Способ получения пептидов или их солей или амидов или сложных бензиловых эфиров

 

Союз Советски»

Социалистически»

Республик 651691

L (61)Дополнительный к патенту .(22) ЗаявлЕно 24.08.73 (21) 1959390/23-04 (23) Приоритет -- {32) 5.08.72

{31) КХ-481 {331 BHP

2 (5l) М. Кл.

С 07 С 103/52

//А 61 K 37/02

Гевударвтввины& ивмитвт

СССР: ив двлам извбрвтвинй и втирытий (53) У ДК 547. 9 84 ..4.07 (088.8}

Опубликовано 05. 03.79е Бюллетень № 9

Дата опубликования описания 09.03.79

Иностранцы т. и П Я

Миклош Лев, Лайош Кишфалудь, Агнеш Паггь, МарйЪ Сирмай, Ольга Ньекй, Ласло Спорни, Дьердь Хайош (BHp ) ) (7р:; -, е -. -ьр 1 О

Иностранное предприятие

"Рихтер Гедеон Ведьесети:Вья о3 1",, (ВНР ) (72) Авторы изобретения (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЕПТИДОВ ИЛИ ИХ СОЛЕЙ, ИЛИ АМИДОВ, ИЛИ СЛОЖНЫХ БЕНЗИЛОВЫХ ЭФИРОВ

Изобретение относится к способу nohyчения новых пептидов-укороченных аналогов адренокортикотропного гормона (AKlT), содержащих на обоих концах цепи остатки а(.-аминоокснкислот, обладающих свой- о ствами АКТГ, которые могут найти применение в медицине. .В пептидной химии широко распространены способы получения пептидов отщеплением, групп, защищающих функциональные 10 группы (амино-, аминоокси- н карбокснльные группы), концевые и боковые цепи, путем ацидолиэа (1).

Целью изобретения является получение укороченных аналогов АКТГ, содержащих 15

l8, 19 аминокислотных остатков, актив носгь которых не ниже активности АКТГ с 24 аминокислотами в цепи.

- --Цель достигается описываемым способом получения пептидов общей формулы

H-Э-ОСер-Тир-CepMe r-Глю-Гис

-ч енА рг-Трп-Гли-Лиэ-Про-Вал Гли-Lllv33g Х (1) где = 3, 4;

1 — еХ -О;ЛизОН, - Q- О-ЛизОН, I

-О-Гл нОН.; или их солей, илн амидов, или сложнь1х бензиловых эфиров, заключающийся в тоМ, что от пептидов обшей формулы (? ), в которых П и Х имеют вышеуказанные значения и в которых, по крайней мере концевые аминооксигруппы, аминогруппы боковой цепи, а также в случае необходимости концевые карбоксильные группы и карбоксильные группы боковой цепи защищены, отшепляют защитные группы ацидолизом с последующим выделением целевых продуктов в свободном виде wzh в виде их солей, или амидов, или бензиповых эфиров.

Применяемые в качестве исходного вещества защищенные пептиды могут быть получены, исходя из соответствующих d аминокислот и аминокислот, известными способами путем конденсации фрагментов или удлинения цепи по необходимости на одну аминокислоту, причем для этой цели могут быть использованы различные спо651691 ф собы, например аэидныи, метод активированных эфиров.

Функциональные группы, не принимающие участия в реакции, целесообразно защищать группами, которые могут быть от- 5 щеплены с помощью известных приемов, например ацидолиза, гидролиза, гидрогенолиза или в результате восстановления., Карбоксипьные группы, например, могут быть защищены главным образом в ребаб эультате этерификации MeTKIoablM третбутиловым, бенэиловым, fj -хлорбензило« вым, и -нитробензиповым спиртами или в результате образования амида. Для защиты аминоокси- и аминогрупп могут быть 35 использованы различные защиты: трет-бутипоксикарбонильная, тозильная и т.п.Гуанидиновая группа аргинина может быть защищена нитрогруппой. Для защиты ими ногруппы т истндина используют бензиль- 26 ную, тритильную или динитрофенильную группу, Гидрооксильные группы, которые находятся в боковых цепях, защищают путем перевода их в простые эфирные группы, причем этерификацию предпочтительна проводят с применением трет-бутипового или бензйпового спирта, Прйменяя подходящую комбинацию за-. щитных групп, можно достичь селективного и одновременного удаления их известным способом.

Наиболее предпочтйтельный вариант осуществления способа следуюший. Защищенную о,-аминокислоту вводят в реакцию конденсации с метиловым эфиром трипепЯ тица - Тир-Сер-Мет-ОСН, гидраэид полученного замешенного метилового эфира тетрапептида вводят в реакцию с обр зованием аэида и затем полученным соеди-, 40 нением ацилируют декапептид -Глу(ОБут)-Гис-Фе-Арг-Три-ГлиЛиз-(БОК )-Про-Вал-Гли. Полученный указанным способом замешенный тетрадекапептид конденсируют со сложным эфиром пентода, сос45 тоящего из соответствующих замешенных аминокислот, расположейных в иной йоследовательности. Образовавшийся гидразид замешенного эфира пептида вводят в реакцию с образованием азида и получен59 ным соединением аципируют соответствующее защищенное производное С-конечной аминооксикислоты. Так, например, при получении замешенного гептадекапептида замещенный тетрадекапептид конденсируют со сложным эфиром 15-16-дипептида, 55

При получении замешенного октадекайеп гида проводят конденсацию со сложным эфиром 15-17-трипептида, а эамещенно го нонадекапептида - со сложным эфиром

1 5-1 8-те тра пептида, Целевой продукт, освобожденный от

-имеющихся в нем защитных групп, может быть очищен с помощью хроматографии на колонке, например ионообменной хроматографии на различных сортах карбоксиметилцеллюло зы.

В зависимости от способов, использованных при получении новых соединений, последние могут быть выделены в ante свободных оснований или в виде солей. Со ли, полученные известными способами, могут быть использованы дпя фармацевтичес ких целей.

При исследовании соединений с помощью хроматографии в тонком слое используют в качестве адсорбента силикагель по Шталю и следующие смеси растворителей: этиловый эфир уксусной кислоты: (пиридин:уксусная кислота:вода = 20:6:

;11) = 99:1; этиловый эфир уксусной кис лоты: (пиридин .уксусная кислота:вода =

=20:6 .11)=8:2; этиловый эфир уксусной кислоты:(пиридин:уксусная кислота:вода

=20:6:11), = 6;4;

Пример 1. З-ОСер-Тир-Сер

Мет-Глу-Гис-ФеА рг-Три-Гли-Ли э-Про-Вал-4 ли-Пиз Лиэ-Лиз-Олиз- КН2.

0,75 r (0,267 моль) БОК-Э-ОСер-Тир-Сер-М ет-Гл у (О Бут) -Гис-Фен-А рг-Три-Гли Пиз(БОК) Чиэ-(БОК)-Лиэ(БОК)-ОЛиз(Фор)- NH> растворяют в смеси из

6 мл трифторуксусной кислоты, 0,75 мл воды и 0,75 мл аниэола, Приготовленный раствор выдерживают в течение 1 ч и затем разбавляют 150 мл диэткпового эфира, Выпавший в осадок продукт отфильтро- . вывают, промывают эфиром и сушат в вакууме над пятиокисью фосфора и гидроокисью калия, В результате получают

0,70 r (86%) трифторацетата замешенного формилоктадекапептида. Образовавшееся вещество растворяют в 10 мл воды, к раствору прибавляют 0,26 мл меркаптоэтанола и рН раствора доводят до 5, прибавляя 1 н. раствор едкого натра. После этого раствор смешивают с 11,5 мл

2 М раствора гидразинацетата и приготовленную смесь выдерживают 2 ч на водяной бане при 95 С. Затем реакционную смесь концентрируют в вакууме и концентрат вносят в колонку, заполненную ионообменной смолой марки Ватман СМ 52.Элюируют приготовленным из 0,2 М (рН 6,7) и 0,5 М (рН 6,7) аммонийацетатных буQpoa буферным раствором с линейным градиентом, соответствующие фракции вы

65169

5 сушивают лиофилизацией и получают

0,275 г (38%) замешенного октадекапептидамида, Применяемый в качестве исходного вещества защищенный замещенный октаде- Ю капептидамид получают по следующей методике:

Стадия l. L - с трет.-бутилоксикарбониламиноокси- Е-формиламинокапроновая кислота (БОК)-ОЛиз(фор)). 36

23,2 г (60 ммоль) И-6-формил-З-лизина и 43,2 г (423 ммоль) бромистого натрия растворяют в 248 мл 2,5 н. раствора серной киспоты. Приготовленный раствор охлаждают до О С и при переме- И шивании прибавляют к нему небольшими порциями в течение 30 мин 13,3 r (192 ммоль) нитра.та натрия. Реакционную смесь перемешивают при О С в течение о

