Способ получения поверхностных растворимых антигенов микробов кишечной группы

 

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

Союз Советских

Социалистических

Республик

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт. свид-Sy (22}Заявлено 021178 (2l)2680553/28-13 (5 )М с присоединением заявки ¹(23) Приоритет—

A 61 К 39/108

Государственный комитет

СССР по делам изобретений и открытий (53) УЛК 6576.8.097.. 2 (088. 8) Опубликовано 23.12,80, Бюллетень Мо 47

Дата опубликования описания 23 12 80 (7 2) А вт ор ы изобретения

И .Л.Ковалевская, Е.С.Щеглова к. С.А.Корнеев л

1

C

i I

1, f

Московский научно-исследовательский институт эпидеМиологии и микробиологии (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОВЕРХНОСТНЫХ РАСТВОРИМЫХ

АНТИГЕНОВ МИКРОБОВ КИШЕЧНОЙ ГРУППЫ

Изобретение относится к медицине, а именно прикладной иьжунологии.

Известен способ получения поверхностных растворимых антигенов мик— робов кишечной группы путем экстрак- 5 ции высушенной биомассы раствором хлористого натрия, отделения экстракта центрифугированием с последующим

era диализом и выделением целевого продукта 1). 10

Однако известный способ не позволяет выделить протективной фракции

SchigeIla Zonne.

Цель изобретения — выделение протективной фракции Sch!9е11а Хоппе. 15

Эта цель достигается тем,что отО деление экстракта ведут при 4-6 С, диализуют против О, 15Ъ-ного раствора хлористого натрия, полученный диализат центрифугируют при 4-6 С и из полученной надосадочной жидкости выделяют целевой продукт с мол. вес. 1,6-2 мпн дальтон фракционированием на ультрагеле.

Способ осуществляют следующим об- 25 разом.

На 1 этапе получают микробную массу шигелл Зонне I фазы.

Лиофилизированную культуру микробов Зонне I фазы (вирулентность в КК-30

2 пробе на морских свинках УДсо не более 5 млн) сеют на твердую питательную среду (казеиновый-агар или агар на мясном Хоттингере) рН 7,47,6, через 18-20 ч отбирают колонии фазы и сеют на мясной (по Хоттингеру ) бульон рН 7,4 — 7,6 на

3-4 ч, затем бульонную культуру засевают на матрицы с arapoM на мясном

Хоттингере рН 7,4-7,6. После выращивания при 37 С в течение 18-20 ч, микробы смывают забуференным 0,85 Ф раствором хлорида натрия рН 7,2.

Взвесь промывают тем же раствором с помощью центрифугирования при 4боC 5-6 тыс об/мин в течение часа.

Микробный осадок суспендируют в охлажденном забуференном 0,859 растворе хлорида натрия. К 1 объему взвеси отмытых микробов добавляют тонкой струей при постоянном помешивании 2 объема ацетона. Взвесь оставляют на 2-3 ч, перемешивая первые 1,5 ч на шуттель-аппарате при

120 об/ж н. Затем ацетон декантируют и добавляют свежий ацетон в объеме, равном двойному объему осадка микробов. После непрерывного взбалтывания в течение 30 мин взвесь оставляют при комнатной температуре н;

789114 ра NaCl Диализат центрифугируют при тех же условиях.;

На 3 этапе получают высокомолекулярную фракцию. Для этого свежеприготовленный экстракт наносят на колонку с ультрагелем ACA-22, в качестве элюирующего раствора 0,15% NaC!.

Высокомолекулярная фракция представляет 1 пик, который собирают и высушивают лиофильно без последующего подогрева. Молекулярный вес полученной фракции 1,6-2 млн- дальтон.

Выход антигенного комплекса по отношению к исходному весу сухой биомассы 3,2-3,9%.

Оптимальные, минимальные и максимальные показатели режима при получении протективной фракции микробов

Зонне представлены в табл.

20 При изменении параметров режима, как в сторону уменьшения, так и в сторону увеличения, свойства протективной фракции,ее растворимость, а следовательно, возможность использо25 вания для иммунизации, снижается.

Предлагаемый способ позволяет выделить протективную фракцию Schige11а Zonne.

4" ю»

Этапы получения протективной

Фракции

Свойства протективной фракции

Показатели

Получение высокомолекулярной фракции

Растворимость

Получение солевого экстракта поверхностных растворимых антигенов

Иммуногенные свойства на морских свинках

Исходная КРаткультура нос-.ь

Е фазы, обработки ацетоном

Лли- Диализ тель- в расност ь,творе обработки ацето-ном, сут

Центрифугирование и диализ при температуре, ас

Элюирующий раствор, В

Минимальные

4 4

0 05

Полная

0,05

Оптимальные

0,1Ь То же

0 15

5 4

100

Максимальные

0,58

0,58

7 7

100

15-16 ч, после чего вновь проводят смену ацетона. Ацетон меняют 5 раз на протяжении 4-х дней, после чего декантируют, а осадок переливают в широкую емкость для высушивания на

2-3 дня. Получают легко рассыпающийся порошок белого или желтоватого цвета.

Оптимальными условиями на этом этапе являются: использование культу« ры с показателем I фазы не менее

90%; 5 кратная" смена ацетойа в течение 4 дней..

На 2 этапе получают солевой экстракт поверхностных растворимых антигенов шигелл Зонне.

На 10 г сухих микробов добавляют

100 мл забуференного 0,85% раствора хлорида натрия рН 7,.2,.тщательно размешивают до получения однородной массы и ставят на один час на шуттель-аппарат при 4-6ОС при 240 колебаний в минуту. Взвесь центрифугируют при 4-6ОС 12 тыс об/мин в течение 20 мин, надосадок декантируют и повторно центрифугируют при тех же условиях и затем диализируют против 0,15% раствора хлорида натрия при 4-6 С в течение 24-48 ч при 3-4 разовой смене свежего раствоПолучение микробной массы шигелл Зонне фазы I

Превышает иммуноген ные свойства антигена Буавена, примененного в оптимальных дозах и приближается к защитной активности живой стрептомицинзависимой культуры

789114

Формула изобретения

Составитель С.Малютина

Редактор С.Патрушева Техрег, М.Рейвес Корректор Е.Папп

8920/3 Тираж 673 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035,Москва,Ж-35,Раушская наб.,д.4/5

Заказ

Филиал ППП "Патент",г.ужгород,ул.Проектная,4

Способ получения поверхностных растворимых антигенов микробов кишечной группы путем экстракции высушенной биомассы раствором хлористого натрия, отделения экстракта центрифугированием с последующим его диализом и выделением целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью выделения протективной фракции 5сЫ ge 11à Zonne отделение экстракта ведут при 4-6 С, диализуют против 0,15%-ного соленого раствора хлористого натрия, полученный диализат центрифугируют при 4-6 С и из полученной насадочной жидкости выделяют целевой продукт с мол.вес 1,62 мпн, дальтон фракционированием на.ультрагеле.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Руководство по :вакцинному и О сывороточному делу. Под ред. П.Н.Бу ргасова, М., 1978, с. 50-53.