Способ получения иммобилизован-ной полирибонуклеотидфосфорилазы
(и) al0717
ОПИСАНИЕ
ИЗОБР ETE H И Я
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ
Сава CIII Свциалистичесивх Республик (6!) Донолинтслы ое к авт. свид-ву— (22) Заявлено 27.09.76 (21) 2407955 23-04 с llpllcocдинением заявки М (23) Прпорнтет— (43) Опубликовано 07.03.81. Бюллclcnb М 9 (45) Дата опубликования описания 07.03.81 (51) .Ч. К.1.» С 07 G 7/02// "А 61 К 37 48 Гееударственный квмитет (53) УДК 577.15.07 (088.8) лв делам изобретений и открытий (72) Авторы изобретения С. Э. Ансберга, Д. Э. Гравите, И. А. Шмите и М. Я. Хейслере (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННОЙ ПОЛ И Р И БОНУКЛ ЕОТИДФО СФОР ИЛ АЗ Ы Изобретение относится к микробиологической и медицинской промышленности, в частности к способу получения иммобилизованного фермента — полирибонуклеотидфосфорилазы, широко применяемоп в cHf- 5 тсзе полинуклеотидов. Известен способ получения иммоби IHзованной полириоонуклсотидфосфорилазы путем связывания ес с силикагслем, нссугцим активные остатки альдсгида, присос- !О динснныс по связи Sl — С в среде буфера при 4 — 6 C и соотношении фермент: носитель 1: 10. Для стабилизации иммобилизованной полирибонуклеотидфосфорплазы образовавшуюся между белками и альдегид- !5 ными группами силикагеля связь стабилизируют восстановлением ооргидрпдом натрия в обратном буфере. С 1 г силикагсля связывается 4! — -51 мг белка, Период «полужизни» иммобилизо- 20 ванного фермента составляет 25 суток. Количество несвязанного фермента 50%. 11). Недостатками известного способа являются сравнительно невысокая активность HM1IOOH1H3OIIIIH IOH IlO.1H1IHOOHiTK COTH1ôOC- 25 форилазы (66 — 120 ед.), так как недостаточна стспсць со.;ранения первоначальной активности фермента в процессе иммобилизации (57 — 68%) в результате потсрь изза длительности процссса: отпос 1гельчо зп 2 короткий срок «полужпзни» нммоонлизованного фермента. Целью изобретения является увеличение активности и повышение срока «полужизни.> пм мобил изова иной полирибонуклеотидфосфорплазы. Указанная nc,1I достигается Tc ll, что в известном способе получения HMMoonënçoванной пол ирибонуклеотидфосфорилазы з качестве носителя используют ьчтдроокись алюминия в у-форме, которую предварительно активируют выдерживанием в воде при 0 — 8 С в течение 4 месяцев, а связываlIiIc фермента с носителем проводят при соотношении соответственно 1: (21,5 — 22,5) и нри тсмпсратурс !8 — 20 С. Такой способ обеспечивает активность готового продукта — иMMобилизованной полирибонуклеотидфосфорилазы — 120— 150 ед. (активность по АДФ), срок «полужизни» вЂ” 38 — 40 суток. Предлагаемьш способ получения иммобилизованной полирибонуклеотидфосфорилазы заключается в связывании ее H срсдс буфера при 18--20 C с гидроокисыо агпомгпшя в у-форме, которую предварительно активируют выдержнванием в воде прн 0 — 8 C в течение 4 месяцев при соогношснии фермент: носитель 1: (21,5 — 22,5). 11oIIhInIcHHc активности иммобнл изова и810717 Состав?(тель О. Скородумова Техред А. Камышникова Редактор 3. Бородкина Еоррект:!p О. Силуяноза Тираж 4!9 Изд. X- 235 ВНИИГ!И Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий f 13035, Москва, )К-35, Раушская наб, д. 4 5 Гт.одп(."нcii Заказ 2!5! Загорская типография Упрполиграфизда га Мособлпсп >. и! lOII liO,1ПРИО0ПУК. 1«ОТИД())OC(j)OPH,1 1lоситсль — гидроокись ал )>!?!Н?!5! q -Aj (O!