1 ч, затем при комнатной температуре в 2О течение 1 ч и непосредственно после это.го три раза экстрагируют 200 kn диэтилового эфира. Обьединенные эфирные экстракты сушат и упаривают досуха. Получают 18,4 r неочищенной З - poM25

-Я-формипаминокапроновой киспоты. Образовавшийся продукт растворяют в 190 мл этипового спирта и к раствору прибавляют

8,4 г (150 ммоль) гидроокиси калия и

10,0 г (76 моль) трет.-бутипоксикарбо36 нилгидроксиламина. Реакционную смесь нагревают 2 ч при температуре кипения и затем выдерживают в течение ночи при комнатной температуре. После этого растзз воритель отгоняют, остаток растворяют в

80 мл воды и рН полученного раствора доводят до 3, приливая 10%-ный раствор соляной кислоты. Кислый раствор насыщают хлористым натрием и трижды зкс40 трагируют 150 мл диэтилового эфира, а затем 150 мл этилового эфира уксусной кислокы. Эфирную фазу и раствор продукта в этиловом эфире уксусной кислоты обьединяют, сушат и упаривают. Кристаллический остаток (16 г) перекристаллизо вывают из 25 мл этипового эфира уксус ной кислоты, В результате получают

10,4 r (27%) (80K-0Лиз (Фор}1, т.пп.

114-11.6 С. и = 0,31, baal = -52 5 (с 1, метиповый спирт).

Найдено, %: С 49,9; Н 7,6-, С Нгх И 0 (290,32)

Вычислено, %: С 49 6 Н 7 65.

Стадия 2. г -о{трет.-бутилоксикарбонгщаминоокси- 6.формиламинокапроновая кислота, амид jBOK-ОЛиз(фор)- И Н .

5,0 г (17,2 ммоль) БОК-Опиз(фор) растворяют в .107 мл безводного тетра гидрофурана и к приготовленному раствору прибавляют 1,90 мл (17,2 ммоль)

-меетилмоофолина. Раствор охлаждают до -10 С и при перемешивании прикапывают к нему 2,25 мл (17,2 ммоль) изобутилового эфира хлорутольной кислоты.

Реакционную смесь выдерживают 10 мин при -10 С и затем охлаждают до -20 С.

О 0

Непосредственно после этого к реакционной смеси осторожно прибавляют по каплям 10,7 мл (142 ммоль) концентрированного раствора гидроокиси аммония и реакционную смесь перемешивают в течение.

1 ч при ОоС и затем 1 ч при комнатной температуре. Непосредственно после этого отгоняют тетрагидрофуран и полученный остаток, частично закристаллизовавшийся, растворяют в 20 мл смеси, состоящей из этилового эфира уксусной кислоты, пиридина, уксусной кислоты и воды, взятых в соотношении 90:54:16:30Ä и вводят в колонку емкостью 250 мл, заполненную сипикагелем. Элюируют указанной смесью. фракции, содержащие целевой продукт, собирают и упаривают. Получают

4,3 г (86%) БОК-ОЛиз(фор)- МНя в виде слабо окрашенного в желтйй цвет аморфного вещества. Я = 0Ä54.

С 2 Н2 З ЫЗО (289,34 .

12 2З 3 6

Стадия 3. трет.-Бутктоксикарбонил-33-<=

-аминоокси-Р -бензилоксипропионовая кис» лота.

48,4 r (0,364 моль) трет. бутилоксикарбонилгидроксипамина, 40,7 r (0,728 моль) гидроокси калия; и 94,0 r (0,364 моль) З, l. -gLMðîì- Ъ-бензилоксипропионовой киспоты растворяют в 360 мл воды. Реакционную смесь перемешивают и течение 3 ч при комнатной температуре.

Непосредственно поспе этого рН реакционной смеси доводят до 3 и затем трижды экстрагируют 720 мл диэтипового эфира, эфирный раствор промывают 720 мл воды, сушат и смешивают с 78 мл (О;40 моль) дициклогексиламина. В результате получают 43,61 г.соли дициклогексиламина и трет.-бутипоксикарбонил-D, I. -ф;

-аминоокси-ф-бензяпоксипропионовой кислоты, т.пп. 144-146 С. Полученную соль о суспендируют в 500 мл диэтипового эфира и приготовленную суспензию пять раз встряхивают со 100 мп 0,2 н. раствора серной кислоты, Эфирньгй слой отделягот, сушат и упаривают, полученный остаток растворяют в 700 мл этипового спирта, после чего к приготовленному раствору прибавляют 6,56 г (48,5 моль) (+)-амфетаг пинового основания. Раствор выдержива7 651691 юг в течение ночи в холодном месте и на следующий лень отфильтровывают выпавший в осадок кристаллический продукт.

Полученную (+)-амфетаминовую соль трет.-бутилоксикарбонич-1}-,(,-"амийоок« си«- р-

-бензилоксипропионовой кислоты перекристаллизовывают нз этилового спирта, Выход образовавшегося продукта 13,27 г, т.пл, 188-191 С, (ck3 = +54 (с - 0,5, мегиловый спирт). Из соли известным способом получают трет. бугилоксикарбо нилЭД.-аминоокси ЬбензилокСийропиу-. оновую кислот . Выход 7,9 г (14%), г.пл.

9698 С,(Ы.3 +38О(с=1, этиловый спирт)

C адин 4. трет. Бутилоксикарбонил-g -a- >>

-еминоокси- Р-гидрооксипропионовая кислота (БОК- Э-ОСер).

5,5 r (17,7 ммоль) Э -д,-трет,-бутилоксикарбониламиноокси- Jb-бензклоксипропионовой кислоты растворяют в 110 Mll метипового спирта и затем гидрйруют в присутствии 2,75 г 10%-ного катализатора, представляющего собой палладий, нанесенный на актйвированййй уголь. Через 3 ч катализатор отфильтровывают, от фильтрата отгоняют метиловый спирт и маслообрабный остаток заливают петро-, лейным эфиром. Через несколько часов вещество закристаллизовывается. После фильтрования и сушки получают 3,65 г (96% ) Х) -с(трет.-бутилоксикарбониламиноокси- -гидрооксинропионовой кислоты, тепле 949УСе Я Ор27» С Н1 И 06 (221,22).

Стадия 5. БОК- 2-ОСер-Тир-Сер-Мет- "гНз

4,4 г {2() ммоль) БОК-J)-0Cåp и

9,0 г (20 ммоль) Тир- :ер-Мет-ОСН рйстворяют в 30 мл диметипформамида, приготовленный раствор охлаждают до

О С и прибавляют к нему сначала 2,22мл (20 ммоль) й-метилморфолина и затем

3,8 г (18,4 моль) QGK. Реакционную смесь перемешивают в течение 1 ч при

О C и затем выдерживают до следующего дня при комнатной температуре. Выпавший в осадок дициклогекснпкарбамид от; фильтровывают. Фипьтрат упаривают и полученный остаток растворяют в 400 мл этилового эфира уксусной кислоты. Раствор два раза промывают 1 н. раствором соляной кислоты, используя каждый раз по 200 мл соляной «ислогы, и два раза

10%-ным раствором кислого углекислого натрия, применяя для каждой промывки по 200 мл раствора. После этого расг вор сушат и упаривают, Полученный ос- таток (8,10 г защищенного замещенногоэфира геграпепгида} растворяют в 85 мл метилового спирта, к приготовленному раствору прибавляют 2,2 мл (46 ммоль) гидразингидрата и реакционную смесь выдерживают до спедую|цего дня при комнатной температуре. На следующий день от реакционной смеси отгоняют метиловый спирт, полученный остаток растворяют с эгиловым эфиром уксусной кислоты, оса» док отфильтровывают и промьпиют эгиловым эфиром уксусной кислоты и диэгиловым эфиром, после чего сушат над концентрированной серной кислотой. Получа» юг 7,21 r (63%} защищенного замешен» ного тетрапепгидгидразида, r.ïë. 174175 С (вода). К" = 0,30.

Найдено, %: С 48,3; Н 6,6; И 13,8.

Сг Ндо Ь 01оЭ (616,69), Вычислено, %: С 48,7; Н 6,55; N13,6.

Стадия 6. БОК-Э -ОСер-Тир-СерМет-Глу(0 Еут)-Гис-Фен-Apr-Три-4 ли-Л из(БОК)-Про-Вал Гли ° НСВ.

