Способ получения дефектных интерферирующих частиц вируса гриппа

 

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДЕФЕКТНЫХ ИНТЕРФЕРИРУЮЩИХ ЧАСТИЦ ВИРУСА ГРИППА путем заражения вирусом гриппа куриных эмбрионов с последующим отбором вирусосодержащей аллантоисной жидкости и выделением целевого продукта , отличающийся тем, что, с целью выделения целевого продукта, свободного от примесей инфекционного вируса и аллантоисных белков, вирусосодержащую жидкость. подвергают замораживанию-оттаиванию и центрифугированию, затем пот лученную надосадочную жидкость адсорбируют на куриные эритроциты и элюируют целевой продукт охлажденным физиологическим раствором при' Соотношении объемов физиологического раствора и эритроцитов 1:1,5 - 0,5.Ф(Лсuufcfitaofftfv ттщг аптр •еятлюягнан»I г 3 1, S 6^ В S vnijijufsisnteiafotiЭяюоты Лп.'00Оее N^ ^ со

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИН

„„su„„ А

g(5g С 12 N 7/00//С 12 N 7/00;!

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ .

Н ABTOPCHOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ имыЧмма ю лаи в — — — титр юаеафлрюураюудц

g /

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 2720976/28-13 (22) 05.02.79 (46) 15.12.83. Бюл. М 46 (72) Ю.П.Христофоров, И ° С.Фучижи и В.Н.Закусило (71) Одесский научно-исследовательский институт вирусологии и эпидемиологии им. И.И.Мечникова (53) 576.858(088 ° 8) (56) 1. Вишниченко В.К. и Петерс B.B.

Плотностной анализ стандартных и дефектных вирионов, "Вопросы вирусологии", 1974, 9 6, с. 688-692 (54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДЕФЕКТНЫХ

ИНТЕРФЕРИРУЮЩИХ ЧАСТИЦ ВИРУСА ГРИППА путем заражения вирусом гриппа куриных эмбрионов с последующим отбором вирусосодержащей аллантоисной жидкости и выделением целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью выделения целевого продукта, свободного от примесей инфекционного вируса и аллантоисных белков, вирусосодержащую жидкость . подвергают замораживанию-оттаива- нию и центрифугированию, затем по-. лученную надосадочную жидкость адсорбируют на куриные эритроциты и элюируют целевой продукт охлажденным физиологическим раствором при соотношении объемов физиологического раствора и эритроцитов

1:1,5 — 0,5.

803479

Способ осуществляют следующим об- 40 разом.

Получение вируса.

Накопление вируса гриппа проводят на куриных эмбрионах. Вирус с титром гемагглютинина от 1:64 до 1:512 раститровывают до предельных разведений, после чего заражают куриные эмбрионы. Инкубация куриных эмбрионов проходит при температуре +35,5 С в течение 72 ч, накопленный вирус выдерживают при температуре -20 С о в течение 3-10 сут. После размораживания в пул берут материалы с положительной реакцией гемагглютинации. Пул центрифугируют при

2,5 тыс. об/мин для удаления белков и других примесей.

Сбор фракций вируса.

Фракционирование проводят на свежих или формалинизированных эритроцитах кур, предварительно отмытых стерильным физиологическим раствором. Вирус адсорбируют на эритроцитах в течение 1-1,5 ч при температуре (+)4 — (+) б C . .Соотношение вирусосодержащей жидкости и эритроцитов 65

-Изобретение относится к области вирусологии и может быть использовано для разработки вакцин на основе дефектных интерферирующих частиц, а также для различных вирусологических исследований с их применением.

Известен способ получения .дефектных интерферирующих частиц вируса гриппа путем заражения вирусом гриппа куриных эмбрионов с последующим отбором вирусосодержащей аллантоисной жидкости и выделением целевого продукта (1) .

Однако известный способ не позволяет полностью освободиться от примеси инфекционного вируса, получаемый целевой продукт содержит большое количество аллантоисных белков.

Целью изобретения является выделение целевого продукта свободного от примесей инфекционного вируса и аллантоисных белков.

Эта цель достигается тем, что способ получения дефектных интерферирующих частиц вируса гриппа осуществляют путем заражения вирусом гриппа, куриных эмбрионов с последующим отбором вирусосодержащей аллантоисной жидкости и выделением целевого продукта, при этом вирусосодержащую жидкость повергают замораживанию — оттаиванию и центрифугированию, затем полученную надосадочную жидкость адсорбируют на куриные эритроциты и элюируют целевой продукт охлажденным физиологическим раствором при соотношении объемов физиологического раствора и эритроцитов 1:1,5-0,5.

Раь1 о 10:1. После адсорбции смесь центрифугируют при 1,5 тыс,об/мин в течение 5 мин. Снимают надосадочную жидкость. Для промывания к эритроцитам добавляют охлажденный физиологический раствор (+4оС) в соотношении 2:1, эритроциты размешивают пастеровской пипеткой и центрифуги- . руют при 1,5 тыс.об/мин в течение

5 мин.

После снятия промывной жидкости к эритроцитам добавляют охлажденный физиологический раствор в соотношении 1:1, эритроциты размешивают пастеровской пипеткой и оставляют для элюции при комнатной температуре. Через 1 ч проводят центрифугирование (1,5 тыс.об/мин 5 мин) и отсасывание пастеровской пипеткой элюата.

К эритроцитам доливают новую порцию охлажденного .физиологического раствора. Элюаты снимают с интервалом в

30 или б0 мин до значительного снижения их титров гемагглютинина (0-1:4/. Для предотвращения прироста в используемый физиологический раствор и в пробирки для элюатов добавляют смесь антибиотиков.

