окончательная культура содержит 10 — 10" жизнеспособных бактерий на 1 мл.

Пробы культур E. coli, пропариваемые 2 ч при 125 С, дают титр 2560, что соответствует

2 560 единицам эндотоксина на 1 мл пропаренной культуры. Пробы культур Salmonella dublin u Salmonella typhimurium, обработанные аналогично, дают титр 1280 каждая.

Каждую из девяти культур (семь Е. coli H по одной на каждый из серотипов Salmonella) центрифугируют для разделения бактерий, которые затем повторно суспендируют в части отделившейся жидкости с целью получения суспензии с концентрацией в 30 раз превышающей концентрацию культуры до центрифугирования. Каждую суспензию отдельно пропаривают 2 ч в автоклаве (125 С) для умерщвления бактерий, а затем все девять смешивают.

Получение корма для телят. Смешанные пропаренные суспензии (1 вес. ч.) перемешивают с порошком сыворотки молока и вводят в стандартный заменитель молока следующего состава, вес, /ц.

Составитель Е. Арская

Редактор Н. Хубларова Тсхред Л. Гладкова Корректор Л. Котова

Заказ 1657j5 Изд. ¹ 595 Тираж 585

НПО Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, К-35, Раушская наб., д. 4,5

Подписное

Типография, пр. Сапунова, 2

Порошок простокваши с добавкой жиров 77,0

Порошок сыворотки молока 17,1

Глюкоза 5,0

Осажденный мсл 0,3

Дикальцийфосфат 0,4

Следь| минералов и витамины в носителе 0,2

Получают продукт с концентрац| ей эндотоксинов каждого серотипа Е. Col! 100 ед./кг корма и каждого серотипа Salmonella 50ед./кг корма.

Формула изобретения

1. Способ получения кормовой добавки для сельскохозяйственных животных, преимущественно для телят, включаю ций культивированне патогенных микроорганизмов, о тл и ч a1o Ilr и и с я тем, что, с целью повышения сопроз iionяcмoсT.1 тслчт и желудочно-кишсчнbIM забОлсваниям, 1 3 IhTIIBIIpr, 10T микрооргaHIIaмы

Salmons!1а ац!з11п и ii.aи Salптопсl!а 1уphimuгп1пт Ii или Escl1colc111a СО11 серотипов 08 и/или

09, и/или 0,15, и/или 078, и/или 0114, и/или

0137, и/или 0139, затем бактерии отделяют от культуры, суспендируют, и полученную суспензию подвергают тсрмооораооткc для выдел IIIIII эндотоксппов.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что термообработку ведут при температуре

68 — 125 C в течение 30 — 60 мин.

15 3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что, с целью более эффективного выделения эндотоксинов, сА ciIcFI3IIIO IIoc Ic тсрм00бработкп обрабатывают этаиолом или трипсином.