1,25 r (2,13 ммоль) БОК-1}ОСер-Тир-Сер-Мет- И Н растворяют в 15 мл г з диметилформамида и приготовленный раствор охлаждают до -20 C. Затем при перемешивании к нем у прибавляют по каплям сначала 2,08 мл (8,32 ммоль) 4 н. раствора хлористого водорода и этилового эфира уксусной кислоты, затем 0,32 мл (2,70 ммоль) трет.-бутнпнитрита. Реакционную смеаь перемешивают в течение о

5 мин при -10 С, затем охлаждают до

-20 С и прибавляют к ней 2,78 г Глуо

-О Бут)-Гис-Фен-А рг-Три-Гли-Л из (EO К )-lipo-Вал;-Гли и 1,4 мл (8,13 ммоль) диизопропипэтипамина в 23 мл диметипформамида. Реакционную смесь перемешивают в течение 1 ч при температуре о от -5 до О С. и затем выдержибают до следующего дня при О С. Раствор упаривают и полученный остаток растирают с

8%-ным раствором кислого углекислого натрии. После фильтрования, промывки водой и сушки получают 3,49 r (94%) защищенного замешенного,геградекапепги да. Продукт суспендируют в 24 мл метилового спирта и к приготовленной суспензии прибавляют раствор солянокислого пирндина, приготовленный из 4,75 мл концентрированной соляной кислоты и 4,75 мл пиридина. Затем раствор разбавляют240 мп воды, выделившийся при этом осадок .ог» фильтровываюг, промывают водой и, наконец, сушат. Полученный 2,95 г (73%) солянокислой соли за щи шенного re градекапеп- гидо,. r.ïï, 200-202 С. и = 0,25.

Cù H N Ог СВ& (1989 68), 9

651691 10

Стадия 7. Лиэ(БО{(}Лиз{ ОК}-ОСН, ок- стени 0,2 г 10%-ного катализатора. Поссалат. ле завершения реакции каталиэатоо ог11,0 r (17,7 ммопь) . -Лиэ(БОК)- фильтровывают, от фильтрата отгоняют ме-0CH растворяют в 200 мл метилового типовый спирт и полученный в виде остатспирта, приготовленный раствор смешива- 5 ка эфир трипептида растворяют вместе с ют с 2,0 г (22,2 ммопь) безводной ша- 2,42 г (1,24 ммоль) Б01(-З-ОСер-Тир велев о и и к споты и в присутствии 2 О r -Сер-Мет-Глу(ОБут)-Гис-Фен-Лрг-Трп-!

10%-ного катализатора (палпадия на ак- -Гли-Лиз (БОК)-Ïðo-Вап-Гпи ° Р в тивированном угле) гидрируют. Катализа- диметилформамида, К приготовленном> тор отфильтровывают, фильтрат упаривают 10 раствору прибавляют, ( и полученный остаток растирают с диэти- пентахлорфенола и О, О 255 г (1,24 ммопь) повым спиртом. Получают 9,1 r (89%) дицикпогексилкарбодиамида и реакционную шавелевокислой соли эфира дипептида, ко- смесь выдерживают в т ают в течение двух дней торую перекристаппизовывают из смеси при комнатной r м р ур . емпе ат е. Выпавший в изопропилового спирта и диизопропилово- > остаток дицикпогексилкарбамид отфипьтрого эфира. Температура плавления ее 65- вываюг, фильтраг упаривают в вакууме и

С R = 0,34, АЗ = +3 79 (с = 1 продукт осаждают диэгичовым эфиром.ОсI метиловый спирт).

З гагок отфильтровывают, сушат и получа° г О

Найдено, %: С 51,5; Н 7,9; >9,9. ют 3,4 г,r.ïï. 177 С (с раэл.). После

С Н М 0„(578,65). 2@ переосаждения из смеси метиловый спирт

Вычислено, %: .: С 51 9. Н 8 9. И 9 7. эфир получают -2,6 г (80%) солянокислой

° ° t ф у

Стадия 8, - из — из

Л (БОК)-Л (БОК)- соли мегилового эфира эашише эа .пл. 191 С (БОК) ОСН . мешенного гептадекапептида, т.пл. л Кз = 054.

8,1 r щавелевокислой соли Лиэ(БОК}- (с разл.}. R

Лиз(БОК)-ОСН (14,0 ммоль) суспенди» С Н И О Ceo.. (2688,61).

Яб 96 27 34 уют в 60мл этилового эфира уксусной кис» Стадия 10. Б -З- р-Т р-»- р-М

О. БОК- 0-ОСе Тир-Сер-Метруют в

-Г (ОБ г)-Гис-Фен-Арг Трп-Гли-Лизлогы, к приготовленной суспензии прнбав- -Глу(ОБут)- - - p p ляюг сначала 3;1 мл (28,0 ммоль) Я- (БОК}-Про-Вал-Гли-Лиз(БОК}-Лиэ(БОК)-метилморфолина, а затем 6,7 г (14,0 -Лиз (БОК)- Й Н .

2 ммоль) Z -Лиз-(БОК)-ОМ Су. Реакционную смесь перемешивают в течение 2 ч

-Т Сер-Ме1 Глу(ОБуг)-Гис»Фен-Аргпри к и и комнатной температуре, после чего а к- -Т п-Гли-Лнз (БОК)-Про-Вап-Гли-Лиз-Т ир-Сер-М разбавляют 200 M этилового эфира ук- - рп- писусной кислоты и 40 мп воды. После от- (БОК}- (}

К -Лаз(БОК}-Лиз БОК»О . во яют в 75 мл кипящего метиловодепения водной фазы раствор, продукта в растворяют эгиловом эфире уксусной кислоты два ра- го спирт . р а. П иготовпенный раствор охза п омывают 40 мл l н. раствора соля паждаюг до комнатной температуры, смеза промывают ной кислоты и два раза 40 мл 8% ного шиваюг с 0,9 мл, мм раствора кислого углекислого натрия, расг- зингидра р и та и еакционную смесь выдерживо сушат над сернокислым натрием и,на- ваюг в течение двух дц х ей при комнаткой вор сушат на е. Непос едственно после этоконец, упариваюг. Сстагок растирают с температуре. Pеакционной смеси отгоняют метидиизопропиловым эфиром. Продукт пере- го or реакц кристаллиэовывают из смеси изопропило- ловый сп р р пи r и остаток растворяют в апвый спирт - дииэопропиловый эфир. Полу» эгиловом -ф р ом эфи е. Неочищенный продукт чают 8,0 г (67%) метилового эфира за-, p,15 г, т.пл. 199 С (с разл.)) перещишенного грипепгида, т.пл. .пл. 117-118 С. осаждают из диметилформамида и воды.

К = 0,58, (ck)= -17,47 (с = 1, мега- Получают 2,00 г (81%) гидраэида заши щенного замешенного гептадекапептида, r.пл. 205 С (c разл.). R g = 0,49.

Найдено, %: С 59,7; H 8,2. т. пл.

Н О S (2652,16}.

С Н N О < (851,03). С„, Н к у эз

%: С 59,3. И 8,3. Стадия 11. БОК-.Р-ОСер»Тнр-Сер-МетВычислено, %:

-ФенА г-Т и-Гли-ЛиэСтадия 9. БОК-Ъ-ОСер-Тир-Сер-Мег- -Глу(ОБут)-Гис-Фен pr- p

-Глу(ОБут)-Гис-Фен-Арг-Трп-Гпи-Лиз (БОК)- (БОК)-Про-Вал-Гли-Лиз (БОК) Лиз (БОК)-Про-Вал-Гли-Лиз (БОК)-Лиз(БОК) Лиз- >> -Лиз (БОК)-ОЛиз (Фор}- ЙН . . 1,25 r Z - 1иэ (БОК)-Лиз (БОК)-Лиз(Б>ОК}-ОСН растворяют в 25 мл уксусной кислоты. Раствор упаривают в

ИЗ > ме и остаток растворяют в 4 мл димегилоього спирта и гидрируюг в присущ» вакууме и

6516,91

12 метилформамида. Приготовленный раствор нейтрализу "г диизопропилэтиламином. б) 1,00 r (0,377 ммоль) БОК-Э«ОСер Тир-Сер-Мет-Глу (ОБут)-Гис-ФенАрг-Трп-Гль-Лиз (БОК)-Про-Вал-Гли- 5

Лиэ (БОК)-Лиз (БОК)-Лиз (БОК)- М Н растворяют при легком нагревании в 5 мл диметилформамида. Приготовленный раствор охлаждают до - 20 С и при перемешивании прибавляют к нему по каплям сначала 0,54 мл (1,52 ммоль) 2,8 н. раствора хлористого водорода в зтиловом эфире уксусной кислоты и затем 0,05 мл (0,42 ммоль) трет.-бутилнитрита. Реакционную смесь перемешивают в течение о о

5 мин при -10 С, охлаждают до -20 С и затем прибавляют к нему приготовленный в в соответствии с и. а) нейтрализованный трифторацетатный раствор ОЛиэ (Фор)-ИН вместе с 0,2 мл (1,17 ммоль) ди- изопропилэтиламина. Реакционную смесь о перемешивают в течение 1. ч при О С и оставляют до следующего дня. Непосредственно после этого or реакционной мас.сы оттонают половину растворителя и ос- 2 таток разбавляют 20 мл води. Выпавшая в осадок. масса затвердевает при стоянии.

