Способ определения гаптена в антигене

 

О"П" И С А Н И Е

ИЗОБРЕТЕНИЯ

<и1784872

Союз Советски1

Социалистических

Республик (61) Дополнительное к авт. сеид-ву

1 (22) Заявлено 300179 (2! ) 2718621/28-13 (я)М. КЛ.3

A 61 В 10/00//

6 01 и 33/54 с присоединением заявки №

Государственный комитет

СССР по деяам ныбретений и открытий (23) Приоритет

Опубликовано 071280.6юллетеиь ¹ 45 Дата опубликования описания 071280 (5.1) УДК 576. 8. .097.2(088.8) (72) Авторы изобретеиия

И.Я. Мошиашвили и Н.Е ° Канделаки (71) Заявитель Московский научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГАПТЕНА В АНТИГЕНЕ

Изобретение относится к области медицины и биологии и может быть ис" пользовано для определения вакцинных препаратов из антигенных комплексов энтеробактерий. 5

Известен способ определения гапте. на s антигене методом электрофореза в агаре (1).

Однако известный способ не позволяет определить точное количество 10 гаптена в антигене.

Целью изобретения является количественное определение гаптена на уровне отдельных рецепторов.

Эта цель достигается тем, что 15 эритроциты параллельно сенсибилизируют исследуемым антигеном и референс-гаптеном, затем определяют их специфическую лактивность в реакции массивной гемаглютинацйи и по разнос 20 ти гоказателей специфической активности определяют количественное со-. держание гаптена в антигене.

Кроме того, сенсибилизирующая до,за исследуемого антигена в 10-20 раз 25 превышает сенсибилизирующую дозу референс-гаптена.

Пример. Свежие или формалинизированные эритроциты отмывают физиологическим раствором рН 7,2 30 (раствор ь. 2) центрифугированием при

5-10 С со скоростью 2800-3000 об/мин.

Осадок ресуспендируют до 2,5% концентрации фосфатным буфером рН-6,4 с содержанием 0,85% хлорида натрия (раствор Р 1) и разливают в стерильные флаконы по 10-.25 мл. На каждый исследуемый препарат и контрольный гаптен берут по 3 флакона и в четвертый флакон заливают контрольные эритроциты. В первые 1-3 флакона добавляют разведенный раствором Р 1 исследуемый антиген.

Сенсибилизирующие дозы антигена равняются 50-100 мкг антигена на

1 мл 2,5% эритроцитав. Параллельно

Ы другие 1-3 флакона добавляют референс-контрольный гаптен. Ультразвуковой 0-антиген обрабатывают 0,02 М

NaOB при теМпературе 100 С 2 ч. Полученный гаптен диализуют и лиофилизируют.

Иммунизация кроликов ультразвуковым 0-антигеном вызывала нарастание титров антител до 1:25000-1:50000.

После обработки 0-антигена NaOH титры сывороток были равны или меньше

1:160-1:320. Сенсибилизирующая доза гептена в 10-20 раз меньше исследуемого антигена и равняется 5 мкг гап784872 тена на 1 мм 2 5 мм,5% зритроцитов. Кроме более концентриров того, готовят контрольные зритроци- является плотный о ты, т.е. в один флакон добавляют Число рядов зав физиологический аство раствор в том же ва исследуемых ант объеме, что и разведенный антнген и торных сывороток. гаптен. Количество гапт

Для сенсибилизации зритроцитов мом препарате оп е все флаконы ставя ф ставят в термостат или равнивания специфи е опре - в водяную баню при 37 С на 2 ч. За диагностикумов, пр это время содержимое всех флаконов исследуемого антиг перемешивают 3-4 раза. По ис еченйи препарата с иэвест времени сенсибилизации процесс пре-. 10 гаптена. если спец кращают добавлением 0,4% формальде- - -ность диагностик м д р 6,4 (конечная концентрация). из исследуемого ан ум

Формальдегид добавляют в виде 4Ъ гаптена при сенсчб раствора, разведенного раствором Р 1. с десятикратным ра

Содержимое флаконов осторожно переме- 15 вы, то содержание шивают до и после добавления форма- емом антигене бУде лина и оставляют при комнатной тем- с 20-кратным разли пературе 60 мин.Содержимое флаконов Например, если разливают в центрифужные пробирки, тивность контрольн уравновешивают и центрифугируют в те 2О сенсибНлизирующей чение 10 мин при 2,8-3 тыс. об/мин ется 1:40, а специ п и +5 +10 р 10ОC. Полученный ос док дваж- ность опытного пре ды отмывают раствором Р 2, а затем лиэирующей дозе 50 ресуспендируют до 2,5% концентрации ется 1:40, то аз э