Проверка элюатов.

У полученных элюатов кроме гемагглютинирующей активности проверяют инфекционность на куриных эмбрионах или на хорионаллантоисных оболочках куриного эмбриона (XAO) . Инкубацию куриных эмбрионоь и :AO проводят при температуре 35,5 С в тео, чение 48 ч.

Пример 1. Для выделения дефектных интерферирующих частиц (ДИЧ) берут вирус А/Гонконг/1/б8, НЗ 2-2 с титром гемагглютинина

1:128. После его накопления на ку— риных эмбрионах и замораживания

100 мл вирусосодержащей аллантоисной жидкости адсорбируют в течение

1 ч на свежих эритроцитах кур.

Элюцию проводят в 10 мл физиологического, раствора при температуре

+21 С. Получают 21 элюат, дающие положительную реакцию гемагглютинации. Инфекционность элюатов проверяют на куриных эмбрионах. На фиг. 1 изображена динамика уровней гемагглютина и инфекционности элюатов

A/Ãîíêoíã/1/68. Как видно из фиr.1 элюаты с 11 по 18 при наличии высоких титров гемагглютинина оказались не инфекционными. При электронномикроскопическом исследовании элюатов выявлено различие в строении вирусных частиц из неинфекционных элюатов и высокоинфекционных. Для вирусных частиц из неинфекционных элюатов характерно отсутствие части генома. В табл. 1 представлены результаты проверки интерферирующих свойств элюатов. Как видно из табл.1 элюаты, содержащие ДИЧ, снижакт ин803479

Т а б л и ц а 1

Способ выделения дефектных интерферирующих частиц вируса гриппа

Средние титры гемагглютинина (по разведениям) ! „!

; Стандарт ный

Гонконг

13 элюа- 15 элю: тов +, атов +

1 стандар- стандар тн61и тный

11

, элюатов

I ! !

15 11 элюI ! элюатов,атов + ! ! ! стандартный элюатов

278

224

10 6

256

128

10-4

288

32

290

128

20

24

149

32 160

0 .- 80

160

Цельное фекционность и урожайность вируса стандартного. Все это подтверждает, что полученные элюаты являются фракциями дефектных интерферирующих частиц. Проверка первентивного действия полученных ДИЧ представлена в табл.2

Пример 2. ДИЧ выделяют из популяции вируса гриппа A/Ïîðò Чалмерс/1/73, Н3- 2-3 с титром гемагглютинина 1:256. После его накопления и замораживания 150 мл 1О вирусосодержащей аллантоисной жидкости адсорбируют в течение 1,5 ч при +5OC на свежих эритроцитах кур.

Элюцию проводят в 15 мл физиологического раствора при температуре 15

+20 С. Получают 65 элюатов, давших положительную реакцию гемагглютинации (интервал между элюатами

30 мин) . Инфекционность проверяют на куриных эмбрионатах. На фиг. 2 изображена динамика уровней гемагглютинина и инфекционности элюатов

A/Ïîðò Чалмерс/1/73. Как видно из фиг, 2, элюаты 27.и с 29 по 63 при наличии достаточно высоких титров гемагглютинина были не инфекционными.

В табл. 3 представлены результаты иропроверки интерфирирующих свойств неинфекционных элюатов A/Ïîðò Чалмерс/1/73.Как видно из табл. 3 не инфекционные элюаты снижают урожайность стандартного вируса. Данные электронно-микроскопического изучения.также подтверждают принадлежность полученных элюатов к ДИЧ. Проверка превентивного действия элюатов представлена в табл. 2.

Предлагаемый способ по сравнению с известным позволяет выделить дефектные интерферирующие частицы с более низким уровнем инфекционности (практически не инфекционные) . Способ позволяет выделить ДИЧ из популяции стандартного вируса, т.е. пассированного с невысокой множественностью инфекции. Получаемые ДИЧ обладают более выдержанным протектив bIM действием. В случае необходимости способ можно использовать для промышленной наработки вакцины на основе дефектных интерферирующих частиц.

803479

Таблица2 динамика гибели ььпаей, инфицированных стандартных вирусом гриппа и в комбинации с гомологичными ДИЧ

День учета гибели мишей

Инфекци онный

ЭИД/50

3 аражающий материал

5 6 7 8 9 10 - 11 12 13

Стандартный A/НК/68 1 10 12 28 36 44 44 44 45 45 46 46 50

2 3 5 5 5 5 5 6 6 6

ДИЧ A/НК/68

Стандартный + ДИЧ

A/НК/68

2 4 6 6 7 7 7 7 7 7 50.

Стандартный д/ПЧ/ 73 1 ° 10 13 27 38 43 45 45 45 45 45 45

1 4 5 5 5 6 6 6 6 6

ДИЧ A/Ï×/73. Ст ан дар т ный + ДИЧ

Л/ПЧ/73

0 2 3 3 5 5 5 5 5 5

Таблица 3

Способ выделения дефектных интерферирующих частиц вируса гриппа

Средние титры гемагглютинина (по разведениям) 41 элю 45 злюРазведение

31 элюат

41 элюат

45 злюатов

10 8

173

341

682

183

512

341

682

384

126

341

426

405

256

1706

104

426

96

1565

448

426

128

682

128

149

313

682

213

299

106

682

267

298

341

768

Цельное

Стандартный

Порт

Чалмерс

31 ат + стандартный

Общее число

1 4 ьышей ат + атов + стандар- стандар тный тный

8034 Ч

Составитель С. Малютина

Редактор Е. Зубиетова Техред N.Tenep Корректор А. Дзятко

Заказ 10698/6 Тираж 523 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР

IIo делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Pаушская наб., д. 4/5

Ф т

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4