Затвердевшую массу под слоем свежей воды измельчают в порошок, отфильтровывают и сушат. Получают 0,80 r (75,5%) защищенного замешенного октадекапептида, т.пл, 140-145 С, B = 0,47.

С Н, N О 5 (2809,35).

Пример 2. XI«OCep-ТирСер»

-Мет-Г лу-Гис-Фе-Арг-Трп-Г ли-Л из-Ilpo . 35

-Вал-Гли-Лиз-Лиз»Лиз- ц -ОЛиз- И Н .

0,75 г (0,267 ммоль) БОК-Э-ОСерТир-СерМет-Глу(ОБут)-ГиоФе»Арг-ТрпГли-Лиз(БОК)-ПроВал-Гли-Лиз(БОК)- 4о

Лиэ (ГзО К)-Лиз (БО К)-Лиз(БОК )«))-ОЛиз(Фор -НН< растворяют в смеси 6 мл трифторуксусной кислоты, 0,75 мл воды и 0,75 мл анизола. Приготовленный раст вор выдерживают в течение 1 ч и затем разбавляют 150 мл диэтилового эфира;

Образовавшийся при этом осадок отфильтровывают, промывают диэтиловым эфиром и сушат в вакууме над пятиокисью фосфо ра и гидроокисью калия. Получают 0,6 r (80%) трифторацетата замешенного формилоктадекапептида. Образовавшееся ве щество растворяют в 10 мл воды, к раст-вору приливают 0,25 мл меркаптоэтаноlie H pH p8cTBop8 доводят до 5 p>BopoM едкого кали, затем добавляют 10,6 мл

2 М раствора гидразинацетата и смесь выдерживают в течение 2 ч на водяной бане йри 95 С. Раствор, оставшийся пос» ле частичного упаривания в вакууме, вы ливают s колонку, заполненную ионообмен ной смолой марки Ватман СМ-52. Элк ируют буферным раствором, приготовленным из 0,2 М (рН 6,7) и 0,5 М (рН

6,7) аммонийацетатных буферов. Соответ- . ствующие фракции собирают, модифицируют и получают 0,28 r (41% ) замешенного октадекапептидамида.

Применяемый в качестве исходного вещества защищенный замещенный октадекапептидамид получают по следующей методике.

Стадия 1. Э -а трет.-бутилоксикарбониламиноокси- Я формиламинокапроновая кислота (EOK»7)-ОЛиэ (Фор )) .

Способом, который описан в примере 1 (стадия 1 ), из N- Е -формил- g -лизина

< получают )-с(.-трет.-бутилоксикарбониламиноокси- Я -формиламинокапроновую кислоту, т.пл. 114-116 С. л = 0,31,IK3 =

= +58,6 (с 1, метиловый спирт).

Найдено, %: С 5 0,0; Н 7 6

С„ Н и 06 (290,32).

Вычислено, 7 С 49,6; Н 7,65.

Стадия 2, Амид- ц-cb-трет.-бутилоксикарбониламиноокси-формиламинокапроновой кислоты (БОК-3-ОЛиз (Фор)- ИН 3.

Амид получают с«пособом, описанным в. примере 1, исходя из 5,0r (17,2 ммоль)

БОК-2-ОЛиз {Фор). Получают 4,4 r (88%)

БОК-Э-ОЛИВ(Фор)- NH<. R = 0,54.

С12 Н22 ИЪОБ (289,34).

Стадия 3. БОК-3-ОСер Тир-Сер-Мет-Глу (ОБут )-Гис-Фен-Арг-Трп-Гли-Лиз(БОК )-Про-Вал»Гли-Лиз (БОК )-,Лиз (БОК )-Jln3 (БОК)-)3-ОЛиз (Фор)» QH>, И спольэ УЯ О, 57 г (1, 97 м моль )

БОК-Э- ЭЛиз (Фор)- ИН, способом, опи санным в примере 1 (стадия 2), получают 0,90 г (85%) защищенного замешенного амида октадекапептида, т.пл. 140- .

145 C. R y = 0,4.

С1ъ Нгоей оОаа S (2809,35 ).

П р и м е p 3, H-Q Cep-Тир-Сер- МетГлю-Гис-Фен-А рг ТрпГлиЛиз-Про

Вал-Гли ЛиэЛиз-Лиэ ОЛиз» ИН .

1,2 г (0,417 ммоль) БОК-Э-ОСерТир СерМет Глю (ОБут)-Гис-Фен-Арг

-Трп-Гли-Лиз (БОК)-ПроВал Гли Лиз (5OK)-Лиэ(БОК)-Лиэ(БОК)- 5Н2 растворяют в смеси из 9,6 мл трифторуксусной кислоты, 1,2 мл воды и 1,2 мл анизола. Раствор оставляют на 1 ч и затем разбавляют 240 мл эфира. Выпавший осадок отфильтровывают, промывают эфиром ч высушивают в вакууме над пятиокисью фосфора и гидроокисью калия. По13

С 51691 лучают 1,10 r (84%) замешенного ами«, нооксикислогами октадекапепгидамйдгрифторацегага. Сырой грифгорацегаг растворяют в 20 мл воды и грифгорацегатные ионы с помощью ацетатциклического ионо- > обменника марки йауэкс 1 к 8 (фирмы

Ri5brn und Haae) обменивают на ацегагные ионы. Затем таким образом получен ный раствор вводят в колонну (4,546,5 c ) заполненную ионообменником марки Ватl0 ман СМ«52. Элюируют, используя линейный буферный градиент, приготовленный иэ 2 л 0,2 М (pH 6,7) и 2 л 0,5 N (рН

6,7) аммонийацетатных буферов со скорос. тью 80 мл/ч, соответствующие фракции

Ю обьединяют и лиофилизуюг. Получают

0,49 г (41%) замешенного аминооксикар боновыми кислотами окгадекапептидамида.

Содержание пептида 78% (по УФ-спектру), 20 метсульфоксида 2,3%. Соотношение Тир: .Трп = 1:10. Анализ аминокислот:Лиз

3,5 (4); Гис 0,9 (1), Арг 1,0 (1);

Сер 0,85 (1 ); .Гпю 1,0 (1 ); Про 1,0 (1 );

Гли 1,9 (2); Вал 0,9 (1); Мет 0,7 (1);.

Тир 0,9 (1); Фен 1,0 (1). R = 0,18.

Применяемый в качестве исходного вещества защищенный замешенный аминооксикарбоновыми кислотами октадекапеп» тидамид получают следующим образом.

Стадия 1. йициклогексиламиновая соль

4 -0(.-грет,-бу тип-оксика рбонила мин оокси1 - Е -бензилоксикарбонипа минокапроновой кислоты (БОК-ОЛиэ (Z 1 OH-Ч3-СНА ).

Способом, описанным в примере 1 (ста35 дия 1) получают иэ М -Е -бензилоксикарбонил-З-лизина маслянистую 4 - pe T.

-бутилоксикарбониламиноокси- Я -4эенэилокси карбонипаминокапроновую кислоту. Продукт растворяют в эфире и вводят во взаимоло действие с дициклогексиламином до образования дициклогексиламиновой соли, т.пл.

158-161 С (перекрисгаллизована из смео си этанол-вода). R y = 0,15,jg(.3 = -34,5 (с = 1, этанол), Стадия 2. Амид 4 -сС-трет. бутилоксикарбониламиноокси Я-бензилоксикарбониламинокапроновой кислоты (БОК-ОЛиз-3 Z )

-ян ).

Дицикпогексиламиновую соль 1. - oL»трет.-бутилоксикарбониламиноокси - Ябенз илоксикарбониламинокапроновой кислоты экстрагируюг 1 н. серной кислотой, эфирный раствор упаривают. Полученную кислоту способом, описанным в примере 1 (стадия 2), превращают в амид. После выпаривания реакционной смеси сырой продукт растворяют в этипацетаге и промывают водой, 1 н. раствором серной киспв1-1 ты и, наконец, 8 4-ным раствором гидрокарбонага натрия. Зтилацегагную фазу упа ривают. Получают амид lÄ - 4,-грет.-бугипоксикарбониламиноокси-g -бензилоксикар» бонил-аминокапроновой кислоты в виде густого. масла, которое кристаллизуюг из смео си метанол-вода, т.пл. 93-95 С. R

= 0,42, (ck 3> -27,5 (с = 1, метанол).

Стадия 3. Оксалат амида L, -ф.-трет. óтилоксикарбонил-аминоокси- Я -аминокапро новой кислоты (БОК, -ОЛиз-ЙН -оксалат ).