1/15 М

/ М фосфатным буферным раствором исследуемый антиге р, с 0,85. хлорида натрия и

25 тена. При эт6м исп

0 4о фо ма ф рмальдегида. Полученные диаг. цепторная сыворотк ностикумы и контрольные эритроциты ровать с контрольн исследуют в РАНГА с использованием . рованными эритроци агглютинирующих адсорбированных мо- исследования антиг норецепторных О-сывороток. из различных энте

РПГP, ставят на полистероловых способами, прЕдста ер пластинках или используют бактерио- и 2). логические пробирки с круглым дном.

В ряды лунок или пробирок разливают

Иэ табл. 1 ви н по 0,4 мг раствора Р 2 (по 12 лунок 35 или пробирок) . по лунок тодом триптическог

В первую лунку или пробирку до бавляют разведенную в 2,5 раза сыво ротку, тщательно перемешивают и переносят во вторую лунку или пробирку 0,4 мл и т.д., титруют 10 лунок илИ пробирок. Из последних лунок или пробирок 0,4 мл выливают. Титруют

3 раза. В первый ряд вносят диагностикум, приготовленный нэ гаптейа, во второй - диагностикум, приготовленный из исследуемого антигена, в тре-. . тий добавляют контрольные несенси-билизированные эритроциты. Диагностикумы добавляют в количестве 0,050,07 мл в каждую лунку или пробирку.

Пластины или пробирки встряхива-. ют и оставляют при комнатной температуре на 3 ч или до следующего дня на 1ф-20 ч, после чегo производят учет реакции.

Реакцию учитывают по следующей схеме: (+) — положительная (эритроциты равномерно устилают всю поверхность дна лунки или пробирки); (-) — отрицательная (на дне пробирки нли лунки плотная "пуговка" или "колечко" правильной формы); (+) — переходная (эритроциты распределяются по дну лунки, пробирки анно, по краю пободОк) . исит от количестигенов и монорецепенов в исследуеделяют путем прической активности иготовленных иэ ена и контрольного ным количеством ифическая активов, приготовленных тигена и референсилизирующих дозах зличием, одинакогаптена в исследут равняться 10%, чием — 5Ъ и т.д. специфическая акого препарата при дозе 5 мкг равняфическая активпарата,при сенсибимкг также равнятого следует, что н содержит 10% гац ользуемая монореа не должна реагиымн несенсибилизитами (результаты енов, полученных обактерий разнымн влены в табл. 1 о, что брюшнотифоэ59, полученная мео переваривания при сЕнсибилизирующей дозе 50 мкг, дает чувствительность к рецептору .

0-9 в разведении 1:40 и к рецептору

0-12-1:20. При этом референс-гаптен

40 при сенсибилиэирующей дозе 5 мкг к рецептору 0-9 обладает чувствительностью в разведении 1:40, а к рецептору 0-12 также в разведении 1:40.

Из этого следует,что в данной серии

4 айтйгена (вакцины) содержатся 103 гаптена к рецептору 0-9 и 5% к рецептору 0-12. Это означает, что общее содержание гдптена в исследуемом антигене по двум исследуемым рецепторам (0-9 и 0-12) равняется 15Ъ.При .-исследовании аналогичного антигена было установлено, что антиген серии

38 содержит 5% гаптена к рецептору

0-9 и 2,5% гаптена .к рецептору 0-12.

Так как эти исследования проводились параллельно в аналогичных условиях (с использованием одной серии контрольного гаптена, формалинизированных эритроцитов, монорецепторных сывороток и т.д.), можно сравнивать

60 количество содержания 0-антигенов и

0-гаптенов в препаратах производства различных предприятий. Хотя исследуемые брюшнотифозные антигены были приготовле*ны по одной техноло65 гии (методбИ триптического перевари784872

Содержание гаптенов к рецепторам, Ъ

Обратные титры сывороток в РПГА

;и рецепторам

100 100

10

40

50

2,5

2,5

10

50

50

100

1,25

10

80

100

10

50, Нет

Нет

100

Нет

Нет

100

Нет

Нет

Нет

Нет вания) разными предприятиями с помощью предлагаемого метода, в короткий срок возможно установление качественных и количественных различий между ними на уровне отдельных рецепторов О-антигена. Так, было установлено, что содержание гаптенов в О-антигене производства Ташкентского

НИИВС в два раза меньше, чем в аналогичном антигене производства Ленинградского НИИВС (7,5 и 15% соответствеино). Таким образом, возможно и установление количественного содержания О-антигенов в исследуемом препарате (вакцине) простым вычислением: в препарате производства Ленинградского НИИВС содержится 15% гаптенов (по рецепторам 0-9 и 0-12), а на долю антигена приходится 85%, в препарате Ташкентского НИИВС

7,5 и 92,5Ъ соответственно. Аналогичные качественные и количественные различия были получены при исследовании других серий О-антигенов, которые представлены в табл. 1.

