Способ определения активностиглюкозо-1-фосфатазы /k.ф.3.1.3.10/ b сперме
1ц 819! УО
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕН ИЯ
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ
Союз Ооеетских
Социалистических
Республик (61) Дополнительное к авт, свид-ву (22) Заявлено 19.06.78 (21) 2647765/30-15 с присоединением заявки № (23) Приоритет (43) Опубликовано 07.04.81. Бюллетень № 13 (45) Дата опубликования описания 07.04.81 (51) М. К .
С 12(} 1/42
Государственный комитет
СССР
ilo делам изобретений и открытий (53) УДК 577.15.08 (088.8) (72) Автор изобретения
Ю. Г. Курило (71) Заявитель Полтавский научно-исследовательский институт свиноводства (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ
ГЛЮКОЗО-1-ФОСФАТАЗЫ (К. Ф. 3.1.3.10) В СПЕРМЕ
Способ относится к методам исследования, а именно определению активности ферментов в биологических тканях.
В доступной нам литературе мы не встречали описания методики определения ак- 5 товности глюкозо-1-фосфатазы в биологических тканях.
Для определения активности глюкозо-6фосфатазы в гомогенате печени и в сыворотке крови существует метод В. С. Аса- )o тиани, который основывается на количестве отщепившегося фосфата от глюкозо-6-фосфата (1).
К инкубационной среде, состоящей из
0,5 мл веронал-ацетатного буфера рН 6,5, вносят 0,2 мл сыворотки кровки и 0,3 мл
0,01 М раствора глюкозо-6-фосфата, смесь инкубируют при 37 С в течение часа. Конечный объем реакционной смеси 1 мл.
После инкубации и осаждения белков в трихлоруксусном фильтрате определяют неорганический фосфат по методу Фиске-Суббороу.
Определение активности глюкозо-6-фос- фатазы этим методом недостаточно точный, 25 так как здесь имеет место наслоение действия неспецифических фосфатаз и он не подходит для определения активности глюкозо-1-фосфатазы.
Целью изобретения является повышение точности определения активности глюкозо1-фосфатазы.
Для достижения указанной цели перед введением пробы спермы в реакционную смесь вносят фтористый натрий и арсенат натрия при следующем соотношении компонентов, мкг/мл:
Фтористый натрий 139,97 — 279,93
Арсенат натрия 34,67 — 69,33
Пример. Предложенный способ осуществляется следующим образом.
К инкубационной среде, состоящей из раствора трис-HCI-буфера рН 7,6 0,05 М— ! мл, калиевой соли глюкоза-1-фосфата
0,06 M — 0,5 мл, фтористого натрия 0,1 М—
0,15 мл, арсената натрия 0,005 М вЂ” 0,1 мл, добавляли исследуемый материал 0,5 мл, инкубировали в водяной бане при 37,5 С в течение разных промежутков времени от
15 мин до 4 час, но более закономерно проявляется активность при 60-минутной инкубации (табл. 1). Реакционная смесь соответствует 2,25 мл. Реакцию прекращали внесением в пробы 2,25 мл 10% трихлоруксусной кислоты. В контрольной пробе трихлоруксусную кислоту добавляли перед внесением исследуемого материала. Через
81917() 3
30 мин пробы фильтровали. Влияние концентраций арсената натрия и фтор истого натрия на активность неспецифических фосфотаз показано в табл. 2.