12,0 r (30,4 ммоль) БОК-ОЛиз-(Е 1- NH< растворяют в 240 мп метанола, смешивают с 3,0 г (33,3 ммопь) безводной щавелевой кислоты и гидрируют в присутствии 2,0 r 10%-ного палладия на активированном угле. По окончании реакции катализатор отфильгровываюг, фильт рат упариваюг и остаток растирают с эфиром. После перекристаллизации сырого оксапага (9,3 r) иэ смеси 45 мл метарола и 95 мп эфира получают 8,7 г (81,5% ) оксалата амида ). — сЬ-трет.-бугипоксикарбониламиноокси- Я -аминокапроновой кислоты, т.пл. 153-155 С, R =.

= 0,30,(aL)>= -38,1 (с = 1, метанол).

Стадия 4. Амид Ь - с6-аминоокси-Е-трет.-бугилоксикарбонил аминокапроно вой кислоты (Н-ОЛиэ-(bOK)- ХН

8,0 r(22,,8 ммоль) БОК-ОЛиз- NH -оксалата растворяют в 40 мл трифгоруксусной кислоты и через 30 мин раствор упаривают в вакууме. Маслянистый остаток промывают несколько раз эфиром, затем 24 мл диоксана и добавляют 2 н. раствор гидроокиси натрия до рН 8-9. В реакционную массу вносят 6,6 г (45,5 моль) трет.-бугилоксикарбонилаэида и

2,3 r (57,5 ммоль) окиси магния, пере мешивают при комнатной температуре в течение 16 ч, осадок огфильгровываюг и фильграг упариваюг. Остаток растворяют в 50 мп воды и эксграгируюг этилацета- том (3 х 70 мл). После упаривания этил» ацегатной фазы остаток растирают с эфиром, отфильтровывают и затем сырой продукт (6,35 г) кристаллизуют иэ этилацегага. Получают 3,6 r (60,5%) амида

-с(,-аминоокси-Я »грет.-бутилоксикарбонил» о аминокапроновой кислоты, т.пл. 118-120С.

R =0,30, (cion =«39,5 (с-"1, метанол). в

Стадия 5, Трит-Лиэ (БОК)-Лиз (БОК)WW(EbOOK K - N*H H°

25,15 r (29,5 ммоль) Z «Лиэ(БОК)-Лиз (БОК )-Лиэ (БОК )-ОСН рас гворяют в 500 мл метанола и гидрйруюг в присутствии 5,0 г 10%-ного палладия на акти15

16

651691 вированном угле. По окончании реакции катализатор огфильгрсвываюг, фильграг упариваюг и остаток растворяют в 180мл дихлорметана. Раствор смеииваюг с

5,72 мл (41,0 ммоль). гриэгиламина и

10,26 r (36,8 ммоль) грифенилмегилхло» рида. Реакционную смесь выдерживают

16 ч при комнатной температуре, затем растворитель отгоняют и остаток растворяют в 300 мл этилацетата. Раствор про1й мывают 5%-ным раствором лимонной кислоты (3 < 50 мл) и 50 мл воды, 8%ным раствором гидрокарбоиата натрия (3 50 мл), сушат и упаривают. Остаток растирают в порошок с петролейным эфиром. После фильтрования и высушивания получают 38,0 г сырого Три.-Лиэ(БОК)-Лиз(БОК)-Лиз (БОК}-OCH . Сырой продукт растворяют в 170 мл метанола, добавляют 7,25 мл (150 ммоль) гидраэин- 21 гидрата и реакционную смесь оставляют на 3 дня при комнатной температуре. Выпавший осадок отделяют фильтрованием и растирают с эфиром. Продукт (17,65г) перекрисгаллизовывают из смеси 35 мл

Метанола и 350 мл эфира. Получают

13,85 г (49%) тет апэптидгидразида, т пл. 197-199 С. R = 0,13(с j =

= -7,1 (с = 1, метанол).

Стадия 6. Триг-Лиэ (БОК)-Лиз (БОК)«Лиэ (БОК)-ОЛиз (БОК)- Н Н>.

4,1 г (4,27 ммоль) Трит Лиэ(БОК)-Лиз (БОК)-ОЛиз (БОК)- N Н растворяют в 14 мл диметилформамида. Раствор о 35 охлаждают до -20 С и при перемешивании прикапывают к нему 6,5 мл (17,0 ммоль) 2,6 н. раствора соляной кислоты в этилацегате, а затем 0,65 мл (5,45 ммоль) трет.-бугилнитрита. Реакционную о смесь перемешивают 5 мин при 10 С, затем охлаждают до -20 С и добавляют (заствор 1,42 r (5,45 ммоль) Н-ОЛиз (БОК)- ИН и 3,2 мл (12,8 ммоль) диизопропилэтиламина в 7 мл диметилформ- 4> амида. Перемешивание продолжают в тео чение 1 ч при темнерагуре от «5 до О С, о после чего оставляют на ночь при О С.

Раствор унаривают, остаток растворяют в 140 мл этилацетага и раствор промывают последовательно 40 мл воды, 5%ной лимонной кислотой (3 а 40 мл) и, наконец, 8%-ным раствором гидрокарбоната натрия (3 < 40 мл). Этилацетатный слой отделяют, сушат, растворитель отгоняют у и твердый остаток растирают с эфиром.

Осадок отфильтровывают, высушивают и получают 2,75 г (54%) защищенного, зд» мещенного аминооксикарбоновой кислотой геграпепгидамида, 7 пл. 137-140 С.

К"g =- 0,26, с ) - -24,4 (c = 1, метанол).

Стадия 7. 11-Лиз (БОК)-Лиз (БОК)-,/(из (БОК)-ОЛиэ (БОК)- И11 11С8.

5,0 г (4,22 ммоль) Триг Лиз (hOK)-Лиз (БОК) /Iиз (bOK)-ОЛиз (UOK}- МН растворяют в 50 мл метанола и смешивают с раствором гидрохлорид-пиридина иэ 1,7 мл пиридина и 1,7 мл концепгрированной соляной кислоты. Реакционную смесь оставляют на 20 ч при комнатной температуре, затем метанол отгоняют и оставшуюся плотную массу размешивают со 150 мл воды. Воду сливают, остаток высушивают в вакууме и растирают в порошок с эфиром. Продукт отделяют фильтрованием, сушат и получают 3,7 г (82%)

Н-Лиэ (БОК) -Лиз (БОК)-)1из (БОК }-ОЛиз(БОК}- Й Н НСР, т.пл. 120-123" С.

Ry = 0,72, (K3 = +17 (с = 1, мегано).

Стадия 8. БОК-Э-ОСер-Тир-Сер-Мег-Глю (ОБут )-Гис-Фен-Арг-Трп-Гли-Лиэ(БОК)-Про-Вал-Гли-Лиз (EOK) / из (БОК)-Диз (БОК }-ОЛиз (БОК)- И Н .

0,9995 г (0,5 ммоль) БОК-Э-ОСер-Тир-Сер-Мег-Глю (ОБут)-Гис-Фен-Apr-Трп-Гли-Лиэ (БОК)-Про-Вал-Гли-ОН НСЯ, 0,491 r (0,5 ммоль) Н-Лиз(БОК)-Лиз (БОК)-Лиз (БОК)-ОЛиз (БОК)- ЯН .НСР и 0,800 r (3,0 ммоль) пентахлорфенола растворяют в 5 мл димегилформамида и добавляют сначала 0,055 мл (0,5 ммоль) М-мегилморфолина, а затем

0,210 г (1,0 ммоль) дициклогексилкарбоди имида ..

Реакционную смесь оставляют стоять при комнатной температуре в течение дня, затем дициклогексилкарбамид отфильтровывают и фильтраг разбавляют 100 мл эфира. Выделившийся продукт отделяют фильтрованием, промывают эфиром и высушивают. Получают 1,30 г (90%) защищенного, замешенного аминооксикарбоновой кислотой октадекапептидамида. R

= 0,50.

Пример 4. Ю-ОСер-Тир-Сер-Мег

-Гис-Фен-А рг ТрпГли-Ли з-Про-Вал-Гли-Л из-Лиз-Я) О Лиз- йН .

1,2 r (0,417 моль) БОК-))-ОСер

»Тир-Сер-Мет-Глю (ОБуг)-Гис-Фен Арг«Трп Гли-Лиз (БОК )»Про«Вал»Гли«Лиз (БОК )«Лиэ (БОК) 20Лиз (БОК)- М11 растворяют в смеси 9,6 мл трифторуксусной кислоты, 1,2 мл воды и 1,2 мл аниэола. Через 1 ч раствор разбавляют 240 мл эфира. Выпавший осадок огфильтровываюг, про

6516 мывают эфиром и высушивают в вакууме над пятиокисью фосфора и гидроокисью калия. Получают 1,05 г (80% ) замешенного октадекапептидамидтрифторацетата.