-1) .; Yaрактеризуется высокой алсорбппонцой способностью за счет возникi!OH«I!I!I! PO l0pO,I II!I Y связей?, 3 T31(>l(C 60: п(ОИ п.!Ощ3дl>lo конта ктиру!Ощсй !1013cp>:ности, что способствует повышении> скорости и эффсктивностп адсорбции. Стаоильпость I! устойчиВость связи носит«ль-фермент повышается в процессе прс;!варительпой обработки носителя в Водном растворс. Предварительная активация увеличивает адсорбционную способность гпдроокиси алк>мипия за счег обраЗОВаНИЯ;(OIIO. Tif?ITC>! ЬПЫХ B030P03 III>T Y СВЯ3 (. !! . Короткий срок иммобилизации (10 мин) IIj)c,(oTâj)3ø3cT инактивацик) фермента. Темп«ратура процесса 18- — 20 С также обссПСЧИВ3,Т ОитцчаЛЬНОСтЬ СОХраНСНИЯ I!KTHIsnoc!и В проц(ссс иммобилизации полирпбопуклсотпдфосфорилазы. Соотfioiiieltli« ферм(нт: носитель создаст среду иммобилизации, обсснсчивающую полное связывание фср f«IIT3 — - 100%, что также прсдотв р >! П I 3 с Т O 61) 3 30 8 3 I- Н С C !) 5I 3> 3 H I I 0! 0 С.! к а И ВО.>ПИК>!ЮЩИС IIPII ЭТОМ ПОТСРИ 3KTH!>ПОСТ(У,I,. !HI! !ill(. c()01(3 «1?03 У>1(liÇH?I» ф«РМСН(c 25 jo 40 суток) cBH;(PT« lbcTIs> cT 06 устойчивости и стабильности иммобилиço ванной полирпоонуклеотидфосфорилазы и обеспечивается за счет высокой степени ЧИСТО! Ы >1, (CO()011()OÂIfffÍO! O фСРМСПТ3 ?1 ВОЗраст iiiliii степ Ii li св5!Зыва!!Ия белка и ноСПТСЛ51. Пример 1. К 16 мл суспснзии 1,01 г у-Л( (OH) з, предварительно акти!)ированной Вьп(сржпва Исм В тсчсппс 4 месяцев в водном растворе при 0 — 8 С и обработанной 5 мл 0,5 М трис-1-101 буфером, рН 8 1, прибав1HIoT 150 ед. (45 мг белка) по;!ирибонуклсотидфосфорилазы из Е. coll при комнатной температуре и перемешивании в течение 10 мин (время адсорбции) . Для оп1)едсз!е?!ия активности фермента инкубиру4 foT при 37 С 1 м.l 1)«31(l!HÎIIIIÎlf смеси, с0. (сржащсй, м кммоль: АДФ 25; грие-НС(буф«р 100; М< (С I COO) 10 (j)11 8,0) и фермент. 1 г у-Al (01-1) з связывак>г 45 м. белка с активностью 150 сл. Bluo;(активности 100%. Пример 2. К 48 мл суси«Изин 13,3 г у-Л1 (ОН) з, предварительно активпрованной выдерживанием в тсчспис 4 месяцев ! О 13 водном растворс при 0 — 8 С и обработанной 25 мл 0,5 (Ч трис-1-(С! буфером, р1-1 8,1, прибавляют 2070 ед. (621 мг белкаj полирибопуклсотидфосфорплазы из 1=.. со!! 11pil комнатной температуре и перемешивании ! 5 в течение 10 мин (время адсорбцпи). Определяют активность фермента. 1 г у-Л! (ОН) з связывают 45 мг белка с активностью 150 ед. Выход активности 1ООЪ. Определение активности полпрпбонук20 лсотидфосфорилазы: Лктивность-результат !!0 кривой >(разведение У. 2 (инкубация 30 мпн X пересчет на 1 мл) = 0,02X(OX ;; 2X 20-8 ед./мл (4 с,l,../>?г белка ) . 25 Формула изобр«r«ii!1: Способ получения и>1>!Об?!.1изо вань!ой полирпбонуклеотидфосфорплазы путем связывания ее с неорганическим Во.!он(-ЗО раствори>(ым носителем в буферной сред«, о гл ичающийся тем, что, с цслшо ув=личения активности и повыш(..ни я срока «полу>к?!Зни» иммобилизованной полирибонуклеотидфосфорилазы, в кач«стве посптс35 ля использу!от гидроокись а(поминия 3 у-форме, которую предварительно актив!руют выдерживанием в воде прп 0--8 С В т("!с!!?!е 4 месяцев, а связывание фермента с носителем проводят при соотношении со40 ответственно 1: (21,5 — 22.3 и IipH темп ратурс 18- — 20 С. 1 сточник?1 информацl(и, принятые во внимание при эк псртиз:.45 1, Лвторс .ос свидетельств» ССС :- Мз 498315, кл. С 07 С) 7 02, 1974 и!)o(c!-.Ип).