Таблица 1
Активность фосфатаэы глюкозо — 1-фосфата (к. ф. 3. 1. .3.;10) в свежей и храненной сперме хряка мл отщепившегося фосфата на 100 мл спермы:
Переживаемость, оо время инкубации в минутах 37,5 С
Хранение в часах
180
120
240
30
78,70 3,85
73 08 2 98
74,88д2,56
54,66 2,27
75,00 1,43
69,50 1,26
63,17 2,81
49,32 1,34
87,70 3,55
77,60 3,20
79,67+ 3,07
57,44 2,96
24,20 1,86
19,25 + 0,85
21,63 1,39
9,20 0,14
71,90 1,83
71,60 1,78
62,07 1,44
37,56 1,59
39,90 3,22
36,40 2,53
36,53+ 2,13
14,00 1,67
61,90 3,01
63,00 3,31
50,40 2,50
29,76 1,56
Свежая
24
48
84
79
73
Цифровые данные обработаны статистически по методу М, А. Ойвина (1960)
Патологическая физиология и экспериментальная терапия. 1960, 1чъ 4, с. 76 — 85
P=0,95 (P<0 01) 1000 у, 0,6190 х — 0.212 2,920 мг
К 2 мл трихлоруксусного фильтрата добавляют 2 мл молибденового реактива, смешивают в соотношении 1: 1 5О/о-ный раствор молибденовокислого аммония
) NH< ) аМотО д-4НаО) с 5%-ным ра створом серной кислоты (Н 804). В качестве восстановителя вносили 1 мл насыщенного раствора тиомочевины (HgCSNHg), растворяют 9 г тиомочевины в 100 мл дистиллированной воды. Содержимое пробирок хо-. рошо смешивали и ставили в водяную баню на 10 мин при 38 С. После охлаждения до комнатной температуры пробы калориметрировали на ФЭКМ при 590 — 610 ммк (красный светофильтр). Одновременно ставили слепую пробу, где вместо фильтрата брали дистиллированную воду и стандартную пробу с известной концентрацией фосфора. Для приготовления стандартного раствора фосфора брали навеску калия фосфорнокислого однозамещенного (КН2РО4)
0,4394 г и растворяли в 1 л дистиллированной воды, в однолитровой мерной колбе.
1 мл раствора содержит 0,1 мг или 100 мкг (микрограмм) фосфора. После по пропорции высчитываем концентрацию фосфора в
1 мл фильтрата, которое умножаем на 4,5 з. и получаем количество РО 4.
Например, в 1 мл исследуемого материала выявлено 0,6190 мг неорганического фосфата, концентрация спермиев в 1 мл, подсчитанных при помощи камеры Горяева 0,212 миллиарда. Высчитываем по пропорции активность на 109 спермиев.
0,212 — 0,6190
10 1000 — х
Если учесть, что 1 спермий хряка имеет
15 125 кубических микрона и полученное количество отщепившегося неорганического фосфата в микрограммах разделить на 125, тогда получим активность, выраженную в микрограммах, неорганического фосфата на
20 2920 мг мм массы спермиев =23 36 мкгlмм
Если учесть, что микромоль глюкозо-1фосфата соответствует 31 микрограмму неорганического фосфата, тогда мы делим
25 23,26 мгк
3I
= 0,753 мкм/моль на мм массы спермиев. Кроме того, полученные данные в 1 мл исследуемого материала умножаем на 100 и получаем активность на 100 мл
30 спермы.
СЧ ь
СЧ
GO
С0
С|
CD
4О
С| (О о
CD
Ю
ОЪ
С|
С:1 4»
1Q
С| ръ
С|
СЧ
»:|
CD
СО л
1Q
Й
D, v
C)
Ю с4»
СЧ
СЧ (»0
С>
4СЮ ,м х ч (Q
64 °
Ф Сб и
64 х
CD
»6»
С|
С| л