Сырой трифторацетат растворяют в 20 мл з воды и трифторацетатные ионы посредст» вом ацетатциклического ионообменника марки Лауэкс 1 < 8 (фирмыйоИщипййас1р} обменивают на ацетат ионы. Затем полу ченный таким образом раствор пропуска- !6 ют через колонну (4,5 <65 см), запол пенную ионообменником марки Ватман

СМ-52. Элюируют линейным буферным градиентом, приготовленным из 2 л 0,2М (pH 6,7) и 2 л 0,5 М (рН 6,7) аммоний->> ацетатных буферов, со скоростью 80 мл/ч.

Фракции, содержащие продукт, объединяют и лиофилизуют. Получают 0,42 г (37%) замешенного аминооксикислотой октадекапептидамида. Содержание пептида 82% (по УФ-спектру), Метсульфоксида 1,8%, Тир/Трп 1,07., Аминокислотный анализ: Лиз 3,4 (4), Гис 1,0 (1), Арг 0,9 (1), Сер 0,8 (1), Глю 0,9 (1), Про 1,0 .(1), Гли 2,05 (2), Вал 0,9 (1), Мет 0,75 (1), Тир 0,9 (1), Фен,. 1,0 (1). R< = 0,18.

Применяемый в качестве исходного вещества защищенный, замешенный аминоок сикарбоновой кислотой октадекапептидамид- получают следующим образом.

Стадия 1. йициклогексиламиновая соль

Ъ -Д. трет.-бутилоксикарбониламиноокси

- Я-бензилоксикарбониламинокапроновой кислоты (БОК- Э-ОЛиз() -ОН).

Это соединение получают из N-f-бензилоксчкарбониллизина описанным в примере 1 (стадия 1) способом. Полученную маслянистую З -с .-трет.бутилокси Щ карбониламийоокси Е -бензилоксикарбонил амино-капроновую кислоту растворяют в эфире и вводят во взаимодействие с дициклогексиламином с образованием дицико логексиламиновой соли, т.пл. 159-162 С

45 (перекристайлизована из смеси этанол вода). Rg =, 0,15,(с(.3 = +35,4 (с За 1, этанол).

Стадия 2. Амид )-с(-трет. бутилоксикар бониламиноокси Я-бенэилоксикарбонилами50 нокапроновой кислоты (БОК-Э-О lmj2. )NH g).

Это соединение получают описанным в примере 3 (стадия 2) способом иэ дициклогексиламиновой соли З «с(.-трет.-бутил

И оксикарбонил аминоокси- Я -бензилкарбониламинокапроновой кислоты. Й g = 0,42, 1 т.пл. 95-97 С, с(.) = +28,9 о (с 1, ме. танол ).

С) 18 . Стадия 3. Оксалат амида g-ф.-трет.-бутилоксикарбонил аминоокси- Я аминокапроновой кислоты ((БОК }-З-ОЛиэ- N H -ок2 салат J.

Это соединение получают описанным в примере 3 (стадия 3) способом из амида

Q -с(.-трет.-бутилоксикарбониламиноокси-.

-бензилоксикарбониламинокаироновой кислоты, температура плавления полученного соединения 155-157 С. R g = 0,30, (с 3 = +39,0 (c = 1, метанол).

Crapèÿ 4. Амид Э -с!аминоокси-Е-rper.-бутилоксикарбониламинокапроновой кислоты (М)- Д-ОЛиэ-{БОК)- NH .

Способом, описанным в примере 3 (стадия 4), иэ оксалата амида З-с .-трет.

-бутилоксикарбониламиноокси 5 -аминокап роновой кислоты получают указанное в заголовке соединение, т.пл. 118-120 С, R = 0,28, (d„3 = +40,4 (с = 1, метанол ).

Стадия 5. Трит-Лиэ (БОК)-Лиэ (БОК }- из (БОК)- Д-ОЛиз(БОК)- 8 !,.

Получают описанным в примере 3 (стадия 6) способом из 8,7 г (1,0 ммоль)

Трит-Лиэ (БОК)-Лиз (БОК)-Лиэ (БОК)- М H з и 3,0г (11,5 ммоль) Н-2-ОЛиэ(БОК}- ИН . После выпаривания этилаце татной фазы остаток растворяют в 20 мл смеси эилацетат:(пирндин:уксусная кисло та:вода = 20:6:11) = 99:1, вносят в колонну с силикагелем и хроматографируют.

Элюат отбирают в виде фракций по 15 мл и их cocraa контролируют с помощью тонкослойной хроматографии. Фракции 85192, содержашие чистый продукт, обьеди няют и отгоняют растворитель. Получают

3,70 г (34,5%) защищенного, замешенного аминооксикарбоновой кислотой тетрапептидамида, т.пл. 132-136 С. R

= 0,23.

Стадия 6. Н-Лиэ(БОК)-Лиз (БОК -Лиэ(БОК}-Э-ОЛи(E 0K)- AH -НСЕ.

2,0 г (2,10 ммоль) ТрихЛиз (БОК)Лиз (БОК)-П из (БОК) I) ÎËèç (БОК) -.

-ЙН растворяют в 20 мл 80%ной уксусной кислоты. Раствор оставляют на

20 мин при комнатной температуре, затем выпаривают и остаток растирают с эфиром. Получают 1,68 r замещенного аминооксикарбоновой кислотой тетрапепо тидамидацетата, т.пл. 94-95 С. Продукт растворяют в 17 мл метанола, затем добавляют раствор пиридингидрохлорида, полученный из 35 мл пиридина .и 1,35мл ,концентрированной соляной кислоты, и ме;танол отгоняют; Остаток растирают с

50 мл воды. После фильтрования и про19

651691 мывки водой высушивают и получают l,2г (72%) Н-Лиз (БОК)-б1из (БОК}-Лиэ (Г>ОК). -Х)-ОЛиз (БОК)- НН ° НСС, т.пл. 122125 С. 8 = 0,70.

Стадия 7. БОК-Э-ОСер-Тир-Сер-Mer- %

-Глю (ОБут)-Гис-Фен-Арг-Трп-Глю (БОК)-Про-Вал-Гпи Лиз (БОК)-Лиз (БОК)-Лиэ(БОК )-Э -ОЛиз (БО К )- М Н .

0,995 г (0,5 ммоль) БОК-З-ОСер

-Тир-Сер-Мет-Глю (ОБут)-4 ис-Фен-Арг«<@

-Трп-Глю-Лиэ (БОК)-Про-Вал-Гпю-О!1+НС©

0,491 г (0,5 ммоль) Н-Лиз(БОК) Лиз (БОК)-Х!иэ (БОК)-Э -ОЛиэ(БОК)- И 1!

<НС6 и 0,800 r (3,0 ммоль) пентахлорфенчла растворяют в 5,0 мл диметилформами- 1 да и к раствору добавляют сначала 0,055 мл (0,5 ммоль) й-метилморфолипа, а затем

0,210 r (1,0 ммопь) дициклогексилкарбоди имида. Реакционную смесь оставляют на день при комнатной температуре, после чего © отфильтровывают дициклогексилкарбамид и фильтрат разбавляют 100 мл эфира. Выделившийся продукт отфильтровывают, про« мывают эфиром и высушивают. Получают

1,40 г (97%) защищенного замешенного аминооксикарбоновой кислотой октадекапептидамида, т.пл. 170-178 С. К

О

= 0,52.

Пример 5. Н РОСер-Тир-С ерМет-.Глю-Гис-Фен-Трп-Гли Лиэ-Про-Вал

Гли-Лиз-Лиз Лиэ Лиэ-ОГли- NH>.

0,4ОО г (0,134 ммоль} БОК-З ОСер

-Тир-СерМет-Глю- (О Бу т ) -Гис-Фен-Т рпГпи-Лиз (БОК)-ПроВал-Гли-Лиз (БОК)И

-Лиз (БОК)-Лиз (БОК)-Лиз (ЬОК)-ОГли

- NH ° НС8 растворяют в смеси 3,2 мл трифторуксусной кислоты, 0,4 мл анизола и 0 4 мл воды. Раствор выдерживают lч, затем разбавляют 80 мл афира и выпавший осадок отфильтровывают. Сырой нонадека пептидамидтрифторацетат растворяют в

5 мл воды и хроматографируют на колон не (3,5 < 56 см), заполненной ионообмен ником на основе карбоксиметилцеллюло зы (Ватман СМ-52), с помощью линейно го буферного градиента, приготовленного из 1,5 л 0,2 М (pH 6,7 ) и 1,5 л0,6М (рН 5,7} буферов. Фракции, содержащие продукт, обьедйняют и лиофилизируют. По. лучают 0,166 г (41,5%) замешенного аминооксикарбоновой кислотой нонадекапептидамида. К = 0,22. Содержание пеп

Я тнда 76%, метиокинсуль юксида 2,3%.

