Способ выделения нуклеиновых кислот хлопчатника или их аминокислотных комплексов

 

Союз Советских

Социалистических

Республик

<щ72 7658 (61) Дополнительно

5f)M. КЛ,2 (22) Заявлено 17.05,7 с присоединением за (23) Приоритет

Опубликовано 15

Дата опубликова

С 07 Н 21/00//

А 61 К 29/00

Государственный комитет — СССР по делам изобретений и открытий

53) УДК 547.963. .3 ° 07 (088.8) / (72) Автор изобретения

T.У. Каракузиев

Всесоюзный ордена Ленина научно-иссЛедОВательсКий институт хлопководства (71) Заявитель (54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ

ХЛОПЧАТНИК ИЛИ VX А ИНОКИСЛОТНЫХ

КОМПЛЕКСОВ

Изобретение относится к усовершенствованному способу выделения нуклеиновых кислот хлопчатника или их аминокислотных комплексов, необходимых для биологических, биохимических и физиологических исследований.

Известен способ выделения нуклеиновых кислот хлопчатника или их аминокислотных комплексов путем хроматографического разделения на колонках10 с Метилированным альбумином на кремниевой кислоте с последующим осаждением посредством добавления белканосителя животного происхождения (каз еи н моло к а) . Выход ну клеи но вых ки с- 1 5 лот или их комплексов 68-74 Ъ (1 ) .

Недостатком известного способа является относительно невысокий выход

: целевого продукта.

Цель изобретения — повысить вы- 2Q ход целевого продукта.

Цель достигается применением в качестве белка-носителя для осаждения нуклеиновых кислот хлопчатника или их аминокислотных комплексов 25 глютелина хлопчатника, что, позволяет повысить выход целевого продукта до 93-95% благодаря сродству глюте.пина хлопчатника к нуклеиновым кислотам хлопчатника. 30

Способ выделения нуклеиновых кислот хлопчатника или их аминокислотных комплексов согласно изобретению заключается в хроматографическом разделении на метилированном альбумине на кремниевой кислоте с последующим осаждением целевого ттродукта путем добавления глютЕлина хз1опчатника. Выход 93-95%.

При мер.

Получение глютелина. Свежий растительный материал (например, семена хлопчатника) фиксируют 85%-ным ацетоном и промывают несколько раз до исчезновения пигментного вещества.

Бело-буроватый порошок, освобожденный от пигмента, для удаления ацетона промывают эфиром, высушивают и хранят до анализа под щелочью (KOH} в вакуум-эксикаторе..

В коническую колбу берут 10 r этого порошка, заливают 10-кратным, количеством 0,2%-ного NaOH (добавляют две капли толуола и сухого порошка бисульфата натрия с таким расчетом,чтобы в конечном итоге в смеси бисульфата на рия концентрация NaOH была 0,2Ъ) . Экстрагирование проводят на магнитной мешалке в течение 1 ч

1ил выдерживают в холодильнике при О С 15 ч.

Такую экстракцию проводят центрифугированием еще три раза. Объединйют супернатант и ставят на диалиэ. При этом щелочерастворимые белки выпадают в осадок. Осадок отделяют центри фугированием, растворяют в 0,2%-ном

NaOH и опять ставят на диализ. Такая процедура повторяется три раза.

После этого можно применять глютелин для осаждения. Но для более полного

f0 очищения глютелина после диализа его. центрифугируют, осадок растворяют в 0,2%-ном растворе щелочи NaOH, к нему добавляют уксусную кислоту в таком количестве, чтобы общее содержание 15 ее в смеси было 4,4%.

Полнота осаждения проверяется в отдельной пробе. Выделившийся при этом хлопьевидный осадок белка центрифугируют и растирают в ступке с so- Я дой, воду сливают и вновь добавляют.

Этот процесс растирания продолжают до тех пор, пока в промывной воде не будет обнаруживаться сахар. После этого осадок растворяют в 20 мл

0,2%-ного,ЧаОН, образовавшийся раствор центрифугируют. Из прозрачного, - слегка опалесцирующего раствора глютелин вновь осаждают прибавлением уксусной кислоты до конечной концентрации в смеси 4, 4%, Эту процедуру перерастворения и переосаждения белка повторяют три раза и каждый раз центрифугируют. После последнего переосаждения осадок белка промывают водой для удаления уксусной кислоты и затем спиртбм, проьытый спиртом

35 осадок переносят на фильтр. Спирт объема холодной 10%-ной НСКОМ.