С5
С>
Ф о
СО
ОЪ
0О
Ю
CD
CD
CD
СЧ
»6»
ОЪ
Ю
0О
0О
0О о о
GO (» л
С1
Р Э л с4»
С|
1Q (Э (О
С|
СЧ
РЭ
0О о
СЧ
0О
C)
СЧ . с4»
ОЪ
С| (:|
СО
СО
CD ь л
С| с(» (О
С 4
1Q
С| (О
Й а и
ot/л
С>
С|
1Q
С 4
С>
С>
С>
»Ф
С> 4» (О
0О
Ch
1О л о (» о
1Q
СЧ
0О
СЧ
Cb о
|.О о
СО
C(4
»6» о
»(4»
»6»
|О о
СЧ (О
CD о
Ю
|О
CD
1О х о х о и р: и
0С|, |О л х
II x
| х
3»6
М 6»
\Q
»:>
З
О» и о (х
"И л
СЧ
|О (О о.„"
Ю СО ох
»6 х
» |
СО 6» о
Ю
Ю
СО
»(» о
»4»
»:> л
C)
CD
CD
CD о
Щ
СО
С|
CD
СЧ (О
001/» л
С|
GO
Щ
С|
GO
С|
С> (О
С|
СЧ
С|
CD о
СЧ (О (О о
СО (О
1О
С|
1Q (1О
С:|
)О
С5
3О (О
С|
CD
СЧ и а
1О
С(»
С| (O
СС»
СЧ
О4 ((|
С>
C(4
С| л
С| т3»
Ю л
С|
С| р4 л
Ю
CD (»
С|
0О с4
8
oot/
С0
CD
С|
С 4
СЧ
С|
Ф
С|
Ю (Ю
Ф Ф хх а (6 ах х »6
Р о х хх
Х о
Ю
СЧ х ч
O (6 х у5 х («
6» (6
Ч 46» оч
Х О
Ф,Я» х °
4» ° »
go
6> О хх х Я (d о
D» Х4 .4
Х IO
|Р Ч(О хо х (»
Х 64(Е ххэ хх: к х х о, Рх 64 (d 64 +
ХХ64
O 8» х х dl хрхх И хнах О» О» Cd («и|р 65 Ъ Ифх 4 64 cd а Cd х ч ах Ф »« о хх .64 р хь оо х я» »х ч о о (б а 64 64 О С6 d» 8 хо хо CCI 6 IrN OOt/» нанизана ,ии/ляи нанимаю 01/aw IrN 001/ли лч oot/» нанимаю сии/нли IrN 00I/ли Irw 00t/ли нанизана сии/лни нанизана ot/» aN 00t/ли нанимаю ,ии/ля и нанизана 0 / Irw/ dIrN H aaIINdaIIO винейлнанно ли н W,IIir - н. иаЮ ноякдх @(х 6 v Х 64 М 3 С(» л»р 0О (. х II Й »6 З, 44 (» «х о И gR Я СО ох о х х (о Х 64 И М CD ". »6 |С> |О Х »» ф И (О (» х "й (»Э "ОЪ До СЧ ох о х х G4 и и |О D4 з «х х С»| II И и с. х 1.О о, л СО Ю о х х о (» 64 х ф 1Q |О> 0С»„, р»х СЧ Х (С) II 6 » и tQ И о(О Cb ." Р4 . СЧ ох х В х о, о (6 Ф х х а (» (6 (6 ах (О хо gÎ Ov В хо 64 М О о 1О II x »6 Х М и о (» (О 4 (8 СС 8х ох х о С 64 х и g v cr» |О (О ъ II x х Д И о «х м;. и 1Q Я о лоох х х 64 g v CD»D 1О ъ х II x 6 Х и к И -( ох „И Я 8о» 8f9170 1О Cb СЧ CD СО (O »С» СО РЪ CD с(» CD о Cr» CD (O »3» СЧ Я о (О GO с1 л GO (ф о о 0С| |О СЧ СЧ СО |О 00 \О 819170 Формула изобретения Составитель А. Макаров Корректор Л. Слепая Редактор Л. Курасова Техред И. Заболотнова Заказ 642/17 Изд. № 258 Тираж 530 Подписное НПО «Поиск» Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5. Типография, пр. Сапунова, 2 Способ определения активности глюкозо-1-фосфатазы (к. ф. 3.1.3.10) в сперме, преимущественно хряков, включающий введение пробы спермы в реакционную смесь, содержащую трис-НС1-буфер, калиевую соль глюкозо-1-фосфата с последующим инкубированием, добавлением раствора трихлоруксусной кислоты для прекращения реакции, отличающийся тем, что, с целью повышения точности определения активности, перед введением пробы спермы в реакционную смесь вносят фтористый натрий и арсенат натрия при следующем 5 соотношении Компонентов, мкг/мл: Фтористый натрий 139,97 — 279,93 Арсенат натрия 34,67 — 69,33 Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 10 1. Асатиани В. С. Ферментные методы анализа, 1969, с. 503 — 507 (прототип).