Аминокислотный анализ: Лиэ 4,5 (5), Гис 1,0 (1), Apr 0,9 (1), Сер (0,85) (1), Глю 1,0 (1), Про 1,0 (1), Гпи 1,9 (2), Вал 0,85 (1), Мет 0,75 (1), Тир

О,95 (1), Фен 1,0 (1).

Применяемый в качестве исходньч о вещества защищенный, замещенный аминооксикарбоновой кислотой нонадекапептидамидгидрохпорид получают следующим образ ом.

Стадия 1. Z Лиз (БОК)-Лиэ (БОК)-Лиз(БОК)-Лиэ(ЬОК)-ОС1-1,.

51 г (60 ммоль) -Лиэ(БОК)-Лиз (БОК )-Лиз (БОК)-ОСН раствори(от в 100 мл метанола и гидрируют в присутствии l0 г 10%-ного палладия на активированном угле в качестве катализатора.

По окончании реакции катализатор отфильт ровывают и раствор выпаривают в вакууме.

Остаток растворяют в 240 мл зтилацета« та, добавляют 28,5 r (60 ммоль)

-Лиз(БОК)-ОСу и оставляют на 2 ч при комнатной температуре. Затем к реакционной смеси добавляют 1000 мл этилацета та и 200 мл воды. После встряхивания отделяют водную фазу и зтилацетатную фазу промывают два раза 200 мл 1 н. соляной кислоты, два раза 200 мл 8%-ного раствора гидрокарбоната натрия и после высушивания выпаривают. Остаток расти« рают с ефиром, отфильтровывают и промывают ефиром. Сырой продукт перекристалпнзовывают из етилацетата. Получают 52,05 г (81%) Z «Лиз(БОК)-Лиэ(БОК}-Лйз(БОК} Лиз (БОК)-ОСН, r.ïë. 122-123С.

Оиааии 2. НЛии (БОК!-Лиа (БОК(-Лиа(БО К )-Лиз (БОК )-ОСНОВ.

35 r (32,4 ммопь) Z Лиз(БОК)-, Лиз (БОК)-Лиэ (БОК)-Лиз (БОК)-ОСН растворяют в 700 мл метанола и гидрируют в присутствии 7 г 10%-ного лалла дия на активированном угле в качестве катализатора. По окончании реакции катализатор отфильтровывают, раствор упаривают и к остатку добавляют смесь зфирдиизопропиловый эфир. Осадок отфипьгро вывают, сырой продукт перекристаллиз(м вывают иэ смеси афир-диизопроциловый ефир. Получают 24,8г (81%) Н-Пиз(БОК)Лиз (БОК)-Лиз (БОК)-Лиэ (БОК }-ОСН, т.пл. 101-103 С.

Стадия 3. Трит Лиэ(БОК)-Лиз(БОК)Лиз (БОК ) Лиз (БОК)-ОСН .

24, г (25,4 ммоль) Н-Лиз(БОК)-Лиз (БОК)-Лиэ (БОК)-Лиз (БОК)-OCH э и 4,7 мл (33;6 ммоль) триетиламина раст- . воряют в 180 мл дихлорметана, к раствору добавляют 8,5 г (30,5 ммопь} трифенилметилхлорида и оставляют стоять при комнатной температуре. Через 24 ч дихлорметан отгоняют, к остатку приливают

100 мл волы, пропукт екстрагируют 500 мл етилацетате и водный слой отпепяют. Этил651691

22 ацетатную фазу промывают трижды 100 мл

5%-ной лимонной кислоты и три раза по

100 мл 8%-ного раствора гидрокарбона та натрия, высушивают и упаривают.Оста .ток растирают с эфиром, отфильтровыва ют, промывают диизопропиловым эфиром и петролейпым эфиром. Получают 23,6 г (78,5%) Трит Лиз (БОК)-Лиз (БОК)-Лиз(БОК)-Лиз (БОК)-ОСН, r.ïë. 166-168 С, Стадия 4. ТритЛиз (БОК)-Лиэ (БОК)16

Лиэ (БОК)-Лиз (БОК)- N< Н .

23,3 г (19,6 ммоль) ТритЛиз(БОК)Лиэ (БОК)-Лиз (БОК)-Лиз (БОК)-ОСН > растворяют в 230 мл метанола, добавляют 5,7 мл (117 ммоль) гидраэингидрата и выдерживают при комнатной температуре. Через 4 дня метанол отгоняют, остаток растирают с эфиром, отфильтровывают и высушивают в вакууме. Получают

23,0 г (98%) ТритЛиэ (БОК) Лиз (БОК)-Лиэ(БОК) Лиз(БОК)- И Н . Т.пл. 217219ОC.

Стадия 5. ТритЛиз (БОК)-Лиз (БОК)-Лиэ (БОК)-Лиз (БОК)-ОГли NH2.

2,37 г (2,0 ммоль) Трит-Лиз(БОК)-.

Лиз (БОК)-Лиз (БОК) Лиз (БОК)- М Н растворяют в 12 мл диметилформамида, .полученный раствор охлаждают до -20 С и при перемешивании добавляют по каплям З, сначала 2 мл (8,0 ммоль) 4 н. раствора соляной кислоты в этилацетате, а затем

0,28 мл (2,35 ммоль) трет. бутилнитри та. Реакционную смесь выдерживают в гечение 5 мин при 10 С, охлаждают до, -20 С и добавляют к ней 0,216 г (2,4 ммоль) Н-ОГли NH и 1,03 мл (6,0 ммоль) диизопропилэтиламина в 8,0 мл диметилформамида. Реакционную массу выдерживают в течение 2 ч при температуре от -5 до О С и затем при О ; в течение ночи, растворитель отгоняют, оста ток растирают с водой, отфильтровывают и промывают водой. Получают 2,35 r (94% ) Трит Лиз (БОК ) Лиэ (БОК ) Лиэ 4 (БОК)-Лиз (ЬОК)-ОГли- ЙН . R4 = 0,72.

Стадия 6. Н-Лиз (БОК)-Лиз (БОК)Лиз- (БОК)-Лиз (БОК)-ОГни- 14Н НСЯ.

1,75 г (1,4 ммоль) Трит-Лиз(БОК)Пиз (БОК)-Лиз (БОК)-Лиз (БОК)-ОГли- И

ЙН растворяют в 35 мл 80%-ного вод2 ного раствора уксусной кислоты, через

1 ч растворитель отгоняют и остаток рас тирают с эфиром. После фильтрования, про

mmKa эфиром и высушивания сырой про - у дукт вместе со смесью этилацетат-пири- . дин:уксусная кислота:вода = 20:6:11 в соотношении 4:1 вносят в колонку с си ликагелем (3,2" 52 cM) и хроматографируют. Элюат собирают в виде фракций по .

15 мл и их состав определяют с помощью тонкослойной хроматографии. Фракции

105-112, содержащие чистый сырой продукт, объединяют, растворитель отгоняют, остаток растирают с эфиром, отфильтровы вают и после высушивання растворяют в

20 мл метанола, К раствору добавляют раствор пиридингидрохлорида, полученный путем смешения 0,22 мл пиридина и

0,22 мл концентрированной соляной кис-лоты. Затем метанол отгоняют, остаток растирают с эфиром, отфильтровывают и высушивают в вакууме. Получают 0,95 г (65%) 1-(-Лиз (БОК)-Лиэ (БОК)-Х1из (БОК)-Лиз(БОК)-ОГли NH " HCg. К = 0,18.

Стадия 7. БОК-Э-ОСер-ТирСер-Мет

-Глю(ОБут)-Гис Фен Арг Трп-Гли Лиз(БОК)-ПроВал-Глю-Лиз (БОК)-Лиз (БОК)-Лиз (БОК)-Лиэ (EOK)-ОГли И Н НСВ, 0,398 г (0,20 ммоль) БОК- -ОСер-Тир-Сер-Мет-Глю (ОБут)-Гис-Фен-Арг-Трп-Гли ОН НС8, 0,208 г (0,20 моль)

Н Лиэ (БОК)-Лиз (БОК)-Лнэ (БОК)-Лиз(БОК) ОГли КН НСО и 0,165 г (0,90 ммоль) пентафторфенола растворяют в 4 мл диметилформамида и добавляют сначала 0,22 мл (0,20 ммоль) М-метилморфолина, а затем 0,063 г (О, 30 м моль ) дициклогексилкарб один мида. Реакционную смесь оставляют на 16 ч при комнатной температуре, после чего отфильтровывают дициклогексилкарбамид и фильтрат разбавляют эфиром. Выделивший/ ся продукт отфильтровывают, промывают эфиром и высушивают в вакууме. Получают 0,540 г (91%) защищенного нонадекапептидамидгидрохлорида. R = 0,63.