В брюшнотифоэных антигенах, выделенных методом прогревания бактери- . альных суспенэий при 56-57@С в течение 1 ч (гретая вакцина), обнаружено содержание гаптена к, рецептору

0-9 1ОЪ, к 0-12 5Ъ. При исследовании .

Исследование гаптенов в б

Серия брюшнотифоэных СенсибилиО-антигенов- зирующая доза препарата на

1 мл 2,5% эритроцитов

Контроль О-гап. тен серия II

О-антиген ЛенНЙИВС серия 59

О-антиген ТашНИИВС серия 38

0-антиген ТашНИИВС серия 38 (а) О-антиген ЛенНИИВС се- рия 36

О-антиген ЛенНИИВС серия 36 (а) О-антиген ЛенНИИВС серия 52 (а)

0-антиген(гретая вакцина)МНИИВС серия 1

0-антиген (фаголиэат)

ТбилНИИВС серия 3

Ультразвуковой О-антиген неактивизированный серия 2

О-антигенов, полученных с помощью дезинтеграции бактерий фагон (фаголизат) и ультразвукового брюшнотифозного О-антигена, гаптены в них не oeiнаруживаются.

Исследование антигенов, полученных из других сальмонеллезных бактерий (сальмонелла мышиного тифа) с по,мощью гидроксиламина при 57 С в течение 72 ч показали, что в этих препаратах также содержится гаптен (см. табл. 2). Например, к рецептору 0-4

2,5Ъ, а к рецептору 0-12 2,5%.

Аналогичные исследования О-антигенов мышиного тифа, паратифа A и паратифа В, полученных методом дезин.35 теграции бактерий фагон (фаголиэат) и ультразвукового О-антигена из этих же штаммов (см. табл. 2) показали, что в них гаптены не содержатся.

Использование предложенного споЩ соба позволит оценивать качественное и количественное содержание О-гаптенов на уровне отдельных рецепторов и таким образом сравнивать и отбирать лучшие методы получения О-антигенов. д Этот способ создает возможность в лабораторных условиях оценивать за короткий срок (несколько часов) не только препараты, но и методы их производства. Таблица 1 рюшнотифоэ ных анти ге нах

784872

Т а б л и ц а 2

Исследование гаптенов в антигенах мышиного тифа, полученных с помощью гидроксиламина при 57 С в течение 72 ч..

Наименование препарата и Р серии

Сенсибилизирующая доза препарата на 1 мл .2,5Ъ эритроцитов

Обратные титры .сывороток s

РПГА и рецепторам

Содержимое гаптена к рецепторам, Ъ

4 12

Г"

Ультразвуковой Т.N. (контроль) 100

320

100

320

2,5

100

160

2 5

160

160

2,5

100

160

2,5

160

160

2,5

2,5

С-2

100

160

2 5

R-8

100

320

Ультразвуковой антиген мышиного тифа серия 2 неактивированный

Нет Нет

Нет

100

Нет

О-антиген фаголизат мышиного тифа ТбилНИИВС серия 2

100

Нет

Нет Нет

Нет

2. Способ по п. 1, о т л и ч а юшийся тем, что сенсибилизирующая доза исследуемого антигена в 1020 раз превышает сенсибилиэирующую дозу референс-гаптена.

Формула изобретения

1. Способ определения гаптена в антигене, отличающийся тем что, с целью количественного определения гаптена на уровне отдельных рецепторов, эритроциты параллельно сенсибилизируют исследуемым антигеном и референс-гаптеном, затем определяют их специфическую актив- 40 ность в реакций пассивной гемагглютйнации и по разности показателей специфической активности определяют количественное содержание гаптейа в антигене, Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Hi)net К.C. and an. "Структура и биологические свойства поверх-. ностных антигенов арамотрицательных бактерий". j. Bacterfalogy Reveiw

1963, 27, 4,, р. 352-368.

Составитель С. Малютина

Редактор П. Горькова Техред T.Èàòî÷êà Корректор Л. Иван

Заказ 8699/3 Тираж 67.3 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Т-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4