Полноту осаждения проверяют» в отдельной пробе. Результаты исследований показали, что нуклеиновые кисd0 лл лоты осаждаются с глютелином на, 20-26% больше, "чем с казеином."

Полученные результаты прйведены в таблице ° вытесн яют э фиром н а водоструйном насосе. Осадок сушат в вакуум-эксикаторе.. Выход глютелина 25-30% 4р (2,5-3 r) .

Фракционирование нуклеиновых кислот, На колонку, заполненную метилированным альбумином на кремниевой кислоте (MAK), уравновешенную

0,02 М натрийфосфатным буфером рН 6,8, наносят 400 опт.ед. суммарных нуклеиновых кислот. Элюцию проводят линейным градиентом в концентрации хлористого натрия 0,1-1,0 М, содержащим

0,02 М фосфатный буфер, рН 6,8 — и сбор фракций. 9-10 мл, Затем содержимое пробирки разделяют поровну на две пробирки, осаждают казеином и глютелином, в пробир-. ки добавляют по три капли 1%-ного

" раствора казеина и глютелина и два .

Фракционирование суммарных нуклеиновых кислот на колонке

MAK (%) жде— с с ажд ие с азеи ом

Ну кле иновы кисло ты теом тРНК 68 94 26

68 92

ДНК иРНК 73 95 22

74 93 19 рРНК

Фракционирование комплекса нуклеиновых кислот. На колонку (Зх25 см), заполненную МАК, уравновешенную

0,02 М Na-ацетатным буфером рН 5,2, содержащим 0,1 М NaCQ, медленно сорбируют 5 мг С -фенилаланил-тРНК

И и промывают ее тем же буфером до полного удаления неадсорбированного комплекса. Элюцию проводят линейным градиентом в концентрации NaC9 (0,11,.0 М) в 0,02 М Na-ацетатном буфере, содержащем 1 ° 10 М MgCQ Скорость элюции 25-30 мл/ч, объем фракции

3-4 мл. После измерения оптической плотности при 260 нм С -фенилаланили

1 тРНК в каждой фракции осаждают равным объемом холодной 5%-ной НС%0<.

Результаты фракционирования С"-фенилаланил-тРНК на колонках с MAK приведены на графике.

В качестве адсорбента носителя . прибавляют 0,2 мл 1%-ного раствора казеина (а) и глютелина (б) . На графике приняты следующие обозначения:

1 — оптическая плртность, 2 — радиоактивность, I, II u III — изоакцепторные формы С -фенилаланил-тРНК.

Выпавший осадок собирают центрифугированием, растворяют в 0,5 M НН ОН,, переносят на мишень, высушивают и пОдсМитылв ают ралдиралкти вйослт ь.

Как видно из приведенного, активностЬ СМ-фенилаланил-тРНК I II u

III изоформ больше на 22-25%, когда применяйт "в" качестве носйтеля глюте-лин вместо казеина.

Формула изобретеййя

Способ выделения нуклеиновых кислот хлопчатнйка или их-аминокислотных комплексов путем хроматографического разделения на метилированном альбумине на кремниевой кислоте с последующим осаждением целевого продукта посредством добавления белка-носителя, отличающийс я тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта, в качестве белка-носителя используют глютелин хлопчатника.

727658 ность отдельных аминоацил-тРНК син,тетаз и тРНК семян хлопчатника. Дис. на соиск. учен. степени канд. биоло- гических наук. Ташкент, 1972 (прототип) .

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Каракуэиев Т.У. Действие

-облучения на функциональную активинп/ае

Е2б9

475

025

Составитель Л. Никулина

Редактор Е. Хорина -Техред M.Кузьма Корректор Е. Папп

ЙВ .: у", Заказ 1070/25 Тираж 495 Подписное

ПНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Моойва, F.-35, Раушская наб., д. 4/5

=ъ=.=-;-=- -дж вюж " :=-: -= .т.: - »- -м .мд маа Ж

Филиал ППП Патент, r. Ужгород, ул. Проектная, 4