Пример 6. H-33-0 ер-Тир

-Сер-Nет-Глю-Гис-Фен-Арг Трп Глю-Х1из-Про-Вал-Гли-Лиз Лиз Лиз Лиэ ОГли-Бэл.

0,400 г (0,130 ммоль) БОК-;Ц-ОСер Тир-Сер-Мет-Глю (ОБут)-Гис-Фен-Арг-Трп-Гли Лиз (БОК)-ПроВал-Гли-Х!из (БОК)-Лиз (БОК) Лиэ (БОК) Лиз (БОК)-ОГли-ОБзл - HCf растворяют в смеси

3,2 мл трифторуксусной кислоты, 0,4 мл анизола и 0,4 мл воды. Через 2 ч раст вор смешивают с 80 мл эфира и отфильт» ровывают выпавший осадок. Сырой нонадекапептидамидтрифторацетат растворяют в

5 мл воды и раствор хроматографируют на колонне (3,5 552 см), заполненной ионообменником на основе карбоксиметил» целлюлозы (Ватман СМ-52) с помощью линейного буферного градиента, приготов ленного из 1,5 л 0,2 М (рН 6,7) и 1,5л

0,6 N (pH 6,7) буферов. фракции, содержашие продукт, собирают, объединяют и лиофилизуют. Получают 0,151 г (39%) замешенного аминооксикарбоновой кислотой нонадекапептнд амида. R = 0,28, 5

Содержание пептида 80%, мет онин суль фоксида 1,9%, соотношение Тир:Трп =

= 1,05.

Аминокислотный анализ: Лиз 4,5 (5);

Гис 0,95 (1); Арг 1,0 (1); Сер 0,8 (1); Глю 1,0 (1); Про 1,0 (1); Гли 1,95 @ (2); Вал 0,95 (1); Мет 0,8 (1); Тир

0,95 (1); Фен 1,0 (1).

Применяемый в качества исходного вещества защищенный, замешенный аминооксикарбоновой кислотой нонадекапептидамид33 гидрохлорид получают следу.мцим образ ом.

Стадия 1 . БО К»ОГли ОЕз л.

3,8 r (20 ммоль) БОК-ОГпи-OH расгворяют в 5 мл диметилформамида и добавляют 4,44 мл (40 ммопь) триэтиламина

26 и 7,8 мл (66 ммоль) бромистого бензи ла. Реакцйонную смесь нагревают 8 ч на горячей водяной базе и- затем оставляют : при комнатной температуре на ночь. Реакционную смесь разбавляют 100 мл этилацетата, промывают 50 мл воды и три раза 20 мл 8%-ного раствора гидрокарбоната натрия. После высушивания этилаце тат отгоняют и остаток перекристаллйзовывают из эфира. получают 4,5 г (80%)

БОК-ОГли-ОБзл, т.пл. 79-80 С. Стадия 2. H-ОГли-ОБзл НС6.

11,2 r (40 ммоль) БОК-ОГли-ОБзл растворяют с 22 мл этилацетата и добавляют 22 мл 4 н. раствора соляной кислоты в этилацетате. Через 3G мин реакционную сМесь упаривают и остаток ра .тирают с эфиром. После фильтрования и высушивания сырой цродукт перекрйсталлизовывают из этилацетата. Получают 5,7 r (66%) Н-ОГли ОБэл ° НС8, r.ïë. 85-87 С.

Стадия 3. Трит-Лиз(БОК)-.-Лиэ(БОК)

-Лиз(БОК)-Лиз(БОК) ОГ »ОБ - НСЕ .

7,11 r (6,0 ммоль) Трит-Лиз(БОК)Джз(БОК) Лиэ(БОК) Лиз(БОК)- Х Н э

phcrÚopàþò в 36 мп диметилформамида.

К охлажденному до -20 С раствору при перемешивании добавляют по .каплям вначале 6 мл (24 ммоль) 4 н. раствора соляной кислоты в этилацетате, а затем

0,84 мл (7,1 ммоль) трет.-бутилнитрита.

Реакционную смесь выдерживают в течение 5 мин при -1OOC, затем охлаждают до -20 С и добавляют смесь из 1,45 г (6,6 ммоль) Н ОГли-ОБэл HCP. и 4,24мл (24,6 ммоль) диизопропилэтиламина в

24 мл диметилформамида. Реакционную смесь перемешивают в течение 2 ч при

651691 24

,температуре от -5 С и затем оставляют при 0 С на ночь. Далее растворитель от« гоняют, остаток растворяют в воле, отфильт ровывают и промывают водой. Сырой продукт перекрнсталлиэовывают из смеси метанол-Вона (1: 1), Получают 6,95 г (87%)

Трит-Лиэ (БОК)-Лиз (БОК)-Лиз (БОК)-Лиз (БОК)-ОГли-ОБзл ° НСС. R = 0,85.

Стадия 4. Н-Лиз (БОК)-Лиэ (БОК)-Лиз(БОК)-Лиз (БОК) ОГли-ОБзл ° НС8.

1,87 г (1,4 ммоль) Трит-Лиз(БОК)«Лиз(БОК)-Лиз(БОК)-Лиз (БОК )-ОГли

-ОБзл растворяют в 37 мл 80%-ного водного раствора уксусной кислоты. Через

1 ч растворитель отгоняют и остаток растирают с эфиром. После фильтрования, промывки эфиром и высушивания сырой продукт вместе со смесью этилацетат-пиридинГуксусная кислота;вода = 20:6;11 в соотношении 4:1 вносят в колонку с силикагелем и хроматографируют. Элюаты собирают в виде фракций по 15 мл, их состав определяют носредством тонкослойной хроматографии. Фракции 83 97, содержащие чистый продукт, объединяют и остаток растирают с эфиром, после фильтрования и высушивания растворяют в 20 мл метанола и добавляют раствор пиридингидрохлорида, который предварительно получают из 0,22 мл пиридина и 0,22 мл концентрированной соляной кислоты. Метанол отгоняют, остаток растирают с эфиром, отфильтровывают и высушивают в вакууме.

Получают 0,905 r (57%) Н-Лиз(БОК)-Лиз (БОК)-Лиз (БОК }-Лиз (БОК )-ОГли-ОБзл HCf R = 0,23, Стадия 5. БОК» р-ОСер-Тир-Сер-Мет-Глю (ОБут)-Гис Фен-Арг-Трп-Гли-Лиз(50K )-Про-Вал-Гли-Лиз (БОК )-Лиз (БОК )-Лиз (EOK )-Лиз (БОК )-ОГли-ОБэл ° HCf,.

0,398 г (0,20 ммоль) БОК- -ОСер«

-Тир-Сер«Мет-Глю (ОБуr )-Гис-Фен Арг-Трп-Гли-ОН НCB, 0,226 г (0,20ммоль)

Н-Лиз (БОК)-Лиз (БОК)-Лиз (БОК)-Лиз(БОК)-ОГли-ОБзл HCE и 0,165 г (0,90 ммоль) пентафторфенола растворяют в

4 мл диметилформамида к раствору добавляют вначале 0,022 мл (0,20 ммоль)

К -метилморфолина, а затем 0,063 r (0,30 ммоль| дициклогексилкарбодиимида. Реакционную смесь выдерживают при комнатной температуре, дициклогексилкар» бодиимид отфильтровывают, фильтрат разбавляют эфиром, выпавший осадок отфильтровывают, промывают эфиром и высушивают в вакууме. Получают 0,502 г (82%) защищенного нонадекапептидамидгидрохлоркда. R = 0,68.

25 651691 26

Ф о р м у л а и э о б р е т е н и я мере, концевые аминооксигруппы, аминогруппы боковой цепи, а также в случае неСпособ получения пептидов обшей фор- обходимости концевые карбоксильные групмулы пы и карбоксильные группы боковой цепи . Н ))ОСерТирСер-МетГлю Гис Фен- $ защищены, отщепляют защитные группы мАргТрп Глй Лиайро-Вал Гли (Лиэ)пХ (11 ацидолизом с последующим выделением где и = 3 или 4; целевых продуктов в свободном виде или

Х а ОЛизОН, -3)-ОЛизОН, -ОГлиОН в виде их солей, амидов или бензиловых или их солей, или амидов, или сложных эфиров. бенэиловых эфиров; о т л и ч а ю щ и й- Е Источники информации, принятые во с я тем, что от пептидов общей формулы внимание при экспертизе (Х), в которых д и Х имеют указанные l. Э. Шредер, К. Любке. Пептиды. М., выше значения и в которых, по крайней Мир, 1967, с. 112.

Составитель В. Волкова

Редактор 3. Бородкина Техред Н. Бабурка Корректор E. Папп

Заказ 838/57 Тираж 512 Подписное

OHHHAH Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4